CN115960828A - 一种靶向hpv16 e7的hla-a*0201限制性cd8毒性t细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向HPV16E7的HLA‑A*0201限制性CD8毒性T细胞的制备方法，属于生物医药技术领域，主要是分离HLA‑A*0201阳性健康供者PBMC，取部分PBMC进行HPV16E7aa11～20刺激，并与剩余PBMC混培，再采用偶联负载HPV16E7aa11～20的HLA‑A2:Ig的磁珠进行筛选，将分选出的细胞经CD3/CD28抗体激活并大量扩增后，收获大量靶向HPV16E7抗原的HLA‑A*0201限制性CD8毒性T细胞，能与HLA‑A2/HPV16E7aa11～ 20Tetramer结合CD8+阳性T细胞占比大于90％，活率大于99％。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向HPV16 E7的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞的制备方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种全球分布的双链环状DNA病毒，可感染皮肤和黏膜。2012年国际癌症研究机构(international Agency for Researchon Cancer，IARC)将目前发现的200多种HPV分型分为高危型、疑似高危型和低危型等三种亚型，不同类型的亚型引起宫颈癌发病风险增加的程度不一样。其中HPV16、18、31、45、52和58等高危型HPV病毒(high risk types human papilloma virus，HR HPV)感染占所有亚型感染的80％。其中HPV16感染占宫颈癌的57％，超过半数，由此可见HPV16是与宫颈癌发生相关性最高的一种高危HPV。
HPV基因组全长约8000个碱基对，由早期区(E区)、晚期区(L区)和长控制区(LongControl Region，LCR)三部分构成。E区有6个编码区，即E1、E2、E4、E5、E6、E7，其中E6、E7是主要的癌基因编码区。目前已有被HLA-A*02:01呈递的E7蛋白CTL表位(YMLDLQPETT)应用在E7多肽疫苗的临床试验，所以以CTL肽为基础的方法是治疗HPV诱发宫颈癌的一种有效途径。
实验和临床证据表明，细胞免疫在抗病毒感染中发挥着至关重要的作用。主要机制为HLA-I类分子在多种伴侣分子的作用下与HPV抗原肽结合形成抗原肽/MHC-I类分子二聚体，该复合物被CD8+T细胞表面受体识别并活化产生CD8毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)，CD8毒性T淋巴细胞通过分泌大量颗粒酶B和穿孔素来消除感染或者癌变的细胞，最终导致细胞死亡。因此，CD8毒性T淋巴细胞被认为是宫颈癌细胞和HPV病毒感染细胞的根除点。但现有的制备工艺培养所得的CD8毒性T淋巴细胞存在数量少，纯度低等问题，导致制备的CD8毒性T淋巴细胞特异性杀伤活性低，无法通过回输患者而直接、快速杀伤HPV感染细胞。
中国专利文献CN102618498B(申请号：201210083796.2)、CN102719400B(申请号：201210231576.X)、CN105505873A(申请号：201610112857.1)公开了一种HLA-A0201限制性抗原特异性CTL制备的方法，其主要内容均是对通过单采收集外周单个核细胞，富集、纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性目标抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+淋巴细胞，并用rhIL-2和rhIL-7联合促进T细胞生长；采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL；采用固相包被的抗人-CD3mAb和IL-2刺激目标CTL的生长；加入γ射线辐照后的自体PBMC增强目标CTL的活化；加入rhIL-15培育扩增，收集鉴定。该专利虽然能够从快速培养得到大量HLA-A0201限制性抗原特异性CTL，但是采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术进行分选，分选时间较长(一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果细胞量超过109个，则需要耗费10小时以上)，存在降低细胞的活力的风险。另外，该发明使用γ射线辐照后的自体PBMC作为滋养层细胞，存在变异的可能，其安全性有待考证。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种靶向HPV16 E7的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞的制备方法。
本发明解决了抗原特异性CTL细胞在体外培养数量低、纯度低、活率低、且安全性低的技术难题。
本发明的技术方案如下：
