CN110678587A - 线及其制备方法 - Google Patents

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竹泽俊明
青木茂久
江内田宽
宫崎歩
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Research Institute Of Food And Nutrition
Saga University NUC
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Abstract

本发明提供可以使用强度差于天然胶原凝胶的水凝胶作为原料的线的制备方法。本发明还提供通过所述制备方法而得到的具有优良强度的线。线的制备方法依次包括：对柱状水凝胶照射紫外线的工序A；将所述紫外线照射后的柱状水凝胶进行玻璃化，得到线状水凝胶干燥体的工序B；以及所述线状水凝胶干燥体进行再水合，得到线状玻璃化凝胶的工序C。线由玻璃化凝胶干燥体构成且附着或含浸有疏水性溶剂。

Description

线及其制备方法
技术领域
本发明涉及线及其制备方法。
本申请基于2017年5月18日在日本申请的特愿2017-098931号主张优先权，并将其内容引用于此。
背景技术
到目前为止，本发明的发明人开发了端胶原玻璃化凝胶膜，并证实其可以再生皮肤、角膜、气管、关节软骨、鼓膜以及食道等的损伤组织。这一过程中得知，端胶原玻璃化凝胶膜是在创伤部具有上皮化促进效果以及瘢痕形成抑制效果的生物相容性素材。
在这一背景下，皮肤的组织再生中有用的端胶原玻璃化凝胶膜，已经被制药企业等作为医疗器械进行了研究开发。另一方面，作为以在日本可使用的端胶原为原料的人工真皮，存在Integra(注册商标)(Integra Life Sciences社制)、TERUDERMIS(注册商标)(Terumo社制)以及PELNAC(注册商标)(GUNZE社制)3种制品。这些人工真皮是由端胶原海绵和硅膜构成的真皮再建用的模板。从如上可知，端胶原玻璃化凝胶预期将扩大再生医疗领域的应用，因此不仅要求对膜状进行开发，还要求对线状进行开发。
另一方面，到目前为止，本发明的发明人开发了将天然胶原玻璃化凝胶加工为膜状、线状、管状等的任意形状的技术(例如，参照专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-204881号公报
发明内容
然而，端胶原凝胶的强度差于天然胶原凝胶，专利文献1中记载的方法中，难以使用强度差于天然胶原凝胶的端胶原等的水凝胶制备线状的玻璃化凝胶。
本发明鉴于上述情况，提供一种以强度差于天然胶原凝胶的水凝胶作为原料使用的线的制备方法。另外，本发明提供通过所述制备方法而得到的具有优良强度的线。
本发明的发明人为了达到上述目的进行了深入研究，其结果发现，通过对柱状的水凝胶实施紫外照射，并进行玻璃化、再水合，可以制备线状的端胶原玻璃化凝胶，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下的方式。
本发明的第1方式涉及的线的制备方法，其依次包括：
对柱状水凝胶照射紫外线的工序A；
将所述紫外线照射后的柱状水凝胶进行玻璃化，得到线状水凝胶干燥体的工序B；以及
将所述线状水凝胶干燥体进行再水合，得到线状玻璃化凝胶的工序C。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，可以包括：在所述工序C之后，进一步将所述线状玻璃化凝胶进行再玻璃化，得到线状玻璃化凝胶干燥体的工序D。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，可以包括：在所述工序D之后，对所述线状玻璃化凝胶干燥体再照射紫外线的工序E。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，可以包括：在所述工序E之后，进一步在再照射紫外线的所述线状玻璃化凝胶干燥体上附着或含浸疏水性溶剂的工序F。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，所述水凝胶可以为端胶原凝胶。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，所述线可以为可用作缝合线的组织再生线。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，所述线可以为细胞移植用载体。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，所述线可以为结膜瘘孔部的填补材料。
在上述第1方式涉及的线的制备方法中，所述线可以为腹膜炎抑制剂或腹膜纤维化抑制剂。
本发明的第2方式涉及的线，其由玻璃化凝胶干燥体构成且附着或含浸有疏水性溶剂。
所述线的断裂强度可以为0.1kgf以上。
所述线的断裂强度可以为0.2kgf以上。
所述玻璃化凝胶干燥体可以为端胶原玻璃化凝胶干燥体。
所述疏水性溶剂可以为硅油。
所述线可以为可用作缝合线的组织再生线。
所述线可以为细胞移植用载体。
所述线可以为结膜瘘孔部的填补材料。
所述线可以为腹膜炎抑制剂或腹膜纤维化抑制剂。
根据上述方式，可以提供能够使用强度差于天然胶原凝胶的水凝胶作为原料的线的制备方法。另外，还可以提供通过所述制备方法得到的具有优良强度的线。
附图说明
图1A为表示实施例1中各条件下线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1的断裂强度的图表。
图1B为表示实施例1中各条件下线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2的断裂强度的图表。
图1C为表示实施例1中各条件下聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)的断裂强度的图表。
