CN105349489B - 一种cik细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种CIK细胞的培养方法。本发明所述培养方法将B细胞用含有Flt3因子和IL‑2的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激B细胞；将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞共培养，并补加含IL‑2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含IL‑2的免疫细胞培养基。本发明选择B淋巴细胞替代传统的DC作为和CIK细胞共培养的细胞，通过B细胞和CIK细胞之间的相互作用促进CIK细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了DC体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化，相比现有方法更加具有优势。

Description

一种CIK细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种CIK细胞的培养方法。

背景技术

CIK细胞(cytokine induced killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)是一种新型的免疫活性细胞，它是自体外周血单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类CD3+和CD56+两种膜蛋白分子共同表达的杀伤细胞。CIK细胞具有抗肿瘤活性和非MHC杀瘤特性，是一种具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等特点的效应细胞。

树突状细胞(Dendritic cells，DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞(Antigenpresenting cell,APC),是唯一能够刺激初始T淋巴细胞成熟的APC，能够将抗原递呈给CD8+T淋巴细胞，从而发挥T淋巴细胞的杀伤作用。

由于肿瘤是低免疫原性的疾病，故机体中的初始T细胞不能有效的识别和杀伤肿瘤细胞，即肿瘤抗原不被DC递呈就不能有效识别和诱导出抗肿瘤免疫。DC可递呈丰富的肿瘤抗原肽占据相应的T细胞受体，并通过分泌协同刺激分子、趋化因子，激活、聚集和增强T细胞，产生对肿瘤细胞具有特异性作用的细胞毒性T细胞，诱导免疫应答，杀掉肿瘤细胞；同时分泌大量的白细胞介素-12(IL-12)增强杀伤肿瘤细胞的作用。

CIK细胞和DC共培养能显著增加树突状细胞和共刺激分子递呈抗原的特异性。此外，两者共培养还能促进树突状细胞IL-12的分泌和CIK细胞的毒性，而IL-12摄取阻断则会减弱CIK细胞的细胞毒性。因此，将CIK细胞和DC联合起来治疗恶性肿瘤，有助于解决部分肿瘤患者的T细胞的免疫无能，从而发挥协同抗肿瘤作用。基于这些优点，现有技术常常将DC和CIK细胞共培养，以其增强CIK细胞的细胞毒性，杀伤肿瘤细胞。例如专利CN104357394A公开了一种自体外周血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，专利CN103642754A公开了一种高毒性、高增殖能力的人D-CIK细胞的制备方法，专利CN104450616A公开了一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法。

DC细胞虽然可以促进CIK细胞的增殖及杀伤活性，但是DC细胞必须经过体外的扩增培养，且扩增的效果还不是很理想，扩增能力较差。且DC细胞的扩增体系需用到多种细胞因子，甚至有的现有方法还加入了某些单抗，造成了DC和CIK细胞共培养方法的复杂程度和成本。

更为重要的一点，现有的方法所培养的CIK细胞杀伤活性、效应细胞比例(CD3+CD56+)普遍不高，同时分泌IL-2、IFN-γ细胞因子的能力也不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CIK细胞的培养方法，使得所述方法更加简便有效，无需进行体外扩增培养和添加多种细胞因子和单抗，同时保证CIK细胞的增殖及杀伤活性较高，成本较低。

本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的培养方法，使得所述方法显著提高培养出的CIK细胞中的效应细胞(CD3+CD56+)数量。

本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的培养方法，使得所述方法显著提高诱导培养出的CIK细胞的杀伤活性。

本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法提高培养出的CIK细胞分泌IL-2、IFN-γ的能力。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种CIK细胞的培养方法，包括：

步骤1、将B细胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激B细胞；

步骤2、将CIK细胞和步骤1的经过肿瘤抗原刺激后的B细胞共培养，并补加含IL-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含IL-2的免疫细胞培养基。

本发明针对现有DC和CIK细胞共培养的缺点，选择B淋巴细胞替代DC和CIK细胞进行共培养。B淋巴细胞，即骨髓依赖性淋巴细胞，亦可简称B细胞，是体内唯一可以产生抗体的细胞。在外周血中占淋巴细胞总数的10％-15％。在抗原的刺激下，B淋巴细胞被激活、增殖，产生抗体，介导特异性体液免疫应答；同时，B淋巴细胞还具有免疫调节的功能，它可以通过分泌细胞因子参与调节巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞以及T细胞的功能。另外活化的B淋巴细胞还具有加工和提呈抗原的作用。