一种靶向HPV16 E7的HLA-A*0201限制性CD8毒性T淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)第0天，分离HLA-A*0201阳性健康供者外周血单个核细胞(PBMC)，取部分PBMC细胞加入含有2～15μM HPV16 E7 aa11～20、体积分数5％人AB血清RPMI-1640培养基中刺激70～110min，取刺激后细胞与剩余2/3PBMC细胞混匀，加入到含有体积分数10％人AB血清X-vivoTM15培养基，细胞密度为(4～6)×106cells/mL；
HPV16 E7 aa11～20为HPV 16E7 HLA-A*0201限制性CTL表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为YMLDLQPETT；
(2)第4天，采用含有10～100ng/mL IL-2、体积分数10％人AB血清的X-vivoTM15培养基对细胞进行半量换液；
(3)第8天，采用含有10～100ng/mL IL-2、体积分数10％人AB血清的X-vivoTM15培养基对细胞全量换液，细胞密度为(2～3)×106cells/mL；
(4)第12天，采用偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠对培养后PBMC进行阳性筛选，并将筛选靶向HPV16 E7抗原细胞加入含有20～70ng/mL CD3抗体、20～70ng/mL CD28抗体、10～100ng ng/mL IL-2、5～50ng ng/mL IL-7、5～50ng/mL IL-15、5～50ng/mL IL-21、体积分数10％人AB血清的X-vivoTM15培养基进行培养，细胞密度为(0.8～1.2)×106cells/mL；
(5)第16天，离心收集细胞，去除磁珠，并采用10～100ng/mL IL-2、5～50ng/mLIL-7、5～50ng ng/mL IL-15、5～50ng ng/mL IL-21、体积分数10％人AB血清X-vivoTM15对细胞全量换液，细胞密度为(0.8～1.2)×106cells/mL；
(6)第20～21天，收获靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T淋巴细胞。
根据本发明优选的，步骤(1)中，外周血单个核细胞的活率≥95％，数量≥5×107cells。
根据本发明优选的，步骤(1)中，部分PBMC细胞为1/3PBMC细胞。
根据本发明优选的，步骤(1)中，加入含有10μM HPV16 E7 aa11～20。
根据本发明优选的，步骤(1)中，刺激90min。
根据本发明优选的，步骤(1)中，细胞密度为5×106cells/mL。
根据本发明优选的，步骤(3)中，细胞密度为2.5×106cells/mL。
根据本发明优选的，步骤(4)中，偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠制备方法，包括如下步骤：
取1～15μg人类HLA-A2:Ig融合蛋白和(0.2～3)×108个DynabeadsTM M-450环氧树脂在250～750μL pH 7.0硼酸缓冲液进行4℃过夜孵育，第二天将磁珠放入磁力架中，弃硼酸缓冲液，并加入250～750μL体积分数5％ AB血清进行4℃过夜孵育，第三天将磁珠放入磁力架中，弃人AB血清，并加入2.48～37.17μg HPV16 E7 aa11～20在0.8～1.2mL PBS pH 7.2进行37℃过夜孵育，第四天获得偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠。
根据本发明优选的，步骤(4)中，细胞密度为1×106cells/mL。
根据本发明优选的，步骤(5)中，细胞密度为1×106cells/mL。
根据本发明优选的，步骤(6)中，细胞活率≥99％，数量≥1×109cells。
利用流式细胞术检测靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞(HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20Tetramer+CD8+)占比≥90％。
有益效果
1、本发明提供的制备靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞方法，先从HLA-A*0201阳性健康供者中分离出不低于5×107cells外周血单个核细胞(PBMC)，取部分PBMC经过HPV 16E7 HLA-A*0201限制性CTL表位肽刺激，之后与剩余PBMC进行混培，再采用偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠分选出靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞，之后将分选出的细胞经CD3/CD28抗体激活，并在含有IL-2、IL-7、IL-15、IL-21四种细胞因子的培养基中进行大量扩增，可收获靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞数量大于1×109个，且能与HLA-A2/HPV16 E7aa11～20Tetramer结合CD8+阳性T细胞占比大于90％。
