水凝胶干燥体、玻璃质凝胶膜干燥体及它们的制造方法
技术领域
本发明涉及不具有不定形外周缘部的水凝胶干燥体、玻璃质凝胶膜干燥体及它们的制造方法。
背景技术
在制药的研究中,长久以来要求开发能够简便地构筑使用各种机能细胞来反映生物体的3维培养模型的培养系统。特别是将胶原凝胶用于细胞的培养载体的3维培养技术对于再构筑血管新生模型、癌浸润模型、上皮间充质模型等是有用的,但还未达到广泛普及。
作为其理由,认为以往的胶原凝胶由于由低密度的纤维构成所以柔软而难以处理,此外,由于为不透明所以培养细胞的相位差显微镜观察不一定容易等。
为了解决这样的问题,本发明者确立了以下技术:通过在低温下将赋予最适于凝胶化(gelation)的盐浓度和氢离子浓度(pH)的胶原的溶胶注入到培养皿内,并进一步保温在最适的温度而将胶原的溶胶凝胶化后,通过在低温下使其充分干燥而不仅除去游离水还慢慢地除去结合水而玻璃化(vitrification),进一步进行再水化(rehydration),从而将胶原凝胶的物性以良好的再现性转换成强度和透明性优异的薄膜(专利文献1)。
并且,若为水凝胶则即使是胶原以外的成分的凝胶,通过在玻璃化后进行再水化,也能够将凝胶变换成稳定的新的物性状态,所以将经由该玻璃化工序而制作的新的物性状态的凝胶命名为玻璃质凝胶(vitrigel)(非专利文献1)。
特别是迄今为止开发的胶原玻璃质凝胶薄膜具有以下特征:其是与生物体内的结缔组织相匹配的高密度的胶原纤维彼此缠绕而成的厚度数十微米的透明的薄的膜,具有优异的蛋白质透过性及强度。此外,由于能够在制作工序的胶原溶胶中添加各种物质,所以能够使胶原玻璃质凝胶薄膜反映出所添加的物质的特性。进而,例如包埋有环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶薄膜能够以镊子容易地进行处理。
并且,本发明者将关于该胶原玻璃质凝胶薄膜的技术进一步发展,还提出了用于提高胶原玻璃质凝胶薄膜的透明性、制作再现性的技术(专利文献2)、将胶原玻璃质凝胶制作成丝状或管状的形状而非膜形状的技术(专利文献3)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平8-228768号公报
专利文献2:WO2005/014774
专利文献3:日本特开2007-204881号公报
非专利文献
非专利文献1:Takezawa T,et al.,Cell Transplant.13:463-473,2004
非专利文献2:Takezawa T,et al.,Cells Tissues Organs185:237-241,2007
非专利文献3:Takezawa T,et al.,J.Biotechnol.131:76-83,2007
然而,在以往的胶原玻璃质凝胶薄膜的制造方法中,例如如图3中例示的那样,通过按照胶原玻璃质凝胶薄膜达到任意的厚度的方式,在塑料制的培养皿中注入规定量的胶原溶胶而凝胶化,并进行利用干燥的玻璃化及再水化来制造。
因此,通过干燥而玻璃化的胶原凝胶干燥体仅能够以附着在培养皿的底面和壁面上的状态来制作。因此,在进行再水化时,存在伴随来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜的问题。在伴随来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜的情况下,胶原玻璃质凝胶薄膜的处理很难,为了作为细胞的3维培养载体利用,需要用于除去不必要的来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜部分的作业,但由于胶原玻璃质凝胶薄膜含有水分,所以该切断加工作业并不容易。此外,虽然通过改变注入胶原溶胶的容器的形状,能够在一定程度上控制所制的胶原玻璃质凝胶薄膜的形状,但由于伴随来自壁面的胶原玻璃质凝胶薄膜,所以为了准确地加工成微细形状需要对含有水分的胶原玻璃质凝胶薄膜进行切断加工,并不容易。并且,为了迅速且大量生产任意形状的胶原玻璃质凝胶薄膜作为产品,克服这样繁杂的作业是个大课题。特别是关于包埋有作为细胞的3维培养载体利用的环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶薄膜,需要微细加工成仅在培养容器的底面上附着胶原玻璃质凝胶薄膜、且在必要时能够用镊子等容易地从培养容器的底面剥离的形状、即胶原玻璃质凝胶薄膜不多余地伸出到环状尼龙膜支撑体的外周部的形状。
此外,在以往的胶原玻璃质凝胶薄膜的制造方法中,由于作为玻璃化的第1工序的凝胶内的游离水的除去通过利用风干的自然干燥来进行,所以通常需要2天以上的时间。
并且,在迄今为止的技术中,关于胶原玻璃质凝胶薄膜的含胶原量和厚度的控制,通过每培养皿的单位面积(1.0cm2)注入0.04~0.4ml的0.25%胶原溶胶进行凝胶化、玻璃化及再水化,从而能够制作每单位面积(1.0cm2)含有100μg~1.0mg胶原的胶原玻璃质凝胶薄膜,通过进一步调节玻璃化的期间,从而能够将胶原玻璃质凝胶薄膜的厚度调整为数μm~数百μm左右。例如,在每培养皿的单位面积(1.0cm2)注入0.2ml的0.25%胶原溶胶而凝胶化后进行2周以上玻璃化后进行再水化的情况下,能够制作厚度约为15μm的胶原玻璃质凝胶薄膜,此外,在同样地注入0.4ml进行凝胶化后进行1周左右玻璃化后进行再水化的情况下,能够制作厚度约为120μm的胶原玻璃质凝胶薄膜(非专利文献2)。
然而认为,为了调制不为薄膜状、例如厚度为1mm以上的胶原玻璃质凝胶膜,每单位面积(1.0cm2)至少需要注入3.3ml以上的0.25%胶原溶胶。但是,由于该量在原有的培养皿中溢出,所以必须准备特殊的容器。进而,在进行凝胶化后,为了使凝胶内的游离水自然干燥,要花费10天以上。因此,为了迅速且大量地生产胶原玻璃质凝胶膜,缩短除去凝胶内的大量的游离水的时间是重要的课题。
进而,在以往的制造方法中,由于不能够将胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体从培养皿上剥离,所以胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体以附着在培养皿的底面和壁面上的状态被制作。因此,无法将胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体以膜状态自由地进行处理。因此,也不能够将胶原玻璃质凝胶薄膜的干燥体切断成任意的微细形状。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明鉴于以上那样的情况而完成,其课题在于提供具有所期望的形状、实用性、处理性等特性优异的玻璃质凝胶膜干燥体及该玻璃质凝胶膜干燥体的前阶段的水凝胶干燥体、以及用于迅速且大量生产该玻璃质凝胶膜干燥体及水凝胶干燥体的方法。
用于解决问题的方法
本发明为了解决上述的课题,提供以下的玻璃质凝胶膜干燥体、水凝胶干燥体及它们的制造方法。
<1>一种玻璃质凝胶膜干燥体,其特征在于,不具有不定形外周缘部。
<2>根据上述<1>的玻璃质凝胶膜干燥体,其特征在于,附着于基板。
<3>根据上述<1>的玻璃质凝胶膜干燥体,其特征在于,玻璃质凝胶膜干燥体与能够剥离的薄膜重叠化。
<4>根据上述<3>的玻璃质凝胶膜干燥体,其特征在于,薄膜为石蜡膜。
<5>一种水凝胶干燥体,其特征在于,不具有不定形外周缘部。
<6>根据上述<5>的水凝胶干燥体,其特征在于,附着于基板。
<7>根据上述<5>的水凝胶干燥体,其特征在于,水凝胶干燥体与能够剥离的薄膜重叠化。
<8>根据上述<7>的水凝胶干燥体,其特征在于,薄膜为石蜡膜。
<9>一种玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,其是所期望形状的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,包括以下的工序:
(1)在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序;
(2)从基板上除去壁面铸型的工序;
(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序;
(4)将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序;以及
(5)使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水,制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体的工序。
<10>根据上述<9>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。
<11>根据上述<9>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,将水凝胶内的游离水减少至1/4~3/4左右。
<12>根据上述<9>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(5)中,将玻璃质凝胶膜在能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜上进行玻璃化。