图2为实施例2中使用浸润了硅油的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1缝合小鼠切开部的图像。
图3A为表示将实施例2中缝合第7天的使用浸润了硅油的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1(浸润体1)的小鼠缝合部的组织切片进行苏木精-伊红(HE)染色的结果的图像。
图3B为表示将实施例2中缝合第7天的使用聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)(干燥体3)的小鼠缝合部的组织切片进行HE染色的结果的图像。
图3C为表示将实施例2中缝合第7天的使用浸润了硅油的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1(浸润体1)的小鼠缝合部的组织切片利用抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin：α-SMA)抗体进行免疫染色的结果的图像。
图3D为表示将实施例2中缝合第7天的使用聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)(干燥体3)的小鼠缝合部的组织切片利用抗αSMA抗体进行免疫染色的结果的图像。
图4A为实施例3中将线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2用作填补材料填塞猪的结膜瘘孔部的图像。
图4B为实施例3中使用以往的填补材料的塑料端口填塞猪的结膜瘘孔部的图像。
图5A为实施例4中与内皮细胞共培养的经再水合的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1(再水合体1)的图像。
图5B为实施例4中与成纤维细胞共培养的经再水合的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1(再水合体1)的图像。
图5C为实施例4中与成纤维细胞共培养的经再水合的聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)(再水合体3)的图像。
图6A为实施例5中使用的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体(CXM1以及CXM5)的图像。
图6B为表示实施例5中将线状端胶原玻璃化凝胶干燥体插入小鼠腹腔内的方法的图。
图6C为表示实施例5中将线状端胶原玻璃化凝胶干燥体插入小鼠腹腔内的情况的图像。
图7A为表示实施例5中腹膜炎诱导后第40天开腹的各组小鼠的腹膜的情况的图像。上图为表示开腹的小鼠的腹部整体的图像，下图为放大腹膜的图像。比例尺表示1cm。
图7B为实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的组织切片的HE染色图像。上图为壁侧腹膜的HE染色图像，下图为脏侧腹膜的HE染色图像。比例尺表示100μm。
图7C为实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的壁侧腹膜组织切片的Azan染色图像。比例尺表示200μm。
图7D为表示实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的纤维化的腹膜的间皮下结缔组织厚度的图表。
图8A为表示实施例5中腹膜炎诱导后第56天开腹的各组小鼠的腹膜的情况的图像。上图为表示开腹的小鼠的腹部整体的图像，下图为将腹膜放大的图像。比例尺表示1cm。
图8B为实施例5中腹膜炎诱导后第56天的各组小鼠的组织切片的HE染色图像。上图为壁侧腹膜的HE染色图像，下图为脏侧腹膜的HE染色图像。比例尺表示100μm。
图8C为实施例5中腹膜炎诱导后第56天的各组小鼠的壁侧腹膜组织切片的Azan染色图像。比例尺表示200μm。
图8D为表示实施例5中腹膜炎诱导后第56天的各组小鼠的纤维化的腹膜的间皮下结缔组织厚度的图表。
图9为实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的腹膜的组织切片利用各种抗体的免疫染色图像。利用抗细胞角蛋白AE1/AE3(CK AE1/AE3)抗体、抗波形蛋白抗体以及抗N-钙粘蛋白抗体的免疫染色图像的比例尺表示50μm。结缔组织生长因子(connectivetissue growth factor：CTGF)抗体以及抗α-SMA抗体的免疫染色图像的比例尺表示100μm。
图10A为实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的腹膜组织切片利用各种抗体的免疫染色图像。比例尺表示50μm。
图10B为表示实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的间皮下间质层(submesothelial interstitial layer：SMIL)中的CD45阳性细胞数的图表。
图10C为表示实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的SMIL中的F4/80阳性细胞数的图表。
图10D为表示实施例5中腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的SMIL中的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen：PCNA)阳性细胞的比例的图表。
具体实施方式
《线的制备方法》
＜第1实施方式＞
本发明的第1实施方式涉及的线的制备方法，其依次包括：
对柱状水凝胶照射紫外线的工序A；
将所述紫外线照射后的柱状水凝胶进行玻璃化，得到线状水凝胶干燥体的工序B；以及