2、本发明制备的细胞可以强有力地杀伤CaSki[细胞表面表达HLA-A*0201，且含有完整的HPV-16(每个细胞大约600个拷贝)序列]细胞系，可用于治疗HPV16感染的HLA-A*0201阳性患者。
3、本发明提供的靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CTL细胞制备方法，具有培养数量高、纯度高、杀伤力强等优势。
4、本发明采用偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠，对靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞进行筛选，使其快速分选出HLA-A2/HPV16 E7aa11～ 20Tetramer+CD8+，极大的提高了细胞的活力。此外，利用磁力架可以有效地将磁珠去除，从而确保CTL制剂的临床使用安全性。
附图说明
图1为制备靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞的流程图。
图2为具体实施例1第16天细胞克隆团形成情况。
图3为具体实施例1第21天收获细胞的流式检查结果。
图4为具体实施例2第16天细胞克隆团形成情况。
图5为具体实施例2第21天收获细胞的流式检查结果。
图6为具体实施例3第16天细胞克隆团形成情况。
图7为具体实施例3第20天收获细胞的流式检查结果。
图8为不同培养组获得细胞的流式检查结果图。
图9为靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T淋巴细胞对宫颈癌的杀伤效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中使用的药品及试剂，若无特殊说明，则为以上市普通产品，实施例中未详加说明的内容，均按本领域现有技术。
以下实施例中5％人AB血清、10％人AB血清，％是指体积分数。
图1为制备靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞的流程图。
HPV16 E7 aa 11～20为HPV 16E7 HLA-A*0201限制性CTL表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为YMLDLQPETT，该表位肽是委托生物公司合成的。
实施例1
一种靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)第0天(分离获得细胞的当天作为第0天)，采集HLA-A*0201阳性健康供者50mL外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离出PBMC，其活率为97.45％，数量为5.08×107cells。取1/3PBMC细胞加入3.33mL含有10μM HPV16 E7 aa11～20(委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成)、5％人AB血清RPMI-1640培养基中，并置于二氧化碳培养箱刺激90min。刺激后，将细胞进行600g离心10min，弃上清后获得刺激细胞，并用3.33mL含有10％人AB血清X-vivoTM15培养基进行重悬。
取剩余2/3PBMC细胞加入6.67mL含有10％人AB血清的X-vivoTM15培养基中，置于二氧化碳培养箱培养90min。
取重悬后刺激细胞与剩余2/3PBMC细胞混匀，并置于二氧化碳培养箱培养，密度为5.0×106cells/mL。
(2)第4天，收集步骤(1)中培养4天后的细胞，600g离心10min后弃一半上清，并用采用30ng/mL IL-2、10％人AB血清的X-vivoTM15培养基对细胞进行半量换液；
(3)第8天，收集步骤(2)中培养4天后的细胞，600g离心10min后弃上清，并用含有30ng/mL IL-2、10％人AB血清的X-vivoTM15培养基对细胞全量换液，其密度不低于2.5×106cells/mL。
(4)制备磁珠，具体方法为：取5μg人类HLA-A2:Ig融合蛋白(购自BD生物科学)和1×108个DynabeadsTM M-450环氧树脂(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)在250μL pH7.0硼酸缓冲液进行4℃过夜孵育。
第二天将磁珠放入磁力架中，弃硼酸缓冲液，并加入1mL 5％ AB血清进行4℃过夜孵育。
第三天将磁珠放入磁力架中，弃人AB血清，并加入12.39μg HPV16 E7 aa11～20在1mL PBS(pH 7.2)进行37℃过夜孵育。
第四天获得偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的自制磁珠。
(5)第12天，采用步骤(4)中自制磁珠对步骤(3)中培养后的PBMC进行阳性筛选，具体步骤如下：
a：将步骤(4)中自制磁珠放入50mL离心管中，并放入磁力架中，静止3min，弃上清液；
