CN104711225B - Nk细胞的体外制备方法 - Google Patents
Nk细胞的体外制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104711225B CN104711225B CN201510165130.5A CN201510165130A CN104711225B CN 104711225 B CN104711225 B CN 104711225B CN 201510165130 A CN201510165130 A CN 201510165130A CN 104711225 B CN104711225 B CN 104711225B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- culture
- cells
- stem cell
- interleukin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 60
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 93
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 13
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 13
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 13
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 claims description 13
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 12
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 9
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 7
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 6
- 150000008540 L-glutamines Chemical class 0.000 claims description 5
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 4
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 claims description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 4
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims description 4
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical class OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylethanol Chemical class CC(O)S GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 2
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012364 Peperomia pellucida Nutrition 0.000 description 2
- 240000007711 Peperomia pellucida Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种适用于免疫治疗的NK细胞制备方法。具体提供了一种NK细胞的体外制备方法，所述的NK细胞由胚胎干细胞体外诱导分化形成，所述的制备方法包括以下几个方面：胚胎干细胞的扩增培养，胚胎干细胞诱导分化为造血干细胞，CD34+造血细胞的纯化、扩增，造血细胞诱导分化为NK细胞。本发明还提供了NK细胞体外制备的诱导培养体系。本发明的制备方法简单，所获得的NK细胞肿瘤靶细胞杀伤效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种NK细胞的体外制备方法，具体的说，涉及一种从胚胎干细胞诱导分化制备成NK细胞的方法。
背景技术
NK细胞（natural killer cells)又称自然杀伤细胞，是一类CD56+，CD3-的淋巴细胞，是机体内天然免疫系统的效应细胞，它无需抗原预先致敏即可识别肿瘤及病毒感染的细胞。它位于机体防御体系的第一道防线，同时它又能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫应答，故也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁，在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用。
现阶段临床上获得NK细胞疗法是采用体外培养的方法，把患者自身外周血中的NK细胞进行扩增，使细胞数目扩大数千倍且细胞毒活性极大增强，再回输患者的体内。取自患者自身的细胞首先限制了其产业化生产的可能性；另外由于外周血中NK细胞的含量低，仅占外周血淋巴细胞总数的5%-10%，细胞数量有限，且目前尚缺乏有效的高纯度的体外扩增体系，所以在很大程度上限制了 NK细胞的临床应用，这种传统的NK细胞制备方法并不是理想的选择。首先，它主要用于一对一的个体化治疗方法，只能在医院床边开展；第二，这种治疗方法自然杀伤性细胞诱导的时间太长，至少需要6周，对于晚期肿瘤病人，尤其是手术后放疗、化疗的病人，在细胞制备完成或细胞回输之前可能就已经去世；第三，一对一的治疗，即每一个人要做一全套细胞诱导扩增培养的过程，在实验室管理方面，室内质量控制很难，室间质量控制更难；第四，很多病人本身的NK细胞就是缺陷的，回输治疗效果有限。
