CN105331581B - 一种cik细胞的诱导培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种CIK细胞的诱导培养方法。所述方法用抗CD8抗体包被细胞培养容器；将单个核细胞接种在包被好的容器中，并添加IFN‑λ细胞因子于39℃下进行细胞培养；培养后去掉培养基并再次加入新鲜的培养基重悬，并转移至新的容器中，添加IFN‑λ、IL‑1α、OKT‑3以及IL‑2细胞因子诱导培养CIK细胞，定期补充新鲜培养基和IL‑2细胞因子。本发明增加单个核细胞在抗CD8抗体中培养的环节，并调整诱导培养环节中细胞因子的加入，从多个方面整体控制诱导培养的过程，抑制了CD4+CD25+调节性T细胞的产生，降低了其数量进而降低了其免疫抑制作用，使CIK细胞治疗发挥最大的免疫作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种CIK细胞的诱导培养方法。
背景技术
CIK细胞(cytokine induced killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)是一种新型的免疫活性细胞，它是自体外周血单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类CD3+和CD56+两种膜蛋白分子共同表达的杀伤细胞。CIK细胞具有抗肿瘤活性和非MHC杀瘤特性，是一种具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等特点的效应细胞。
现有诱导培养CIK细胞的方法一般为从外周血分离得到的单个核细胞(PBMC)在白介素-2(IL-2)等细胞因子的作用下在37℃、5％二氧化碳的条件下直接诱导成CIK细胞。但是这种方法诱导培养的CIK细胞中含有数量较多的CD4+CD25+调节性T细胞。
1995年Sakaguchi发现成年鼠中近10％的外周CD4+T细胞表达IL-2受体α链CD25。去除这群细胞会引起小鼠自发产生多种自身免疫性疾病而回输该细胞则阻止疾病的发生。因此将这群细胞命名为CD4+CD25+调节性T细胞Treg。
调节性T细胞(Treg)是抑制性T细胞的一种功能亚群，天然的Treg细胞于1995年由Sakafguchi等首次报道，他们约占外周血CD4+T细胞数的5％-10％左右。
调节性Treg细胞分为两类：天然Treg细胞和获得性Treg细胞，目前认为天然Treg细胞来自于胸腺，主要通过细胞接触抑制发挥抑制功能；获得性Treg细胞是外周血成熟T细胞在持续抗原的刺激和细胞因子条件下诱导产生，主要通过TGF-β、IL-10等可溶性细胞因子发挥作用。
近年来，许多学者对Treg细胞在肿瘤免疫方面大量的研究证实，肝癌、肺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌、急慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌等患者外周血或肿瘤局部Treg细胞成分显著增加。在对结直肠癌的研究中发现进展期癌较早期癌患者外周血调节性T细胞显著增加。在对肝癌的研究中发现，肝癌组织较旁组织Treg细胞明显增加，这些分布方式说明，在肿瘤组织中的Treg由于与效应细胞T淋巴细胞的紧密接触，抑制效应细胞的功能，从而发挥肿瘤免疫作用。因此，为了使免疫细胞治疗，如CIK细胞治疗，发挥最大的免疫作用，故寻求一种降低CD4+CD25+调节性T细胞数量的CIK诱导培养方法非常必要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法能够显著降低CIK细胞中CD4+CD25+调节性T细胞数量。
本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法显著提高诱导培养出的CIK细胞中的效应细胞数量。
本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法显著提高诱导培养出的CIK细胞的杀伤活性。
本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法提高诱导培养出的CIK细胞分泌TGF-β和IL-10的能力。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种CIK细胞的诱导培养方法，包括：
步骤1、用抗CD8抗体包被细胞培养容器；
步骤2、将单个核细胞用免疫细胞培养基重悬并接种在步骤1包被好的容器中，添加IFN-λ细胞因子于39℃下进行细胞培养；
步骤3、培养后去掉培养基并再次加入新鲜的免疫细胞培养基重悬，并转移至新的容器中，添加IFN-λ、IL-1α、OKT-3以及IL-2细胞因子诱导培养CIK细胞，定期补充新鲜培养基和IL-2细胞因子。