b：从磁力架取出含有自制磁珠50mL离心管，并加入步骤(3)中培养后的PBMC进行混匀；
c：将含有混悬液的50mL离心管再次放入磁力架中，静止3min，弃上清液，并加入20mL PBS(pH 7.2)清洗；
d：从磁力架取下50mL离心管，并采用含有30ng/mL CD3抗体、30ng/mL CD28抗体、30ng/mL IL-2、10ng/mL IL-7、10ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、10％人AB血清X-vivoTM15对吸附靶向HPV16 E7抗原细胞的磁珠进行重悬，并置于二氧化碳培养箱培养，其密度为1×106cells/mL。
(6)第16天，对步骤(5)中培养物进行600g离心10min，弃除上清，收集细胞到50mL离心管，加入20mLPBS(pH 7.2)后放置在漩涡振荡器上，800rpm震荡5min，之后将离心管放入磁力架，静止3min，吸取细胞悬液到一个新50mL离心管，之后将新离心管放入磁力架，静止3min，吸取细胞悬液到另一个新50mL离心管，600g离心10min，弃除上清，并采用30ng/mLIL-2、10ng/mL IL-7、10ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、10％人AB血清X-vivoTM15对细胞进行重悬，其密度为1×106cells/mL。操作前细胞克隆团形成情况见图2。
(7)第21天，对步骤(6)培养后细胞进行收获，其活率为99.45％，数量1.23×109cells。
采用HLA-A*0201HPV16 E7 aa11～20 Tetramer(购自北京博尔迈生物技术有限公司)和CD8抗体(购自北京博尔迈生物技术有限公司)对收获的细胞进行流式检测，靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞(HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20 Tetramer+CD8+)的占比为91.18％，具体见图3。
实施例2
(1)第0天，采集HLA-A*0201阳性健康供者100mL外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离出PBMC，其活率为97.58％，数量为9.79×107cells。取1/3PBMC细胞加入6.5mL含有10μM HPV16 E7 aa11～20、5％人AB血清RPMI-1640培养基中，并置于二氧化碳培养箱刺激90min。刺激后，将细胞进行600g离心10min，弃上清后获得刺激细胞，并用5mL含有10％人AB血清X-vivoTM 15培养基进行重悬。
取剩余2/3PBMC细胞加入13mL含有10％人AB血清的X-vivoTM 15培养基中，置于二氧化碳培养箱培养90min。
取重悬后刺激细胞与剩余2/3PBMC细胞混匀，并置于二氧化碳培养箱培养，密度为5.0×106cells/mL。
(2)第4天，收集步骤(1)中培养4天后的细胞，600g离心10min后弃一半上清，并用采用30ng/mL IL-2、10％人AB血清的X-vivoTM 15培养基对细胞进行半量换液；
(3)第8天，收集步骤(2)中培养4天后的细胞，600g离心10min后弃上清，并用含有30ng/mL IL-2、10％人AB血清的X-vivoTM 15培养基对细胞全量换液，其密度不低于2.5×106cells/mL。
(4)制备磁珠，具体方法为：取7.5μg人类HLA-A2:Ig融合蛋白和1.5×108个DynabeadsTM M-450环氧树脂在375μL pH 7.0硼酸缓冲液进行4℃过夜孵育。
第二天将磁珠放入磁力架中，弃硼酸缓冲液，并加入1mL 5％ AB血清进行4℃过夜孵育。
第三天将磁珠放入磁力架中，弃人AB血清，并加入18.59μg HPV16 E7 aa11～20在1mL PBS(pH 7.2)进行37℃过夜孵育。
第四天获得偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的自制磁珠。
(5)第12天，采用步骤(4)中自制磁珠对步骤(3)中培养后PBMC进行阳性筛选，具体步骤如下：
a：将步骤(4)中自制磁珠放入50mL离心管中，并放入磁力架中，静止3min，弃上清液；
b：从磁力架取出含有自制磁珠50mL离心管，并加入步骤(3)中培养后PBMC进行混匀；
c：将含有混悬液的50mL离心管再次放入磁力架中，静止3min，弃上清液，并加入20mL PBS(pH 7.2)清洗；
d：从磁力架取下50mL离心管，并采用含有30ng/mL CD3抗体、30ng/mL CD28抗体、30ng/mL IL-2、10ng/mL IL-7、10ng/mLIL-15、10ng/mL IL-21、10％人AB血清X-vivoTM 15对吸附靶向HPV16 E7抗原细胞的磁珠进行重悬，并置于二氧化碳培养箱培养，其密度为1×106cells/mL。