目前虽然有大量的研究集中在寻找不同来源的CD34+细胞向NK细胞诱导分化的最佳体系，但是尚未有一种方法能够简便、高效地得到高纯度、高数量、杀伤能力强的NK细胞。
随着科研的发展和进步，利用干细胞诱导分化为NK细胞成为可能，是一个极具吸引力的选择，具有广阔的应用前景。胚胎干细胞就是其中的佼佼者，胚胎干细胞具有高度的未分化性以及很强的增殖能力，能够分化为人体组织的各种细胞。目前，人胚胎干细胞已被成功地分化为成熟和功能的子集的每一个胚层，包括细胞的造血系统。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题和不足，提供一种由胚胎干细胞诱导培养NK细胞的体外制备方法，以解决现有技术中NK细胞来源不足、疗效限制和难以产业化生产的问题，具有广阔的应用前景。
本发明同时提供了NK细胞的体外制备的诱导培养体系，简化纯化和鉴定细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种NK细胞的体外制备方法，具体包括以下步骤：
（1）胚胎干细胞的体外培养
采用无饲养层的胚胎干细胞培养体系，胚胎干细胞复苏后在明胶预处理过的培养皿中贴壁培养，培养2-3d后，消化液消化传代。
（2）诱导胚胎干细胞向造血细胞分化
采用基质细胞共培养与细胞因子诱导相结合的方法，胚胎干细胞用2mL分化培养液重悬后，接种于已经预先铺有OP9细胞的6孔板中，放入37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，并添加细胞因子Flt3配体（FL），白细胞介素-15（IL-15），白细胞介素-6（IL-6），白细胞介素-7(IL-7)，Kit配体（KL）。培养1天，胚胎干细胞形成悬浮的细胞集落，把这些细胞集落转移到超低吸附培养皿中，并添加上述细胞因子，2-3天后收集细胞。
（3）免疫磁珠分离纯化CD34+细胞
由于造血干细胞主要分布于CD34+细胞中，因此采用免疫磁珠法纯化CD34+造血干细胞，并用流式细胞仪检测所分离得到的CD34+细胞纯度。
（4）CD34+细胞的扩大培养
将纯化后的CD34+细胞以1.0×104cells/mL 密度接种无血清培养基中，置于37℃、5%CO2、95%饱和湿度的孵箱中静置培养，每7天半量换液。培养液中均含细胞因子：干细胞因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、红细胞生成素(EPO)和白细胞介素-6(IL-6)。培养2-3周收集细胞。
（5）CD34+细胞诱导分化NK细胞
CD34+细胞扩增至足够数量时，用无血清培养基重悬，并添加细胞因子组合①：干细胞因子(SCF)，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和Flt3配体（FL），37℃、5%CO2和95%湿度的培养箱培养，24小时后，将细胞转移至新的细胞培养瓶继续培养，添加细胞因子组合②：白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、单克隆抗体anti-CD3(anti-CD3)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-7(IL-7)，放置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养诱导NK细胞，每三天换液一次，并补充细胞因子组合②，诱导4周后流式检测CD3-CD56+NK细胞。
（6）NK细胞杀伤活性的测定。
进一步的，所述的步骤（1）胚胎干细胞的体外培养过程中采用无饲养层的DMEM培养体系，所述的胚胎干细胞的培养液组成是：DMEM培养基，加入20%KnockOut血清替代物、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/mL L-谷氨酰胺，1%的非必需氨基酸，1000U/mL的白细胞因子LIF，0.1mM MEM。
进一步的，所述的步骤（2）诱导胚胎干细胞向造血细胞分化中采用基质细胞共培养与细胞因子诱导相结合的方法，所用的胚胎干细胞分化培养液组成是：α-MEM培养基，体积分数10%KnockOut血清替代品，100μmol/L硫代甘油(MTG)；所用的诱导因子组合为：5ng/mL FL + 20ng/mL IL-15 + 20ng/mL IL-6 + 10 ng/mL IL-7 + 10ng/mL KL。本发明采用无血清造血干细胞的培养基，避免异源基因的污染。
进一步的，所述的步骤（4）为获得足够多的纯净的CD34+细胞，采用先免疫磁珠分离纯化CD34+细胞，后扩大培养CD34+细胞的方法，并且培养过程中采用无血清培养基：IMDM培养基，5×10-5Mβ-巯基乙醇、1%BSA、0.01mg/mL胰岛素、0.7mg/mL转铁蛋白、2×10-6M胆固醇、20mmol/100mL L-谷氨酰胺；扩增培养中所用的因子组合为50ng/mL SCF + 20ng/mLIL-3 + 4U/mL TPO + 3U/mL EPO + 20ng/mL IL-6。
进一步的，所述的步骤（5）CD34+细胞诱导分化NK细胞中采用细胞因子多次诱导的方法来获取足够的NK细胞，所用的细胞因子组合①为： 30ng/mL SCF + 30ng/mL GM-CSF +5ng/mL FL；所用的细胞因子组合②为：10ng/mL IL-2 + 20ng/mL IL-12 + 20ng/mL IL-15+ 10ng/mL anti-CD3 + 20ng IL-4 + 10ng/mL IL-7。