<13>根据上述<12>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,薄膜为石蜡膜。
<14>一种玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,其是能够成形为所期望形状的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,包括以下的工序:
(1)在配置于铺有能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜的基板上的、任意形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间隙中流出的工序;
(2)从基板上除去壁面铸型的工序;
(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序;
(4)将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序;
(5)使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水,制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体的工序。
<15>根据上述<14>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(5)之后,包括:
(6)将与薄膜重叠化的玻璃质凝胶膜干燥体切断成所期望形状的工序。
<16>根据上述<15>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(6)之后,包括从薄膜上剥离玻璃质凝胶膜干燥体的工序。
<17>根据上述<14>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,薄膜为石蜡膜。
<18>根据上述<14>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。
<19>根据上述<14>的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,将水凝胶内的游离水减少至1/4~3/4左右。
<20>一种水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,其是所期望形状的水凝胶干燥体的制造方法,包括以下的工序:
(1)在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序;
(2)从基板上除去壁面铸型的工序;
(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。
<21>根据上述<20>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。
<22>根据上述<20>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,将水凝胶内的游离水减少至1/4~3/4左右。
<23>根据上述<20>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(3)中,在能够剥离水凝胶干燥体的薄膜上进行玻璃化。
<24>根据上述<23>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,薄膜为石蜡膜。
<25>一种水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,其是能够成形为所期望形状的水凝胶干燥体的制造方法,包括以下的工序:
(1)在配置于铺有能够剥离水凝胶干燥体的薄膜的基板上的、任意形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间隙中流出的工序;
(2)从基板上除去壁面铸型的工序;
(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。
<26>根据上述<25>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(3)之后,包括:
(4)将与薄膜重叠化的水凝胶干燥体切断成所期望形状的工序。
<27>根据上述<26>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(4)之后,包括从薄膜上剥离水凝胶干燥体的工序。
<28>根据上述<25>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,向壁面铸型内部的水凝胶导入支撑体。
<29>根据上述<25>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,在上述工序(1)中,将水凝胶内的游离水减少至1/4~3/4左右。
<30>根据上述<25>的水凝胶干燥体的制造方法,其特征在于,薄膜为石蜡膜。
<31>一种层叠体,其特征在于,其是上述<1>的玻璃质凝胶膜干燥体重叠化、并一体化而得到的。
<32>一种构成角膜的主要实质的胶原的模仿物,所述模仿物为如下的层叠体,所述层叠体为重叠多张将玻璃质凝胶膜干燥体进行再水化而成的玻璃质凝胶膜而得到的,所述玻璃质凝胶膜干燥体为上述<1>的玻璃质凝胶膜干燥体,以胶原作为原料。
<33>一种构成角膜的主要实质的胶原的模仿物,所述模仿物为如下玻璃质凝胶膜,玻璃质凝胶膜为将该玻璃质凝胶膜干燥体重叠化并一体化的层叠体进行再水化而得到的,所述玻璃质凝胶膜为上述<1>的玻璃质凝胶膜干燥体,以胶原作为原料。
发明的效果
根据本发明,能够迅速地大量生产不具有来自壁面的不定形外周缘部的所期望形状的水凝胶干燥体及玻璃质凝胶膜干燥体。
此外,通过将玻璃质凝胶膜干燥体或水凝胶干燥体在能够剥离的薄膜上重叠化,可以使玻璃质凝胶膜干燥体或水凝胶干燥体从薄膜上剥离,以膜状态自由地进行处理。进而,除了壁面铸型的形状以外,能够将已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体或水凝胶干燥体切断加工成任意的形状。
附图说明
图1是例示出本发明的玻璃质凝胶膜的制造方法的一个实施方式的流程图。
图2是例示出本发明的玻璃质凝胶膜的制造方法中使用的壁面铸型的立体图。
图3是例示出以往的玻璃质凝胶薄膜的制造方法的一个实施方式的流程图。
图4是例示出不具有不定形外周缘部的胶原玻璃质凝胶膜的图。
图5是例示出附带有不定形外周缘部的胶原玻璃质凝胶膜的图。
图6是例示出将吸附在石蜡膜上的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的一部分从石蜡膜容易地剥离的状态的图。
图7是例示出将吸附在石蜡膜上的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的一部分从石蜡膜容易地剥离的状态的图。
图8是例示出在1个基板上设置4个壁面铸型并在壁面铸型内部注入胶原溶胶的状态的图。
图9是在图8的形态中通过使壁面铸型上下稍微移动而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接的状态的图。
图10是例示出在图8的形态中从基板上除去壁面铸型的形态的图。
图11的(A)是将实施例8中制作的含有FITC标记山羊抗小鼠抗体的玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体用PBS进行再水化,并用荧光显微镜(Nikon)观察的图。(B)是观察通过实施例6的方法制作的层叠体的图。
图12是表示实施例8中制作的玻璃质凝胶膜中的FITC标记山羊抗小鼠抗体的局部存在的玻璃质凝胶膜的垂直剖面图。
图13是将实施例9中制作的含有琼脂糖的玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体用PBS进行再水化,并用荧光显微镜观察的图。
图14是对于在增加所重叠的玻璃质凝胶膜的张数的情况下没有被一体化的层叠体表示吸光度的变化的图。
图15是关于重叠10张的玻璃质凝胶膜的没有被一体化的层叠体表示透明性的图。
图16是表示通过插入9张的玻璃质凝胶膜而一体化的层叠体(来自0.25%胶原溶胶1.0ml+0.25%胶原溶胶2.0ml×9层+0.25%胶原溶胶1.0ml)的透明性的图。
具体实施方式
本发明的水凝胶干燥体的制造方法的第1实施方式是所期望形状的水凝胶干燥体的制造方法,包括以下的工序:
(1)在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出的工序;
(2)从基板上除去壁面铸型的工序;以及
(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。
进而,本发明的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法的第1实施方式是所期望形状的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,紧接着上述工序(3),包括:
