CN108486053A - 一种高效体外扩增外周血nk细胞的方法 - Google Patents

一种高效体外扩增外周血nk细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞扩增培养技术领域，公开了一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括：1）用肝素钠对全血抗凝，用PBS稀释；2）将稀释后的抗凝全血平铺加到淋巴细胞分离液的液面上；3）离心，吸取白膜层，将其吹打混匀，离心，弃上清液，重复洗涤；4）去除CD3+淋巴细胞，对外周血单核细胞抗体染色，分选细胞；5）将CD3‑淋巴细胞稀释，加入IL‑2、IL‑15、IL‑21和IL‑7，进行扩增。本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大降低了细胞免疫原性，同时用4种特定细胞因子按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大幅提高了NK细胞在治疗中的安全性。

Description

一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞扩增培养技术领域，尤其涉及一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法。
背景技术
NK细胞又称为自然杀伤细胞，属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞的5％～15％，是重要的免疫细胞。科学家在1975年首次鉴定到了NK细胞，这类细胞能够在缺少T、B细胞的情况下直接杀伤肿瘤细胞。与具有细胞毒性的CD8+T细胞不同，NK细胞杀伤肿瘤细胞时不需要预先致敏可以直接杀伤MHC阴性的肿瘤细胞，这使得NK细胞在过继细胞免疫治疗中被广泛应用。
但由于NK细胞在人外周血中的含量极低及肿瘤组织中分布频率较低(＜10％)，仅占单个核细胞的5％-10％，极大地限制了NK细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。多年来，人们一直尝试能在体外实现NK细胞的大量扩增，目前体外扩增培养后仅可以使NK细胞扩增几倍或十几倍，纯度亦不理想，不能满足实际的应用。因此有必要开发出一种高扩增倍数以及高纯度的NK细胞体外扩增工艺，用于研究NK细胞的功能并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大地降低了细胞免疫原性，同时用4种特定的细胞因子(IL-2、IL-15、IL-21和IL-7)按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大大提高了NK细胞在治疗中的安全性。
本发明的具体技术方案为：一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)无菌状态下，取全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用PBS稀释抗凝全血。
2)另取淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰。
3)对步骤2)所得液体离心处理，吸取血浆层与分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用MACS吹打混匀，离心处理，弃上清液，再用MACS重复洗涤至少2次。
4)利用磁珠分选法去除CD3+淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3-beads抗体染色后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3-淋巴细胞。
5)用FBS/RPMI 1640将CD3-淋巴细胞稀释至浓度为1*104/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入10-50ng/mL的IL-2、10-50ng/mL的IL-15、10-50ng/mL的IL-21和10-50ng/mL的IL-7，进行扩增NK细胞。
本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大地降低了细胞免疫原性，同时用4种特定的细胞因子(IL-2、IL-15、IL-21和IL-7)按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大大提高了NK细胞在治疗中的安全性。
虽然IL-2、IL-15、IL-21和IL-7这四种细胞因子单独来看都是现有的物质，但是本发明人经过长期研究后发现，当上述四种物质以特定比例组合后，对于NK细胞的扩增能够起到特别好的技术效果，其原理为：IL-2可诱导NK细胞细胞因子分泌和上调NKG2D表面受体及自然杀伤受体(NCRs)，这些受体是NK细胞活化和细胞毒性的关键。IL-15可维持肿瘤细胞毒活性，以及增加自然杀伤受体(NCRs)和CD69的表达。IL-7促进NK细胞的存活和记忆的形成。IL-21可增强NK细胞的功能和生存。
作为优选，步骤1)中，所述全血和肝素钠的体积比是5000∶10，其中肝素钠的浓度为6250U/mL。
作为优选，步骤2)中，所述淋巴细胞分离液、抗凝全血和PBS体积比为1∶1∶1。
作为优选，步骤3)中，第一次离心处理的条件为：室温，用水平转子以1500-2500rpm的速率离心13-17min；第二次离心处理的条件为：室温，用水平转子以1500-2500rpm的速率离心3-7min。
作为优选，步骤3)中，吹打混匀和洗涤时，每次所述MACS的添加量与全血体积相同。
作为优选，步骤4)中，染色工艺参数为：在4℃下染色25-35min。
作为优选，步骤4)中，获得CD3-淋巴细胞后，用小鼠抗人CD56-PE抗体和小鼠抗人CD3-FITC抗体染色，用流式细胞仪检测，确保CD3+淋巴细胞比例小于3％后再进行扩增培养。
上述操作可以避免或极大降低细胞治疗中的免疫原性，去除或减少CD8+T细胞可减少T细胞介导的移植物抗宿主病的可能性。
作为优选，步骤5)中，所述FBS/RPMI 1640的浓度为18-22％。