本发明中B细胞从单个核细胞分选出后无须像DC那样进行体外扩增培养，也不需要添加很多种的细胞因子和单抗，仅需加培养基重悬后用肿瘤抗原刺激即可以和CIK细胞共培养，降低了培养方法的复杂程度以及成本，同时保证了CIK细胞增殖及杀伤活性不低于DC和CIK细胞共培养的效果。

其中，本发明所采用B细胞可以通过现有任何常规方法收集获得，本发明提供由单个核细胞通过CD19分选试剂盒分选出的优选方案，所述CD19分选试剂盒为市售产品，是用来将B淋巴细胞从外周血或脐血的单个核细胞中分选出来的一类产品，可购自于STEM CELL公司。同时，对于CIK细胞的诱导培养也可采用常规方法，本发明提供CIK细胞由单个核细胞诱导培养获得的优选方法，作为进一步的优选：

将单个核细胞用X-VIVO 15培养基重悬，按照1×10⁶-2×10⁶/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入500-1500U/mL IFN-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细胞；

第2天补加50-150U/mL的IL-1α、10-50ng/ml的OKT-3以及100-1000U/ml的IL-2溶液继续培养，整个CIK细胞的诱导培养过程为14天。其中，所述IFN-λ浓度在本发明的一些具体实施方式中可以选择为500、1000或1500U/mL IFN-λ，而IL-1α可以选择为50、100或150U/mL，OKT-3可以选择为10、30或50ng/ml，IL-2可以选择为100、550或1000U/ml。

在上述获得B细胞和CIK细胞的方案中，单个核细胞的分离可参照本领域已有的分离方法，本发明提供优选地的方案：

外周血离心收集下层血细胞加生理盐水稀释，加入淋巴分离液后离心，弃上层液体，加水生理盐水洗涤，再次离心后去上清，获得单个核细胞。

作为优选，步骤1为：

将B细胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫细胞培养基重悬并在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中维持培养1天，然后加入肿瘤抗原刺激B细胞36-48h。

作为更优选地，步骤1所述Flt3因子的浓度为10-20ng/ml，IL-2的浓度为10-50U/ml。在本发明的一些具体实施方式中，所述Flt3因子的浓度可以为10、15或20ng/ml，而IL-2的浓度可以为10、20、30、40或50U/ml。

作为优选，步骤2所述CIK细胞和B细胞的体积比为10:1；

作为优选，步骤2所述共培养为在在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中共培养14天；

作为优选，步骤2所述共培养中CIK细胞密度为1×10⁶/ml；

作为优选，步骤2所述IL-2浓度为100-1000U/ml；在本发明的一些具体实施方式中，所述IL-2浓度可以为100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000U/ml。

作为优选，所述免疫细胞培养基为X-VIVO 15培养基。

按照本发明所述培养方法培养的CIK细胞经流式细胞仪检测其表面的抗原标志物，如CD3和CD56。CD3+CD56+为CIK细胞中的效应细胞，CIK细胞是一群异质的细胞群，其CD3+CD56+双阳性表达的细胞越多，其杀伤活性会更好。结果显示，本发明CIK细胞中CD3+CD56+效应细胞比例为29.6％，而现有技术方法的比例为16.6％。

此外，对K562细胞的杀伤性检测结果显示，本发明所培养的CIK细胞杀伤活性为显著高于现有技术方法培养的CIK细胞。同时在CIK细胞分泌IL-2、IFN-γ的能力方面也有提高。

基于上述试验结果，本发明提供了B细胞在培养CIK细胞中的应用。

由以上技术方案可知，本发明选择B淋巴细胞替代传统的DC作为和CIK细胞共培养的细胞，通过B细胞和CIK细胞之间的相互作用促进CIK细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了DC体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化，相比现有方法更加具有优势。