(4)将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序;以及
(5)使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水,制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体的工序。
本发明中,“水凝胶”是指高分子通过化学键合而采取网眼状结构,并在该网眼中保有大量水的物质,更具体而言,是指在天然物来源的高分子或合成高分子的人工原料中导入交联使其凝胶化而成的物质。
此外,“水凝胶干燥体”是指从水凝胶中除去游离水而玻璃化的物质。进而,“玻璃质凝胶膜”是指使该水凝胶干燥体再水化而成的物质。另外,如上所述,“能够经由玻璃化(vitrification)的工序而制作的新的稳定状态的凝胶”被本发明者命名为“玻璃质凝胶(vitrigel)”。并且,“玻璃质凝胶膜干燥体”是指将该玻璃质凝胶再次玻璃化而成的物质。玻璃质凝胶膜干燥体通过在必要时进行再水化,可以得到玻璃质凝胶膜。
以下,对各工序进行说明。图1是例示出本发明的玻璃质凝胶膜的制造方法的一个实施方式的流程图。
工序(1):在配置于基板上的与上述所期望形状相同形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙中流出。
基板和壁面铸型可以适当使用70%乙醇或可耐受利用高压釜等的灭菌的材料。具体而言,可例示出聚苯乙烯或丙烯酸树脂等塑料、玻璃、或不锈钢等。
第1实施方式中,壁面铸型可以制成不具有上表面、底面的筒状的框体,壁面铸型的形状可以设计成与所期望的玻璃质凝胶膜的形状相同的形状。具体而言,例如,在制作圆形的玻璃质凝胶膜的情况下,如图2中例示的那样,可以使用壁面(框)为环状的壁面铸型(圆筒状)。此外,在制作矩形的玻璃质凝胶膜的情况下,可以制成壁面(框)为矩形状的壁面铸型(方筒状)。
并且,若在基板上配置壁面铸型,则两者处于抵接状态,但形成物理上利用基板和壁面铸型的表面的凹凸能够使游离水流出的程度的很小的间隙。本发明中,可以根据所期望的数目的玻璃质凝胶膜,在基板上配置多个壁面铸型。
本发明中,作为用于制作水凝胶的原料的来自天然物的高分子例如可例示出胶原、由小鼠EHS肿瘤提取物再构成的基底膜成分(商品名:Matrigel)、明胶、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、糖胺聚糖、透明质酸、蛋白聚糖等。可以选择最适于各自的凝胶化的盐等成分、其浓度、pH等来制作水凝胶。
此外,作为用于制作水凝胶的合成高分子,可列举出聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、甲基纤维素、聚环氧乙烷、聚(甲基丙烯酸树脂2-羟基乙酯)/聚己内酯等。此外,也可以使用2种以上这些高分子来制作水凝胶。水凝胶的量可以考虑所制作的玻璃质凝胶膜的厚度来调节。
其中,水凝胶的原料优选胶原,在使用胶原凝胶的情况下,可以使用将胶原溶胶注入配置在基板上的壁面铸型中并用孵化器凝胶化而成的物质。图1中,作为水凝胶的原料,例示出胶原溶胶。
以使用胶原溶胶的情况为例进行说明,胶原溶胶可以用生理盐水、PBS(Phosphate Buffered Saline:磷酸盐缓冲盐水)、HBSS(Hank’s BalancedSalt Solution:汉克斯平衡盐溶液)、基础培养液、无血清培养液、或含血清的培养液等调制成具有最适的盐浓度的溶液。此外,胶原凝胶化时的溶液的pH优选为6~8左右。
这里,胶原溶胶的调制期望在4℃下进行。之后,凝胶化时的保温必须为比依赖于所使用的胶原的动物种类的胶原的变性温度低的温度,但一般可以保温于在37℃以下的温度下能够以数分钟~数十分钟凝胶化的温度下进行。
此外,胶原溶胶若胶原的浓度达到0.2%以下则过于稀薄而凝胶化弱,若达到0.3%以上则过于浓稠而难以均一化。因此,胶原溶胶的胶原的浓度优选为0.2~0.3%,更优选为0.25%左右。
将这样调整的胶原溶胶注入到壁面铸型内部。由于上述浓度的胶原溶胶具有粘性,所以若将胶原溶胶注入到壁面铸型内部并迅速地保温,则胶原溶胶不会从基板与壁面铸型的间隙中流出,能够在数分钟以内进行凝胶化。
并且,所形成的胶原凝胶与基板和壁面铸型密合,但通过放置规定的时间,随着时间的经过,胶原凝胶内的游离水的一部分从基板与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流出。
这里,通过使壁面铸型上下等稍微移动,从而凝胶与壁面铸型间的粘接被解除而产生很小的间隙,所以能够促进游离水的流出。
进而,例如,在每单位面积(1.0cm2)注入的0.25%胶原溶胶的量为0.4ml以上的情况下,期望在将已凝胶化的胶原凝胶内的游离水减少至1/4~2/3左右之前,经时地除去从基板与壁面铸型的间隙流出的游离水。由此,由于凝胶的胶原浓度变成0.375~1.0%左右,所以即使除去壁面铸型,也可以达到凝胶形状不变形的凝胶强度。另外,之后可以在也伴随流出到基板上的游离水的状态下使残留在凝胶内的游离水自然干燥并除去而玻璃化。这里,从迅速大量生产的观点出发,将胶原凝胶内的游离水减少至1/4~2/3左右的时间期望为2~8小时。进而,之后使残留在凝胶内的游离水自然干燥而完全除去的时间期望为48小时以内。因此,每单位面积(1.0cm2)注入的0.25%胶原溶胶的量期望为0.1~2.4ml,其结果是,可以制作每单位面积(1.0cm2)含有250μg~6mg胶原的胶原玻璃质凝胶膜。
另外,作为制作每单位面积含有更多胶原的胶原玻璃质凝胶膜的方法,可以采用以下的2种方法。第1方法是在已经制作的胶原玻璃质凝胶膜或其干燥体上重叠胶原溶胶而进行凝胶化、玻璃化及再水化的方法。通过重复该方法,可得到胶原玻璃质凝胶膜重叠化了的层叠体,能够制作任意厚度的胶原玻璃质凝胶膜(层叠体)。此外,第2方法是在胶原溶胶内包埋已经制作的胶原玻璃质凝胶膜或其干燥体进行凝胶化、玻璃化及再水化的方法。该方法中,可得到以包埋有任意张数的胶原玻璃质凝胶膜的状态重叠化的层叠体,能够制作任意的厚度的胶原玻璃质凝胶膜。另外,也可以在第1方法中用于重叠的溶胶及第2方法中用于包埋的溶胶中使用胶原以外的成分,制作表里或层状中成分不同的玻璃质凝胶膜。
此外,可以在壁面铸型的内部的水溶胶中导入支撑体。例如,支撑体可例示出尼龙膜、金属丝、棉制薄纱、蚕丝、其它的织成体、生物体吸收性材料等,可以使用与壁面铸型的内部的形状对应的支撑体。优选的是,在壁面铸型为环状的情况下,支撑体可以制成如图1中例示的那样的具有与壁面铸型的内径大致相等的外径的环状尼龙膜。通过在溶胶中导入支撑体,玻璃质凝胶膜的强度或形状保持能力提高,处理性、便利性提高。例如,通过导入比圆形的壁面铸型的直径短1.0mm左右的外圆直径的环状尼龙膜支撑体,可以制作可用镊子容易地处理的玻璃质凝胶膜。
工序(2)从基板上除去壁面铸型。
在基板上留下水凝胶,去掉壁面铸型。水凝胶由于游离水流出,所以在基板上不会发生变形等,可以维持保持于壁面铸型中的形状。
工序(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体。
根据需要,使水凝胶移动至最终想要玻璃化的容器内后,通过干燥,完全地除去水凝胶内的游离水而玻璃化。例如,通过使水凝胶移动到能够剥离水凝胶干燥体的薄膜上,可以将所制作的水凝胶干燥体从薄膜上剥离。此外,这种情况下,也可以在薄膜上将水凝胶干燥体成形为所期望的形状。作为薄膜,可例示出石蜡膜、莎纶包装膜(Saran Wrap)、乙烯树脂等非吸水性薄膜,特别优选石蜡膜。
越延长该玻璃化工序的期间,在再水化时越能够得到透明度、强度优异的玻璃质凝胶膜。另外,也可以根据需要将在短期间的玻璃化后进行再水化而得到的玻璃质凝胶膜用PBS等进行洗涤,再次玻璃化。
作为干燥方法,例如可以采用风干、在密闭容器内进行干燥(使容器内的空气循环,总是供给干燥空气)、在放置硅胶的环境下进行干燥等各种方法。例如,作为风干的方法,可例示出在10℃40%湿度下在保持无菌的孵化器中干燥2天、或在无菌状态的超净台内在室温下干燥一昼夜等方法。
水凝胶干燥体由于可以在必要时通过进行再水化来制作玻璃质凝胶膜,所以在产业上可以有效利用。此外,将本发明的水凝胶干燥体进行再水化而成的玻璃质凝胶膜如后所述那样在不伴随来自壁面的不必要的玻璃质凝胶膜(本发明中,称为“不定形外周缘部”)这一点上也是出色的。
进而,在本发明的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法中,
工序(4)将水凝胶干燥体进行再水化而制作玻璃质凝胶膜。
通过将水凝胶干燥体用PBS或所使用的培养液等进行再水化,可以制作玻璃质凝胶膜。这里,进行再水化的液体中也可以包含生理活性物质等各种成分,例如,作为生理活性物质,可列举出以抗生素为首的各种医药品、细胞增殖因子、分化诱导因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、外源凝集素、或不凝胶化的作为细胞外基质成分的纤维连接蛋白、玻璃体结合蛋白、内功素、骨桥蛋白等。此外,也可以含有多种它们。
工序(5)使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水,制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体。
