CN105861484B - 一种含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白的细胞培养基组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白的细胞培养基组合物,其中两者在培养体系中的浓度范围如下:白藜芦醇 1μM‑100μM;蚕丝丝胶蛋白 1μg/ml‐100μg/ml。本发明将白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白组合,添加到自然杀伤细胞培养体系中,意外的发现其可提高外周血单个核细胞(Peripheral blood monocyto,PBMC)来源的体外扩增的自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)的迁移活性和杀伤活性。
Description
技术领域:
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种培养自然杀伤细胞的培养基组合物,所述组合物中含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白。
背景技术
自然杀伤性细胞(Natural killer cell,NK)细胞是一种广泛存在于外周血,脾脏,淋巴结等组织和器官中,包浆内含有大颗粒成分的淋巴样细胞,是参与人体天然免疫反应和抗肿瘤免疫的主要效应细胞。NK细胞主要通过直接和间接两种方式发挥免疫活性。其中直接途径主要是NK细胞通过其表面的特异的活化性或者/和抑制性受体对体内的“自我”与“非我”细胞进行区分,识别后这些表面受体与靶细胞表面的相应分子进行特异性结合,进而NK细胞释放穿孔素,颗粒酶以及IL-2,IL-15,INF-γ等多种细胞因子对靶细胞进行杀伤和清除。间接方式又称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody DependentCell-mediated Cytotoxicity,ADCC)。该途径主要是通过NK细胞表面的CD16分子与IgG抗体的Fc段结合,进而可对该抗体俘获的靶细胞发挥杀伤作用,诱导已被抗体结合的靶细胞发生凋亡或者裂解。
随着近年来肿瘤免疫治疗技术突飞猛进的发展,NK已在免疫抗肿瘤临床应用中表现出越来越突出的优势和潜力。目前,临床上获得NK的方法主要是从病人或者健康供者外周血中分离PBMC,利用包括IL-2,IL-15,IL-21等 在内的多种细胞因子进行诱导,扩增,使NK细胞在体外扩增到一定数量后回输给患者,达到治疗的目的(专利)。但是,依然有诸多障碍阻碍了NK的临床应用:1)NK体外扩增效率低,增殖能力较弱;2)培养后的NK细胞纯度不高;3)NK细胞在体外培养过程中无法得到充分的刺激与活化,导致其进入体内后对肿瘤细胞的杀伤效率低下;4)NK细胞进入体内后由于缺乏归巢,趋化等细胞因子信号分子,无法有效的迁移至肿瘤病灶部位,发挥其杀伤活性。
白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种广泛存在于多种植物中的天然抗氧化物质,具有良好的抗氧化性,可预防血小板凝集,降低血液粘稠度,在临床上被广泛用于心脑血管疾病的治疗。近些年越来越多的研究还证明,RES具有良好的抗肿瘤和免疫调节作用。体内实验证明,RES可以增强免疫抑制小鼠体内巨噬细胞的清除能力,提高淋巴细胞转化率(高路等,《西安交通大学学报》2003,24:2);体外实验表明,RES可提高NK细胞对A549肺癌细胞株的杀伤活性(吕小婷等,《现代免疫学》2014,01)。