将所述线状水凝胶干燥体进行再水合，得到线状玻璃化凝胶的工序C。
以往的制备方法中，不能使用强度差于天然胶原凝胶的水凝胶制备线。
与之相对，根据本实施方式的制备方法，即使使用强度差于天然胶原凝胶的水凝胶作为原料，也能够制备线。
以下，针对本实施方式的线的制备方法的各工序进行详细说明。
[工序A]
首先，对柱状水凝胶照射紫外线，提高柱状水凝胶的强度。
工序A中使用的柱状水凝胶，例如，使用将溶胶形成期望直径的筒状型等，并使其凝胶化而得到的柱状水凝胶即可。另外，进行凝胶化时将溶胶进行保温的温度，根据使用的溶胶的种类适当调整即可。例如，溶胶为胶原溶胶的情况下，进行凝胶化时的保温，低于依赖于使用的胶原的动物种类的胶原的改性温度的温度即可，一般可以在20℃以上37℃以下的温度下保温数分至数小时进行凝胶化。
此外，在本说明书中，“溶胶”是指由将液体作为分散剂的分散质的胶体粒子(尺寸：约1～数百nm左右)构成的溶胶，特别是由高分子化合物构成的溶胶。作为溶胶，更具体而言，为天然物高分子化合物或合成高分子化合物的水溶液。因此，通过这些高分子化合物的化学键导入交联而得到网眼结构时，会转换为在其网眼中保有大量水的半固态物质的“水凝胶”。即，“水凝胶”是指将溶胶凝胶化而得到的产物。
另外，“玻璃化凝胶”是指将以往的水凝胶玻璃化(vitrification)后进行再水合得到的处于稳定状态的凝胶，由本发明的发明人命名为“玻璃化凝胶(vitrigel)(注册商标)”。
另外，在本说明书中，对本实施方式的制备工序进行详细说明时，对于紧接在该玻璃化工序之后未经过再水合的工序的水凝胶的干燥体，仅称为“水凝胶干燥体”。并且，将该玻璃化工序之后经过再水合的工序得到的凝胶区别表示为“玻璃化凝胶”，将使该玻璃化凝胶玻璃化而得到的干燥体称为“玻璃化凝胶干燥体”。另外，将对玻璃化凝胶干燥体实施紫外线照射工序而得到的产物称为“再照射紫外线后的线状玻璃化凝胶干燥体”。因此，“玻璃化凝胶”为水合体。
另外，作为柱状水凝胶原料的溶胶，只要是具有生物相容性的材料即可，例如可举出凝胶化的来自细胞外基质的成分、纤维蛋白、琼脂、琼脂糖、纤维素等的天然高分子化合物，以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、poly(II-hydroxyethylmethacrylate)/polycaprolactone等的合成高分子化合物。
作为所述凝胶化的来自细胞外基质的成分，例如可举出胶原(I型、II型、III型、V型、XI型等)、由小鼠EHS肿瘤提取物(包括IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等)再构成的基底膜成分(商品名：Matrigel)、糖胺聚糖、透明质酸、蛋白多糖、明胶等，但并不限定于此。在各自的凝胶化中，可以选择最优的盐等的成分、其浓度、pH等，制备期望的玻璃化凝胶。另外，通过将原料组合，可以得到模仿各种活体内组织的玻璃化凝胶。
其中，作为溶胶，优选为凝胶化的来自细胞外基质的成分，更优选为胶原。另外，作为胶原中更优选的原料，可以例示出天然胶原或端胶原，进一步优选为端胶原。即，作为本工序中使用的水凝胶，由于是在创伤部具有上皮化促进效果以及瘢痕形成抑制效果的生物相容性素材，因此特别优选为端胶原凝胶。
另外，由上述例示的溶胶得到的水凝胶，根据其组成以及含量，成为与天然胶原凝胶具有同等强度的凝胶，或者成为强度差于天然胶原凝胶的凝胶。另外，也可以成为强度高于天然胶原凝胶的凝胶。任意强度的水凝胶，根据本实施方式的制备方法，均可以将由上述例示的溶胶得到的水凝胶作为原料而制备线。
此外，本说明书中“上皮化促进效果”是指：在创伤部的治愈过程中，抑制肉芽组织的形成，进而促进表皮细胞的增殖，从而促进再生上皮的形成。通过将由端胶原玻璃化凝胶干燥体构成的线作为缝合线使用，由于促进上皮化，因此可以期待比以往短时间内治愈创伤部。
另外，“瘢痕形成抑制效果”是指抑制创伤部治愈后留下的痕迹(瘢痕)，也就是伤痕形成抑制的效果。通过将由端胶原玻璃化凝胶干燥体构成的线作为缝合线使用，可以不留伤痕地治愈创伤部。
本工序中的紫外线对柱状水凝胶的照射能量，在继续进行水凝胶化的工序B中，例如在以悬挂柱状水凝胶的状态进行玻璃化的情况下，具有不断裂程度的强度即可，可以根据水凝胶的组成以及含量适当调整。紫外线对柱状水凝胶的照射能量，例如可以为0.1mJ/cm2以上6000mJ/cm2以下，例如可以为10mJ/cm2以上4000mJ/cm2以下，例如可以为100mJ/cm2以上3000mJ/cm2以下。
另外，紫外线对柱状水凝胶的照射，以使柱状水凝胶全面照射紫外线的方式，将紫外线的照射部位分为柱状水凝胶的一侧的面和另一侧的面(例如，“上面和下面”或者“表面和里面”等)分别照射，可将其总照射量作为对柱状水凝胶的每单位面积的紫外线总照射量。
[工序B]
接下来，通过将紫外线照射后的柱状水凝胶干燥、玻璃化，得到线状水凝胶干燥体。
通过使柱状水凝胶干燥，可以将柱状水凝胶内的自由水完全除去，进而可以进行结合水的部分除去。
该玻璃化工序(将柱状水凝胶内的自由水完全除去之后，进行结合水的部分除去的工序)的时间越长，再水合时可以得到透明度、强度更良好的线状玻璃化凝胶。此外，也可以根据需要将短时间玻璃化后进行再水合得到的线状玻璃化凝胶用PBS等洗净，进行再次玻璃化。
作为干燥方法，可以使用各种方法，例如风干、在密闭容器内的干燥(使容器内的空气循环，通常供给干燥空气)、放置有硅胶的环境下干燥等。例如，作为风干的方法，可以例示出在10℃、40％湿度下在保持无菌的培养箱中干燥2天，或者，在无菌状态的清洁工作台内室温干燥一昼夜等的方法。
另外，在本工序中，由于在上述的工序A中照射紫外线，柱状水凝胶具有适当的强度，干燥时，可以在悬挂在晾晒架等的状态下高效地进行干燥。
[工序C]
接下来，将得到的线状水凝胶干燥体进行再水合得到线状玻璃化凝胶。
这时，可以使用生理盐水、PBS(Phosphate Buffered Saline)等进行再水合。