本发明的制备方法具备以下优点：
（1）解决NK细胞来源不足的问题，为NK细胞治疗提供了新的思路。
（2）采用无血清培养简化了纯化和鉴定细胞产物的程序，避免了病毒污染造成的危害。
（3）在胚胎干细胞定向造血细胞分化阶段，首创添加了诱导因子5ng/mL FL、20ng/mL IL-15、20ng/mL IL-6、10 ng/mL IL-7、10ng/mL KL，显著缩短了诱导培养时间，提高了造血细胞的活率。
（4）在造血细胞定向分化为NK细胞阶段创造性地进行了二次诱导，在接种阶段添加了诱导因子组合①：30ng/mL SCF、30ng/mL GM-CSF、5ng/mL FL，培养两天以后，添加诱导因子组合②：10ng/mL IL-2、20ng/mL IL -12、20ng/mL IL-15、10ng/mL anti-CD3、20ngIL-4、10ng/mL IL-7。经过该方法所获得的NK细胞活性高，能达到97%以上，且NK细胞的肿瘤杀伤效果显著。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是NK细胞的体外制备方法的技术方案实施流程图。
具体实施方法
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。参照图1：NK细胞的体外制备方法的技术方案实施流程图所示，本发明具体实施方式如下：
实施例 1 胚胎干细胞的体外培养：
1.将液氮中保存的胚胎干细胞与37℃水浴，快速溶化，细胞悬液由固态变为液态。
2.将上述细胞悬液接种于明胶预处理过的培养皿中，放置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，培养2-3d，细胞融合度达到85%-90%后，用消化液消化传代。
3.按照1:3-1:5传代到新的培养皿中，补足培养液继续培养。
4.每2-3d用消化液消化传代。
实施例 2 诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化
1.使用前1天将冻存的OP9细胞，以1.5×105 cells/mL细胞浓度接种到预铺有明胶的6孔培养板中。
2.第2天将胚胎干细胞离心，弃清液，用分化培养液重悬后，接种于已经预先有OP9细胞的6孔板中，放入37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，并添加细胞因子5ng/mL FL，20ng/mL IL-15，20ng/mL IL-6，10 ng/mL IL-7，10ng/mL KL。
3.培养1d将正在分化的ES转移到新的超低吸附培养皿中，并补加上述细胞因子。
4.培养2-3天后，离心收集细胞，加PBS液清洗细胞，离心（1500r/min，10min）后去上清液，再加PBS液重悬细胞，离心清洗3次；对清洗后细胞加入少量培养液后，制成细胞悬液，计数，备用。
实施例 3 免疫磁珠分离纯化CD34+细胞
1.将收集的细胞以1×108个单核细胞悬于300μl PBS缓冲液中，加入100μl Fc受体阻断剂，再向其中加入100μl抗CD34免疫磁珠，混匀，4℃孵育30min，然后用PBS缓冲液离心洗涤2次，每次以1000rpm的速度离心10min，500μl PBS缓冲液重新悬浮洗涤过的细胞密度为108个/500μl。
2.将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓慢通过MiniMACS分离柱，洗脱去除CD34-细胞，将分离柱移出磁场，用1mL缓冲液加压洗脱分离柱，收集CD34+细胞并计数。用流式细胞仪分析CD34+细胞纯度。结果表明该CD34+造血干细胞的纯度为96%以上。
实施例 4 CD34+细胞的扩大培养
将纯化后的富含CD34+细胞以1.0×104cells/mL 密度接种于24孔细胞培养板中，于 37℃、5%CO2、95%饱和湿度的孵箱中静置培养，每7天半量换液。采用无血清培养基并添加50ng/mL SCF、20ng/mL IL-3、4U/mL TPO、3U/mL EPO和20ng/mL IL-6，并添加双抗（青霉素100IU/L链霉素100mg/L）。培养2-3周收集细胞。
所用无血清培养基成分：IMDM 培养基，5×10-5Mβ-巯基乙醇、1%BSA、0.01mg/mL胰岛素、0.7mg/mL转铁蛋白、2×10-6M胆固醇、20mmol/100mL L-谷氨酰胺。
实施例 5 CD34+细胞诱导分化NK细胞
1.细胞接种：CD34+细胞扩增至足够数量时，用无血清培养基重悬，并添加细胞因子：30ng/mL SCF，30ng/mL GM-CSF，5ng/mL FL，37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养。
2.转移培养：接种后的细胞培养2天后，转移至细胞培养瓶继续培养，加入无血清培养基，并添加因子：10ng/mL IL-2、20ng/mL IL -12、20ng/mL IL-15、10ng/mL anti-CD3、20ng IL-4、10ng/mL IL-7，放置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养诱导NK细胞5天。
3.扩大培养：每三天换液一次，并补充营养因子。诱导4周后流式检测CD3-CD56+NK细胞。结果表明该CD3-CD56+NK细胞的纯度为97%以上。
实施例 6 NK细胞杀伤活性的测定
采用4h LDH 释放测定法，检测NK细胞对人白血病细胞K562的杀伤效果。
1.取传代细胞株K562细胞进行计数，制成1×105cells/mL细胞悬液，加入96孔板，每孔50μl。