蚕丝丝胶蛋白(Silk Sericin,SS)是天然蚕丝中的主要成分之一,是一种包裹于在丝素外周的球状蛋白。丝胶蛋白是丝绸制造业中的主要副产物。由于丝胶蛋白的性状和化学成分与动物胶相似度极高,又具有一定的弹性和韧性,因此在再生医学,组织工程,化妆品制造领域具有很好的应用前景。而近些年大量的基础研究表明,丝胶蛋白除了具有物理支撑性以外,其还具有多种生物学活性,包括抗氧化(相入丽等,《丝绸》2008,45:5),促进细胞体外活性维持,粘附(Pornanong Aramwit et al.Int.J.Mol.Sci.2010,11;SatoshiTerada et al.Cytotechnology 2002,11:01), 提高细胞系冻存后复苏活率(MartinaVerdanova et al.BIOPRESERVATION AND BIOBANKING 2014,12:2)等方面表现出了极具希望的应用效果。
但将白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白组合,添加到自然杀伤细胞培养体系中对其进行扩增培养并进一步用于治疗的技术方案现有技术没有报道。
本发明将白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白组合,添加到自然杀伤细胞培养体系中,意外的发现其可提高外周血单个核细胞来源的体外扩增的自然杀伤细胞的迁移活性和杀伤活性。
发明内容
本发明提供一种含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白的细胞培养基组合物,所述组合物含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白,两者在组合物中的终浓度如下:
白藜芦醇 1μM-100μM
蚕丝丝胶蛋白 1μg/ml‐100μg/ml
优选的,两者在混合物中的终浓度如下:
白藜芦醇 1μM-50μM
蚕丝丝胶蛋白 1μg/ml‐50μg/ml
最优选的,两者在混合物中的终浓度如下:
白藜芦醇 5μM
蚕丝丝胶蛋白 20μg/ml
本发明所述的组合物,其中还含有培养细胞用的其他物质,其与白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白混合在一起构成本发明的细胞培养基组合物。
其中所述的培养细胞用的其他物质为任何一种细胞培养基,包括按照现有技术使用时现用现配的细胞培养基和市场上购买的可直接使用的细胞培养 基,这些细胞培养基可以用来培养任何细胞,包括植物细胞,动物细胞,真菌和细菌,人的组织细胞,肿瘤细胞,重组的细胞,优选的是培养NK细胞等人工制备的细胞的培养基,如SCGM培养基。
本发明进一步包括本发明所述的组合物的制备方法,所述方法包括将白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白与培养细胞用的其他物质混合的步骤。
本发明的制备方法,优选的是将白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白分别或一起配制成液体储备液,使用时,和培养细胞用的其他物质混合即可。
本发明的制备方法,最优选的是将白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白分别配制成液体储备液,冷冻保存,使用时,和培养细胞用的其他物质按照适当的比例混合即可。
本发明进一步提供一种体外NK细胞培养方法,所述方法包括使用本发明的组合物在体外培养NK细胞。
优选的,本发明的体外NK细胞培养方法,步骤如下:
分离PBMC,接种于含有本发明的组合物的培养体系中,使用OKT-3,和IL-2刺激细胞3-5天后;每2-3天补加IL-2,至培养结束,培养周为14-21天。其中PBMC细胞初始接种密度为1×106/ml-5×106/ml,优选的比例为1×106/ml。加入OKT-3的终浓度为1ng/ml-1000ng/ml,加入IL-2的终浓度为50IU/ml-3000IU/ml;几天后,补加IL-2的终浓度为50IU/ml-1000IU/ml。本发明意外的发现,使用本发明的培养方法可以提高NK细胞的体外扩增能力,提高细胞得率;可以增强NK细胞的活化性受体表达,提高NK细胞的杀伤能力;提高NK细胞趋化性受体的表达,提高NK细胞在体内的迁移能力。
本发明的有益效果包括:
1.提高了NK细胞的体外扩增能力;
2.提高了NK细胞在细胞终产品中的纯度;