＜第2实施方式＞
本发明的第2实施方式涉及的线的制备方法包括：在所述工序C之后，进一步将所述线状玻璃化凝胶进行再玻璃化，得到线状玻璃化凝胶干燥体的工序D。
根据本实施方式的制备方法，即使使用强度差于天然胶原凝胶的水凝胶作为原料，也能够制备线。
关于工序A～工序C，如上述的第1实施方式中的记载。关于本实施方式中的工序D，以下进行详细说明。
[工序D]
接下来，将得到的线状玻璃化凝胶干燥、再次玻璃化。
作为干燥方法，可举出与上述工序B中例示的方法同样的方法。
另外，在本工序中，由于线状玻璃化凝胶具有适当的强度，干燥时，可以在悬挂在晾晒架等的状态下高效地进行干燥。
＜第3实施方式＞
本发明的第3实施方式涉及的线的制备方法包括：在所述工序D之后，进一步对所述线状玻璃化凝胶干燥体再照射紫外线的工序E。
根据本实施方式的制备方法，即使使用比强度差于天然胶原凝胶的水凝胶作为原料，也能够制备线。另外，通过本实施方式的制备方法得到的线，具有优良的强度。
关于工序A～工序D，如上述的第1实施方式以及第2实施方式中的记载。关于本实施方式中的工序E，以下进行详细说明。
[工序E]
接下来，对得到的线状玻璃化凝胶干燥体再照射紫外线，进一步提高线状玻璃化凝胶干燥体的强度。
本工序中的紫外线对线状玻璃化凝胶干燥体的照射能量，只要是线状玻璃化凝胶干燥体用作缝合线等的情况下不断裂程度的强度即可，可以根据线状玻璃化凝胶干燥体的组成以及含量适当调整。紫外线对线状玻璃化凝胶干燥体的照射能量，例如可以为0.1mJ/cm2以上6000mJ/cm2以下，例如可以为10mJ/cm2以上4000mJ/cm2以下，例如可以为100mJ/cm2以上3000mJ/cm2。
另外，紫外线对线状玻璃化凝胶干燥体的照射，以使线状玻璃化凝胶干燥体全面照射紫外线的方式，将紫外线的照射部位为线状玻璃化凝胶干燥体的一侧的面和另一侧的面(例如，“上面和下面”或者“表面和里面”等)分别照射，可将其总照射量作为对线状玻璃化凝胶干燥体的每单位面积的紫外线总照射量。
＜第4实施方式＞
本发明的第4实施方式涉及的线的制备方法包括：在所述工序E之后，进一步在再照射紫外线的所述线状玻璃化凝胶干燥体上附着或含浸疏水性溶剂的工序F。
根据本实施方式的制备方法，可以将强度差于天然胶原凝胶的水凝胶作为原料制备线。另外，通过本实施方式的制备方法得到的线，由于疏水性溶剂作为润滑剂起作用，提高了柔软度，并且，由于含有疏水性溶剂，即使在水系溶剂的存在下也可以保持强度。
关于工序A～工序E，如上述的第1实施方式、第2实施方式以及第3实施方式的记载所述。关于本实施方式中的工序F，以下进行详细说明。
[工序F]
接下来，在再照射紫外线后的线状玻璃化凝胶干燥体上附着或含浸疏水性溶剂。由此，提高线状玻璃化凝胶干燥体的柔软度，在缝合线等的用途中使用时，疏水性溶剂作为润滑剂起作用，可以不挂住裂伤部，顺利进行缝合。另外，通过将疏水性溶剂附着在线状玻璃化凝胶干燥体的表面上，或者通过从表面正下方向内部含浸疏水性溶剂，可以防止由于缝合部中体液等导致的再水合而使强度降低，可以保持线的强度。
此外，在此所称的“附着”是指使疏水性溶剂附着在线状玻璃化凝胶干燥体的表面，“含浸”是指将疏水性溶剂从线状玻璃化凝胶干燥体的表面正下方渗入内部。
作为本工序中使用的疏水性溶剂，具有生物相容性的疏水性溶剂即可，可示例出公知的医疗用途中使用的疏水性溶剂。作为疏水性溶剂，具体地，例如可举出医疗用石蜡；来自植物、海产品或者动物源的液状油(例如，橄榄油、玉米油、大豆油、芥花油、棉籽油、棕榈油、芝麻油、向日葵油、琉璃苣籽油、丁香油、大麻籽油、鲱鱼油、鳕鱼肝油、鲑鱼油、亚麻籽油、麦芽油、月见草油以及它们任意比例的混合物等)；亚油酸和亚麻酸、γ-亚油酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)、以及二十二碳六烯酸(DHA)等的含有ω-3以及ω-6脂肪酸的多价不饱和油；来自玫瑰、茶树、罗勒、樟脑、豆蔻、胡萝卜、香茅、南欧丹参(香紫苏)、山艾、丁香、柏树、乳香、姜、葡萄柚、牛膝草、茉莉、薰衣草、柠檬、中国柑桔、墨角兰、没药、橙花油、肉豆蔻、苦橙、鼠尾草、柑橘、香草以及马鞭草等的精油；甘油三酸酯油，硅油等，但并不限定于此。这些疏水性溶剂可以单独使用，也可以组合使用。
其中，作为疏水性溶剂，优选为硅油。硅油可以为未经改性的硅油，也可以为经改性的硅油。作为硅油，更具体地，例如可举出聚二甲基硅氧烷、聚甲基苯基硅氧烷、聚二苯基硅氧烷、聚甲基氢硅氧烷等，但并不限定于此。
附着或含浸疏水性溶剂的温度，没有特别的限定，例如可以为10℃以上40℃以下。
附着或含浸疏水性溶剂的时间，没有特别的限定，例如可以为30分钟以上48小时以下。
作为附着或含浸疏水性溶剂的方法，例如可举出将线状玻璃化凝胶干燥体浸渍在疏水性溶剂中的方法、在线状玻璃化凝胶干燥体上涂布疏水性溶剂的方法、在线状玻璃化凝胶干燥体上喷雾疏水性溶剂的方法等，但并不限定于此。
＜用途＞
通过本实施方式的制备方法得到的线，如后述的实施例所示，例如可以用作组织再生线、细胞移植用载体等。或者，如后述的实施例所示，通过本实施方式的制备方法得到的线，可以作为玻璃体手术时用于将治疗器械插入玻璃体内而制作的结膜瘘孔部的填补材料使用。另外，如后述的实施例中所示，通过本实施方式的制备方法得到的线，可以用作插入腹腔内抑制腹膜炎以及腹膜纤维化的留置材料使用。
线
本发明的一个实施方式涉及的线，由玻璃化凝胶干燥体构成，且附着或含浸有疏水性溶剂。
本实施方式的线，虽由玻璃化凝胶干燥体构成，但由于具有优良的强度，可以作为缝合线等利用。另外，本实施方式的线，由于疏水性溶剂作为润滑剂起作用，提高了柔软度，并且，由于含有疏水性溶剂，在水系溶剂的存在下也能保持强度。因此，将本实施方式的线用作缝合线的情况下，手术后缝合部不会分离，保持缝合状态。
＜物性＞
本实施方式的线的横断面的形状，没有特别的限定，例如可举出三角形、四角形(包括正方形、长方形、台形)、五角形、六角形、七角形、八角形等的多角形；圆形、椭圆形、近圆形、椭圆形、近椭圆形、半圆形，扇形等，但并不限定于此。其中，线的横断面的形状，优选为圆形。