针对现有CIK细胞诱导培养方法诱导的细胞中CD4+CD25+调节性T细胞数量较高、效应细胞较少、杀伤活性不高以及分泌TGF-β和IL-10能力不高的一系列问题，本发明在前期将单个核细胞培养在抗CD8抗体包被的容器中，并添加适当的细胞因子和提高细胞培养温度，而后期培养添加多种适宜细胞因子进行CIK细胞的诱导培养，才能够多个措施入手降低CD4+CD25+调节性T细胞数量。
其中，作为优选，所述单个核细胞采用Ficoll分离液运用sepmate离心管从外周血分离获得。除此之外，本领域技术人员也可参照已公开的单个核细胞分离方法。
作为优选，步骤2所述IFN-λ细胞因子的浓度为500-1500U/mL，具体可以选择500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500U/mL。
作为优选，所述免疫细胞培养基为X-VIVO 15培养基。
作为优选，所述单个核细胞接种以5×105-10×105个/ml的细胞密度接种。
作为优选，步骤3所述各细胞因子浓度为500-1500U/mL IFN-λ、50-150U/mL的IL-1α、10-50ng/ml的OKT-3以及100-1000U/ml的IL-2。其中，IFN-λ具体可以选择500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500U/mL；IL-1α具体可以选择50、75、100、125或150U/mL；OKT-3具体可以选择10、20、30、40或50ng/ml；IL-2具体可以选择100、200、300、400、500、550、600、700、800、900或1000U/ml。
作为优选，步骤3所述诱导培养细胞为在37℃、5％二氧化碳的环境中培养14天。
作为优选，步骤2所述培养为在39℃、5％二氧化碳的环境中培养12-24h。
作为优选，所述细胞培养容器为细胞培养瓶，例如T75细胞培养瓶等。
按照本发明方法诱导培养的CIK细胞其CD4+CD25+调节性T细胞数量为3.6％，而现有的诱导培养方法中CD4+CD25+调节性T细胞数量为6.7％，明显得到降低，从而降低了CIK细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制作用。同时，本发明诱导的CIK细胞中效应细胞数量为34.3％，而现有的诱导培养方法中效应细胞的数量为20.8％，显著提高效应细胞的数量。
此外，本发明还对所诱导的CIK细胞进行了杀伤活性检测以及TGF-β和IL-10含量检测，虽然本发明改变了诱导培养方法，但是CIK细胞的杀伤活性和分泌TGF-β和IL-10含量并未受到影响，且高于现有的CIK细胞的诱导培养方法。
由以上技术方案可知，本发明增加单个核细胞在抗CD8抗体中培养的环节，并调整诱导培养环节中细胞因子的加入，从多个方面整体控制诱导培养的过程，抑制了CD4+CD25+调节性T细胞的产生，降低了其数量进而降低了其免疫抑制作用，使CIK细胞治疗发挥最大的免疫作用。
附图说明
图1所示本发明所述方法诱导培养14天后CIK细胞的镜检图；
图2所示为CIK细胞效应细胞以及CD4+CD25+调节性T细胞的流式检测结果；其中A为本发明诱导的CIK细胞CD4+CD25+调节性T细胞的流式检测图，B为现有方法诱导的CIK细胞CD4+CD25+调节性T细胞的流式检测图，C为本发明诱导的CIK细胞效应细胞的流式检测图，D为现有方法诱导的CIK细胞效应细胞的流式检测图；
图3所示为TGF-β标准品的吸光度值曲线；
图4所示为IL-10标准品的吸光度值曲线。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种CIK细胞的诱导培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种CIK细胞的诱导培养方法进行详细说明。
实施例1：本发明所述诱导培养方法
用抗CD8的抗体包被T75细胞培养瓶2-3小时；
采集20ml血液，采用Ficoll分离液运用sepmate离心管(购自STEM CELL公司)分离外周血单个核细胞(PBMC)；
将PBMC用X-VIVO 15培养基重悬，按照10×105个/ml的细胞密度接种在已包被好的T75培养瓶中；加入1000U/mL IFN-λ，将细胞置于39℃、5％二氧化碳的培养箱中培养12-24小时；
培养后轻摇培养瓶2-5下，用移液管吸走培养基，重新加入新的X-VIVO15培养基将瓶底的所有细胞重悬，转移到新的无抗体包被的T75培养瓶中，并加入800U/mL的IFN-λ、100U/mL的IL-1α、30ng/ml的OKT-3以及550U/ml的IL-2溶液，诱导培养CIK细胞；
每日在显微镜下观察细胞的形态，并拍照。图1即是CIK细胞培养14天后的形态图；由图1可知，绝大多数细胞呈圆形，且折光性很强，胞质明显。
每隔两天进行细胞计数，并根据细胞密度补加X-VIVO 15培养基和IL-2细胞因子；
