CN105586313A - Nkt细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学领域，公开了一种NKT细胞的培养方法。本发明所述NKT细胞的培养方法将单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基，加入羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞。本发明所述培养方法利用羟丙基甲基纤维素的常温成胶效果，加入羟丙基甲基纤维素溶液，在NKT细胞培养初期建立起培养液的三维结构，使NKT细胞在三维空间内增殖，空间更大、接触的培养液面积更充足，实验结果显示采用本发明所述NKT细胞的培养方法培养NKT细胞，细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，可以获得更高纯度的NKT效应细胞，得到的NKT细胞杀伤效果也明显高于常规的培养方法。

Description

NKT细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种NKT细胞的培养方法，尤其是NKT细胞的三维培养方法。
背景技术
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。
传统的肿瘤治疗方法有手术治疗、放疗和化疗。但手术对于对分散的、不可见的癌细胞无法消除，故存在着复发和转移的风险。放化疗可以消灭肿瘤细胞，缓解病情，但放化疗没有识别的能力，往往在杀死肿瘤细胞的同时杀伤了正常的细胞，长期的放化疗会让患者免疫力降低，出现毒副作用。为弥补这些治疗方法的缺陷，细胞免疫治疗出现了。
细胞免疫治疗是一种新兴的治疗技术。细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成百倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫治疗可以恢复与增强肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强、副作用轻等优点。
NKT细胞是免疫细胞治疗中非常重要的一类细胞群。NKT(naturalkillerT)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群，可分泌大量的IL-4和IFN-γ因子，是免疫调节和细胞杀伤性作用的重要细胞群。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子是穿孔素、Fas配体和IFN-γ。目前NKT细胞作为具有强力杀伤靶细胞的一类细胞群，在肿瘤免疫细胞治疗中具有非常重要的作用。经体外培养得到的NKT细胞能很好的起到肿瘤免疫治疗和保健作用。
在NKT细胞常规培养中，主要是利用培养瓶或培养袋按一定细胞密度直接进行培养，具体培养方法是：普通培养瓶用包被液A(Retronectin蛋白)和包被液B(Anti-CD3蛋白)包被；外周血分离单个核细胞(PBMC)，经磁珠分选获得NK/NKT细胞，接种至经包被后的培养瓶中；培养14天收集NK/NKT细胞。
然而传统培养瓶培养NKT细胞，部分细胞很容易贴壁。当细胞增殖培养时，大量的成团细胞很容易沉于底部，易导致NKT细胞不能充分接触培养液，减缓细胞增殖，并且容易使成团的细胞死亡。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种NKT细胞的培养方法。本发明所述培养方法利用羟丙基甲基纤维素在NKT细胞培养初期建立起培养液的三维结构，以解决NKT细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部而无法很好的接触培养液的问题。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种NKT细胞的培养方法，单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基，加入羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞。
羟丙基甲基纤维素(HPMC)：是选用高度纯净的棉纤维素作为原料，在碱性条件下经专门醚化而制得，溶于水及大多数适当比例的乙醇/水、丙醇/水、二氯乙烷等，在冷水中溶胀成澄清或微浊的胶体溶液。本发明所述培养方法利用羟丙基甲基纤维素的常温成胶效果，加入羟丙基甲基纤维素溶液，在NKT细胞培养初期建立起培养液的三维结构，使NKT细胞在三维空间内增殖，空间更大、接触到的培养液面积更充足，避免NKT细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部，不能很好的继续增殖。
其中，在一些实施方案中，所述NKT细胞的培养方法中所述羟丙基甲基纤维素的终浓度为0.8wt％-6wt％，粘度为20Mpa.s-80Mpa.s。
在一些实施方案中，所述NKT细胞的培养方法中所述单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基的接种量为5×106个/mL-15×106个/mL。
本发明所述培养方法除了加入了羟丙基甲基纤维素外还加入了一下细胞因子，包括IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体。
在一些实施方案中，本发明所述培养方法中所述IL-2的终浓度为200-1000U/mL、IL-15的终浓度为200-1000U/mL、IL-21的终浓度为200-1000U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为100-1000U/mL。
本发明所述培养方法培养时间优选为14天以上。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述培养方法每隔2-3天补液一次。
其中，每次补液添加X-VIVO15无血清培养基、羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体。
优选的，每次补液IL-2的终浓度为200-1000U/mL、IL-15的终浓度为200-1000U/mL、IL-21的终浓度为200-1000U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为100-1000U/mL；羟丙基甲基纤维素的终浓度为0.8wt％-6wt％，粘度为20Mpa.s-50Mpa.s。