另外，本实施方式的线的横断面的形状为圆形的情况下，其平均直径可以根据用途适当选择。作为线的平均直径，例如可以为1μm以上1mm以下，例如可以为3μm以上900μm以下。
本实施方式的线的断裂强度，为在缝合线等的用途中使用的情况下不断裂程度的强度即可。作为线的断裂强度，具体地，例如可以为0.1kgf以上，例如可以为0.2kgf以上。通过使线的断裂强度的下限值在上述范围以上，可以具有在缝合线等的用途使用的情况下不断裂程度的强度。
此外，线的断裂强度的测定方法如下所述。
使用数字测力计(日本NIDEC-SHIMPO社制)，将线切断为全长5cm后固定两端的1cm，测定以每分钟9mm拉伸时的断裂强度(kgf)即可。
接下来，以下针对本实施方式的线的构成成分，进行详细说明。
＜玻璃化凝胶干燥体＞
本实施方式的线由玻璃化凝胶干燥体构成。
作为玻璃化凝胶干燥体的原料的溶胶，可举出与在上述线的制备方法中例示的溶胶同样的溶胶。其中，作为构成本实施方式的线的玻璃化凝胶干燥体，从作为具有创伤部的上皮化促进效果以及瘢痕形成抑制效果的生物相容性素材来考虑，优选为端胶原玻璃化凝胶干燥体。
＜疏水性溶剂＞
本实施方式的线附着或含浸有疏水性溶剂。
作为疏水性溶剂，可举出与上述线的制备方法中例示的溶剂同样的溶剂。其中，作为本实施方式的线中含有的疏水性溶剂，优选为硅油。
＜用途＞
如后述的实施例中所示，本实施方式的线具有良好的强度，并且，即使存在体液等，也能保持其强度，因此作为缝合线是有用的。进而，将本实施方式的线作为缝合线使用的情况下，在创伤部促进组织再生，并且不形成瘢痕。即，本实施方式的线作为可用作缝合线使用的组织再生线是有用的。
特别地，本实施方式的线由端胶原玻璃化凝胶干燥体构成的情况下，由于在创伤部具有上皮化促进效果以及瘢痕形成抑制效果，适合作为组织再生线。
此外，在本说明书中，“组织再生线”是指促进缝合部中组织再生的线。在此，具体地，“促进组织再生”表示创伤部的治愈过程中促进伤口收缩，抑制肉芽组织的形成，促进表皮细胞的增殖导致的再生上皮的形成等。
另外，如后述的实施例中所示，本实施方式的线具有优良的细胞粘着性以及细胞增殖性。由此，可以使用本实施方式的线培养期望的细胞，并将粘着有该细胞状态的线移植入受检体的活体。即，本实施方式的线作为细胞移植用载体是有用的。
另外，如后述的实施例中所示，本实施方式的线作为玻璃体手术时用于将治疗器械插入玻璃体内而制作的结膜瘘孔部的填补材料是有用的。
另外，本实施方式的线由端胶原玻璃化凝胶干燥体构成的情况下，如后述的实施例中所示，具有对壁侧腹膜以及脏侧腹膜的炎症以及纤维化的抑制作用。进而，具有对脏侧腹膜(肠道之间)的粘连的抑制作用。另外，本实施方式的线留置在活体内也是安全的，在腹膜以外的组织中也同样具有炎症抑制作用或纤维化抑制作用。即，本实施方式的线作为炎症抑制剂或纤维化抑制剂(特别是腹膜炎抑制剂或腹膜纤维化抑制剂)是有用的。另外，本实施方式的线作为肠道粘连抑制剂是有用的。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行说明，本发明不受以下实施例的限定。
[制备例1]线的制备
(1)柱状端胶原凝胶的调制
首先，调制将1.0％猪端胶原溶液(关东化学社制)与无血清培养液等量混和的0.5％的来自猪的端胶原溶液。接下来，将调制的端胶原溶液分别在1mL吸头内吸入1.4mL，在5mL吸头内吸入7mL。接下来，将各吸头的两端用封口膜(PARAFILM)密封，在细胞培养用培养箱(37℃，5％CO2)内静置2小时使其凝胶化，调制柱状端胶原凝胶。
(2)对柱状端胶原凝胶的紫外线照射
接下来，从各吸头的两端除去封口膜。从吸头内取出柱状端胶原凝胶，将其在铺有乙烯片材的平面状托盘上以直线拉伸状态静置。接下来，照射紫外线(照射能量：800mJ/cm2)，将柱状端胶原凝胶翻转，再次照射紫外线(照射能量：800mJ/cm2)。合计的紫外线照射能量为1600mJ/cm2。
(3)线状端胶原凝胶干燥体的调制
接下来，将经紫外线照射柱状端胶原凝胶的一端固定悬挂在聚丙烯树脂制的晾晒架的边缘上。接下来，在具备温度10℃、湿度40％的条件的恒温恒湿机的简易清洁工作台内充分风干，使悬挂状态的柱状端胶原凝胶玻璃化，调制了线状端胶原凝胶干燥体。
(4)线状端胶原玻璃化凝胶的调制
接下来，将得到的线状端胶原凝胶干燥体用PBS再水合，调制线状端胶原玻璃化凝胶。
(5)线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的调制
接下来，将得到的线状端胶原玻璃化凝胶的一端固定悬挂在聚丙烯树脂制的晾晒架的边缘上。接下来，在具备温度10℃、湿度40％的条件的恒温恒湿机的简易清洁工作台内充分风干，使悬挂状态的线状端胶原凝胶再玻璃化，调制了线状端胶原玻璃化凝胶干燥体。
(6)对线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的紫外线照射
接下来，将得到的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体在平面状托盘上以直线拉伸状态静置。接下来，照射紫外线(照射能量：400mJ/cm2)，将线状端胶原凝胶翻转，再次照射紫外线((照射能量：400mJ/cm2)。合计的紫外线照射能量为800mJ/cm2。
关于得到的紫外线照射后的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的平均直径，使用1mL的吸头制备的干燥体(以下也称为“线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1”)为148±42μm，使用5mL的吸头制备的干燥体(以下也称为“线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2”)为444±30μm。