3.提高了NK细胞表面活化性受体的表达水平,增强了NK细胞对靶细胞的杀伤能力;
4.提高了NK细胞表面趋化性受体的表达水平,增强了NK细胞在体内的归巢能力;
5、本发明发现,将将白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白联合用于NK细胞的体外扩增培养,具有协同增效作用,包括协同增加对靶细胞的杀伤等,其和单独使用白藜芦醇以及单独使用蚕丝丝胶蛋白相比,具有无法比拟的协同优势,产生了协同增效作用。
以下是对本发明中名称术语的解释:
白藜芦醇:又称为芪三酚,是多酚类化合物,主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物
蚕丝丝胶蛋白:由家蚕产丝过程中分泌的一种蛋白,是蚕丝的主要成份
SCGM培养基:用于NK细胞体外扩增活化的培养试剂
NK细胞:自然杀伤细胞
PBMC:外周血单个核细胞
OKT-3:小鼠来源的抗人CD3蛋白单链抗体
IL-2:白细胞介素-2
RES:白藜芦醇
SS:蚕丝丝胶蛋白
附图说明
图1.白藜芦醇和丝胶蛋白联用可以有效的刺激NK细胞体外的增殖
图2.白藜芦醇和丝胶蛋白提高了NK细胞亚群在总细胞中的比例
图3.白藜芦醇和丝胶蛋白组合物对NK细胞表面不同分子受体表达量的影响
图4.白藜芦醇和丝胶蛋白联用对NK效靶比杀伤活性检测
图5.白藜芦醇和丝胶蛋白联用时NK体外迁移能力的检测
图6.白藜芦醇和丝胶蛋白联用时NK在NOD/SCID小鼠体内的迁移及归巢能力评价
图7.白藜芦醇与丝胶蛋白联用可以增强NK细胞在体外对Treg抑制杀伤能力的抵抗作用
具体实施方式:
以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。
以下实施例中所述的丝胶蛋白即为本发明所述的蚕丝丝胶蛋白。
实施例1.
白藜芦醇和丝胶蛋白储存液的制备
将白藜芦醇粉末(购自Sigma公司,美国)溶解于细胞培养级DMSO中,配制成终浓度为5mM的储存液,溶液经0.22μm滤器过滤除菌,按照1ml/支进行分装,避光保存于-80度下。
蚕丝丝胶蛋白干粉(购自Wako公司,日本)溶解于pH7.4的PBS中,配制成10mg/ml的储存液,溶液经0.22μm滤器过滤除菌,分装为1ml/支,冻存于-80度保存。
使用时,将两种添加物的储存液取出并在室温下迅速融化;
按照以下比例和培养基混合
取白藜芦醇储存液2ml,丝胶蛋白储存液1ml,SCGM培养基97ml,
在室温下混合均匀,即得。所得培养基注意避光保存。
其中白藜芦醇在终产品中的浓度为100μM,丝胶蛋白的浓度为100μg/ml。
另外,根据实验需要,也可按照以下比例配制:
按照以下比例和培养基混合
取白藜芦醇储存液1ml,丝胶蛋白储存液0.5ml,SCGM培养基98.5ml,
在室温下混合均匀,即得。所得培养基注意避光保存。
其中白藜芦醇在终产品中的浓度为50μM,丝胶蛋白的浓度为50μg/ml。
也可按照以下比例配制:
按照以下比例和培养基混合
取白藜芦醇储存液100μl,丝胶蛋白储存液200μl,SCGM培养基100ml,
在室温下混合均匀,即得。所得培养基注意避光保存。
其中白藜芦醇在终产品中的浓度为5μM,丝胶蛋白的浓度为20μg/ml。
也可按照以下比例配制:
按照以下比例和培养基混合
取白藜芦醇储存液1ml,丝胶蛋白储存液0.5ml,X-VIVO10培养基98.5ml,在室温下混合均匀,即得。所得培养基注意避光保存。
其中白藜芦醇在终产品中的浓度为50μM,丝胶蛋白的浓度为50μg/ml。
也可按照以下比例配制:
按照以下比例和培养基混合
取白藜芦醇储存液100μl,丝胶蛋白储存液200μl,X-VIVO10培养基100ml,在室温下混合均匀,即得。所得培养基注意避光保存。
其中白藜芦醇在终产品中的浓度为5μM,丝胶蛋白的浓度为20μg/ml。
实施例2.白藜芦醇与丝胶蛋白联用对NK细胞体外培养增殖能力的评价采集健康人外周血30ml,按照文献报道的方法,使用人单个核细胞分离液(北京东方华辉生物医药科技有限公司,Cat.No.25610)进行PBMC的分离。分离后的PBMC利用台盼蓝拒染法进行计数,调整细胞数为0.5x106细胞/ml,用D-PBS重悬。
