CN104231288A - 一种高强度胶原凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高强度胶原凝胶，其特征在于所述高强度胶原凝胶通过将辐射交联的低密度胶原水凝胶浸没于水或水溶液中一定时间，维持一定温度使其发生三维尺寸收缩。在经过溶液浸泡的自收缩后，压缩模量提高至所述低密度胶原水凝胶的2-5倍；并且该高强度胶原凝胶具有三维结构或呈高孔隙率且孔径梯度分布。本发明同时涉及一种制备所述高强度胶原凝胶的方法。

Description

一种高强度胶原凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗器械及其制备技术领域，具体涉及一种胶原凝胶，更具体涉及一种高强度的胶原凝胶及其制备方法。 

背景技术

胶原是结缔组织的主要成分，占人体中蛋白总量的近三分之一。其良好的生物相容性和生物降解性，使得其成为在临床上获得广泛应用和深入研究的生物材料。水凝胶是一种由亲水大分子交联而成的三维网络，具有高含水量、低表面张力和优异亲水性；且由胶原、弹性蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖及糖蛋白通过高度水合作用而构建的天然组织支架——细胞外基质(ECM)本身即呈现水凝胶形态。因此胶原水凝胶被认为是替代ECM的理想材料，作为人工皮肤、人工角膜、玻璃体替代物、多种组织的体外培养支架、细胞载体和药物控释体系等而备受关注。但对于天然材料，共有的一大弱点是物理机械性能欠缺，胶原也因此而被限制了在某些方面的应用。 

中国发明专利CN1513565A提供了一种应用生物工程技术制备的胶原凝胶人工真皮替代物。发明利用胶原在37℃中性环境下纤维重排形成水凝胶的机理，包埋人胎真皮成纤维细胞共培养，获得人工真皮。制备过程不加入交联剂，技术简单、绿色，但由于是物理水凝胶，凝胶机械强度低，仅50kPa左右，因而仅能作为真皮等软组织替代物应用。 

为提升胶原水凝胶的力学性能，常用的方法一是将胶原与其他高分子组合构成复合材料，已被报道的包括胶原-聚乙烯醇(PVA)、胶原-聚甲基丙烯酸β-羟乙酯(PHEMA)、胶原-琼脂糖复合水凝胶等，但强度仍不够高，以琼脂糖/胶原 水凝胶为例，其压缩模量仅达到2-15kPa(朱琳，等.琼脂糖/胶原复合水凝胶的制备及性能研究[J].西安交通大学学报.47(2013)：121-126.)。由于胶原通常与其他组分不易相容，在胶原基复合材料中，一大类是互穿网络(IPN)/双网络(DN)水凝胶。由向胶原中引入磷酰胆碱构建的IPN水凝胶即被证明有较高模量和拉伸强度，是有潜力的角膜替代物材料。增强的方法之二是交联，对于胶原，可用的交联剂有戊二醛、碳二亚胺类(EDC)、京尼平以及近期被研究开发的化学修饰的碳纳米管等。但这些交联剂在使用过程中的残留和所致的潜在毒性都必须引起足够的关注。 

发明内容

传统物理交联的胶原凝胶存在使胶原变性的问题和由交联程度不足导致的凝胶机械强度较低的问题，而化学交联法增强胶原凝胶过程中的化学溶剂、交联剂残留会导致潜在生物安全隐患。针对上述问题，本发明旨在提供一种尽可能减少甚至不引入其他外加组分及减少外部设备使用的条件下获得高强度的胶原凝胶，尤其是一种高强度3D胶原凝胶，并相应提供一种能够制得上述胶原凝胶的可规模化工业应用的方法。 

本发明首先采用清洁的高能辐射技术制备高交联度的胶原水凝胶，无外源物引入、残留，然后利用辐射交联胶原凝胶的自收缩性质，通过简单工艺获得高强度3D胶原凝胶。 

本发明对上述技术问题的解决具体是采用以下技术方案实现的。 

本发明中的高强度胶原水凝胶，是通过将辐射交联的低密度胶原水凝胶浸没于水或水溶液中一定时间，维持一定温度使其发生三维尺寸收缩而得。对凝胶进行冷冻干燥还可获得具有多孔微结构的冻干凝胶，而利用冷冻干燥-溶胀后包覆技术可装载生长因子和负载药物，即干凝胶在接触到盐缓冲溶液、药物/生 长因子溶液、细胞培养基及体液时重新溶胀，成为功能化的支架材料；再次干燥所得载有药物和生长因子的冻干凝胶还能干态保存，避免活性因子的失活和泄漏。此外，通过限制还能使胶原凝胶仅在局部发生收缩，从而获得特殊形状的非均质材料，冷冻干燥后可得孔径呈梯度分布的支架。 

