CN109294988B - 一种nk细胞诱导试剂盒 - Google Patents

一种nk细胞诱导试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109294988B
CN109294988B CN201811340078.2A CN201811340078A CN109294988B CN 109294988 B CN109294988 B CN 109294988B CN 201811340078 A CN201811340078 A CN 201811340078A CN 109294988 B CN109294988 B CN 109294988B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
induction kit
factor
kit
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811340078.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109294988A (zh
Inventor
李海峰
张莹莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
YOCON HENGYE BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.
Original Assignee
Yocon Hengye Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yocon Hengye Biotechnology Beijing Co ltd filed Critical Yocon Hengye Biotechnology Beijing Co ltd
Priority to CN201811340078.2A priority Critical patent/CN109294988B/zh
Publication of CN109294988A publication Critical patent/CN109294988A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109294988B publication Critical patent/CN109294988B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种NK诱导试剂盒，是由以下浓度的组分组成的，CD3因子:1～500ng/m L胸腺肽：1～150ng/m LIL‑7：1～300ng/m L IL‑15：1～300ng/m LIL‑21：1～300ng/m L IL‑2：200U～2000U/m L。本发明的NK诱导试剂盒，无滋养层细胞，为纯因子诱导试剂盒，安全性更高，同时本发明实例3诱导出的NK细胞高达90%以上，纯度更高，同时细胞数可以达到40亿以上，并支持脐带血，外周血、浓白，冻存PBMC等样本的培养，适应性更强。

Description

一种NK细胞诱导试剂盒
技术领域
本发明涉及生物、医学领域，具体是涉及一种NK细胞的无血清培养诱导试剂盒。
背景技术
肿瘤过继免疫治疗（adoptiveimmunotherapy，ACI）是指通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，前者是采用非特异性刺激因子（IL-2、干扰素）刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如NK、LAK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine induced killer cells，CIK）等；特异性激活的效应细胞是指采用肿瘤抗原作刺激物所诱导的抗肿瘤效应细胞，如树突状细胞（DC），细胞毒T淋巴细胞（CD8+细胞）等。ACI可通过体外扩增筛选出高活性的免疫效应细胞，将其转入宿主体内并建立长期的特异性抗肿瘤免疫效应，克服了疫苗免疫治疗的诸多缺陷，具有良好的应用前景。
NK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IL-7 IL-2 IL-12,TNF-a等)的作用下培养获得的一群以CD3-CD56+细胞，其既具有强大的抗肿瘤活性，又具有非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。NK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点。
传统对NK体外扩增的方法为从人外周血内提取单个核细胞，体外添加干扰素、CD3、介素2、IL-7进行诱导培养连续14天。传统方法细胞增殖慢、倍增时间长、细胞CD3-CD56+阳性率比例不稳定。并且由于采用含肿瘤滋养层细胞激活有伦理问题，同时临床不确定的危害都无法评估。并且由于滋养层细胞不稳定无法进行后期质量控制，无法在工业上大规模生产。因此亟需开发能克服上述缺陷的NK细胞诱导扩增试剂盒。
发明内容
针对上述现有的技术，本发明提供一种培养NK细胞的试剂，其特征在于使用此试剂盒培养。用本发明的试剂盒最终诱导的NK细胞总数在14天内可达到6×109，CD3-CD56+阳性率最低65%，最高可达到93%，细胞存活率大于95%。本发明的因子试剂盒还有稳定性好可质控的特点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种NK细胞诱导的试剂盒，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为ng/mL：
CD3因子: 1～500ng/m L；
胸腺肽：1～150ng/ m L；
IL-7： 1～300ng/m L；
IL-15：1～300ng/m L；
IL-21：1～300ng/m L；
IL-2： 200U～2000U/m ；L
余量为PBS。
以上所述因子均为临床应用，安全性更可靠。
附图说明
图1：NK细胞倍增曲线。
图2：NK细胞表型图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等,通过培养检测实例3可在细胞数及阳性率上得到最优结果。
实施例1 制备NK因子诱导试剂盒
各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为ng/mL：
CD3因子: 150ng/m L；
胸腺肽：10ng/ m L；
IL-7：200ng/m L；
IL-15：200ng/m L；
IL-21：200ng/m L；
IL-2： 500U/m L；
余量为PBS。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
实施例2 制备NK因子诱导试剂盒
各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为ng/mL：
CD3因子:300ng/m L；
胸腺肽：10ng/ m L；
IL-7：100ng/m L；
IL-15：100ng/m L；
IL-21：100ng/m L；
IL-2： 1000U/m L；
余量为PBS。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
实施例3 制备NK因子诱导试剂盒
各原料浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为ng/mL：
CD3因子:300ng/m L；
胸腺肽：10ng/ m L；
IL-7：300ng/m L；
IL-15：300ng/m L；
IL-21：300ng/m L；
IL-2：2000U/m L；
余量为PBS。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
实验 本发明的NK细胞诱导试剂盒性能的考察
利用本发明的NK细胞诱导试剂盒（实施例3）：
单个核细胞分离：患者外周血50ml，转入2支50ml离心管，1600rpm（400g）离心5min，吸取上层淡黄色血浆，转移至新的50ml离心管中，置于56℃灭活30min，2000 rpm（900g）离心10min，取上清分装后置于 4℃保存备用。
细胞的诱导和扩增：在上述分离的单个核细胞悬液中添加重组介素2终浓度为1000U/ml，然后移入T175培养瓶中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中，同时添加CD3因子，胸腺肽，培养72小时，之后，添加介素7，介素15，介素21，终浓度分别为100ng/ml，100U/ml和500U/ml。继续培养48小时后显微镜下细胞计数，然后用细胞培养液调节细胞密度为0.6-1×106/ml，分装到T175培养瓶中，进行扩大培养，此后，每隔48小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第14天时收集NK细胞待用。
结论：
连续培养14天，细胞数量达到45.2亿，CD3-CD56+阳性率为90.4%。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (4)