2.将培养的NK细胞分别按照效：靶为1:1、10:1、20:1、40:1加入96孔板中，同时设效应细胞和靶细胞自然释放孔，培养基自然释放孔，靶细胞最大释放孔，体积矫正对照，每孔体积100μl，均设3个复孔，250g离心4min，置于37℃，5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中孵育4h。
3.在反应结束前45min靶细胞最大释放孔每孔加入10μl裂解液。反应结束后，每孔吸取50μl上清和50μl LDH酶反应液置于另一新的96孔板，室温避光反应30min，加入反应终止液50μl，酶标仪测其OD值。
4.计算自然杀伤活性。公式为：自然杀伤活性%=（测定管OD值-靶细胞自然释放管OD值-效应细胞自然释放管OD值）/（靶细胞最大释放管OD值-靶细胞自然释放管OD值）×100%。
表1：不同效靶比的细胞杀伤率比较
* 与1∶1 比较P ＜ 0.05。
实验结果：如表1所示，本发明方法所制备的各个效靶比均能杀伤靶细胞，且随着效靶比的升高NK 细胞对靶细胞的杀伤活性随之升高，在效靶比为40:1时可达到90%以上。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种NK细胞的体外制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）胚胎干细胞的体外培养：采用无饲养层的胚胎干细胞培养体系，胚胎干细胞复苏后在明胶预处理过的培养皿中贴壁培养，培养2-3d后，消化液消化传代；
步骤2）诱导胚胎干细胞向造血细胞分化：胚胎干细胞用2mL分化培养液重悬后，接种于已经预先铺有OP9细胞的6孔板中，放入37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，并添加细胞因子Flt3配体（FL）、 白细胞介素-15（IL-15）、 白细胞介素-6（IL-6）、 白细胞介素-7（IL-7）、 Kit配体（KL）；培养1天，胚胎干细胞形成悬浮的细胞集落，把这些细胞集落转移到超低吸附培养皿中，并添加上述细胞因子，2-3天后收集细胞；
步骤3）免疫磁珠分离纯化CD34+细胞：采用免疫磁珠法纯化CD34+细胞，并用流式细胞仪检测所分离得到的CD34+细胞的纯度；
步骤4）CD34+细胞的扩大培养：将纯化后的CD34+细胞以1.0×104cells/mL密度接种无血清培养基中，置于37℃、5%CO2、95%饱和湿度的孵箱中静置培养，每7天半量换液；培养液中均含细胞因子：干细胞因子（SCF）、白细胞介素-3（IL-3）、血小板生成素（TPO）、红细胞生成素（EPO）和白细胞介素-6（IL-6）；培养2-3周收集细胞；
步骤5）CD34+细胞诱导分化NK细胞：CD34+细胞扩增至足够数量时，用无血清培养基重悬，并添加细胞因子组合①：干细胞因子（SCF）、 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和Flt3配体（FL），37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养，24小时后，将细胞转移至新的细胞培养瓶继续培养，添加细胞因子组合②：白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-15（IL-15）、单克隆抗体 anti-CD3（anti-CD3）、白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-7（IL-7），放置于37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱培养诱导NK细胞，每三天换液一次，并补充细胞因子组合②，诱导4周后流式检测CD3-CD56+NK细胞；
步骤6）NK细胞杀伤活性的测定。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的NK细胞是由胚胎干细胞在体外定向诱导分化，并采用无血清诱导培养体系制备。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤1）胚胎干细胞的体外培养采用无饲养层的DMEM培养体系，所述的胚胎干细胞的培养体系组成是：DMEM培养基、 加入20%KnockOut血清替代物、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/mL L-谷氨酰胺、 1%的非必需氨基酸、 1000U/mL的白细胞因子LIF、 0.1mM MEM。
4.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中诱导胚胎干细胞向造血细胞分化所用的胚胎干细胞分化培养体系组成是：α-MEM培养基、 体积分数10% KnockOut血清替代品、 100μmol/L硫代甘油（MTG）；所用的诱导因子组合为：5ng/mLFL+20ng/mL IL-15+20ng/mL IL-6 +10ng/mL IL-7+10ng/mL KL。
5.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤4）中CD34+细胞的扩大培养采用的无血清培养体系为：IMDM培养基、 5×10-5Mβ-巯基乙醇、1%BSA、0.01mg/mL胰岛素、0.7mg/mL转铁蛋白、2×10-6M胆固醇、20mmol/100mL L-谷氨酰胺；扩增培养中所用的因子组合为50ng/mL SCF+20ng/m L IL-3+4U/mL TPO+3U/mL EPO +20ng/mLIL-6。
