CN111849898A - 一种环二肽用于体外高效扩增nk细胞的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环二肽用于体外高效扩增NK细胞的用途。近年来，随着医学技术的发展，基于NK细胞的肿瘤过继性细胞免疫治疗应用越来越广泛。影响NK细胞临床应用的两个关键是如何体外获得大量NK细胞和如何获得高杀伤力的NK细胞。本发明研究发现，一种二肽环(D‑脯‑D‑苯丙)具有促进NK细胞体外增殖的活性，且环(D‑脯‑D‑苯丙)不会造成NK细胞含量降低，因而可以用于体外高效扩增NK细胞，可以用于制备体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液。现有技术没有公开过本发明技术方案。
Description
技术领域
本发明属于过继性细胞免疫治疗领域，涉及NK细胞的体外培养，具体涉及一种环二肽用于体外高效扩增NK细胞的用途。
背景技术
过继性细胞免疫治疗是将淋巴细胞经体外刺激培养后回输给肿瘤病人，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，进行肿瘤治疗的一种生物治疗方法。近年来，随着医学技术的发展，基于NK细胞的肿瘤过继性细胞免疫治疗应用越来越广泛。NK细胞主要分布在骨髓、外周血和脾脏，是占外周血淋巴细胞10～20％的天然免疫系统的主要效应细胞，主要参与机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的过程。NK细胞在免疫反应的早期能够分泌不同的细胞因子和各种趋化因子以调节机体获得性免疫应答，从而在天然免疫与获得性免疫之间起到了很好的桥梁作用。
NK细胞非特异性杀伤肿瘤细胞的主要机制为直接溶解和分泌细胞因子两方面。直接杀伤主要通过释放杀伤介质如穿孔素、颗粒酶或介导ADCC效应杀伤靶细胞。同时，活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，调节机体免疫反应以及靶细胞杀伤溶解的作用。
影响NK细胞临床应用的两个关键是如何体外获得大量NK细胞和如何获得高杀伤力的NK细胞。因此，NK细胞领域的很多研究力量都集中在这两方面。
本发明也是为了提高NK细胞的体外增殖率和/或杀伤力。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的不足，提供一种环二肽用于体外高效扩增NK细胞的用途。
技术方案如下：
一种环二肽用于体外高效扩增NK细胞的用途，所述环二肽为环(D-脯-D-苯丙)。具体实施例研究发现，环(D-脯-D-苯丙)可以显著促进NK细胞的增殖，且具有时间依赖效应和剂量依赖效应。另外，环(D-脯-D-苯丙)的干预也不会导致NK细胞含量明显下降。
一种环二肽用于制备体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液的用途，所述环二肽为环(D-脯-D-苯丙)。具体实施例研究发现，环(D-脯-D-苯丙)可以显著促进NK细胞的增殖，且具有时间依赖效应和剂量依赖效应。另外，环(D-脯-D-苯丙)的干预也不会导致NK细胞含量明显下降。因而环(D-脯-D-苯丙)可以用于制备体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液。
一种体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液，由基础培养基或培养液和环二肽添加剂组成，所述环二肽为环(D-脯-D-苯丙)。
进一步地，所述基础培养基或培养液可以为NK细胞培养基CellGro SCGM。
有益效果：
本发明研究发现，一种二肽环(D-脯-D-苯丙)具有促进NK细胞体外增殖的活性，且环(D-脯-D-苯丙)不会造成NK细胞含量降低，因而可以用于体外高效扩增NK细胞，可以用于制备体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液。
附图说明
图1为培养14d的NK细胞的流式鉴定图，从该图中可以看出，CD3-CD56+表型细胞(即NK细胞)的比例达到83.75％，NK细胞培养成功；
图2为培养24、48、72h药物组NK细胞增殖率，从该图中可以看出，药物组NK细胞的增殖活性显著优于对照组，且具有时间、剂量依赖效应。
具体实施方式
实施例1：
一、试验材料
淋巴细胞分离液购自Solarbio。
NK细胞培养基购自CellGro SCGM，胎牛血清购自Gibco。
CD3-PerCP-Cy5.5和CD56-FITC购自BD。
环(D-脯-D-苯丙)纯度不低于98％。
二、试验方法
1、NK细胞的培养和鉴定
按常规方法取健康献血者外周抗凝血100mL，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，再用含500U/mL rhIL-2的NK细胞培养基对单个核细胞重悬制成细胞密度为2×105/mL的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，每2～3d半量换液1次，并且在每次换液时调整细胞数量至5×104/mL，培养14d后，收集细胞。