(6)第16天，对步骤(5)中培养物进行600g离心10min，弃除上清，收集细胞到50mL离心管，加入20mL pH 7.2PBS后放置在漩涡振荡器上，800rpm震荡5min，之后将离心管放入磁力架，静止3min，吸取细胞悬液到一个新50mL离心管，之后将新离心管放入磁力架，静止3min，吸取细胞悬液到另一个新50mL离心管，600g离心10min，弃除上清，并采用30ng/mLIL-2、10ng/mL IL-7、10ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、10％人AB血清X-vivoTM 15对细胞进行重悬，其密度为1×106cells/mL。操作前细胞克隆团形成情况见图4。
(7)第21天，对步骤(6)培养后细胞进行收获，其活率为99.83％，数量1.76×109cells。
采用HLA-A*0201HPV16 E7 aa11～20 Tetramer(购自北京博尔迈生物技术有限公司)和CD8抗体(购自北京博尔迈生物技术有限公司)对收获的细胞进行流式检测，靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞(HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20 Tetramer+CD8+)的占比为91.17％，具体见图5。
实施例3
(1)第0天，采集HLA-A*0201阳性健康供者200mL外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离出PBMC，其活率为96.23％，数量为1.92×108cells。取1/3PBMC细胞加入12.8mL含有10μM HPV16 E7 aa11～20、5％人AB血清RPMI-1640培养基中，并置于二氧化碳培养箱刺激90min。刺激后，将细胞进行600g离心10min，弃上清后获得刺激细胞，并用10mL含有10％人AB血清X-vivoTM 15培养基进行重悬。
取剩余2/3PBMC细胞加入25.6mL含有10％人AB血清的X-vivoTM 15培养基中，置于二氧化碳培养箱培养90min。
取重悬后刺激细胞与剩余2/3PBMC细胞混匀，并置于二氧化碳培养箱培养，密度为5.0×106cells/mL。
(2)第4天，收集步骤(1)中培养4天后的细胞，600g离心10min后弃一半上清，并用采用30ng/mL IL-2、10％人AB血清的X-vivoTM 15培养基对细胞进行半量换液；
(3)第8天，收集步骤(2)中培养4天后的细胞，600g离心10min后弃上清，并用含有30ng/mL IL-2、10％人AB血清的X-vivoTM 15培养基对细胞全量换液，其密度不低于2.5×106cells/mL。
(4)制备磁珠，具体方法为：取10μg人类HLA-A2:Ig融合蛋白和2×108个DynabeadsTM M-450环氧树脂在500μL pH 7.0硼酸缓冲液进行4℃过夜孵育。
第二天将磁珠放入磁力架中，弃硼酸缓冲液，并加入1mL 5％ AB血清进行4℃过夜孵育。
第三天将磁珠放入磁力架中，弃人AB血清，并加入24.78μg HPV16 E7 aa11～20在1mL PBS(pH 7.2)进行37℃过夜孵育。
第四天获得偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的自制磁珠。
(5)第12天，采用步骤(4)中自制磁珠对步骤(3)中培养后PBMC进行阳性筛选，具体步骤如下：
a：将步骤(4)中自制磁珠放入50mL离心管中，并放入磁力架中，静止3min，弃上清液；
b：从磁力架取出含有自制磁珠50mL离心管，并加入步骤(3)中培养后PBMC进行混匀；
c：将含有混悬液的50mL离心管再次放入磁力架中，静止3min，弃上清液，并加入20mL PBS(pH 7.2)清洗；
d：从磁力架取下50mL离心管，并采用含有30ng/mL CD3抗体、30ng/mL CD28抗体、30ng/mL IL-2、10ng/mL IL-7、10ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、10％人AB血清X-vivoTM 15对吸附靶向HPV16 E7抗原细胞的磁珠进行重悬，并置于二氧化碳培养箱培养，其密度为1×106cells/mL。
(6)第16天，对步骤(5)中培养物进行600g离心10min，弃除上清，收集细胞到50mL离心管，加入20mL pH 7.2PBS后放置在漩涡振荡器上，800rpm震荡5min，之后将离心管放入磁力架，静止3min，吸取细胞悬液到一个新50mL离心管，之后将新离心管放入磁力架，静止3min，吸取细胞悬液到另一个新50mL离心管，600g离心10min，弃除上清，并采用30ng/mLIL-2、10ng/mL IL-7、10ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、10％人AB血清X-vivoTM 15对细胞进行重悬，其密度为1×106cells/mL。操作前细胞克隆团形成情况见图6。
(7)第20天，对步骤(6)培养后细胞进行收获，其活率为99.96％，数量2.53×109cells。