按照表1.中实验设计的分组方法,利用不同的培养配方进行NK细胞的体外培养,SCGM培养基购自CellGenix,人源化CD3单克隆抗体OKT-3购自Takara,重组人白细胞介素-2(IL-2)购自北京双鹭药业。
培养体系分别为,
空白SCGM培养基,
含有白藜芦醇的SCGM培养基其中白藜芦醇在培养体系中的浓度为5μM,含有丝胶蛋白的SCGM培养基,其中的丝胶蛋白浓度为20μg/ml。
含有白藜芦醇与丝胶蛋白的SCGM培养基,其中的白藜芦醇在培养体系中的浓度为5μM,丝胶蛋白浓度为20μg/ml。
在分离PBMC当天,将细胞接种于T25培养瓶中,使用OKT-3,10ng/ml和IL-2,500IU/ml刺激细胞;5天后,每3天根据细胞生长情况,向培养瓶中补加含有IL-2,500IU/ml的培养基,直至培养结束;不同实验组按照表1.的设计,在培养体系中分别添加空白SCGM培养基,白藜芦醇,丝胶蛋白 以及白藜芦醇和丝胶蛋白之混合,并使各组容积相同。各组起始培养细胞数为3x106,分别在培养中的第5,7,10,和14天取样进行细胞计数,根据计数结果绘制细胞增殖曲线。
同时在第14天收获细胞时,利用流式细胞分析技术检测NK细胞占总细胞的百分率,评价NK细胞的纯度。实验方法简述如下:根据细胞计数结果,按照每个样品106细胞数从四组收获的NK细胞中进行取样。细胞离心后,重悬于200μl细胞保存液中,检测NK细胞表面标志物,包括CD3,CD56和CD16,其中CD3-/CD56+,CD56+/CD16-,CD56+/CD16-是NK细胞的表面标志性分子。
实验结果图1.显示,与对照组相比,添加白藜芦醇或者添加丝胶可以促进NK细胞体外的增殖,但是与对照组相比,并没有显著性差异;而同时向培养体系中添加白藜芦醇和丝胶蛋白,可以显著的提高NK体外扩增的能力。通过流式细胞分析,检测四组培养体系获得的NK细胞其表面标志性分子,对其纯度进行分析表明,使用白藜芦醇和丝胶蛋白的培养组中,NK细胞占总细胞的百分率高于其他组。
表1.实验分组
其中RES为5μM,SS为20μg/ml,PBMC其实接种密度为2×106/ml
实施例3.白藜芦醇和丝胶蛋白对NK细胞表面不同分子受体表达水平的影响
在培养第14天,收集不同组的NK细胞,采用流式细胞分析技术对NK表面表达的具有代表性的活化性受体,抑制性受体,趋化性受体以及细胞因子受体进行了分析。操作过程简述如下:每个进行流式检测的样品中细胞数不少于106细胞。样品在室温下,350g离心10分钟,弃去培养基上清,用细胞保存液进行重悬,终体积为200μl。根据检测的分子加入不同的特异性抗体,检测的分子以及相应分子表达倍数变化的计算方法见下表2.。
表2.本实验涉及的NK细胞表面分子及分类
通过流式细胞分析的结果显示(图3.),培养体系中添加了白藜芦醇和丝胶蛋白后,与单独使用任何一种或者不适用任何一种添加物的培养方法相比,NK细胞表面的趋化性受体CCR7,CXCR3和CD62L的表达量和细胞因子受体IL-21R显著升高;抑制性受体包括KIR2DL1,KIR3DL1的表达量显著下降。此外,与其他实验组相比,活化性受体NKG2D,NKp30,NKp44和NKp46的表达量也发生上调。
实施例4.白藜芦醇和丝胶蛋白对NK细胞体外杀伤活性的影响
利用CFSE法测定不同实验组获得的NK体外靶细胞杀伤活性,使用靶细胞为人白血病细胞系K562。CFSE染色试剂盒购自Life Technology公司(货号:Cat.34554),碘化丙啶(PI)购自Sigma公司。K562细胞系购自中国协和医科大学基础医学研究所。实验分组与实施例2相同。
将靶细胞的密度均调整至6x104/ml,加入到U型底96孔培养板中,每孔100μl。收获四个实验组培养的NK细胞,按照试剂盒说明书对NK细胞进行标记,将标记后的细胞按照效靶比5:1,10:1,和20:1的比例与靶细胞等体积混合,设置3个平行对照空。同时设单独效应细胞和空白培养基作为对照空。混合后培养板在37℃,5%CO2条件下孵育4小时。孵育结束后,每孔加入25μl PI染液(100μg/μl),冰浴孵育5分钟后,用流式细胞仪进行分析,测定NK对靶细胞的杀伤能力。靶细胞的杀伤百分比的计算方式为: 细胞毒百分比=[实验组死亡的靶细胞-自然死亡的靶细胞/100–自然死亡的靶细胞]×100