附图说明

图1所示为CIK细胞的流式检测结果，其中A表示现有技术方法的CIK细胞流式检测结果，B表示本发明所述方法的流式检测结果；

图2所示为IFN-γ标准品的吸光度值；

图3所示为IL-2标准品的吸光度值。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种CIK细胞的培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种CIK细胞的培养方法进行详细说明。

实施例1：本发明所述培养方法

1、单个核细胞(PBMC)的分离：

将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；

另取一支新的sepmate离心管(购自STEM CELL公司)，加入Ficoll淋巴细胞分离液(购自STEM CELL公司)12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离心管，600-800g离心15-20min；

离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；

离心，去上清，即得到PBMC。

2、B淋巴细胞的分选、维持和刺激

用CD19分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将B淋巴细胞从上述单个核细胞分选出来；

用含有15ng/ml的Flt3因子和30U/ml的IL-2的X-VIVO 15培养基重悬细胞，将B淋巴细胞培在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中维持培养1天；

第2天加入肿瘤抗原刺激B淋巴细胞36-48小时。

3、CIK细胞的诱导培养

将分选后的单个核细胞用X-VIVO 15培养基重悬，按照1×10⁶-2×10⁶/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入1000U/mL IFN-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细胞；

第2天补加100U/mL的IL-1α、30ng/ml的OKT-3以及550U/ml的IL-2溶液继续培养；

4、B淋巴细胞和CIK细胞的共培养

将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞按照10:1的共培养比例在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中共培养，并补加含600U/ml的IL-2的X-VIVO 15培养基共培养14天，其中CIK细胞密度为1×10⁶/ml，定期在导致倒置显微镜下观察细胞的状态，每隔1-2天补充含IL-2的X-VIVO 15培养基。

实施例2：现有技术共培养方法

1、单个核细胞(PBMC)的分离：

将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；

另取一支新的离心管，加入Ficoll淋巴细胞分离液12ml，将稀释后的血细胞转移到离心管，600-800g离心15-20min；

离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；

离心，去上清，即得到PBMC。

2、DC细胞的培养

将PBMC按照1×10⁶/ml接种到细胞培养瓶中进行培养1-4小时；

将悬浮细胞吸出到一个新的培养瓶中，剩余的贴壁细胞加入X VIVO15培养基，以及100-1000U/ml的GM-CSF和100-1000U/ml的IL-4溶液诱导培养成DC细胞；

每隔2天补液一次和补加100-1000U/ml的GM-CSF和100-1000U/ml的IL-4溶液；

第6天加入肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激DC细胞的成熟。

3、CIK细胞的诱导培养

将悬浮细胞用X-VIVO 15培养基重悬，按照1×10⁶-2×10⁶/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入500-1500U/mL IFN-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细胞；

第2天补加50-150U/mL的IL-1α、10-50ng/ml的OKT-3以及100-1000U/ml的IL-2溶液继续培养；

4、DC细胞和CIK细胞的共培养

第7天将DC细胞和CIK细胞在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱共培养，并补加含100-1000U/ml的IL-2溶液的X-VIVO 15培养基；

定期在导致倒置显微镜下观察细胞的状态，每隔1-2天对细胞进行补液；两者细胞共培养14天。

实施例3：本发明所述培养方法

1、单个核细胞(PBMC)的分离：

将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；

另取一支新的sepmate离心管(购自STEM CELL公司)，加入Ficoll淋巴细胞分离液(购自STEM CELL公司)12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离心管，600-800g离心15-20min；

离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；

离心，去上清，即得到PBMC。

2、B淋巴细胞的分选、维持和刺激

用CD19分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将B淋巴细胞从上述单个核细胞分选出来；

用含有10ng/ml的Flt3因子和50U/ml的IL-2的X-VIVO 15培养基重悬细胞，将B淋巴细胞培在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中维持培养1天；

第2天加入肿瘤抗原刺激B淋巴细胞36-48小时。

3、CIK细胞的诱导培养

将分选后的单个核细胞用X-VIVO 15培养基重悬，按照1×10⁶-2×10⁶/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入500U/mL IFN-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细胞；

第2天补加150U/mL的IL-1α、10ng/ml的OKT-3以及1000U/ml的IL-2溶液继续培养；

4、B淋巴细胞和CIK细胞的共培养

将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞按照10:1的共培养比例在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中共培养，并补加含1000U/ml的IL-2的X-VIVO 15培养基共培养14天，其中共培养CIK细胞密度为1×10⁶/ml，定期在导致倒置显微镜下观察细胞的状态，每隔1-2天补充含IL-2的X-VIVO 15培养基。