采用HLA-A*0201HPV16 E7 aa11～20 Tetramer(购自北京博尔迈生物技术有限公司)和CD8抗体(购自北京博尔迈生物技术有限公司)对收获的细胞进行流式检测，靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞(HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20 Tetramer+CD8+)的占比为95.58％，具体见图7。
对比例
不加自制磁珠筛选、不同培养天数加磁珠筛选的实验效果对比数据。
采集HLA-A*0201阳性健康供者200mL外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离出PBMC，其活率为96.56％，数量为2.05×108cells。将PBMC分成等量4份，分别记为：未添加实施例1制备的磁珠组、第8天添加实施例1制备的磁珠组、第12天添加实施例1制备的磁珠组、第16天添加实施例1制备的磁珠组。培养21天后，比较各组HLA-A2/HPV16 E7 aa11～ 20Tetramer+CD8+细胞数量。该实验重复三次。
结果为：在未添加实施例1制备的磁珠组收获总细胞量为(2.44±0.56)×109cells，HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20Tetramer+CD8+为(32.73±0.36)％，该组HLA-A2/HPV16E7 aa11～20Tetramer+CD8+细胞数量为(0.80±0.43)×109cells。
第8天添加实施例1制备的磁珠组收获总细胞量为(1.65±0.54)×109cells，HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20Tetramer+CD8+为(95.78±0.32)％，该组HLA-A2/HPV16 E7 aa11～ 20Tetramer+CD8+细胞数量为(1.58±0.25)×109cells。
第12天添加实施例1制备的磁珠组收获总细胞量为(2.15±0.38)×109cells，HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20Tetramer+CD8+为(93.94±0.51)％，该组HLA-A2/HPV16 E7aa11～20Tetramer+CD8+细胞数量为(2.02±0.56)×109cells。
第16天添加实施例1制备的磁珠组收获总细胞量为(2.28±0.56)×108cells，HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20Tetramer+CD8+为(87.46±0.32)％，该组HLA-A2/HPV16 E7aa11～20Tetramer+CD8+细胞数量为(1.99±0.35)×109cells。
由此说明本发明制备自制磁珠，即偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠在第12天添加有利于提高HLA-A2/HPV16 E7 aa11～20Tetramer+CD8+细胞的数量，具体见图8。
效果例
以CaSki细胞系为靶细胞，分别以具体实施例1、2、3获得靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞为效应细胞，按10:1的效/靶比分别将效应细胞加入到靶细胞中，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和等体积含体积分数10％胎牛血清RPMI-1640培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。靶细胞数为1×104个，靶细胞接种6h后加入效应细胞，分别于37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养2、4、6h时向各孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵育1h±10min，用酶标仪于450nm波长下测定OD值。杀伤率由下式计算：杀伤率％＝[1-(效靶细胞作用孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100％。结果在效靶比为30:1的情况下，作用6h后，靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞对靶细胞的杀伤率均达到95％以上，具体见图9。说明本发明制备靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞具有较高的杀伤力。