作为优选，步骤5)中，所述IL-2、IL-15、IL-21和IL-7的浓度分别为10ng/mL，扩增培养天数为14-21天。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大地降低了细胞免疫原性，同时用4种特定的细胞因子(IL-2、IL-15、IL-21和IL-7)按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大大提高了NK细胞在治疗中的安全性。
附图说明
图1为分选前NK细胞和T细胞比例变化；
图2为扩增第10天NK细胞和T细胞比例变化；
图3为扩增第16天NK细胞和T细胞比例变化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)无菌状态下，取10mL全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用10mLPBS稀释抗凝全血，其中，所述全血和肝素钠的体积比是5000∶10，其中肝素钠的浓度为6250U/mL。
2)另取10mL淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰。
3)在室温下对步骤2)所得液体离心处理(用水平转子以1500-2500rpm的速率离心13-17min)，吸取血浆层与分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用10mL的MACS吹打混匀，室温下离心处理(用水平转子以1500-2500rpm的速率离心3-7min)，弃上清液，再用10mL的MACS重复洗涤至少2次。
4)利用磁珠分选法去除CD3+淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3-beads抗体在4℃下染色25-35min后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3-淋巴细胞。用小鼠抗人CD56-PE抗体和小鼠抗人CD3-FITC抗体染色，用流式细胞仪检测，确保CD3+淋巴细胞比例小于3％后再进行扩增培养。
5)用浓度为18-22％的FBS/RPMI 1640将CD3-淋巴细胞稀释至浓度为1*104/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入10-50ng/mL的IL-2、10-50ng/mL的IL-15、10-50ng/mL的IL-21和10-50ng/mL的IL-7，进行扩增NK细胞。
所述IL-2、IL-15、IL-21和IL-7的最佳浓度组合为5-20ng/ml，最终确定的扩增培养天数为14-21天。
实施例1
一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)无菌状态下，取10mL全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用10mLPBS稀释抗凝全血，其中，所述全血和肝素钠的体积比是5000∶10，其中肝素钠的浓度为6250U/mL。
2)另取10mL淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰。
3)在室温下对步骤2)所得液体离心处理(用水平转子以2000rpm的速率离心15min)，吸取血浆层与分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用10mL的MACS吹打混匀，室温下离心处理(用水平转子以2000rpm的速率离心5min)，弃上清液，再用10mL的MACS重复洗涤至少2次。
4)利用磁珠分选法去除CD3+淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3-beads抗体在4℃下染色30min后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3-淋巴细胞。用小鼠抗人CD56-PE抗体和小鼠抗人CD3-FITC抗体染色，用流式细胞仪检测，确保CD3+淋巴细胞比例小于3％后再进行扩增培养。
5)用浓度为20％的FBS/RPMI 1640将CD3-淋巴细胞稀释至浓度为1*104/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入10-50ng/mL的IL-2、10-50ng/mL的IL-15、10-50ng/mL的IL-21和10-50ng/mL的IL-7，进行扩增NK细胞16天。
实施例2
一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)无菌状态下，取10mL全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用10mLPBS稀释抗凝全血，其中，所述全血和肝素钠的体积比是5000：10，其中肝素钠的浓度为6250U/mL。
2)另取10mL淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰。
3)在室温下对步骤2)所得液体离心处理(用水平转子以2500rpm的速率离心13min)，吸取血浆层与分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用10mL的MACS吹打混匀，室温下离心处理(用水平转子以2500rpm的速率离心3min)，弃上清液，再用10mL的MACS重复洗涤至少2次。
4)利用磁珠分选法去除CD3+淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3-beads抗体在4℃下染色25min后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3-淋巴细胞。用小鼠抗人CD56-PE抗体和小鼠抗人CD3-FITC抗体染色，用流式细胞仪检测，确保CD3+淋巴细胞比例小于3％后再进行扩增培养。