所述的辐射交联低密度胶原水凝胶是通过对胶原水溶液或者其与其他天然高分子、水溶性合成高分子、乙烯基类单体组成的共混水溶液，进行高能辐射交联制备而成。 

所述用于浸没胶原凝胶使其发生收缩的水溶液可以是磷酸盐缓冲液或浓度在0～5mol/L之间的氯化钠、氯化钙、氯化钾、硫酸钠水溶液或MEM、DMEM、1640培养基。 

所述用于诱导胶原凝胶发生自行收缩的温度为30～40℃。 

所述供胶原凝胶收缩的时间为2～72h。 

所述的高能辐射为γ射线或高能电子束，用于辐射交联，辐照剂量为1～50kGy。 

所述胶原水溶液的重量百分浓度为0.1～10％。 

所述天然高分子可以为葡聚糖、糖胺聚糖、海藻酸、藻酸盐、改性纤维素、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白的一种或多种。 

所述葡聚糖选自α-葡聚糖(右旋糖酐)、β-葡聚糖及其胺基化、羧基化、磷酸化、磺化、氧化改性产物中的一种或多种。 

所述糖胺聚糖组分选自透明质酸、肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素及其丙烯酸酯化、甲基丙烯酸酯化产物的一种或多种。 

所述藻酸盐组分选自海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙及其丙烯酸酯化、甲基丙烯酸酯化产物的一种或多种。 

所述改性纤维素组分选自甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素中的一种或多种。 

所述共混水溶液中胶原与其他组分的共混比例为10∶0～5∶5。 

所述冷冻干燥的温度在-20～-196℃。 

所述生长因子水溶液可选择本领域技术人员常用的血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子等促进血管化的生长因子的水溶液，或是可以促进牙周组织、皮肤组织及骨组织再生修复的碱性成纤维细胞生长因子水溶液，也可是人表皮生长因子、神经生长因子水溶液等。此外，通过将冻干凝胶浸没于富血小板血浆重新溶胀后再次冷冻干燥，还可获得富血小板血浆涂层的组织工程支架，其中包含的多种生长因子将在增强与干细胞间相互作用和诱导支架-组织整合方面发挥积极影响。 

所述药物水溶液可选择本领域常用的抗生素、消炎药、烧烫伤药、抗栓塞剂等药物水溶液，使之具有相应的辅助治疗作用，其用量可采用本领域常规用量。 

同时本发明提供一种高孔隙率且孔径梯度分布的胶原基多孔基质。 

通过本发明得到的高强度胶原水凝胶，在经过溶液浸泡的自收缩后，压缩模量可提高至初始低密度水凝胶的2-5倍。由辐射交联所得的低密度胶原水凝胶自身模量就能达到0.1-0.3MPa，在30℃以上温度的水中凝胶即表现出自收缩行为(附图1)，且不同离子强度介质(浓度在0～5mol/L之间的氯化钠水溶液)中的凝胶将呈现不同的体积相转变速率(附图2)。当温度下降时，收缩不可恢复。此水凝胶可直接作为药物、生长因子载体，由环境响应性的收缩起到浓缩和缓释功能；作为细胞载体，自收缩凝胶将为包埋的间充质干细胞等提供挤压的刺激，以促进细胞激活表达基因，诱导分化进程；由天然高分子组成的水凝 胶，可完全生物降解，因而可兼为组织工程支架应用，且因具有高强度，所以能作为软骨等硬组织修复材料。此外，凝胶的收缩在三个维度同时发生，凝胶内孔径也随之发生缩减，对经不同时间处理的各个收缩程度的凝胶行冷冻干燥，将进一步获得微观结构可灵活调控的冻干凝胶，于药物/生长因子水溶液、细胞培养基中溶胀后可用作功能化组织工程支架。 

由此得出，本发明制备的自收缩生物基水凝胶至少具有下列优点及有益效果： 

(1)由本发明制备的胶原水凝胶，具有超过现有单一胶原组分材料的高机械强度，且有三维形状。 

(2)本发明应用高能辐射技术交联天然材料制备水凝胶，交联在纯水体系中完成，无化学溶剂、交联剂等对人体有毒害作用或刺激性成分的引入，且交联程度高，产物纯净，生物安全性高，相容性好。 

(3)本发明的制备方法简便、可控且有良好的可重复性，便于工业应用。 

(4)本发明可制备的产品形式、结构、性能多样。 

附图说明

图1是本发明制备的胶原水凝胶的热缩行为曲线。 

图2是本发明制备的胶原水凝胶在不同浓度氯化钠溶液中的收缩曲线。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1 

将固含量约10％的胶原水溶液，注入特定模具，脱除气泡后密封，用高能电子束辐照25kGy，得到初始水凝胶，压缩模量0.3MPa。将此水凝胶浸没于37℃水 中，24h凝胶自行收缩40％，压缩模量0.8MPa，提高至初始水凝胶的2.67倍；72h凝胶自行收缩80％，压缩模量1.5MPa，提高至初始水凝胶的5倍。 