培养14天后，收集细胞进行细胞流式检测和杀伤活性检测；同时收集细胞培养液进行细胞因子TGF-β和IL-10含量的检测。
实施例2：现有诱导培养方法
采集20ml血液，采用Ficoll分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；
将PBMC X-VIVO 15培养基重悬，按照10×105个/ml的细胞密度接种在T75培养瓶中；加入1000U/mL IFN-λ，将细胞置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中诱导培养CIK细胞；
第二天加入800U/mL的IFN-λ、100U/mL的IL-1α、30ng/ml的OKT-3以及550U/ml的IL-2溶液，继续培养；
每日在显微镜下观察细胞的形态，并拍照。根据镜检结果得知，多数细胞呈圆形，且折光性较弱，胞质不明显，整体细胞形态不如本发明方法诱导培养的CIK细胞。
每隔两天进行细胞计数，并根据细胞密度补加X-VIVO 15培养基和IL-2细胞因子
养14天后，收集细胞进行细胞流式检测和杀伤活性检测；同时收集细胞培养液进行细胞因子TGF-β和IL-10含量的检测。
实施例3：本发明所述诱导培养方法
用抗CD8的抗体包被T75细胞培养瓶2-3小时；
采集20ml血液，采用Ficoll分离液运用sepmate离心管(购自STEM CELL公司)分离外周血单个核细胞(PBMC)；
将PBMC用X-VIVO 15培养基重悬，按照10×105个/ml的细胞密度接种在已包被好的T75培养瓶中；加入500U/mL IFN-λ，将细胞置于39℃、5％二氧化碳的培养箱中培养12-24小时；
培养后轻摇培养瓶2-5下，用移液管吸走培养基，重新加入新的X-VIVO15培养基将瓶底的所有细胞重悬，转移到新的无抗体包被的T75培养瓶中，并加入1400U/mL的IFN-λ、150U/mL的IL-1α、10ng/ml的OKT-3以及1000U/ml的IL-2溶液，诱导培养CIK细胞；
每日在显微镜下观察细胞的形态，并拍照。根据镜检结果可知，绝大多数细胞呈圆形，且折光性很强，胞质明显。
每隔两天进行细胞计数，并根据细胞密度补加X-VIVO 15培养基和IL-2细胞因子；
培养14天后，收集细胞进行细胞流式检测和杀伤活性检测；同时收集细胞培养液进行细胞因子TGF-β和IL-10含量的检测。
实施例4：本发明所述诱导培养方法
用抗CD8的抗体包被T75细胞培养瓶2-3小时；
采集20ml血液，采用Ficoll分离液运用sepmate离心管(购自STEM CELL公司)分离外周血单个核细胞(PBMC)；
将PBMC用X-VIVO 15培养基重悬，按照10×105个/ml的细胞密度接种在已包被好的T75培养瓶中；加入1200U/mL IFN-λ，将细胞置于39℃、5％二氧化碳的培养箱中培养12-24小时；
培养后轻摇培养瓶2-5下，用移液管吸走培养基，重新加入新的X-VIVO15培养基将瓶底的所有细胞重悬，转移到新的无抗体包被的T75培养瓶中，并加入600U/mL的IFN-λ、50U/mL的IL-1α、20ng/ml的OKT-3以及600U/ml的IL-2溶液，诱导培养CIK细胞；
每日在显微镜下观察细胞的形态，并拍照。根据镜检结果可知，绝大多数细胞呈圆形，且折光性很强，胞质明显。
每隔两天进行细胞计数，并根据细胞密度补加X-VIVO 15培养基和IL-2细胞因子；
培养14天后，收集细胞进行细胞流式检测和杀伤活性检测；同时收集细胞培养液进行细胞因子TGF-β和IL-10含量的检测。
实施例5：本发明所述诱导培养方法
用抗CD8的抗体包被T75细胞培养瓶2-3小时；
采集20ml血液，采用Ficoll分离液运用sepmate离心管(购自STEM CELL公司)分离外周血单个核细胞(PBMC)；
将PBMC用X-VIVO 15培养基重悬，按照10×105个/ml的细胞密度接种在已包被好的T75培养瓶中；加入1500U/mL IFN-λ，将细胞置于39℃、5％二氧化碳的培养箱中培养12-24小时；
培养后轻摇培养瓶2-5下，用移液管吸走培养基，重新加入新的X-VIVO15培养基将瓶底的所有细胞重悬，转移到新的无抗体包被的T75培养瓶中，并加入1000U/mL的IFN-λ、80U/mL的IL-1α、50ng/ml的OKT-3以及100U/ml的IL-2溶液，诱导培养CIK细胞；
每日在显微镜下观察细胞的形态，并拍照。根据镜检结果可知，绝大多数细胞呈圆形，且折光性很强，胞质明显。
每隔两天进行细胞计数，并根据细胞密度补加X-VIVO 15培养基和IL-2细胞因子；
培养14天后，收集细胞进行细胞流式检测和杀伤活性检测；同时收集细胞培养液进行细胞因子TGF-β和IL-10含量的检测。
实施例6：流式细胞仪检测结果
