CN109679902A - 一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括收集外围血、cik免疫细胞分离、获取单个核细胞、配置诱导培养基和诱导扩增培养。本发明的有益效果是：步骤B中，离心操作为1500rpm离心五分钟，使cik免疫细胞能够彻底分离，提高分离率，激活培养基为添加了第一血浆、白介素‑2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且白介素‑2的浓度均为900IU/ml，扩增培养基为添加了白介素‑2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且沙培林的浓度均为0.01KE/ml，cik免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，步骤D中，所添加的胎牛血清胎牛血清体积浓度为15％，且还含有抗生素，能够提高cik免疫细胞扩增的效率，同时扩增后的cik免疫细胞具有较高的纯度。

Description

一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法
技术领域
本发明涉及一种诱导扩增方法，具体为一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，属于生物技术领域。
背景技术
CIK免疫细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller，CIK)，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞，尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，CIK免疫细胞扩增能力限制了其在临床上进一步的推广应用。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤
步骤A：收集外围血，筛选体检合格的供者，由医护人员使用注射器抽取适量血液，并保存备用；
步骤B：cik免疫细胞分离，将上述采集的外周血进行离心分离，除去上清，下层液体中加入PBS缓冲液，混匀后缓慢加入淋巴分离液，并再次离心，获得PBMC；
步骤C：获取单个核细胞，用巴斯德吸管将PBMC层吸出，在新的离心管中加入PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用PBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀后1000rpm离心6min，弃上清；
步骤D：配置诱导培养基，在基础培养基内添加胎牛血清组成混合液，并分别配置激活培养基与扩增培养基；
步骤E：诱导扩增培养，利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器，将单个核细胞置于包被后的培养容器中，并添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，以便得到初代诱导扩增的cik免疫细胞，再将初代诱导扩增的cik免疫细胞分置于多个包被后的培养容器中，再次添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，即可实现cik免疫细胞的体外诱导扩增。
优选的，为了使cik免疫细胞能够彻底分离，所述步骤B中，离心操作为1500rpm离心五分钟。
优选的，为了有利于cik免疫细胞的体外高效扩增培养，所述步骤D中，基础培养基为OpTmizer TMCTSTM无血清培养基或SuperCulture TML500人淋巴细胞无血清培养基。
优选的，为了使cik免疫细胞的诱导和增殖速度更快，且扩增效率高，所述步骤D中，激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且白介素-2的浓度均为900IU/ml，扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且沙培林的浓度均为0.01KE/ml。
优选的，为了能够提高cik免疫细胞扩增的效率，所述步骤D中，所添加的胎牛血清胎牛血清体积浓度为15％，且还含有抗生素。
本发明的有益效果是：该基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法设计合理，步骤B中，离心操作为1500rpm离心五分钟，使cik免疫细胞能够彻底分离，进而提高分离率，步骤D中，基础培养基为OpTmizer TMCTSTM无血清培养基或SuperCulture TML500人淋巴细胞无血清培养基，有利于cik免疫细胞的体外高效扩增培养，并且保持较高的功能活性，步骤D中，激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且白介素-2的浓度均为900IU/ml，扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且沙培林的浓度均为0.01KE/ml，cik免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，步骤D中，所添加的胎牛血清胎牛血清体积浓度为15％，且还含有抗生素，能够提高cik免疫细胞扩增的效率，同时扩增后的cik免疫细胞具有较高的纯度。
附图说明
图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤
步骤A：收集外围血，筛选体检合格的供者，由医护人员使用注射器抽取适量血液，并保存备用；
步骤B：cik免疫细胞分离，将上述采集的外周血进行离心分离，除去上清，下层液体中加入PBS缓冲液，混匀后缓慢加入淋巴分离液，并再次离心，获得PBMC；
步骤C：获取单个核细胞，用巴斯德吸管将PBMC层吸出，在新的离心管中加入PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用PBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀后1000rpm离心6min，弃上清；
步骤D：配置诱导培养基，在基础培养基内添加胎牛血清组成混合液，并分别配置激活培养基与扩增培养基；
步骤E：诱导扩增培养，利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器，将单个核细胞置于包被后的培养容器中，并添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，以便得到初代诱导扩增的cik免疫细胞，再将初代诱导扩增的cik免疫细胞分置于多个包被后的培养容器中，再次添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，即可实现cik免疫细胞的体外诱导扩增。
所述步骤B中，离心操作为1500rpm离心五分钟，使cik免疫细胞能够彻底分离，进而提高分离率，所述步骤D中，基础培养基为OpTmizer TMCTSTM无血清培养基或SuperCulture TML500人淋巴细胞无血清培养基，有利于cik免疫细胞的体外高效扩增培养，并且保持较高的功能活性，所述步骤D中，激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且白介素-2的浓度均为900IU/ml，扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且沙培林的浓度均为0.01KE/ml，cik免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，所述步骤D中，所添加的胎牛血清胎牛血清体积浓度为15％，且还含有抗生素，能够提高cik免疫细胞扩增的效率，同时扩增后的cik免疫细胞具有较高的纯度。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：包括以下步骤
步骤A：收集外围血，筛选体检合格的供者，由医护人员使用注射器抽取适量血液，并保存备用；
步骤B：cik免疫细胞分离，将上述采集的外周血进行离心分离，除去上清，下层液体中加入PBS缓冲液，混匀后缓慢加入淋巴分离液，并再次离心，获得PBMC；
步骤C：获取单个核细胞，用巴斯德吸管将PBMC层吸出，在新的离心管中加入PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用PBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀后1000rpm离心6min，弃上清；
步骤D：配置诱导培养基，在基础培养基内添加胎牛血清组成混合液，并分别配置激活培养基与扩增培养基；
步骤E：诱导扩增培养，利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器，将单个核细胞置于包被后的培养容器中，并添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，以便得到初代诱导扩增的cik免疫细胞，再将初代诱导扩增的cik免疫细胞分置于多个包被后的培养容器中，再次添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，即可实现cik免疫细胞的体外诱导扩增。
2.根据权利要求1所述的一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤B中，离心操作为1500rpm离心五分钟。
3. 根据权利要求1所述的一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤D中，基础培养基为OpTmizer TMCTSTM无血清培养基或SuperCulture TML500人淋巴细胞无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤D中，激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且白介素-2的浓度均为900IU/ml，扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且沙培林的浓度均为0.01KE/ml。
5.根据权利要求1所述的一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤D中，所添加的胎牛血清胎牛血清体积浓度为15％，且还含有抗生素。
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