1.一种NK诱导试剂盒，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为：CD3因子：150～300ng/mL，胸腺肽：1～150ng/mL，IL-7：100～300ng/mL，IL-15：100～300ng/mL，IL-21：100～300ng/mL，IL-2：200U～2000U/mL。
2.根据权利要求1所述的NK诱导试剂盒，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为：CD3因子：150ng/mL，胸腺肽：10ng/mL，IL-7：200ng/mL，IL-15：200ng/mL，IL-21：200ng/mL，IL-2：500U/mL。
3.根据权利要求1所述的NK诱导试剂盒，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为：CD3因子：300ng/mL，胸腺肽：10ng/mL，IL-7：100ng/mL，IL-15：100ng/mL，IL-21：100ng/mL，IL-2：1000U/mL。
4.根据权利要求1所述的NK诱导试剂盒，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为：CD3因子：300ng/mL，胸腺肽：10ng/mL，IL-7：300ng/mL，IL-15：300ng/mL，IL-21：300ng/mL，IL-2：2000U/mL。
CN201811340078.2A 2018-11-12 2018-11-12 一种nk细胞诱导试剂盒 Active CN109294988B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811340078.2A CN109294988B (zh) 2018-11-12 2018-11-12 一种nk细胞诱导试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811340078.2A CN109294988B (zh) 2018-11-12 2018-11-12 一种nk细胞诱导试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109294988A CN109294988A (zh) 2019-02-01
CN109294988B true CN109294988B (zh) 2021-05-11