实施例4：本发明所述培养方法

1、单个核细胞(PBMC)的分离：

将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；

另取一支新的sepmate离心管(购自STEM CELL公司)，加入Ficoll淋巴细胞分离液(购自STEM CELL公司)12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离心管，600-800g离心15-20min；

离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；

离心，去上清，即得到PBMC。

2、B淋巴细胞的分选、维持和刺激

用CD19分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将B淋巴细胞从上述单个核细胞分选出来；

用含有20ng/ml的Flt3因子和10U/ml的IL-2的X-VIVO 15培养基重悬细胞，将B淋巴细胞培在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中维持培养1天；

第2天加入肿瘤抗原刺激B淋巴细胞36-48小时。

3、CIK细胞的诱导培养

将分选后的单个核细胞用X-VIVO 15培养基重悬，按照1×10⁶-2×10⁶/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入1500U/mL IFN-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细胞；

第2天补加50U/mL的IL-1α、50ng/ml的OKT-3以及100U/ml的IL-2溶液继续培养；

4、B淋巴细胞和CIK细胞的共培养

将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞按照10:1的共培养比例在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中共培养，并补加含100U/ml的IL-2的X-VIVO 15培养基共培养14天，其中共培养CIK细胞密度为1×10⁶/ml，定期在导致倒置显微镜下观察细胞的状态，每隔1-2天补充含IL-2的X-VIVO 15培养基。

实施例5：CIK细胞的流式检测(检测CD3+CD56+)

本发明共培养方法：实施例1；

现有技术共培养方法：同实施例2；

流式检测步骤：

从共培养后的细胞中取1×10⁶个CIK细胞，250g离心5min去上清；用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；避光加入CD3、CD56抗体2.5μL室温孵育30min；用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；用500mL RPMI 1640培养基重悬细胞并过滤，然后滤液上流式细胞仪进行检测。结果见图1。

由图1可知，本发明所述方法中效应细胞(CD3+CD56+)的比例为29.6％，现有技术中效应细胞的比例为16.6％，明显较低。此外，将实施例3和实施例4进行相同的流式检测，结果依然显示CIK效应细胞CD3+CD56+的比例显著高于现有技术共培养方法。

实施例6：CIK细胞杀伤活性检测

现有技术共培养方法：同实施例2；

杀伤活性检测步骤：

本实施例中使用的细胞裂解液为9％Triton X-100，购自PROMEGA；底物液为Sunstrate Mix，购自PROMEGA；终止液为1Macetic acid。

1)铺板时各实验孔和对照设置如下：

实验孔：按效靶比40:1、20:1和10:1进行靶细胞(K562)和效应细胞(CIK细胞)的铺板。其中，CIK细胞的浓度分别为4×10⁶/mL，2×10⁶/mL，1×10⁶/mL，每孔100μL，每组3个复孔；K562浓度为1×10⁵/mL，每孔100μL，每组3个复孔。

效应细胞自然释放孔：4×10⁶/mL，2×10⁶/mL，1×10⁶/mL，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。

靶细胞最大释放孔：1×10⁵/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。

靶细胞自然释放孔：1×10⁵/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。

培养液空白对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔。

体积纠正对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。

2)铺板后将培养板250g离心4min，置于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育4h。在培养结束前45min，取出培养板，在靶细胞最大释放组和体积纠正组每孔加入20μL细胞裂解液，250g离心4min，继续培养45min后取出。

3)进行LDH(乳酸脱氢酶)测定，具体步骤如下：250g离心4min，每孔吸出50μL上清转移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μL，室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测定490波长处的吸光度值。

4)试验组、靶细胞LDH自然释放组和效应细胞LDH自然释放组的吸光度均值减去培养液空白对照组吸光度值均值，获得校正值。靶细胞LDH最大释放组的吸光度均值减去体积纠正组吸光度值均值，获得校正值。