实验结果显示(图4.),当效靶比为5:1时,四个培养体系的NK细胞对靶细胞的杀伤活性没有显著性差异;当效靶比提高到10:1和20:1时,白藜芦醇和丝胶蛋白联用组的NK的体外杀伤活性显著高于其他组。
实施例5.白藜芦醇和丝胶蛋白对NK体外迁移能力的影响
利用TransWell法检测了四种不同培养体系中获得的NK细胞在体外的迁移能力。TransWell培养系统(0.5μm孔径)购自BD Bioscience公司;AIM-V培养基购自LifeTechnology公司。参考文献Cancer Res 2008;68:(14)中报道的方法进行成熟DC的制备,并收集成熟DC细胞的培养上清,冻存于-80度。
分别从不同培养体系中收获NK细胞,并进行计数。将细胞重悬于AIM-V无血清培养基中,调整细胞数为5x105细胞/ml,同时使用未处理的PBMC作为对照。向TransWell培养体系下腔室加入500μl冻存的成熟DC培养上清,空白组加入500μl空白AIM-V培养基作为对照。四组来源不同的NK细胞,按照5x105细胞/孔接种于TransWell上腔内,接种体积为200μl。静止培养90分钟后,收集下腔室中的培养基。培养基样品加入CD56-PE和CD3-FITC抗体后,用流式细胞仪进行分析,检测发生迁移的NK细胞。
NK细胞迁移率=[实验组NK细胞数-PBMC组细胞数/对照组NK细胞数-PBMC组细胞数]x100%
实验结果表明,单独使用白藜芦醇或丝胶蛋白进行培养的NK,其体外迁移能力比对照组略强,但是没有显著性差异;而白藜芦醇和丝胶蛋白联用扩 增的NK细胞,其体外的迁移能力比对照组或者单独使用上述两种添加物培养获得的NK细胞显著提高。
实施例6.白藜芦醇和丝胶蛋白对NK细胞内体归巢能力的影响
利用NOD/SCID小鼠对四种不同培养体系中获得的NK细胞在体内的归巢能力进行评价及比较。NOD-SCID小鼠分为五组(表3.),每组10只,在注射NK细胞前,进行350RAD剂量辐照处理。将四种培养体系中培养14天的NK细胞收获,用细胞保存液(北京东方华辉生物医药科技有限公司,Cat.No.41611)进行重悬并计数。细胞通过尾静脉注射方式给予小鼠,注射的细胞数为2x107,阴性对照组给予等体积的生理盐水。
表3.动物实验分组
注射后4天,处死小鼠,分离骨髓和脾脏的总白细胞。总白细胞经计数后 调整细胞数为106细胞/ml。每份样品取5~10x106细胞,用偶联了抗人CD45,CD56的磁珠进行分选并计数,统计NK细胞向小鼠脾脏和骨髓中的归巢能力。实验分析数据显示(图6.),单独使用白藜芦醇或者丝胶蛋白进行NK培养时,NK细胞体内向骨髓和脾脏的归巢能力较对照组有所提高,但是与对照组相比差异部不显著;而当白藜芦醇与丝胶蛋白联用进行NK体外培养时,所获得的NK细胞在体内的归巢能力与其他实验组相比具有显著的提高。
实施例7.白藜芦醇和丝胶蛋白联用增强NK细胞对调节性T细胞(Treg)的抑制抵抗作用
采用体外共培养法检测使用本发明涉及培养体系获得的NK细胞与对照组培养体系获得的NK细胞在Treg存在下对靶细胞K562和实体瘤肿瘤细胞株非小细胞肺癌细胞H1299的杀伤能力(实验分组见表4.)。实验方法参考文献(Mark J.Smyth et alJ.Immunol.2006:176)大致如下:
使用anti-CD52-PE,anti-CD4-FITC,anti-TCRβ-APC单克隆抗体(均购自BDPharmingen公司)的磁珠,用FACSAria从健康志愿者外周血中分离调节性T细胞。分离后的细胞取样进行流式分析,检测细胞表面标志分子为TCRβ+/CD4+/CD52+细胞亚群,保证其纯度大于97%。收集活化的Treg细胞,用X-VIVO15无血清培养基重悬,并调整细胞数为105细胞/ml。