干燥方法与工序(3)同样地可以采用风干、在密闭容器内进行干燥(使容器内的空气循环,总是供给干燥空气)、在放置硅胶的环境下进行干燥等各种方法。
通过使玻璃质凝胶膜进行再干燥,可以制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体。该玻璃质凝胶膜干燥体通过在必要时进行再水化,可以再次变换成玻璃质凝胶膜。
此外,也可以将玻璃质凝胶膜在例如像石蜡膜那样的能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜上进行玻璃化。石蜡膜是以石蜡作为原料的热塑性薄膜,具有具备伸缩性和粘合性,气密性、防水性也优异的特征。
通过在能够剥离玻璃质凝胶膜干燥体的薄膜上重叠化,可以使胶原玻璃质凝胶膜的干燥体从薄膜上剥离,以膜状态自由地进行处理。进而,除了壁面铸型的形状以外,可以将玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体切断加工成任意的形状。
另外,“水凝胶干燥体”和“玻璃质凝胶膜干燥体”中包含的成分不一定相同。“水凝胶干燥体”包含水凝胶的成分,但“玻璃质凝胶膜干燥体”包含用将水凝胶干燥体进行再水化时的水溶液平衡化的玻璃质凝胶膜中残存的成分。
此外,通过将工序(5)的玻璃质凝胶膜干燥体进行再水化而得到的玻璃质凝胶膜与工序(4)中得到的玻璃质凝胶膜相比较,由于玻璃化的期间长,所以强度及透明性优异。
进而,玻璃化的期间也可以在“水凝胶干燥体”的状态下延长,但“水凝胶干燥体”是制作水凝胶时的成分全部共存的状态,也混杂在继续维持水凝胶干燥体时或利用玻璃质凝胶膜时变得不必要的成分。另一方面,关于将“水凝胶干燥体”再水化而除去不必要的混杂成分后的玻璃质凝胶膜,其干燥体中不必要的成分也被除去。因此,在有必要较长地维持玻璃化的期间时,优选以该玻璃质凝胶膜干燥体的状态继续维持,在将玻璃质凝胶膜干燥体进行再水化而得到的玻璃质凝胶膜中不混杂不必要的成分这一点是优异的。
在本发明的第1实施方式中,壁面铸型的形状设计成与所期望的玻璃质凝胶膜的形状相同的形状,进而,由于使游离水从基板与壁面铸型的间隙中流出1/4~3/4左右后,除去壁面铸型,进行利用干燥的玻璃化,所以可以得到反映出壁面铸型的形状的所期望形状的玻璃质凝胶膜。即,如上所述,在使用以往的培养皿的方法中,伴随培养皿的来自壁面的不必要的玻璃质凝胶薄膜(本发明中,称为“不定形外周缘部”),但在本发明中,可以得到不具有不定形外周缘部的在基板上反映出壁面铸型的形状的水凝胶干燥体或玻璃质凝胶膜干燥体。因此,不需要以往必要的除去不定形外周缘部的作业,能够迅速、且大量地生产玻璃质凝胶膜。进而,由于通过壁面铸型的利用,将游离水的量减少至1/4~3/4左右,所以能够将以往通常需要2天以上的用于除去游离水的干燥时间缩短至1/2~1/4左右的时间。这样的干燥时间的缩短也大大有助于玻璃质凝胶膜干燥体的迅速且大量生产。
此外,以往,由于干燥时间需要2天以上,所以为了将干燥时间控制在实用的范围,水凝胶的注入量受到限制。因此,玻璃质凝胶膜作为厚度最大约为120μm左右的薄膜状(玻璃质凝胶薄膜)被制作(非专利文献2)。与此相对,本发明的玻璃质凝胶膜由于能够将用于除去游离水的干燥时间缩短至1/2~1/4左右的时间,所以即使将干燥时间控制在实用的范围,也能够与以往相比增加水凝胶的注入量。具体而言,本发明中,能够以2~3天左右的实用的干燥时间,容易地制作厚度约为1mm的玻璃质凝胶膜。
进而,玻璃质凝胶膜及玻璃质凝胶膜干燥体也可以在例如凝胶化之前的溶胶溶液中混合期望含有的生理活性物质,之后,经由凝胶化·玻璃化等玻璃质凝胶膜的制作工序来制作。
含有生理活性物质的玻璃质凝胶膜及玻璃质凝胶膜干燥体由于可以从玻璃质凝胶膜侧供给对于细胞的粘附·增殖·分化等需要的因子,所以能够实现更好的培养环境。此外,对于进行调查所含有的生理活性物质对细胞的影响的试验非常有用。此外,包含生理活性物质的玻璃质凝胶膜通过向体内移植还能够作为药物传递系统发挥功能(非专利文献3)。
进而,通过本发明的方法制作的玻璃质凝胶膜能够透过分子量大的生理活性物质,由此,能够大大贡献于接种在该玻璃质凝胶膜的不同的2个面上的各细胞之间的介由生理活性物质的相互作用的试验·研究(非专利文献3)。
此外,通过本发明的方法制作的玻璃质凝胶膜可以作为插入培养容器中培养动物细胞的细胞培养载体使用。作为所培养的动物细胞,可列举出原代培养细胞、确立细胞株、受精卵、及向这些细胞中导入了外来基因的细胞。进而这些细胞也可以是未分化的干细胞、处于分化过程中的细胞、终末分化的细胞、及脱分化的细胞。此外,作为开始这些细胞的培养的方法,可列举出细胞悬浮液、组织切片、受精卵、或三维再构筑的凝胶培养体或多细胞性聚集块(多细胞球体)的接种。即,能够通过现有的方法来培养的粘附性的细胞可以在本玻璃质凝胶膜上进行培养。
进而,例如当然可以将上述的细胞在玻璃质凝胶膜的单面上进行培养,也可以在两面上培养1种以上的细胞。在两面培养中,可以在各个面上培养不同种类的细胞。特别是通过在玻璃质凝胶膜的一个面上培养上皮系细胞、在另一面上培养间充质细胞,能够实现具有上皮间充质相互作用的经皮吸收模式或肠道吸收模式等细胞功能测定,此外,通过在一个面上培养血管内皮细胞、在另一个面上培养癌细胞,能够实现血管新生模式或癌浸润模式等细胞功能测定。
进而,在提高1张玻璃质凝胶膜的厚度的情况下,玻璃质凝胶膜的透明性与厚度成比例地降低,但在重叠多张玻璃质凝胶膜而制成相同程度的厚度的情况下,与1张玻璃质凝胶膜相比透明性高。因此,重叠多张胶原玻璃质凝胶膜而提高透明性,例如通过在该胶原玻璃质凝胶膜上培养角膜来源的细胞等,能够作为角膜的模仿物来利用。该角膜的模仿物可以移植到生物体中,也可以作为角膜模型利用于各种药理试验中。
另外,作为制作通过重叠多张胶原玻璃质凝胶膜而一体化的层叠体的方法,可以采用下面的2种方法(反复法和插入法)。在反复法中,通过反复进行向已经制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体上注入胶原溶胶并进行凝胶化、玻璃化及再水化,可以制作一体化的层叠体。另一方面,在插入法中,通过在胶原溶胶中插入预先制作的多张的胶原玻璃质凝胶膜或胶原玻璃质凝胶膜干燥体后进行玻璃化及再水化,可以制作一体化的层叠体。
接着,对本发明的水凝胶干燥体及玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法的第2实施方式进行说明。关于与第1实施方式共同的点,以下省略一部分说明。
本发明的水凝胶干燥体的制造方法的第2实施方式是能够成形为所期望形状的水凝胶干燥体的制造方法,包括以下的工序:
(1)在配置于铺有能够剥离水凝胶干燥体的薄膜的基板上的、任意形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间隙中流出的工序;
(2)从基板上除去壁面铸型的工序;
(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序。
该实施方式中,壁面铸型可以制成不具有上表面、底面的筒状的框体,其形状任意,没有必要为与所期望的水凝胶干燥体的形状相同的形状。
并且,在第2实施方式中,预先在基板上铺上能够剥离水凝胶干燥体的薄膜,向该薄膜上注入溶胶,进行凝胶化、利用干燥的玻璃化。作为能够剥离水凝胶干燥体的薄膜,可例示出石蜡膜、莎纶包装膜、乙烯树脂等非吸水性薄膜,特别优选石蜡膜。
在第2实施方式中,在薄膜上使水凝胶干燥而除去残留的游离水,可以制作已玻璃化的水凝胶干燥体。这种情况下,可得到与薄膜重叠化的水凝胶干燥体。
水凝胶干燥体由于吸附在薄膜上而重叠化,所以稳定性高,可以容易地切断成所期望的形状。可以切断加工成壁面铸型的形状以外的所期望形状。因此,该实施方式中,紧接着上述工序(3),可以包括将与薄膜重叠化的水凝胶干燥体切断成所期望形状的工序。
进而,该实施方式中,可以包括将切断成所期望形状的水凝胶干燥体从薄膜上剥离的工序。通过使水凝胶干燥体从薄膜上剥离,可以以膜状态自由地进行处理。进而,该水凝胶干燥体也不具有不定形外周缘部。另外,也可以对从薄膜剥离的水凝胶干燥体进行切断加工。
并且,通过将成形为所期望形状的水凝胶干燥体进行再水化,可以得到所期望形状的玻璃质凝胶膜。
进而,本发明的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法的第2实施方式是能够成形为所期望形状的玻璃质凝胶膜干燥体的制造方法,包括:
(1)在配置于铺有能够剥离水凝胶干燥体的薄膜的基板上的、任意形状的壁面铸型内部保持水凝胶,使水凝胶内的游离水的一部分从基板上的薄膜与壁面铸型的间隙中流出的工序;
(2)从基板上除去壁面铸型的工序;
(3)使水凝胶干燥而除去残留的游离水,制作已玻璃化的水凝胶干燥体的工序;
(4)将水凝胶干燥体进行再水化来制作玻璃质凝胶膜的工序;及
(5)使玻璃质凝胶膜再干燥而除去游离水,制作已玻璃化的玻璃质凝胶膜干燥体的工序。
通过将上述工序(3)中得到的与薄膜重叠化的水凝胶干燥体进行再水化,可以得到与薄膜重叠化的玻璃质凝胶膜(工序(4))。通过将该与薄膜重叠化的状态的玻璃质凝胶膜再次进行干燥而玻璃化,可以得到与薄膜重叠化了的玻璃质凝胶膜干燥体(工序(5))。
通过该实施方式制作的玻璃质凝胶膜干燥体也不具有不定形外周缘部,所以不需要以往必要的除去不定形外周缘部的作业,能够迅速、且大量地生产玻璃质凝胶膜。