杀伤活性按如下公式计算：

活性＝(A-E-T)/(Tmax-T)×100％

A:试验组吸光度值校正值；

E:效应细胞自然释放孔吸光度值校正值；

T：靶细胞自然释放孔吸光度值校正值；

Tmax：靶细胞最大释放组吸光度值校正值。

结果见表1。

表1 CIK细胞对K562细胞的杀伤活性检测

组别	40:1	20:1	10:1
				实施例1	65.4％	34.5％	12.9％
实施例2	46.3％	18.9％	2.02％
				实施例3	59.6％	35.2％	10.89％
实施例4	66.5％	38.9％	6.8％

由表1可知，在杀伤K562时，本发明方法诱导的CIK细胞比现有方法诱导的CIK细胞的杀伤效果更好，差异较明显。

实施例7：CIK细胞分泌的细胞因子含量的检测(ELASA法定量检测IFN-γ和IL-2含量)

本发明共培养方法：实施例1；

现有技术共培养方法：同实施例2；

细胞因子含量检测步骤：

将CIK细胞培养后的细胞培养液收集起来进行浓缩，为实验品；分别将IFN-γ和IL-2标准品溶解，分别设置了5个浓度，分别是10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml、40μg/ml及50μg/ml；从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；

留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10℃～35℃下避光放置；

分别将实验品或不同浓度的标准品(0μg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔中，100μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min，洗板4次：

除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育60min，洗板4次；

除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育30min，洗板4次；

加入显色底物，100μl/孔，于37℃孵箱避光孵育15min；加入终止液，100μl/孔，混匀后检测其吸光度值(OD₄₅₀值)。

标准品吸光度值曲线分别参见图2和图3，实施例1和实施例2中细胞培养液所测IFN-γ的OD₄₅₀值分别为1.22和1.02，根据IFN-γ标准品的吸光度值曲线，可知IFN-γ标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先线性曲线为：Y＝0.047X+0.29，根据曲线图，从而可计算出本发明和现有技术的中的TGF-β的含量分别为19.78μg/ml和15.53μg/ml。

实施例1和实施例2中细胞培养液所测IL-2的OD₄₅₀值分别为1.386和1.054，根据IL-2标准品的吸光度值曲线，可知IL-10标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先线性曲线为：Y＝0.11X+0.8，根据曲线图，从而可计算出本发明和现有技术的中的IL-2的含量分别为11.31μg/ml和8.426μg/ml。

此外，将实施例3-实施例4的细胞培养液进行同样的检测，结果显示，IFN-γ含量均高于18μg/ml，IL-2的含量均高于10μg/ml。表明本发明方法诱导出的CIK细胞分泌IFN-γ的能力和分泌IL-2的能力更高。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括：

步骤1、将B细胞用含有Flt3因子和IL-2的X-VIVO 15培养基重悬并在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中维持培养1天，然后加入肿瘤抗原刺激B细胞36-48h，所述Flt3因子的浓度为10-20ng/ml，IL-2的浓度为10-50U/ml；

步骤2、将CIK细胞和步骤1的经过肿瘤抗原刺激后的B细胞共培养，并补加含IL-2的X-VIVO 15培养基共培养，定期补充含IL-2的X-VIVO 15培养基。

2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述B细胞由单个核细胞通过CD19分选试剂盒分选出。

3.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述CIK细胞由单个核细胞诱导培养获得。

4.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，将单个核细胞用X-VIVO 15培养基重悬，按照1×10⁶-2×10⁶/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入500-1500U/mL IFN-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细胞；

第2天补加50-150U/mL的IL-1α、10-50ng/ml的OKT-3以及100-1000U/ml的IL-2溶液继续培养，整个CIK细胞的诱导培养过程为14天。

5.根据权利要求2-4任意一项所述培养方法，其特征在于，所述单个核细胞通过以下方法获得：

外周血离心收集下层血细胞加生理盐水稀释，加入淋巴分离液后离心，弃上层液体，加生理盐水洗涤，再次离心后去上清，获得单个核细胞。

6.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述CIK细胞和B细胞的体积比为10:1。

7.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述共培养为在5％的二氧化碳浓度，95％的湿度的37℃培养箱中共培养14天。

8.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述共培养中CIK细胞的密度为1×10⁶/ml。

9.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述IL-2浓度为100-1000U/ml。