[实施例1]线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的断裂强度确认试验
测定制备例1制备的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1以及线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2的断裂强度。
作为测定对象，准备线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1(以下也称为“干燥体1”)、将干燥体1再水合的线状端胶原玻璃化凝胶(以下也称为“再水合体1”)、浸润了硅油的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1(以下也称为“浸润体1”)、线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2(以下也称为“干燥体2”)、将干燥体2再水合的线状端胶原玻璃化凝胶(以下也称为“再水合体2”)以及浸润了硅油的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2(以下也称为“浸润体2”)。
另外，作为对照，准备聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)(7-0，缝合线的规格的平均直径：50-69μm左右)(以下也称为“干燥体3”)，将干燥体3再水合的VICRYL(注册商标)(以下也称为“再水合体3”)以及浸润了硅油的VICRYL(注册商标)(以下也称为“浸润体3”)。
另外，作为断裂强度的具体的测定方法，使用数字测力计(日本NIDEC-SHIMPO社制)，切断为全长5cm后固定两端的1cm，测量以每分钟9mm拉伸时的断裂强度(kgf)。结果如图1A、图1B以及图1C所示。
图1A表示各条件下线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1的断裂强度的图，图1B表示各条件下线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2的断裂强度的图，图1C表示各条件下聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)的断裂强度的图。
从图1A-图1C确认到，干燥体1以及浸润体1，与作为对照的VICRYL(注册商标)的干燥体3、再水合体3以及浸润体3具有基本相等的断裂强度。另一方面，再水合体1以及再水合体2的断裂强度比0.1kgf更小。
另外，还确认到干燥体2以及浸润体2的断裂强度比1kgf更大，比作为对照的VICRYL(注册商标)的干燥体3、再水合体3以及浸润体3具有更好的强度。推测这是由于平均直径的大小造成的。
[实施例2]使用线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的小鼠切开部的缝合试验为了确认浸润了硅油的制备例1得到的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1(浸润体1)能够承担手术用的强度，进行小鼠表皮切开部的缝合试验。进行缝合当天的小鼠的图像如图2所示。
从图2确认到，浸润体1充分具有作为缝合线的强度，手术后不发生创口分离。
另外，制作缝合第7天的缝合部的组织切片，进行苏木精-伊红(HE)染色以及使用抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin：α-SMA)抗体的免疫染色。HE染色的结果如图3A所示，抗α-SMA抗体的免疫染色结果如图3C所示。
进而，使用作为对照的聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)(7-0，缝合线的规格的平均直径：50-69μm左右)(干燥体3)进行小鼠表皮切开部的缝合试验。与使用浸润体1时同样地，制作缝合第7天的缝合部的组织切片，进行HE染色以及使用抗α-SMA抗体的免疫染色。HE染色的结果如图3B所示，抗α-SMA抗体的免疫染色结果如图3D所示。
从图3A以及图3B确认到，使用浸润体1的缝合部，与干燥体3同样地被良好地结扎，组织彼此结合。
进而，从图3C以及图3D可知，与使用干燥体3的情况相比，使用浸润体1的情况下，作为瘢痕形成主体的αSMA阳性的肌成纤维细胞数在缝合部周围压倒性地少。
[实施例3]使用线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的猪结膜瘘孔部的填充试验
为了确认制备例1得到的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2(干燥体2)具有良好的强度，在猪的结膜缺损部(瘘孔部)作为填补材料使用。作为填补材料埋入当天的猪结膜瘘孔部的图像如图4A所示。在图4A中，箭头表示埋入的干燥体2。
另外，作为对照，埋入通常作为结膜瘘孔部的填补材料使用的塑料端口。其结果如图4B所示。在图4B中，箭头表示埋入的塑料端口。
从图4A以及图4B确认到，干燥体2具有优良的强度，可以作为填塞结膜瘘孔部的填补材料利用。
[实施例4]使用线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的细胞粘着性以及增殖性确认试验
为了确认制备例1中将线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1再水合的再水合体(再水合体1)具有良好的细胞粘着性以及增殖性，进行了使用内皮细胞以及成纤维细胞的细胞培养试验。