将实施例1和实施例2中培养14天后收集的CIK细胞进行流式检测，取1×106个CIK细胞，250g离心5min去上清，用含10％FBS的PBS溶液清洗2次，避光加入CD4、CD25抗体2.5μL室温孵育30min，用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；用500mL RPMI 1640培养基重悬细胞并过滤，上流式细胞仪进行检测，结果见图2。
由如图2所示，本发明所述方法中Treg细胞的比例为3.6％，现有技术中Treg细胞的比例为6.7％，明显高于本发明诱导培养方法(A和B)。本发明所述方法中效应细胞的比例为34.3％，现有技术中效应细胞的比例为20.8％，明显高于现有的培养方法(C和D)。此外，将实施例3-实施例5的细胞培养液进行同样的检测，结果显示，由本发明培养出的CIK细胞其效应细胞比例均高于实施例2，而Treg细胞的比例均低于实施例2，差异明显。
实施例7：ELASA法定量检测TGF-β和IL-10含量
检测对象：实施例1和实施例2；
将CIK细胞培养后的细胞培养液收集起来进行浓缩，为实验品；分别将TGF-β和IL-10标准品溶解，分别设置了5个浓度，分别是10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml、40μg/ml及50μg/ml；从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；
留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10℃～35℃下避光放置；
分别将实验品或不同浓度的标准品(0μg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔中，100μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min；
洗板4次；
除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育60min；
洗板4次；
除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育30min；
洗板4次；
加入显色底物，100μl/孔，于37℃孵箱避光孵育15min；
加入终止液，100μl/孔，混匀后检测其吸光度值(OD450值)。
标准品吸光度值曲线分别参见图3和图4，实施例1和实施例2中细胞培养液所测TGF-β的OD450值分别为1.22和1.02，根据TGF-β标准品的吸光度值曲线，可知TGF-β标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先线性曲线为：Y＝0.047X+0.29，根据曲线图，从而可计算出本发明和现有技术的中的TGF-β的含量分别为19.78μg/ml和15.53μg/ml。
实施例1和实施例2中细胞培养液所测IL-10的OD450值分别为1.386和1.054，根据IL-2标准品的吸光度值曲线，可知IL-10标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先线性曲线为：Y＝0.11X+0.8，根据曲线图，从而可计算出本发明和现有技术的中的IL-10的含量分别为11.31μg/ml和8.426μg/ml。
此外，将实施例3-实施例5的细胞培养液进行同样的检测，结果显示，TGF-β含量均高于18μg/ml，IL-10的含量均高于10μg/ml。表明本发明方法诱导出的CIK细胞分泌TGF-β的能力和分泌IL-2的能力更高。
实施例8：CIK细胞的杀伤活性检测
本实施例中使用的细胞裂解液为9％Triton X-100，购自PROMEGA；底物液为Sunstrate Mix，购自PROMEGA；终止液为1M acetic acid。
1)铺板时各实验孔和对照设置如下：
实验孔：按效靶比40:1、20:1和10:1进行靶细胞(K562)和效应细胞(CIK细胞)的铺板。其中，CIK细胞的浓度分别为4×106/mL，2×106/mL，1×106/mL，每孔100μL，每组3个复孔；K562浓度为1×105/mL，每孔100μL，每组3个复孔。
效应细胞自然释放孔：4×106/mL，2×106/mL，1×106/mL，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。
靶细胞最大释放孔：1×105/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。
靶细胞自然释放孔：1×105/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。
培养液空白对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔。
体积纠正对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。
2)铺板后将培养板250g离心4min，置于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育4h。在培养结束前45min，取出培养板，在靶细胞最大释放组和体积纠正组每孔加入20μL细胞裂解液，250g离心4min，继续培养45min后取出。
3)进行LDH(乳酸脱氢酶)测定，具体步骤如下：250g离心4min，每孔吸出50μL上清转移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μL，室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测定490波长处的吸光度值。
4)试验组、靶细胞LDH自然释放组和效应细胞LDH自然释放组的吸光度均值减去培养液空白对照组吸光度值均值，获得校正值。靶细胞LDH最大释放组的吸光度均值减去体积纠正组吸光度值均值，获得校正值。
杀伤活性按如下公式计算：
活性＝(A-E-T)/(Tmax-T)×100％
A:试验组吸光度值校正值；
E:效应细胞自然释放孔吸光度值校正值；
T：靶细胞自然释放孔吸光度值校正值；
Tmax：靶细胞最大释放组吸光度值校正值。
结果见表1。
表1 CIK细胞对K562细胞的杀伤活性检测
| 组别 | 40:1 | 20:1 | 10:1 |
| 实施例1诱导的CIK | 76％ | 48.2％ | 24.8％ |
| 实施例2诱导的CIK | 49.8％ | 15.9％ | 8.9％ |
| 实施例3诱导的CIK | 68.45％ | 42.1％ | 25.4％ |
| 实施例4诱导的CIK | 72.4％ | 45.6％ | 23.67％ |
| 实施例5诱导的CIK | 73.59％ | 39.74％ | 19.6％ |
由表1可知，在杀伤K562时，本发明方法诱导的CIK细胞比现有方法诱导的CIK细胞的杀伤效果更好，差异较明显。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，包括：
步骤1、用抗CD8抗体包被细胞培养容器；
步骤2、将单个核细胞用免疫细胞培养基重悬并接种在步骤1包被好的容器中，添加500-1500U/mL IFN-λ细胞因子在39℃、5％二氧化碳的环境中培养12-24h；
步骤3、培养后去掉培养基并再次加入新鲜的免疫细胞培养基重悬，并转移至新的容器中，添加IFN-λ、IL-1α、OKT-3以及IL-2细胞因子诱导培养CIK细胞，定期补充新鲜培养基和IL-2细胞因子；所述各细胞因子浓度为500-1500U/mL IFN-λ、50-150U/mL的IL-1α、10-50ng/ml的OKT-3以及100-1000U/ml的IL-2。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述单个核细胞采用Ficoll分离液运用sepmate离心管从外周血分离获得。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述单个核细胞接种以5×105-10×105个/ml的细胞密度接种。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述免疫细胞培养基为X-VIVO 15培养基。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述诱导培养CIK细胞为在37℃、5％二氧化碳的环境中培养14天。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞培养容器为细胞培养瓶。
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2015
- 2015-12-07 CN CN201510894815.3A patent/CN105331581B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154206A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-17 | 郑骏年 | 一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的cik细胞的制备方法 |
| CN103923880A (zh) * | 2014-05-08 | 2014-07-16 | 成都百赛泰科生物科技有限公司 | 一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的ctl制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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