6.根据权利要求1所述的NK细胞的体外制备方法，其特征在于，所述的步骤5）中CD34+细胞诱导分化NK细胞采用步骤4）的无血清培养体系，添加的细胞因子组合①具体为：30ng/mLSCF +30ng/mL GM-CSF+5ng/mL FL；细胞因子组合②具体为：10ng/mL IL-2+20ng/mL IL-12+20ng/mL IL-15+10ng/mL anti-CD3 +20ng/mL IL-4+10ng/mL IL-7。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510165130.5A CN104711225B (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | Nk细胞的体外制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510165130.5A CN104711225B (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | Nk细胞的体外制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104711225A CN104711225A (zh) | 2015-06-17 |
| CN104711225B true CN104711225B (zh) | 2018-05-22 |
Family
ID=53410944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510165130.5A Expired - Fee Related CN104711225B (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | Nk细胞的体外制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104711225B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021015615A1 (en) * | 2019-07-22 | 2021-01-28 | Glycostem Therapeutics B.V. | Low density cell culture |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105441390A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-03-30 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | Nk细胞的体外三维扩增培养方法 |
| CN107779433A (zh) * | 2016-08-30 | 2018-03-09 | 天津市康婷生物工程有限公司 | 便捷的刺激nk细胞增殖和分化的饲养层制备方法 |
| CN106434556B (zh) * | 2016-11-22 | 2019-10-11 | 上海新长安生物科技有限公司 | 一种体外诱导扩增i型nkt细胞的方法 |
| CN107418931A (zh) * | 2017-08-17 | 2017-12-01 | 重庆斯德姆生物技术有限公司 | 一种提高活率的细胞培养液 |
| CN114507641B (zh) * | 2022-04-20 | 2022-07-12 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 一种由人胚胎干细胞诱导分化为nk细胞的方法 |
| CN115896019B (zh) * | 2023-02-23 | 2023-05-26 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 一种诱导性多能干细胞诱导分化为nk细胞的方法 |
| CN117305241B (zh) * | 2023-11-28 | 2024-03-19 | 上海兴瑞一达生物科技有限公司 | 一种hiPSCs诱导分化为NK细胞的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102822332A (zh) * | 2009-12-04 | 2012-12-12 | 干细胞及再生医学国际股份有限公司 | 从源于人胚胎干细胞的成血管细胞产生自然杀伤细胞和树突细胞的方法 |
| CN103937743A (zh) * | 2014-04-27 | 2014-07-23 | 浙江大学 | 一种利用三维诱导系统获得造血干细胞的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8034613B2 (en) * | 2005-06-01 | 2011-10-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Multipotent lymphohematopoietic progenitor cells |
| EP2788475A1 (en) * | 2011-12-05 | 2014-10-15 | Primorigen Biosciences Inc. | Compositions and methods for differentiating pluripotent stem cells into primitive blood cells and uses thereof |
-
2015
- 2015-04-09 CN CN201510165130.5A patent/CN104711225B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102822332A (zh) * | 2009-12-04 | 2012-12-12 | 干细胞及再生医学国际股份有限公司 | 从源于人胚胎干细胞的成血管细胞产生自然杀伤细胞和树突细胞的方法 |