在一些优选实施方案中，本发明所述的培养方法从第三次补液开始不添加IL-21和CD3单克隆抗体。即从第三次补液开始只添加X-VIVO15无血清培养基、羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2和IL-15。IL-2的终浓度为200-1000U/mL、IL-15的终浓度为200-1000U/mL；羟丙基甲基纤维素的终浓度为0.8wt％-6wt％，粘度为20Mpa.s-50Mpa.s。
本发明所述培养方法中所述羟丙基甲基纤维素溶液可以由通过商业渠道购买的羟丙基甲基纤维素加水配制而成。
在一些实施方案中，所述羟丙基甲基纤维素溶液的制备方法为70-75℃热水溶解羟丙基甲基纤维素冷却至室温，配制质量浓度为8％-20％，粘度40Mpa.s-100Mpa.s的羟丙基甲基纤维素溶液，并调节PH至6.8-7.5。
本发明所述培养方法中所述单个核细胞可以由外周血或脐带血分离得到。
在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500-800g离心20-30min。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种NKT细胞的培养方法，单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基，加入羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞。本发明所述培养方法利用羟丙基甲基纤维素的常温成胶效果，加入羟丙基甲基纤维素溶液，在NKT细胞培养初期建立起培养液的三维结构，使NKT细胞在三维空间内增殖，空间更大、接触到的培养液面积更充足，避免NKT细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部，不能很好的继续增殖。实验结果显示采用本发明所述NKT细胞的培养方法培养NKT细胞，细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，可以获得更高纯度的NKT效应细胞，得到的NKT细胞杀伤效果也明显高于常规的培养方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示试验例1各组增殖曲线；
图2示试验例1中组2在培养14天时NKT显微观察的细胞形态图，放大倍数为40倍；
图3示试验例1中组5在培养14天时NKT显微观察的细胞形态图，放大倍数为40倍；
图4示试验例1中组2培养的NKT细胞表面标记物CD3+CD56+表达情况图；
图5示试验例1中组5培养的NKT细胞表面标记物CD3+CD56+表达情况图；
图6示试验例1中组2和组5培养14天后的细胞对K562细胞的杀伤能力检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中所述羟丙基甲基纤维素(HPMC)购自山东苏诺克化工有限公司；
实施例1：单个核细胞的分离
采集外周血20mL，加入10mL生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液15mL的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500g-800g离心力，升降速为0，离心20-30min，提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞量为2×107个-4×107个。
实施例2、羟丙基甲基纤维素溶液的配制
取一定量去离子水加热至70℃-75℃，按100mL去离子水加入10g-20g羟丙基甲基纤维素，配制质量浓度为8％-20％羟丙基甲基纤维素溶液，在磁力搅拌器上溶解，搅拌机转速300r/min，溶解10min，静置消除气泡，冷却至室温，得到的羟丙基甲基纤维素溶液粘度控制在室温40Mpa.s-100Mpa.s，0.1mol/mL的HCl或NaOH溶液调节PH至6.8-7.5，备用。
实施例3、本发明所述NKT细胞的培养方法
1、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按5-15×106/mL接种X-VIVO15无血清培养基，同时加入羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞；其中，按100mL培养液加入HPMC溶液10mL，维持HPMC质量百分比为1.5-2％，溶液粘度20Mpa.s；IL-2终浓度为200U/mL，IL-15终浓度为200U/mL，IL-21终浓度为200U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为100U/mL；
2、每隔2-3天补液一次，每次补液添加X-VIVO15无血清培养基、羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体；其中，按100mL培养液加入HPMC溶液10mL，维持HPMC质量百分比为1.5-2％，溶液粘度20Mpa.s；IL-2终浓度为200U/mL，IL-15终浓度为200U/mL，IL-21终浓度为200U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为100U/mL；
3、细胞从第三次补液开始不添加IL-21和CD3单抗，只添加IL-2和IL-15；
4、培养14天收集细胞。
实施例4、本发明所述NKT细胞的培养方法
1、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按5-15×106/mL接种X-VIVO15无血清培养基，同时加入羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞；其中，按100mL培养液加入HPMC溶液30mL，维持HPMC质量百分比为4.5-5％，溶液粘度80Mpa.s；IL-2终浓度为1000U/mL，IL-15终浓度为1000U/mL，IL-21终浓度为1000U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为1000U/mL；
2、每隔2-3天补液一次，每次补液添加X-VIVO15无血清培养基、羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体；其中，按100mL培养液加入HPMC溶液30mL，维持HPMC质量百分比为4.5-5％，溶液粘度80Mpa.s；IL-2终浓度为1000U/mL，IL-15终浓度为1000U/mL，IL-21终浓度为1000U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为1000U/mL；
3、细胞从第三次补液开始不添加IL-21和CD3单抗，只添加IL-2和IL-15；
4、培养14天收集细胞。
实施例5、本发明所述NKT细胞的培养方法