进而,以往,玻璃质凝胶膜存在难以切断加工成所期望的形状的问题,但吸附在薄膜上而重叠化的状态的玻璃质凝胶膜干燥体即使为复杂的形状,也可以准确地切断加工成所期望的形状。因此,在该实施方式中,可以包括将与薄膜重叠化的玻璃质凝胶膜干燥体切断成所期望形状的工序。成形为所期望的形状的玻璃质凝胶膜干燥体通过在必要时进行再水化,可以得到所期望的形状的玻璃质凝胶膜。由于可以根据用途来制造所期望形状的玻璃质凝胶膜,所以便利性进一步提高。
另外,如水凝胶干燥体的制造方法的第2实施方式中说明的那样,该实施方式中,也可以在上述工序(3)之后,将与薄膜重叠化后的水凝胶干燥体成形为所期望的形状。这种情况下,也可以通过紧接着经由上述工序(4)、(5),来制作所期望的形状的玻璃质凝胶膜干燥体。
此外,与薄膜重叠化后的玻璃质凝胶膜干燥体可以容易地从薄膜上剥离。因此,可以使成形为所期望的形状的玻璃质凝胶膜干燥体从薄膜上剥离,以膜状态进行处理。因此,玻璃质凝胶膜干燥体的处理性优异,并且可期待在利用其水分吸收性等特性的医疗原料等中的有效利用。
实施例
以下,通过实施例对本发明进一步进行详细说明,但本发明不受这些实施例的任何限定。
<实施例1>利用基板和壁面铸型的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体(胶原量:0.55~2.2mg/cm2)的制作
来自牛真皮的I型胶原的0.25%溶胶通过在于冰上冷却的50ml容量的灭菌圆锥管(Falcon#35-2070)内将0.5%I型胶原酸性溶液(KOKEN#IAC-50;5mg/ml)和细胞培养液均一地等量混合来调制。另外,这里使用的细胞培养液是含有10%失活(日文:非動化)胎牛血清(SIGMA#F2442)、20mM HEPES(GIBCO BRL#15630-080)、及100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GIBCO BRL#15140-148)的达尔伯克改良伊格尔培养液(GIBCO BRL#11885-084)。
环状尼龙膜支撑体通过按照外圆的直径达到33mm且内圆的直径达到24mm的方式剪下尼龙膜(GE Healthcare#RPN1732B;Hybond-N+核酸印迹用膜(原文:プロツテイング用メンプレン)后,用70%乙醇进行10分钟灭菌处理、用灭菌PBS进行10分钟3次洗涤、进一步用上述的细胞培养液进行10分钟平衡化而制作(参照专利文献2的图1)。
作为基板,使用直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)的底表面。此外,作为壁面铸型,使用外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm且高度为10.0mm的丙烯酸树脂。此外,壁面铸型在实施喷雾70%乙醇并擦去的灭菌处理后使用。具体而言,通过在1个基板上设置1个壁面铸型,来制作能够将基板和壁面铸型分离的1个容器。
胶原凝胶通过向该容器内插入1张环状尼龙膜支撑体,之后立即注入2.0ml、4.0ml、6.0ml、或8.0ml的0.25%胶原溶胶并在基板上盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化来制作。此时,所注入的胶原溶胶不会从基板与壁面铸型的间隙流出地发生凝胶化。自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时、第4小时、第6小时、及第8小时,对胶原凝胶内的游离水从基板与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流出的量进行定量,同时除去各时间流出的游离水。另外,在第2小时通过使壁面铸型上下地稍微移动,从而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。
其结果获知,所有胶原凝胶均在至第4小时为止使1/3以上左右的游离水向壁面铸型的外侧流出,此外,至第8小时为止使2/3左右的游离水向壁面铸型的外侧流出(表1)。
[表1]
另外,壁面铸型在第8小时从基板上除去,但此时,壁面铸型与胶原凝胶处于非粘接状态,从基板上除去的壁面铸型的内壁等周围完全没有胶原凝胶的附着。此外,在第8小时从37.0℃的保湿孵化器移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下边使流出的游离水流出边将残留在胶原凝胶内的游离水通过自然干燥而完全除去,得到玻璃化的胶原凝胶干燥体。这里,从残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去的阶段起开始玻璃化。因此,测量至该玻璃化开始为止的自然干燥所需的大概的时间。其结果是,至玻璃化开始为止(至残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去而变成胶原凝胶干燥体为止)所需的时间在2.0ml及4.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为21小时以内,此外,在6.0ml及8.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为21小时以上且41小时以内(表2)。
[表2]
自然干燥所需的时间与以往的方法(以下的比较例1)相比大幅缩短。
将玻璃化后第1天至第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的超净台,向基板的培养皿内添加5.0ml的PBS进行再水化并从基板上剥离,从而制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。然后,多次用5.0ml的PBS进行冲洗,从而制作以PBS平衡化的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜反映出壁面铸型的直径为34mm的内圆(面积:9.1cm2)形状,以略微的宽裕包埋环状尼龙膜支撑体的直径为33mm的外圆周围(图4)
另外,该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜自图4的左侧起含有胶原5.0mg(来自胶原溶胶2.0ml来源)、10.0mg(来自胶原溶胶4.0ml)、15.0mg(来自胶原溶胶6.0ml)、及20.0mg(来自胶原溶胶8.0ml)。
进而,将该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜移入直径为35mm的亲水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-3001)及在底表面铺有石蜡膜(Pechiney Plastic Packaging公司制)的直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)中,在10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在取下盖子的状态下放置1~2天左右使其完全干燥。之后,移入室温下的超净台内在各培养皿上盖上盖子后在室温下无菌地保管维持而进行玻璃化,从而制作各带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。
其结果是,关于前者的在直径为35mm的亲水性聚苯乙烯制培养皿内制作的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体,在干燥的状态下与培养皿底面密合而无法剥离,但在再水化时不需要沿周围用之前的尖锐的镊子划培养皿的内壁的操作,此外,能够在环状尼龙膜的外周不伴随多余的玻璃质凝胶膜(不定形外周缘部)的状态下容易地从培养皿底面用镊子剥离。因此,作为将细胞在两面上进行3维培养的载体处理性优异,是有用的。
关于后者的在石蜡膜上制作的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体,带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体呈现出吸附在石蜡膜上的状态,此外在干燥的状态下能够容易地从石蜡膜上剥离。因此,吸附在石蜡膜上的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体或从石蜡膜剥离的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体作为生物材料处理性优异,是有用的。
另外,该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体每单位面积(1.0cm2)含有胶原0.55mg(来自胶原溶胶2.0ml)、1.1mg(来自胶原溶胶4.0ml)、1.6mg(来自胶原溶胶6.0ml)、或2.2mg(来自胶原溶胶8.0ml)。
另外,若在上述的工序中不插入环状尼龙膜,则可以制作无环状尼龙膜的支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。此外,通过改变壁面铸型的底平面形状及高度,可以制作具有任意的形状和厚度的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。