5)用浓度为18％的FBS/RPMI 1640将CD3-淋巴细胞稀释至浓度为1*104/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入50ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21和50ng/mL的IL-7，进行扩增NK细胞14天。
实施例3
一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)无菌状态下，取10mL全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用10mLPBS稀释抗凝全血，其中，所述全血和肝素钠的体积比是5000：10，其中肝素钠的浓度为6250U/mL。
2)另取10mL淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰。
3)在室温下对步骤2)所得液体离心处理(用水平转子以1500rpm的速率离心17min)，吸取血浆层与分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用10mL的MACS吹打混匀，室温下离心处理(用水平转子以1500rpm的速率离心7min)，弃上清液，再用10mL的MACS重复洗涤至少2次。
4)利用磁珠分选法去除CD3+淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3-beads抗体在4℃下染色35min后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3-淋巴细胞。用小鼠抗人CD56-PE抗体和小鼠抗人CD3-FITC抗体染色，用流式细胞仪检测，确保CD3+淋巴细胞比例小于3％后再进行扩增培养。
5)用浓度为22％的FBS/RPMI 1640将CD3-淋巴细胞稀释至浓度为1*104/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入30ng/mL的IL-2、30ng/mL的IL-15、30ng/mL的IL-21和30ng/mL的IL-7，进行扩增NK细胞21天。
实验结果
实施例1的试验结果就如下：
1、第0天扩增前NK细胞
表1 NK细胞扩增前数量和比例
其中，分选前NK细胞和T细胞比例变化如图1所示。
2扩增第10天NK细胞数量变化
表2NK细胞扩增第10天数量和比例变化
其中，扩增第10天-NK细胞和T细胞比例变化如图2所示。
3扩增第16天NK细胞数量变化
表3NK细胞扩增第16天数量和比例变化
其中，扩增第16天-NK细胞和T细胞比例变化如图3所示。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）无菌状态下，取全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用PBS稀释抗凝全血；
2）另取淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰；
3）对步骤2）所得液体离心处理，吸取血浆层与淋巴细胞分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用MACS 吹打混匀，离心处理，弃上清液，再用MACS 重复洗涤至少2次；
4）利用磁珠分选法去除CD3阳性（CD3+）淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3-beads抗体染色后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3阴性（CD3-）淋巴细胞；
5）用FBS/RPMI 1640将CD3-淋巴细胞稀释至浓度为1*104/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入10-50 ng/mL的IL-2、10-50 ng/mL的IL-15、10-50 ng/mL的IL-21和 10-50 ng/mL的IL-7，进行扩增NK细胞。
2.如权利要求1所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤1）中，所述全血和肝素钠的体积比是5000:10，其中肝素钠的浓度为6250U/mL。
3.如权利要求1或2所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤2）中，所述淋巴细胞分离液、抗凝全血和PBS体积比为1:1:1。
4.如权利要求1所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤3）中，第一次离心处理的条件为：室温，用水平转子以1500-2500rpm的速率离心13-17min；第二次离心处理的条件为：室温，用水平转子以1500-2500rpm的速率离心3-7min。
5.如权利要求1或4所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤3）中，吹打混匀和洗涤时，每次所述MACS的添加量与全血体积相同。
6.如权利要求1所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤4）中，染色工艺参数为：在4℃下染色25-35min。
7.如权利要求1所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤4）中，获得CD3-淋巴细胞后，用小鼠抗人CD56-PE抗体和小鼠抗人CD3-FITC抗体染色，用流式细胞仪检测，确保CD3+淋巴细胞比例小于3%后再进行扩增培养。
8.如权利要求1所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤5）中，所述FBS/RPMI 1640的浓度为18-22%。
9.如权利要求1所述的一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于，步骤5）中，所述IL-2、IL-15、IL-21和 IL-7的浓度分别为10ng/mL，扩增培养天数为14-21天。
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