具体地，将内皮细胞(MS-1，ATCC(American Type Culture Collection))以及成纤维细胞(Wistar rat由来初代培养真皮成纤维细胞)分别与切断为5cm的再水合体1在培养皿中共培养10天。培养后，取出再水合体1，进行HE染色，使用光学显微镜(OLYMPUS社制，BX53)观察。图5A为表示与内皮细胞共培养的再水合体1的图像，图5B为表示与成纤维细胞共培养的再水合体1的图像。在图5A中，箭头表示粘着在再水合体1上的内皮细胞。
进而，对于作为对照的制备例1中将聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)进行再水合的再水合体(再水合体3)，同样地，切断为5cm，与成纤维细胞在培养皿中共培养10天。培养后，取出再水合体3，进行HE染色，使用光学显微镜(OLYMPUS社制，BX53)观察。图5C为表示与成纤维细胞共培养的再水合体3的图像。
从图5C可知，使用再水合的聚乳糖缝合线VICRYL(注册商标)的情况下，仅极少数的细胞粘着，并且增殖也很少。另一方面，从图5B可知，使用再水合的线状端胶原玻璃化凝胶的情况下，多数的细胞粘着并且增殖。
另外，从图5A以及图5B确认到，经再水合的线状端胶原玻璃化凝胶显示出与内皮细胞以及成纤维细胞良好的粘着性以及增殖性。
[实施例5]使用线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的腹膜炎抑制效果以及腹膜纤维化抑制效果确认试验
调查将制备例1制备的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1以及线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2留置在腹膜纤维化模型小鼠中造成的影响。
(1)线状端胶原玻璃化凝胶干燥体在小鼠腹腔内的插入以及留置
图6A为表示制备例1制备的线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1以及线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2的图像。在图6A中，“CXM1”表示线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1，“CXM5”表示线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2。另外，图6B为表示线状端胶原玻璃化凝胶干燥体在小鼠腹腔内的插入方法的图。
在体重40g的雌性ICR小鼠的腹腔内，使用留置针以及镊子，将线状端胶原玻璃化凝胶干燥体1以及线状端胶原玻璃化凝胶干燥体2分别进行插入并留置(参照图6C)。
(2)通过氯己定的腹腔内注入的腹膜纤维化模型小鼠的诱导
留置线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的第二天，在该小鼠的腹腔内将0.1％的氯己定溶液(使用含15％乙醇的生理盐水溶液预先调制)以体重每1kg给药10mL的给药量，每隔1天进行给药。
此外，包括对照试验组在内，准备以下的4组。
Sham组：仅针穿刺，未腹腔内注射氯己定
CG组：仅腹腔内注射氯己定
Gel组：腹腔内注入端胶原凝胶，腹腔内注射氯己定
CXM组：腹腔内插入线状端胶原玻璃化凝胶干燥体，腹腔内注射氯己定
(3)腹膜的観察
在腹膜炎诱导后第40天以及第56天，分别将各组的小鼠中的1只开腹，通过目視观察。结果如图7A(腹膜炎诱导后第40天)以及图8A(腹膜炎诱导后第56天)所示。在图7A中，CG组以及Gel组中记载的箭头表示腹膜与肠道的粘连，Gel组中记载的箭头表示留置在腹膜内的胶原凝胶，CXM组中记载的箭头表示留置在腹膜的线状端胶原玻璃化凝胶。另外，在图8A中，CG组中记载的箭头表示腹膜与肠道的粘连，CXM组中记载的箭头表示留置在腹膜内的线状端胶原玻璃化凝胶。
(4)HE染色以及Azan染色
接下来，制作腹膜炎诱导后第40天以及第56天的各组小鼠的腹膜组织切片，进行了HE染色以及Azan染色。腹膜炎诱导后第40天的各组的小鼠的结果如图7B(HE染色图像)以及图7C(Azan染色图像)所示。另外，腹膜炎诱导后第56天的各组的小鼠的结果如图8B(HE染色图像)以及图8C(Azan染色图像)所示。
在图7B以及图8B中，上图为壁侧腹膜的HE染色图像，下图为脏侧腹膜的HE染色图像。比例尺表示100μm。另外，在图7C以及图8C中，比例尺表示200μm。
进而，从图7C以及图8C分别表示的Azan染色图像中，测定各组小鼠的间皮下结缔组织的厚度(μm)，将其平均值图表化(参照图7D以及图8D)。
从图7A-图7D可知，腹膜炎诱导后第40天的时点，与CG组相比较，Gel组以及CMX组的壁侧腹膜的纤维化显著被抑制。另外，与Gel组相比，CMX组的壁侧腹膜的纤维化抑制效果尤为显著。
另外，从图8A-图8D可知，腹膜炎诱导后第56天的时点，与CG组相比较，CMX组的壁侧腹膜的纤维化显著被抑制。另外，此后，CG组的体重显著减少，试验无法继续。
(5)使用针对纤维化标志物的抗体的免疫染色
接下来，制作腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的腹膜组织切片，使用各种抗体进行了免疫染色。使用的抗体如下所示。
抗细胞角蛋白AE1/AE3(CK AE1/AE3)抗体：CK AE1/AE3为通用的上皮性标志物。
抗波形蛋白(Vimentin)抗体：波形蛋白是间质细胞中特有的中间丝。间质细胞的标志物。
抗N-钙粘蛋白(N-cadherin)抗体：上皮细胞分化为间质细胞的过程中，表达N-钙粘蛋白。上皮-间质分化转变的标志物。
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor：CTGF)抗体：CTGF是使成纤维细胞的增殖和胶原的产生冗余的因子。纤维化标志物。
抗α-SMA抗体：上皮细胞分化为间质细胞的过程中，表达α-SMA。上皮-间质分化转变的标志物。