1、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按5-15×106/mL接种X-VIVO15无血清培养基，同时加入羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞；其中，按100mL培养液加入HPMC溶液25mL，维持HPMC质量百分比为4-4.5％，溶液粘度60Mpa.s；IL-2终浓度为500U/mL，IL-15终浓度为500U/mL，IL-21终浓度为500U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为200U/mL；
2、每隔2-3天补液一次，每次补液添加X-VIVO15无血清培养基、羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体；其中，按100mL培养液加入HPMC溶液25mL，维持HPMC质量百分比为4-4.5％，溶液粘度60Mpa.s；IL-2终浓度为500U/mL，IL-15终浓度为500U/mL，IL-21终浓度为500U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为200U/mL；
3、细胞从第三次补液开始不添加IL-21和CD3单抗，只添加IL-2和IL-15；
4、培养14天收集细胞。
对比例1、
1、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按5-15×106/mL接种X-VIVO15无血清培养基，同时加入IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞；其中，IL-2终浓度为500U/mL，IL-15终浓度为500U/mL，IL-21终浓度为500U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为200U/mL；
2、每隔2-3天补液一次，每次补液添加X-VIVO15无血清培养基、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体；其中，IL-2终浓度为500U/mL，IL-15终浓度为500U/mL，IL-21终浓度为500U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为200U/mL；
3、细胞从第三次补液开始不添加IL-21和CD3单抗，只添加IL-2和IL-15；
4、培养14天收集细胞。
对比例2、
1、Retronectin蛋白和Anti-CD3蛋白包被培养瓶，加入X-VIVO15无血清培养基；
2、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按5-15×106/mL接种X-VIVO15无血清培养基，同时加入IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞；其中，IL-2终浓度为500U/mL，IL-15终浓度为500U/mL，IL-21终浓度为500U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为200U/mL；
3、每隔2-3天补液一次，每次补液添加X-VIVO15无血清培养基、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体；其中，IL-2终浓度为500U/mL，IL-15终浓度为500U/mL，IL-21终浓度为500U/mL，CD3单克隆抗体终浓度为200U/mL；
4、细胞从第三次补液开始不添加IL-21和CD3单抗，只添加IL-2和IL-15；
5、培养14天收集细胞。
试验例1、效果实验
取外周血或脐带血40ml，淋巴细胞分离液获取单个核细胞(PBMC)4-8×107，分5组，每组1×107的细胞量进行NKT培养。具体分组如下：
组1：采用对比例1所述培养方法；
组2：采用对比例2所述培养方法；
组3：采用实施例3所述培养方法；
组4：采用实施例4所述培养方法；
组5：采用实施例5所述培养方法。
各组培养至14天收集上述5组细胞，分别进行计数，并进行流式细胞检测和杀伤实验。
统计各组培养至14天的细胞量、增殖情况及活率结果如表1所示。各组增殖曲线如图1所示。
表1各组培养14天后的细胞量、增殖情况及活率
组别 接种细胞量 培养后总细胞量 增殖倍数 活率
组1 1×107 1.03×109 103 93.9％
组2 1×107 3.88×109 388 88.3％
组3 1×107 8.76×109 876 98.5％
组4 1×107 8.62×109 862 99.3％
组5 1×107 1.17×1010 1170 98.8％
由上述结果可见，组3-组5细胞增殖倍数明显高于组1和组2，且活率也比组1和组2高。
对组2和组5培养14天时的细胞形态进行显微观察，结果如图2-3所示。
结果显示组5培养方法培养的NKT细胞是致密生长，很好的利用培养瓶的立体空间增殖；而组2培养方法出现细胞成团严重，不均匀，团块内部的细胞易死亡。
组3和组4培养方法培养的NKT细胞形态与组5相似，均为致密生长，
以初始分离的PBMC细胞作为对照，对组2和组5培养的细胞的细胞表面标志物进行检测，结果如图4-5所示。
从流式检测结果可以看出，组2培养方法培养得到的NK/NKT效应细胞CD3+CD56+总和为23.1％；组5培养方法培养得到的NK/NKT效应细胞CD3+CD56+总和为43.2％。
而组3和组4培养方法培养得到的NK/NKT效应细胞CD3-CD56+总和也均明显高于组2。表明本发明所述培养方法培养后可以获得更高纯度的NKT效应细胞。
对组2和组5培养14天后的细胞对K562细胞的杀伤能力进行检测，结果如表2及图6所示。
表2组2、组2培养的NKT细胞对K562细胞的杀伤实验结果
效靶比 40:1 20:1 10:1
组2 0.443 0.208 0.112
组5 0.756 0.582 0.327
由表2结果可见，组5培养方法得到的NKT细胞杀伤效果明显优于组2。组3和组4培养方法培养得到的NKT细胞杀伤效果也明显高于组2。

Claims (10)