本发明提供的制备靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞方法，可收获大量的靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T细胞，且能与HLA-A2/HPV16E7 aa11～20Tetramer结合CD8+阳性T细胞占比大于90％。发明人发现偶联负载HPV16 E7aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠在第12天添加有利于提高HLA-A2/HPV16 E7aa11～20Tetramer+CD8+细胞的数量。本发明制备的细胞可以强有力地杀伤CaSki细胞系，可用于治疗HPV16感染的HLA-A*0201阳性患者。本发明提供的靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CTL细胞制备方法，具有培养数量高、纯度高、杀伤力强等优势。
Claims (10)
1.一种靶向HPV16 E7的HLA-A*0201限制性CD8毒性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)第0天，分离HLA-A*0201阳性健康供者外周血单个核细胞(PBMC)，取部分PBMC细胞加入含有2～15μM HPV16 E7 aa11～20、体积分数5％人AB血清RPMI-1640培养基中刺激70～110min，取刺激后细胞与剩余2/3PBMC细胞混匀，加入到含有体积分数10％人AB血清X-vivoTM15培养基，细胞密度为(4～6)×106cells/mL；
HPV16 E7 aa11～20为HPV 16E7 HLA-A*0201限制性CTL表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为YMLDLQPETT；
(2)第4天，采用含有10～100ng/mL IL-2、体积分数10％人AB血清的X-vivoTM15培养基对细胞进行半量换液；
(3)第8天，采用含有10～100ng/mL IL-2、体积分数10％人AB血清的X-vivoTM15培养基对细胞全量换液，细胞密度为(2～3)×106cells/mL；
(4)第12天，采用偶联负HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠对培养后PBMC进行阳性筛选，并将筛选靶向HPV16 E7抗原细胞加入含有20～70ng/mL CD3抗体、20～70ng/mL CD28抗体、10～100ng ng/mL IL-2、5～50ng ng/mL IL-7、5～50ng/mL IL-15、5～50ng/mL IL-21、体积分数10％人AB血清的X-vivoTM15培养基进行培养，细胞密度为(0.8～1.2)×106cells/mL；
(5)第16天，离心收集细胞，去除磁珠，并采用10～100ng/mL IL-2、5～50ng/mL IL-7、5～50ng ng/mL IL-15、5～50ng ng/mL IL-21、体积分数10％人AB血清X-vivoTM15对细胞全量换液，细胞密度为(0.8～1.2)×106cells/mL；
(6)第20～21天，收获靶向HPV16 E7抗原的HLA-A*0201限制性CD8毒性T淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，外周血单个核细胞的活率≥95％，数量≥5×107cells。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，部分PBMC细胞为1/3PBMC细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入含有10μM HPV16 E7 aa11～20。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，刺激90min；
优选的，步骤(1)中，细胞密度为5×106cells/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，细胞密度为2.5×106cells/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠制备方法，包括如下步骤：
取1～15μg人类HLA-A2:Ig融合蛋白和(0.2～3)×108个DynabeadsTM M-450环氧树脂在250～750μL pH 7.0硼酸缓冲液进行4℃过夜孵育，第二天将磁珠放入磁力架中，弃硼酸缓冲液，并加入250～750μL体积分数5％AB血清进行4℃过夜孵育，第三天将磁珠放入磁力架中，弃人AB血清，并加入2.48～37.17μg HPV16 E7 aa11～20在0.8～1.2mL PBS pH 7.2进行37℃过夜孵育，第四天获得偶联负载HPV16 E7 aa11～20的HLA-A2:Ig的磁珠。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，细胞密度为1×106cells/mL。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，细胞密度为1×106cells/mL。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，细胞活率≥99％，数量≥1×109cells。
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