<比较例1>利用以往的培养皿的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的制作
代替实施例1中利用能够与基板分离的壁面铸型,使用以往的直径为35mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1008),与实施例1同样地进行实验。
具体而言,胶原凝胶通过在该培养皿内插入1张环状尼龙膜支撑体,之后立即注入2.0ml、4.0ml、6.0ml、或8.0ml的0.25%胶原溶胶并盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化来制作。自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时、第4小时、第6小时、及第8小时,对逐渐渗出到胶原凝胶的上表面侧的游离水的量进行定量,同时除去在各时间渗出的游离水。其结果获知,从所有胶原凝胶至第8小时为止均仅10%以下的游离水渗出到上表面侧(表3)。
[表3]
此外,在第8小时从37.0℃的保湿孵化器移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下将残留在胶原凝胶内的游离水通过自然干燥而完全除去,得到已玻璃化的胶原凝胶干燥体。
这里,自残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去的阶段起开始玻璃化。因此,测量至该玻璃化开始为止(至残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去而变成胶原凝胶干燥体为止)的自然干燥所需的大概的时间。其结果是,所有胶原凝胶均由于在凝胶内残留90%以上的游离水,所以至玻璃化开始为止所需的时间在2.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为21小时以上且41小时以内,在4.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为41小时以上且48小时以内,在6.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为48小时(2天)以上且3天以内,此外,在8.0ml的0.25%胶原的情况下为3天以上且4天以内(表4)。
[表4]
将玻璃化后第1天至第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的超净台内,向培养皿内添加2.0ml的PBS进行再水化,从培养皿底面及壁面剥离,从而制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。然后,多次用2.0ml的PBS进行冲洗,从而制作以PBS平衡化的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜中,在环状尼龙膜支撑体的直径为33mm的外圆周围附带培养皿的来自壁面的多余的胶原玻璃质凝胶膜(不定形外周缘部)(图5)。另外,即使在再水化时沿培养皿的内壁用之前的尖锐的镊子进行化的操作,也由于从环状尼龙膜支撑体的直径为33mm的外圆周围伸出,而无法切掉该环状尼龙膜支撑体的外圆周围的多余的胶原玻璃质凝胶膜。因此,切取与环状尼龙膜支撑体的外圆周围吻合的胶原玻璃质凝胶膜的作业非常困难。
此外,该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜自图5的左侧起含有胶原5.0mg(来自胶原溶胶2.0ml)、10.0mg(来自胶原溶胶4.0ml)、15.0mg(来自胶原溶胶6.0ml)、或20.0mg(来自胶原溶胶8.0ml),但在切掉了来自壁面的多余的胶原玻璃质凝胶膜的情况下,变得无法算出准确的胶原含量。
比较例1中,虽然也能够制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体,但若考虑伴随制作的作业的困难性、无法算出准确的胶原含量、及至玻璃化为止胶原凝胶内游离水的干燥时间长,则确认不实用。
<实施例2>利用铺在基板上的石蜡膜和壁面铸型的吸附在石蜡膜上的胶原玻璃质凝胶膜干燥体(胶原量:0.52~2.1mg/cm2)的制作
作为基板,使用直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)的底表面。此外,作为壁面铸型,使用外圆的直径为39mm且内圆的直径为35mm且高度为10.0mm的丙烯酸树脂。石蜡膜(Pechiney PlasticPackaging公司制)切断成直径为50mm的圆形后使用。另外,壁面铸型及石蜡膜均在实施喷雾70%乙醇并擦去的灭菌处理后使用。具体而言,在直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底表面上铺上切断成直径为50mm的圆形的1张石蜡膜,在其上设置1个壁面铸型,从而制作能够将铺在基板上的石蜡膜与壁面铸型分离的1个容器。
胶原凝胶通过向该容器内注入2.0ml、4.0ml、6.0ml、或8.0ml的0.25%胶原溶胶并盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化而制作。此时,注入的胶原溶胶不会从铺在基板上的石蜡膜与壁面铸型的间隙中流出地进行凝胶化。
自移入37.0℃的保湿孵化器内起第4小时、第6小时、及第8小时,对胶原凝胶内的游离水从铺在基板上的石蜡膜与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流出的量进行定量,同时除去在各时间流出的游离水。另外,在第2小时通过使壁面铸型上下稍微移动,从而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。其结果获知,来自胶原溶胶6.0ml及8.0ml的胶原凝胶至第4小时为止1/3以上的游离水向壁面铸型的外侧流出,来自胶原溶胶4.0ml的胶原凝胶至第6小时为止约1/3的游离水向壁面铸型的外侧流出,此外来自胶原溶胶2.0ml的胶原凝胶至第8小时为止约1/4的游离水向壁面铸型的外侧流出(表5)。
[表5]
壁面铸型在第8小时从基板上除去,但此时,壁面铸型与胶原凝胶处于非粘接状态,从铺在基板上的石蜡膜上除去的壁面铸型的内壁等周围完全没有胶原凝胶的附着。此外,在第8小时从37.0℃的保湿孵化器移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下边使流出的游离水流出边将残留在胶原凝胶内的游离水通过自然干燥而完全除去,得到胶原凝胶干燥体。
这里,自残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去的阶段起开始玻璃化。因此,测量至该玻璃化开始为止(至残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去而变成胶原凝胶干燥体为止)的自然干燥所需的大概的时间。其结果是,至玻璃化开始为止所需的时间在2.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为20小时以内,此外,在4.0ml、6.0ml及8.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为20小时以上且41小时以内(表6)。
[表6]
将玻璃化后第1天至第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的超净台内,向基板的培养皿内添加5.0ml的PBS而进行再水化,以吸附于铺在基板上的石蜡膜上的状态制作胶原玻璃质凝胶膜。然后,多次用5.0ml的PBS进行冲洗,以吸附在石蜡膜上的状态制作以PBS平衡化的胶原玻璃质凝胶膜。该胶原玻璃质凝胶膜反映出壁面铸型的直径为35mm的内圆(面积:9.6cm2)形状,不具有不定形外周缘部。
进而,将该吸附在石蜡膜上的状态的胶原玻璃质凝胶膜移入直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)中,在10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在取下盖子的状态下放置1~2天左右使其完全干燥后,移入室温下的超净台内在培养皿上盖上盖子后在室温下无菌地保管维持而进行玻璃化,由此制作吸附在石蜡膜上的状态的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。该吸附在石蜡膜上的状态的胶原玻璃质凝胶膜干燥体可以用剪刀或手术刀等容易地切断成所期望的微细形状。此外,胶原玻璃质凝胶膜干燥体也能够从石蜡膜上容易地剥离(图6)。
通过该工序制作的胶原玻璃质凝胶膜含有胶原5.0mg(来自胶原溶胶2.0ml)、10.0mg(来自胶原溶胶4.0ml)、15.0mg(来自胶原溶胶6.0ml)、或20.0mg(来自胶原溶胶8.0ml)。此外,通过该工序制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体自图6的左侧起每单位面积(1.0cm2)含有胶原0.52mg(来自胶原溶胶2.0ml)、1.0mg(来自胶原溶胶4.0ml)、1.6mg(来自胶原溶胶6.0ml)、或2.1mg(来自胶原溶胶8.0ml)。