Family

ID=65145774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811340078.2A Active CN109294988B (zh) 2018-11-12 2018-11-12 一种nk细胞诱导试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109294988B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3163258A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Large-scale combined car transduction and crispr gene editing of nk cells
CN111690608A (zh) * 2020-06-19 2020-09-22 珠海贝索细胞科学技术有限公司 一种双抗体联合胸腺肽体外培养nk细胞试剂及试剂盒和培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484429A (zh) * 2013-09-28 2014-01-01 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 一种nk细胞的制备方法
CN107083361A (zh) * 2017-06-14 2017-08-22 深圳市泰华细胞工程有限公司 一种细胞培养方法
CN108300698A (zh) * 2017-07-27 2018-07-20 深圳市泰华细胞工程有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法与应用
CN108486053A (zh) * 2018-03-21 2018-09-04 浙江康佰裕生物科技有限公司 一种高效体外扩增外周血nk细胞的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484429A (zh) * 2013-09-28 2014-01-01 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 一种nk细胞的制备方法
CN107083361A (zh) * 2017-06-14 2017-08-22 深圳市泰华细胞工程有限公司 一种细胞培养方法
CN108300698A (zh) * 2017-07-27 2018-07-20 深圳市泰华细胞工程有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法与应用
CN108486053A (zh) * 2018-03-21 2018-09-04 浙江康佰裕生物科技有限公司 一种高效体外扩增外周血nk细胞的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clinical-grade, large-scale, feeder-free expansion of highly active human natural killer cells for adoptive immunotherapy using an automated bioreactor;Sutlu T等;《CYTOTHERAPY》;20101231;第12卷(第8期);第1044-1055页 *
IL-15与IL-21细胞因子组合优化临床级人NK细胞培养体系;陈伟等;《临床军医杂志》;20170131;第45卷(第1期);第64-68,72页 *
不同细胞因子组合对人自然杀伤细胞体外高纯度扩增的实验研究;刘新玲等;《国际免疫杂志》;20151130;第38卷(第6期);第501-506页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109294988A (zh) 2019-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5358683B2 (ja) ナチュラルキラー細胞の増殖方法
CN109294985B (zh) 一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法
CN104395461B (zh) 得到单核细胞或nk细胞的方法
JP2023153361A (ja) がん治療のためのナチュラルキラー細胞および組成物の製造方法
CN113046313A (zh) 用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物、试剂盒以及该免疫细胞的培养方法
CN109294988B (zh) 一种nk细胞诱导试剂盒
WO2009139413A1 (ja) サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法
EP1233058B1 (en) Method of proliferating natural killer cells
JP2024502012A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球を調製するための方法
KR20190111804A (ko) 자연살해세포의 제조방법
CN111286486A (zh) 体外大量扩增恶性肿瘤腹水浸润的淋巴细胞的方法
CN113293130B (zh) 一种肿瘤特异性t细胞的培养方法
TWI768357B (zh) 一種體外擴增及活化γδ-Ｔ細胞之方法
JP6782503B1 (ja) 癌治療用細胞組成物を製造する方法、それにより製造される癌治療用細胞組成物、及び癌治療用細胞組成物を用いた癌の治療方法
CN108004213B (zh) 一种cik细胞快速扩增的方法及试剂盒
CN105861484B (zh) 一种含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白的细胞培养基组合物
KR20190093499A (ko) 자연살해세포의 생산방법
CN114990061B (zh) 一种诱导扩增中央记忆性t细胞的培养方法
CN106754702B (zh) 细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法
CN114958740B (zh) 体外培养富集人nk细胞的方法
CN118165931A (zh) 一种工艺稳定且特异性杀伤功能增强的nk细胞制备方法及其应用
CN111849898A (zh) 一种环二肽用于体外高效扩增nk细胞的用途
CN117603911A (zh) 自然杀伤细胞的培养体系、培养试剂盒及培养方法
CN114134111A (zh) 一种免疫细胞活化剂及其制备方法和应用
CN117660333A (zh) 一种伽马代尔塔t细胞高效扩增方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200828

Address after: 304, 3rd floor, No.7, Fengxian Middle Road, Haidian District, Beijing 100094

Applicant after: YOCON HENGYE BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.

Address before: 100094, Beijing, Haidian District Feng Yin Zhong Road, No. 7, block B

Applicant before: Wang Xiaoke

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant