CN105296426A

CN105296426A - 一种nk细胞的诱导培养方法

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Publication number: CN105296426A
Application number: CN201510897188.9A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王一飞; 葛啸虎; 曾维杰
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-12-07
Also published as: CN105296426B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种NK细胞的诱导培养方法。本发明所述方法先制备细胞三维培养载体；然后从外周血分离出单个核细胞并接种到细胞三维培养载体中，同时补加IL-2、IL-15、IL-21以及OKT-3因子诱导培养，定期补液。本发明在NK细胞的诱导培养引入了细胞三维培养载体进行诱导培养，同时配合细胞因子的加入，由此解决了传统培养方法扩增的数量有限、表面抗原CD3-/CD56+的表达水平较低、细胞杀伤活性不高的问题，满足临床上对于NK细胞的需求。

Description

一种NK细胞的诱导培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种NK细胞的诱导培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

细胞治疗是继手术、放疗和化疗之后的有一种肿瘤治疗方法，它一般作为手术、放化疗的辅助手段，延长患者的寿命，清除体内手术后残余的癌细胞。细胞治疗主要包括NK细胞治疗、CTL细胞治疗、CIK细胞治疗以及LAK细胞治疗等。

NK细胞是机体重要的免疫细胞，不只消灭细菌和病毒感染，还能消灭癌细胞或肿瘤。因此NK细胞被广泛应用于肿瘤癌症的临床治疗。目前，NK细胞的体外扩增培养多为二维培养，即把NK细胞接种到培养瓶中，添加诸如X-VIVO15免疫细胞培养基以及加入一些因子组合诱导NK细胞扩增培养。然而，临床上采用NK细胞治疗肿瘤时，需要NK细胞的量较高，而普通的NK细胞诱导培养方法扩增的数量有限，很难达到临床回输的要求；同时所诱导培养的NK细胞中表面抗原表达水平(CD3-、CD56+)比较低，细胞对癌细胞的毒性效果不高。因此，必需寻找用另一种能增强NK细胞的增殖活性，最好同时能增强NK细胞的杀伤能力的免疫细胞培养方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NK细胞的诱导培养方法，使得所述方法能够显著提高NK细胞的数量。

本发明的另一个目的在于提供一种NK细胞的诱导培养方法，使得所述方法能够显著提高NK细胞表面抗原CD3-/CD56+的表达水平，增强NK细胞的杀伤能力。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种NK细胞的诱导培养方法，包括：

步骤1、制备细胞三维培养载体；

步骤2、从外周血分离出单个核细胞并接种到步骤1中的载体中，同时补加IL-2、IL-15、IL-21以及OKT-3因子诱导培养，定期补液。

本发明主要引入了细胞三维培养的技术思维来解决现有免疫细胞NK细胞的技术问题，三维培养是指将具有三维结构的载体与各种不同的种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。

二维细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状,往往和体内情况不相符；动物实验虽在体内进行，但体内多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而不能观察到研究者最为关心的中间过程。因此，现有技术提出了三维细胞培养技术模拟体内的微环境，填补了单层细胞培养和动物实验的鸿沟，主要用于医学领域的理论研究，但是将其用于提高免疫细胞的增殖活性以及杀伤活性还未见报道。而本发明针对现有NK细胞培养方式的缺点，将细胞三维培养载体引入NK细胞的培养中，利用载体进行NK细胞的三维培养，同时配合适宜的细胞因子，由此促进NK细胞的增殖，以及提高其表面抗原CD3-/CD56+的表达水平，增强NK细胞的杀伤能力。

在本发明中，所述步骤1具体为：

用免疫细胞培养基稀释细胞三维培养载体材料，于细胞培养容器中孵育包被，获得细胞三维培养载体。所述细胞三维培养载体材料是该领域经常用到的具有三维结构的载体材料。

其中，作为优选，所述免疫细胞培养基为X-VIVO15培养液；所述具有三维结构的载体材料为Matrigel基质；所述免疫细胞培养基稀释细胞三维培养载体材料的体积比为5:1；所述各因子的浓度为：100～1000U/mLIL-2、10～100ng/mLIL-15、10～100ng/mLIL-21、50～100ng/mLOKT-3。

本发明优选地的载体材料Matrigel基质是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等，市售可得。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的理论研究。

作为一个整体的优选方案，所述步骤1为：

混匀Matrigel基质成匀浆状，用X-VIVO15培养液按X-VIVO15培养液：Matrigel基质＝5:1的体积比稀释Matrigel基质，将稀释的Matrigel基质包被于T75培养瓶中，室温下孵育1小时，用X-VIVO15培养液冲洗，去除未结合的Matrigel基质，获得细胞三维培养载体。

同时，本发明所述外周血分离出单个核细胞可参照本领域已有的分离方法，本发明优选为：

外周血加生理盐水稀释，加入到淋巴分离液上层，离心，然后用巴氏吸管吸取单个核细胞，清洗、离心、重悬，分离得到单个核细胞悬液。

更进一步优选为：

把抽取的人外周血用生理盐水对血液进行1:1稀释并混合均匀，获得血液稀释液；

另取离心管，加入淋巴细胞分离液，把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上层，注意不要冲破分离液层(淋巴细胞分离液：血液稀释液为1：2体积比)；

放入冷冻离心机中，3000rpm/min离心30min。

离心结束后，用巴氏吸管吸取单个核细胞并用生理盐水清洗，再次离心，用免疫细胞培养基(优选X-VIVO15培养液)重悬细胞，获得单个核细胞悬液。

作为优选，步骤2所述诱导培养为在37℃、5％二氧化碳的环境中培养14天。

作为优选，所述单个核细胞的接种密度为1×10⁶cell/mL。

以本发明所述方法进行NK细胞的诱导培养，相对于现有的诱导培养方法，本发明能够将NK细胞数量扩增到10⁹数量级，而现有技术中的NK细胞量为10⁸数量级，活力也高于现有技术培养的NK细胞，而且本发明诱导培养的NK细胞中CD3-/CD56+的表达水平为85.6％，现有技术培养的NK细胞表达水平为74.4％，同时对K562细胞的杀伤活性上也显著高于现有技术培养的NK细胞。

由以上技术方案可知，本发明在NK细胞的诱导培养引入了细胞三维培养载体进行诱导培养，同时配合细胞因子的加入，由此解决了传统培养方法扩增的数量有限、表面抗原CD3-/CD56+的表达水平较低、细胞杀伤活性不高的问题，满足临床上对于NK细胞的需求。

附图说明

图1所示为NK细胞的镜检图，其中A为现有对照方法诱导培养的NK细胞的镜检图，B为本发明方法诱导培养的NK细胞镜检图；

图2所述为NK细胞表面抗原CD3-/CD56+表达水平的流式检测图，其中A为现有对照方法诱导培养的NK细胞表面抗原表达水平图，B为本发明方法诱导培养的NK细胞表面抗原表达水平图；

图3所示为现有对照方法诱导培养的NK细胞对K562杀伤活性折线图；

图4所示为本发明方法诱导培养的NK细胞对K562杀伤活性折线图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种NK细胞的诱导培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种NK细胞的诱导培养方法进行详细说明。

实施例1：本发明所述诱导培养方法

1、细胞三维培养载体的构建(Matrigel基质成胶)

冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。用X-VIVO15培养液(按X-VIVO15培养基：Matrigel基质＝5:1体积比)稀释Matrigel基质。将稀释的Matrigel基质包被于T75培养瓶中，室温下孵育1小时。用X-VIVO15培养基轻轻地冲洗，去除未结合的Matrigel。

2、单个核细胞的分离

把抽取的40ml人外周血转移至两个50ml离心管中，用生理盐水对血液进行1:1稀释并混合均匀。

另取两个新的50ml离心管，加入15ml淋巴细胞分离液(淋巴细胞分离液：血液稀释液为1：2，体积比)，把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上层，注意不要冲破分离液层。

放入冷冻离心机中，3000rpm/min离心30min。

离心结束后，用巴氏吸管吸取单个核细胞至15ml离心管中，用10ml生理盐水清洗一遍，400g离心5min，用5mlX-VIVO15培养基重悬细胞沉淀并计数。

3、NK细胞的诱导培养

按2×10⁷cell/ml接种于用Matrigel基质包被的T75培养中，并加入100～1000U/mLIL-2、10～100ng/mLIL-15、10～100ng/mLIL-21和50～100ng/mLOKT-3，放置37℃、5％CO₂恒温培养箱中诱导培养NK细胞，每天观察细胞生长状况，每隔2～3天对细胞进行计数，并且补液补细胞因子处理。培养14天后对细胞进行流式和细胞毒性效果检测。

实施例2：现有对照诱导培养方法

1、单个核细胞的分离

同实施例1。

2、NK细胞的诱导培养

用X-VIVO-15培养基按2×10⁷cell/ml接种于T75培养中，并加入100～1000U/mLIL-2、10～100ng/mLIL-15、10～100ng/mLIL-21和50～100ng/mLOKT-3(添加细胞因子浓度与实施例1保持一致相同)，放置37℃、5％CO₂恒温培养箱中诱导培养NK细胞，每天观察细胞生长状况，每隔2～3天对细胞进行计数，并且补液补细胞因子处理。培养14天后对细胞进行流式和细胞毒性效果检测。

实施例3：NK细胞的流式检测结果和镜检结果

将实施例1和实施例2两种方法诱导培养的N空细胞进行流式细胞仪检测和镜检，对比NK细胞活力、表面抗原表达水平、细胞扩增数量，结果如下：

1、镜检结果以及扩增数量结果

由1可以明显看出，本发明诱导培养出的NK细胞数量显著多于现有方法培养出的NK细胞。而根据表1也能够得知，本发明能够将NK细胞数量扩增至2×10⁹，相比其实细胞数量，扩增倍数为100倍，而现有方法将NK细胞数量扩增至5×10⁸，扩增倍数为75倍，远不如本发明NK细胞的增殖活性高。而且，在细胞活力方面本发明培养出的NK细胞液较高一些。

表1细胞数量和活力对照

	对照组NK细胞	实验组NK细胞
			细胞量(起始量2×10⁷)	5×10⁸	2×10⁹
扩增倍数	25倍	100倍
			活力	94.5％	96.7％

2、抗原表达量结果

根据图2可以看出，本发明方法诱导培养的NK细胞的表面抗原CD3-/CD56+的表达水平为85.6％要比对照的74.4％高。

3、细胞杀伤活性检测结果

根据图3和图4可以看出，两种方法培养诱导的NK细胞表现出对K562细胞的不同毒性，随着效靶比的不断降低，NK细胞对K562的特异性释放率不断降低，但相同条件下本发明培养诱导的NK细胞的特异性释放率均显著高于对照方法培养的NK细胞，证明其细胞杀伤活性要高。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种NK细胞的诱导培养方法，其特征在于，包括：

步骤1、制备细胞三维培养载体；

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：

用免疫细胞培养基稀释细胞三维培养载体材料，于细胞培养容器中孵育包被，获得细胞三维培养载体。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述免疫细胞培养基为X-VIVO15培养液。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述具有三维结构的载体材料为Matrigel基质。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述免疫细胞培养基稀释细胞三维培养载体材料的比例为5:1。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述各因子的浓度为：

100～1000U/mLIL-2、10～100ng/mLIL-15、10～100ng/mLIL-21、50～100ng/mLOKT-3。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1为：

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，从外周血分离出单个核细胞具体为：

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导培养为在37℃、5％二氧化碳的环境中培养14天。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述单个核细胞的接种数量为2×10⁷cell。