1.一种NKT细胞的培养方法，其特征在于，单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基，加入羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体培养NKT细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述羟丙基甲基纤维素的终浓度为0.8wt％-6wt％，粘度为20Mpa.s-80Mpa.s。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基的接种量为5×106个/mL-15×106个/mL。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述IL-2的终浓度为200-1000U/mL、IL-15的终浓度为200-1000U/mL、IL-21的终浓度为200-1000U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为100-1000U/mL。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养时间为14天以上。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，每隔2-3天补液一次，每次补液添加X-VIVO15无血清培养基、羟丙基甲基纤维素溶液、IL-2、IL-15、IL-21以及CD3单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，每次补液IL-2的终浓度为200-1000U/mL、IL-15的终浓度为200-1000U/mL、IL-21的终浓度为200-1000U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为100-1000U/mL；羟丙基甲基纤维素的终浓度为0.8wt％-6wt％，粘度为20Mpa.s-50Mpa.s。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，从第三次补液开始不添加IL-21和CD3单克隆抗体。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述羟丙基甲基纤维素溶液的制备方法为70-75℃热水溶解羟丙基甲基纤维素冷却至室温，配制质量浓度为8％-20％，粘度40Mpa.s-100Mpa.s的羟丙基甲基纤维素溶液，并调节PH至6.8-7.5。
10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述单个核细胞的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500-800g离心20-30min。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106554942A (zh) * 2016-11-18 2017-04-05 吉林省拓华生物科技有限公司 一种高效的临床级cd56+群免疫细胞的制备方法
CN107446888A (zh) * 2017-10-09 2017-12-08 天津长和生物技术有限公司 Nk细胞培养基、培养方法及二者的应用
CN107475194A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 天津长和生物技术有限公司 Nkt细胞培养基、培养方法及二者的应用
CN112359015A (zh) * 2020-11-06 2021-02-12 上海映天生物科技有限公司 一种cik2(nk nk-t)细胞的诱导扩增方法
CN113699107A (zh) * 2021-10-27 2021-11-26 东莞再立健生物科技有限公司 一种外周血nkt细胞培养液及培养方法
CN113957050A (zh) * 2021-11-24 2022-01-21 李国强 一种nkt细胞的培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104231288A (zh) * 2014-08-07 2014-12-24 厦门凝赋生物科技有限公司 一种高强度胶原凝胶及其制备方法
CN105039255A (zh) * 2015-09-09 2015-11-11 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种nkt细胞诱导培养的添加剂及诱导培养的方法
CN105296426A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种nk细胞的诱导培养方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104231288A (zh) * 2014-08-07 2014-12-24 厦门凝赋生物科技有限公司 一种高强度胶原凝胶及其制备方法
CN105039255A (zh) * 2015-09-09 2015-11-11 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种nkt细胞诱导培养的添加剂及诱导培养的方法
CN105296426A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种nk细胞的诱导培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JONATHAN M. COQUET ET AL.: "IL-21 Is Produced by NKT Cells and Modulates NKT Cell Activation and Cytokine Production", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106554942A (zh) * 2016-11-18 2017-04-05 吉林省拓华生物科技有限公司 一种高效的临床级cd56+群免疫细胞的制备方法
CN107446888A (zh) * 2017-10-09 2017-12-08 天津长和生物技术有限公司 Nk细胞培养基、培养方法及二者的应用
CN107475194A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 天津长和生物技术有限公司 Nkt细胞培养基、培养方法及二者的应用
CN107475194B (zh) * 2017-10-09 2018-07-24 天津长和生物技术有限公司 Nkt细胞培养基、培养方法及二者的应用
CN112359015A (zh) * 2020-11-06 2021-02-12 上海映天生物科技有限公司 一种cik2(nk nk-t)细胞的诱导扩增方法
CN113699107A (zh) * 2021-10-27 2021-11-26 东莞再立健生物科技有限公司 一种外周血nkt细胞培养液及培养方法
CN113699107B (zh) * 2021-10-27 2022-02-01 东莞再立健生物科技有限公司 一种外周血nkt细胞培养液及培养方法
CN113957050A (zh) * 2021-11-24 2022-01-21 李国强 一种nkt细胞的培养方法

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