实施例2 

将固含量约0.3％的胶原水溶液注入模具，脱泡密封，用⁶⁰Coγ射线辐照5kGy，得到初始水凝胶，压缩模量0.02MPa。将凝胶置于磷酸盐缓冲溶液中37℃恒温24h，即收缩超过80％，压缩模量提高至0.06MPa，提高至初始水凝胶的3倍。 

实施例3 

将含水胶原(固含量约5％)与透明质酸水溶液按胶原/透明质酸质量比98/2配成总质量分数3％的共混液(超声分散磷酸三钙β-TCP)，搅拌机充分搅拌，脱除气泡注入特定模具，密封后迅速用电子束辐照10kGy获得三元复合水凝胶。将一大小适宜的电热环(37℃)或内部循环温水的环形物套在凝胶中央位置，恒温一段时间诱导凝胶中部收缩，得到哑铃形材料，可作为有形的骨组织工程支架，培养骨髓基质细胞用于骨缺损修复。 

实施例4 

将含水胶原(固含量约1.5％)与胺基化右旋糖酐水溶液(质量分数15％)按胶原/葡聚糖质量比9∶1的比例配成总质量分数0.5％的共混水溶液，添加碱性成纤维细胞生长因子，使其质量浓度达到50ng/ml，用搅拌机充分共混，脱除气泡，注入特定模具，密封后用⁶⁰Coγ射线辐照5kGy，得到复合生长因子的仿生水凝胶。将凝胶的一部分浸于37℃盐溶液中24h，取出凝胶于-80℃无水乙醇浴中速冻，真空冷冻干燥，得到高孔隙率且孔径梯度分布的胶原基多孔基质。 

实施例5 

在体外向实施例1-4中制备的水凝胶/冻干凝胶上种植成纤维细胞、成骨细胞、间充质干细胞等的高密度悬液，其后于37℃共培养，凝胶收缩的同时将给 予细胞力场刺激，一段时候后可获得材料-细胞复合物，用于体内移植。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (11)

1.一种高强度胶原凝胶，其特征在于所述高强度胶原凝胶通过将辐射交联的低密度胶原水凝胶浸没于水或水溶液中一定时间，维持一定温度使其发生三维尺寸收缩，由此低密度胶原水凝胶的强度显著提高。

2.如权利要求1所述的高强度胶原凝胶，其压缩模量是所述低密度胶原水凝胶的2-5倍。

3.如权利要求1所述的高强度胶原凝胶，还具有三维结构。

4.如权利要求1所述的高强度胶原凝胶，为一种高孔隙率且孔径梯度分布的胶原基多孔基质。

5.一种制备高强度胶原凝胶的方法，将辐射交联的低密度胶原水凝胶浸没于水或水溶液中一定时间，维持一定温度使其发生三维尺寸收缩制得所述高强度胶原凝胶。

6.如权利要求5所述的方法，所述低密度胶原水凝胶是通过对胶原水溶液或者其与其他天然高分子、水溶性合成高分子、乙烯基类单体组成的共混水溶液，进行高能辐射交联制备而成；所述水溶液是磷酸盐缓冲液或浓度在0～5mol/L之间的氯化钠、氯化钙、氯化钾、硫酸钠水溶液或MEM、DMEM、1640培养基；用于诱导胶原凝胶发生自收缩的温度为30～40℃，供胶原凝胶收缩的时间为2～72h。

7.如权利要求6所述的方法，所述高能辐射为γ射线或高能电子束，辐照剂量为1～50kGy。

8.如权利要求6所述的方法，所述胶原水溶液的重量百分浓度为0.1～10％；所述天然高分子为葡聚糖、糖胺聚糖、海藻酸、藻酸盐、改性纤维素、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白的一种或多种；所述合成高分子为聚乙烯醇、聚乙二醇或其丙烯酸酯化产物、甲基丙烯酸酯化产物中的一种或多种；所述乙烯基类单体为丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮中的一种或多种；所述共混水溶液中胶原与其他组分的共混比例为10∶0～5∶5。

9.如权利要求8所述的葡聚糖选自α-葡聚糖(右旋糖酐)、β-葡聚糖及其胺基化、羧基化、磷酸化、磺化、氧化改性产物中的一种或多种；所述糖胺聚糖组分选自透明质酸、肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素及其丙烯酸酯化、甲基丙烯酸酯化产物的一种或多种；所述藻酸盐组分选自海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙及其丙烯酸酯化、甲基丙烯酸酯化产物的一种或多种；所述改性纤维素组分选自甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素中的一种或多种。

10.如权利要求5所述的方法，进一步包括对凝胶进行冷冻干燥获得具有多孔微结构的冻干凝胶，利用冷冻干燥-溶胀后包覆技术装载生长因子和负载药物成为功能化支架材料，干燥所得载有药物和生长因子的冻干凝胶进行干态保存；此外，使胶原凝胶仅在局部发生收缩，获得特殊形状的非均质材料，冷冻干燥后获得孔径呈梯度分布的支架。

11.如权利要求10所述的方法，所述冷冻干燥的温度在-20～-196℃。