另外,若在上述的工序中在胶原溶胶中插入环状尼龙膜,则能够以吸附在石蜡膜上的状态制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体(图7)。此外,通过改变壁面铸型的底平面形状及高度,可以以吸附在石蜡膜上的状态制作具有任意的形状和厚度的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。
<实施例3>利用基板和壁面铸型的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的迅速大量生产法
作为基板,使用100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1112)的底表面。此外,作为壁面铸型,使用4个外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm外圆且高度为10.0mm的丙烯酸树脂。此外,壁面铸型在实施喷雾70%乙醇并擦去的灭菌处理后使用。
具体而言,通过在1个基板上设置4个壁面铸型,从而制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器。向各容器内插入1张环状尼龙膜支撑体并注入2.0ml的0.25%胶原溶胶,在基板上盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化,从而在1个基板上制作4个胶原凝胶。此时,注入的胶原溶胶不会从基板与壁面铸型的间隙中流出地进行凝胶化(图8)。
此外,自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时,通过使壁面铸型上下稍微移动而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接(图9)。之后,由于至第4小时为止1/3左右的游离水向壁面铸型的外侧流出,所以从基板上除去壁面铸型(图10)。将流出的游离水除去后,移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下边使流出的游离水流出边将残留在胶原凝胶内的游离水通过自然干燥而完全除去,得到胶原凝胶干燥体。
这里,自残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去的阶段起开始玻璃化。至该玻璃化开始为止(至残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去而变成胶原凝胶干燥体为止)的自然干燥在1天以内完成。在玻璃化后第1天至第2天移入室温下的超净台内,向基板的培养皿内添加20ml的PBS进行再水化,从基板上剥离,由此同时制作4个带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。以下,通过实施与实施例1同样的操作,同时制作4个每单位面积(1.0cm2)含有0.55mg胶原的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。
另外,若在上述的工序中不插入环状尼龙膜,则能够同时制作4个无环状尼龙膜的支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。此外,若在上述的工序中与实施例2同样地在基板上铺上石蜡膜使用,则能够同时制作4个吸附在石蜡膜上的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。
<实施例4>利用基板和壁面铸型的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体(胶原量:2.7~11.0mg/cm2)的制作
为了能够在实施例1的能够将基板与壁面铸型分离的容器中,注入从10.0ml到40.0ml的0.25%胶原溶胶,制作高度比实施例1中使用的壁面铸型高的壁面铸型,进行与实施例1同样的实验。
具体而言,制作外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm且高度为30.0mm及60.0mm的由丙烯酸树脂构成的壁面铸型。作为基板,在高度为30.0mm的壁面铸型中使用直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)的底表面,此外在高度为60.0mm的壁面铸型中使用100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1112)的底表面。分别通过在1个基板上设置1个壁面铸型,制作能够将基板与壁面铸型分离的1个容器,向各容器内插入1张环状尼龙膜支撑体。之后立即向具有高度为30.0mm的壁面铸型的容器中注入10.0ml、12.0ml、16.0ml、或20.0ml的0.25%胶原溶胶,此外向具有高度为60.0mm的壁面铸型的容器中注入24.0ml、28.0ml、32.0ml、36.0ml、或40.0ml的0.25%胶原溶胶,在基板上盖上各培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化,由此制作胶原凝胶。此时,注入的胶原溶胶不会从基板与壁面铸型的间隙中流出地进行凝胶化。自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时、第4小时、第6小时、及第8小时,对胶原凝胶内的游离水从基板与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流出的量进行定量,同时除去在各时间流出的游离水。另外,在第2小时通过使壁面铸型上下稍微移动,从而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。
另外,壁面铸型在第8小时从基板上除去,但此时,壁面铸型与胶原凝胶处于非粘接状态,从基板上除去的壁面铸型的内壁等周围完全没有胶原凝胶的附着。此外,在第8小时从37.0℃的保湿孵化器移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下使流出的游离水流出。这里,关于将从10.0ml至20.0ml的0.25%胶原溶胶注入高度为30.0mm的壁面铸型内的直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿,将残留在胶原凝胶内的游离水通过自然干燥而完全除去,得到玻璃化的胶原凝胶干燥体。此外,关于将从24.0ml至40.0ml的0.25%胶原溶胶注入高度为60.0mm的壁面铸型内的100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿,由于流出的游离水的量多,所以自移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内起1个半小时后(凝胶制作后的第9个半小时)也对向胶原凝胶的外侧流出的游离水的量进行定量,除去该游离水后,将残留在胶原凝胶内的游离水通过自然干燥而完全除去,得到玻璃化的胶原凝胶干燥体。
其结果获知,关于10.0ml及12.0ml的胶原凝胶,至第8小时为止1/2左右的游离水向壁面铸型的外侧流出,此外,关于16.0ml及20.0ml的胶原凝胶,至第8小时为止2/3以上的游离水向壁面铸型的外侧流出(表7)。
【表7】
进而获知,关于从24.0ml至40.0ml的胶原凝胶,自第8小时为止1/2以上的游离水向壁面铸型的外侧流出,此外,自第9个半小时为止2/3左右的游离水向壁面铸型的外侧流出(表8)。
【表8】
另外,从残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去的阶段起开始玻璃化。因此,测量至该玻璃化开始为止的自然干燥所需的大概的时间。其结果是,至玻璃化开始为止(至残留在胶原凝胶内的游离水被完全除去而变成胶原凝胶干燥体为止)所需的时间在10.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为21小时以上且37小时以内,在12.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为40小时以上且43小时以内,此外,在16.0ml及20.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为37小时以上且40小时以内(表9)。
【表9】
进而,在24.0ml及32.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为47小时以内,在28.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为47小时以上且51小时以内,在36.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为51小时以上且62小时以内,此外,在40.0ml的0.25%胶原凝胶的情况下为47小时以上且51小时以内(表10)。