收集来自不同培养体系的NK细胞,350g离心10分钟,重悬于20ml含X-VIVO15无血清培养基中并进行计数,调整细胞数为105细胞/ml。将上述NK与Treg两种细胞以1:1进行混合,再与K562细胞系进行共培养,利用CFSE法检测效靶杀伤能力。
表4.实验分组
通过检测结果显示,使用本发明涉及的培养体系获得的NK与其他实验组使用的培养体系得到的NK相比,其可以显著的抵抗Treg对效靶杀伤的抑制作用;而对于其他培养体系获得的NK细胞而言,Treg的存在显著降低了其 对靶细胞的杀伤能力。(图7.)。
Claims (1)
1.一种体外NK细胞培养方法,其特征在于,在含有白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白的细胞培养基中培养,其中所述白藜芦醇和蚕丝丝胶蛋白在培养体系中的终浓度如下:
白藜芦醇 5μM
蚕丝丝胶蛋白 20μg/ml
所述培养方法,步骤如下:
分离PBMC,接种于上述培养体系中,使用OKT-3,和IL-2刺激细胞3-5天,之后每2-3天补加IL-2,总培养周期为14-21天,至培养结束,其中PBMC细胞的初始接种密度为1×106/ml-5×106/ml。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP3935942A1 (en) * | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg | Medium additive for reducing storage-associated death of leukocytes and stem cells |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102604885A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-07-25 | 董扬 | 丝胶蛋白替代血清的细胞培养基 |
CN105296422A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-02-03 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种nk细胞培养组合物及其培养方法 |
-
2016
- 2016-06-03 CN CN201610391352.3A patent/CN105861484B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102604885A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-07-25 | 董扬 | 丝胶蛋白替代血清的细胞培养基 |
CN105296422A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-02-03 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种nk细胞培养组合物及其培养方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
丝蛋白肽对小鼠免疫功能的影响;李加斌;《中国优秀硕士论文全文数据库 农业科技辑》;20140515;1.1、3.1-3.4部分 * |
白藜芦醇增强人NK细胞杀伤肺癌细胞株A-549的体外研究;吕小婷等;《现代免疫学》;20141231;摘要、第1.2-第3部分 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3935942A1 (en) * | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg | Medium additive for reducing storage-associated death of leukocytes and stem cells |
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