| CN103937743A (zh) * | 2014-04-27 | 2014-07-23 | 浙江大学 | 一种利用三维诱导系统获得造血干细胞的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| High Log-Scale Expansion of Functional Human Natural Killer Cells from Umbilical Cord Blood CD34-positive Cells for Adoptive Cancer Immunotherapy;Jan Spanholtz et.al.;《PLoS one》;20100228;第5卷(第2期);摘要、 Figure1 * |
| Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells:efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential;Maxim A et.al.;《BLOOD》;20050115;第105卷(第2期);摘要，第617页右栏第4段第103行，第618页左栏第3段第8-13行、第6段第1-7行、右栏第2段1-8行 * |
| 自然杀伤细胞分离、培养方法的建立;朱向情等;《中华细胞与干细胞杂志》;20121130;第2卷(第4期);第269-273页 * |
| 自然杀伤细胞在造血干细胞移植中的应用;常英军等;《中华血液杂志》;20030831;第24卷(第8期);第443-44页 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021015615A1 (en) * | 2019-07-22 | 2021-01-28 | Glycostem Therapeutics B.V. | Low density cell culture |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104711225A (zh) | 2015-06-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104711225B (zh) | Nk细胞的体外制备方法 | |
| CN105087487B (zh) | 一种高效扩增cik的方法 | |
| CN103756963A (zh) | 一种体外扩增nk细胞的方法 | |
| CN105349489B (zh) | 一种cik细胞的培养方法 | |
| JP7549355B2 (ja) | 間葉系間質細胞を拡大するための方法 | |
| KR101948534B1 (ko) | 세포밀도 조절을 이용한 자연살해세포의 대량증식방법 | |
| JPWO2013118899A1 (ja) | 単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法 | |
| CN104845934B (zh) | 脐血cd34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法 | |
| CN102268405A (zh) | 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基 | |
| EP3000876B1 (en) | Method for preparing nk cells | |
| CN105713879A (zh) | 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用 | |
| CN111690610A (zh) | 一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法 | |
| JP2022050596A (ja) | Ｔ細胞又はｎｋ細胞の製造方法、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養用培地、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養方法、未分化ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びｔ細胞又はｎｋ細胞の増殖促進剤 | |
| CN101314764A (zh) | 一种体外扩增自然杀伤细胞的方法 | |
| CN104498434A (zh) | 一种大量树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞 | |
| CN102643784A (zh) | 一种造血干/祖细胞的体外扩增体系 | |
| CN107502590A (zh) | 一种人类脐带血造血干细胞高效扩增nk细胞的方法 | |
| CN112608896A (zh) | 一种nk细胞的培养方法及其应用 | |
| CN110607276A (zh) | 高效扩增脐带血nk细胞的无血清培养方法 | |
| CN109486758A (zh) | 一种外周血nk细胞体外高效扩增试剂及操作说明 | |
| CN106754704A (zh) | 免疫细胞体外诱导扩增的方法 | |
| CN109370988A (zh) | 干细胞体外扩增培养体系及其方法 | |
| CN107864627A (zh) | 包含粘附基质细胞的方法和组合物 | |
| CN113881629A (zh) | 一种体外高效扩增nk细胞的培养基及培养方法 | |
| CN104109653A (zh) | 利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血dnt细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180522 |