另外，免疫染色的结果如图9所示。在图9中，利用抗CK AE1/AE3抗体、抗波形蛋白抗体以及抗N-钙粘蛋白抗体的免疫染色图像的比例尺表示50μm。利用抗CTGF抗体以及抗α-SMA的免疫染色图像的比例尺表示100μm。另外，在图9的利用抗α-SMA抗体的免疫染色图像中，箭头表示作为阳性对照的血管壁。
从图9可知，腹膜炎诱导后第40天的时点，与CG组相比较，CXM组的波形蛋白阳性细胞、N-钙粘蛋白阳性细胞以及α-SMA阳性细胞的出现被抑制。这意味着作为腹膜的纤维化原因的间皮细胞的上皮-间质分化转变和肌成纤维细胞的出现被抑制。
(6)使用针对炎症标志物的抗体的免疫染色
接下来，制作腹膜炎诱导后第40天的各组小鼠的腹膜组织切片，使用各种抗体进行了免疫染色。使用的抗体如下所示。
抗CD45抗体：CD45为白细胞的标志物。
抗F4/80抗体：F4/80为小鼠的成熟巨噬细胞的标志物。
抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen：PCNA)抗体：PCNA为细胞周期相关核蛋白质。细胞增殖和细胞周期的标志物(G1-S期)。
另外，免疫染色的结果如图10A所示。在图10A中，比例尺表示50μm。
进而，从图10A的各免疫染色图像中，算出小鼠的间皮下间质层(submesothelialinterstitial layer：SMIL)中CD45阳性细胞数、F4/80阳性细胞数以及PCNA阳性细胞的比例，并图表化(参照图10B-图10D)。此外，图10B以及图10C中，将各阳性细胞数用面积(mm2)表示，图10D中，用相对于SMIL总体的面积的PCNA阳性细胞的面积的比例(％)表示。
从图10A-图10D可知，腹膜炎诱导后第40天的时点，与CG组相比较，CXM组的CD45阳性的白细胞、F4/80阳性的巨噬细胞以及PCNA阳性的间质细胞的出現显著被抑制。由该结果启示，CMX组中，通过腹膜炎被抑制，腹膜纤维化被抑制。
由以上可知，线状端胶原玻璃化凝胶干燥体，抑制氯己定引起的腹膜的炎症以及纤维化。凝胶状的胶原中也确定了同样的腹膜的炎症抑制效果以及纤维化抑制效果，线状端胶原玻璃化凝胶干燥体和凝胶状的胶原之间的效果有显著差异。即，线状端胶原玻璃化凝胶干燥体比凝胶状的胶原具有更显著优良的腹膜的炎症抑制效果以及纤维化抑制效果。
另外，腹膜炎诱导后第56天时，线状端胶原玻璃化凝胶干燥体的性状也未见大的变化(参照图8A-图8C)。由此推测，此后腹膜纤维化抑制效果持续。
产业上的可利用性
根据本实施方式的线的制备方法，可以制备具有优良的强度的线。另外，通过所述制备方法得到的线是由端胶原玻璃化凝胶干燥体构成的情况下，端胶原玻璃化凝胶干燥体为高密度收敛的结构，具有上皮化促进效果以及瘢痕形成抑制效果。因此，所述线作为组织再生线是有用的。进而，通过所述制备方法得到的线，具有良好的细胞粘着性以及增殖性。因此，作为细胞移植用载体是有用的。进而，通过所述制备方法得到的线，具有对于壁侧腹膜以及脏侧腹膜的炎症以及纤维化的抑制作用。另外，具有对于脏侧腹膜(肠道之间)的粘连的抑制作用。因此，作为腹膜炎抑制剂、腹膜纤维化抑制剂或肠道粘连抑制剂是有用的。

Claims (18)

1.一种线的制备方法，其依次包括：
对柱状水凝胶照射紫外线的工序A；
将所述紫外线照射后的柱状水凝胶进行玻璃化，得到线状水凝胶干燥体的工序B；以及
将所述线状水凝胶干燥体进行再水合，得到线状玻璃化凝胶的工序C。
2.根据权利要求1所述的线的制备方法，其中，该方法包括：在所述工序C之后，进一步将所述线状玻璃化凝胶进行再玻璃化，得到线状玻璃化凝胶干燥体的工序D。
3.根据权利要求1或2所述的线的制备方法，其中，该方法包括：在所述工序D之后，进一步对所述线状玻璃化凝胶干燥体再照射紫外线的工序E。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的线的制备方法，其中，该方法包括：在所述工序E之后，进一步在再照射紫外线的所述线状玻璃化凝胶干燥体上附着或含浸疏水性溶剂的工序F。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的线的制备方法，其中，所述水凝胶为端胶原凝胶。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的线的制备方法，其中，所述线为可用作缝合线的组织再生线。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的线的制备方法，其中，所述线为细胞移植用载体。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的线的制备方法，其中，所述线为结膜瘘孔部的填补材料。
9.根据权利要求1-5中任意一项所述的线的制备方法，其中，所述线为腹膜炎抑制剂或腹膜纤维化抑制剂。
10.由玻璃化凝胶干燥体构成且附着或含浸有疏水性溶剂的线。
11.根据权利要求10所述的线，其中，所述线的断裂强度为0.1kgf以上。
12.根据权利要求10或11所述的线，其中，所述线的断裂强度为0.2kgf以上。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的线，其中，所述玻璃化凝胶干燥体为端胶原玻璃化凝胶干燥体。
14.根据权利要求10-13中任意一项所述的线，其中，所述疏水性溶剂为硅油。
15.根据权利要求10-14中任意一项所述的线，其中，所述线为可用作缝合线的组织再生线。
16.根据权利要求10-14中任意一项所述的线，其中，所述线为细胞移植用载体。
17.根据权利要求10-16中任意一项所述的线，其中，所述线为结膜瘘孔部的填补材料。
18.根据权利要求10-14中任意一项所述的线，其中，所述线为腹膜炎抑制剂或腹膜纤维化抑制剂。
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