流式鉴定：收集培养14d的细胞，PBS洗涤，按照常规的流式细胞检测法加入PerCP-Cy5.5标记的CD3和FITC标记的CD56抗体对细胞表面标志物进行检测。
2、NK细胞增殖活力测定
收集培养14d的细胞，PBS洗涤，用含5％胎牛血清的NK细胞培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔5000个细胞，24h后，药物组更换为含有5μM或10μM环(D-脯-D-苯丙)、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，对照组更换为含有等体积溶媒、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，在37℃、5％CO2条件下培养，继续培养24h、48h、72h后，每孔加入20μL的CCK8溶剂，继续培养4h，用酶标仪于450nm处测定各孔吸光值OD，按照公式计算药物组细胞增殖率(％)：
NK细胞增殖率(％)＝(药物组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100％。
3、NK细胞含量测定
收集培养14d的细胞，PBS洗涤，用含5％胎牛血清的NK细胞培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于24孔板中，24h后，药物组更换为含有5μM或10μM环(D-脯-D-苯丙)、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，对照组更换为含有等体积溶媒、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，在37℃、5％CO2条件下培养，继续培养72h后，PBS洗涤，按照常规的流式细胞检测法加入PerCP-Cy5.5标记的CD3和FITC标记的CD56抗体，检测CD3-CD56+表型细胞(即NK细胞)的含量。
4、统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件包处理数据，用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
三、试验结果
1、NK细胞的培养和鉴定
流式鉴定结果显示，培养14d后CD3-CD56+表型细胞的比例达到83.75％，如图1所示。而培养前CD3-CD56+表型细胞的比例仅为6.62％。这表明NK细胞已经被成功培养。
2、NK细胞增殖活力测定结果
各组OD值和药物组NK细胞增殖率结果如表1～3和图2所示，该结果表明，环(D-脯-D-苯丙)可以显著促进NK细胞的增殖，且具有时间依赖效应和剂量依赖效应。
表1培养24h各组OD值和药物组NK细胞增殖率
表2培养48h各组OD值和药物组NK细胞增殖率
表3培养72h各组OD值和药物组NK细胞增殖率
3、NK细胞含量测定
流式鉴定结果如表4所示，与对照组相比，药物组CD3-CD56+表型细胞的比例无显著差异，这说明环(D-脯-D-苯丙)不会导致NK细胞含量明显下降。
表4各组CD3-CD56+表型细胞的比例
上述试验说明，环(D-脯-D-苯丙)具有促进NK细胞体外增殖的活性，且环(D-脯-D-苯丙)不会造成NK细胞含量降低，因而可以用于体外高效扩增NK细胞，可以用于制备体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液。
实施例2：
一种体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液，由基础培养基或培养液和环二肽添加剂组成，所述环二肽为环(D-脯-D-苯丙)，所述基础培养基或培养液可以为NK细胞培养基CellGro SCGM或RPMI-1640培养液。
以上实施例旨在具体介绍本发明的实质性内容，但不应将本发明的保护范围局限于以上具体的实施例。
Claims (4)
1.一种环二肽用于体外高效扩增NK细胞的用途，所述环二肽为环(D-脯-D-苯丙)。
2.一种环二肽用于制备体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液的用途，其特征在于：所述环二肽为环(D-脯-D-苯丙)。
3.一种体外高效扩增NK细胞的培养基或培养液，其特征在于：由基础培养基或培养液和环二肽添加剂组成，所述环二肽为环(D-脯-D-苯丙)。
4.根据权利要求3所述的培养基或培养液，其特征在于：所述基础培养基或培养液可以为NK细胞培养基CellGro SCGM。
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