【表10】
即,获知自然干燥所需的时间在从10.0ml至40.0ml的0.25%胶原凝胶中最长为62小时以内,在向由基板和壁面铸型构成的容器中注入胶原溶胶后3天以内得到玻璃化的胶原凝胶干燥体。
将玻璃化后第1天至第2天的胶原凝胶干燥体移入室温下的超净台内,在基板的培养皿为直径60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的情况下向培养皿内添加5.0ml的PBS,并且在基板的培养皿为100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的情况下向培养皿内添加20.0ml的PBS,进行再水化并从基板上剥离,由此制作带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。然后,多次用PBS进行冲洗,从而制作以PBS平衡化的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜反映出壁面铸型的直径34mm的内圆(面积:9.1cm2)形状,以很小的宽裕包埋环状尼龙膜支撑体的直径33mm的外圆周围。
通过该工序制作的胶原玻璃质凝胶膜含有胶原25.0mg(来自胶原溶胶10.0ml)、30.0mg(来自胶原溶胶12.0ml)、40.0mg(来自胶原溶胶16.0ml)、50.0mg(来自胶原溶胶20.0ml)、60.0mg(来自胶原溶胶24.0ml)、70.0mg(来自胶原溶胶28.0ml)、80.0mg(来自胶原溶胶32.0ml)、90.0mg(来自胶原溶胶36.0ml)、或100.0mg(来自胶原溶胶40.0ml)。
进而,将该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜移入直径为35mm的亲水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-3001)及在底表面铺有石蜡膜(Pechiney Plastic Packaging公司制)的直径为60mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1007)中,在10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在取下盖子的状态下放置1~2天左右使其完全干燥。之后,移入室温下的超净台内在各培养皿上盖上盖子后在室温下无菌地保管维持而进行玻璃化,由此制作各带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体。
通过该工序制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体每单位面积(1.0cm2)含有胶原2.7mg(来自胶原溶胶10.0ml)、3.3mg(来自胶原溶胶12.0ml)、4.4mg(来自胶原溶胶16.0ml)、5.5mg(来自胶原溶胶20.0ml)、6.6mg(来自胶原溶胶24.0ml)、7.7mg(来自胶原溶胶28.0ml)、8.8mg(来自胶原溶胶32.0ml)、9.9mg(来自胶原溶胶36.0ml)、或11.0mg(来自胶原溶胶40.0ml)。
<比较例2>利用以往的培养皿的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的制作
代替实施例4中利用能够与基板分离的壁面铸型,使用以往的直径为35mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1008),与实施例4同样地进行实验。
具体而言,向该培养皿内插入1张环状尼龙膜支撑体,之后立即想要注入从10.0ml至40.0ml的0.25%胶原溶胶,但获知若注入10.0ml的0.25%胶原溶胶,则注入的胶原溶胶从培养皿的高度以圆顶状隆起而无法盖盖子,此外,若注入12.0ml以上的0.25%胶原溶胶,则超过培养皿的容许容量而溢出。即,获知在以往的直径为35mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿中,无法制作10.0ml以上的胶原凝胶。
<实施例5>利用基板和壁面铸型而制作的无环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜的厚度的测定
实施例4中,使用外圆的直径为39mm且内圆的直径为35mm且高度为60.0mm的由丙烯酸树脂构成的壁面铸型、及作为基板的100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿(Falcon#35-1112)的底表面,在1个基板上设置1个壁面铸型,从而制作能够将基板与壁面铸型分离的1个容器。在各容器内不插入环状尼龙膜,注入20.0ml、24.0ml、28.0ml、32.0ml、36.0ml、或40.0ml的0.25%胶原溶胶,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化,同时整个8小时使胶原凝胶内的游离水从基板与壁面铸型的间隙向壁面铸型的外侧流出而除去。之后,移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在1个半小时后(凝胶制作后的第9个半小时),对各胶原凝胶除去向外侧流出的游离水。进而,用3天将残留在各胶原凝胶内的游离水通过自然干燥而完全除去,得到玻璃化的胶原凝胶干燥体。将玻璃化后第1天的各胶原凝胶干燥体移入室温下的超净台内,向基板的培养皿内添加20.0ml的PBS进行再水化,从基板上剥离,由此制作胶原玻璃质凝胶膜。然后,多次用PBS进行冲洗,由此制作以PBS平衡化的胶原玻璃质凝胶膜。各胶原玻璃质凝胶膜反映出壁面铸型的直径为35mm的内圆(面积:9.6cm2)形状,不具有不定形外周缘部。
对于这样制作的无环状尼龙膜支撑体的各胶原玻璃质凝胶膜,测量厚度。具体而言,在2片玻璃载片(Matsunami#S-0317)之间夹持1张胶原玻璃质凝胶膜的状态下安装到千分尺(Mitutoyo数显千分尺#MDC-25M)上进行测量。其结果是,含有胶原50.0mg的胶原玻璃质凝胶膜(来自胶原溶胶20.0ml)为428±148.1μm(3次测定),含有60.0mg的胶原玻璃质凝胶膜(来自胶原溶胶24.0ml)为635±21.4μm(3次测定),含有70.0mg的胶原玻璃质凝胶膜(来自胶原溶胶28.0ml)为714±34.6μm(3次测定),含有80.0mg的胶原玻璃质凝胶膜(来自胶原溶胶32.0ml)为774±29.9μm(3次测定),含有90.0mg的胶原玻璃质凝胶膜(来自胶原溶胶36.0ml)为934±22.2μm(3次测定),及含有100.0mg的胶原玻璃质凝胶膜(来自胶原溶胶40.0ml)为1,073±58.5μm(3次测定)。
<实施例6>胶原玻璃质凝胶膜干燥体重叠化的层叠体的制作
作为基板,使用100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底面,作为壁面铸型,使用4个外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm且高度为30mm的丙烯酸树脂。通过在1个基板上设置4个壁面铸型,制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器。向各容器中插入1张环状尼龙膜支撑体,注入2.0ml的0.25%胶原溶胶在基板上盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化,由此在1个基板上制作4个胶原凝胶。
自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时,通过使壁面铸型上下稍微移动,从而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。之后,由于至第4-6小时为止1/4左右的游离水向壁面铸型的外侧流出,所以从基板上除去壁面铸型。除去流出的游离水后,移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下将残留在胶原凝胶内的游离水通过2天的自然干燥而完全除去,得到胶原凝胶干燥体。
对于该玻璃化的胶原凝胶干燥体,在基板的培养皿内添加10ml的细胞培养液(与实施例1同样的组成)而再水化,从基板上剥离,由此制作4个带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。
进而,在1个基板上设置4个壁面铸型,再次制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器。然后,除去通过上述的方法制作的带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜的细胞培养液后,向各容器中各插入1张该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。
以下,与之前同样地向各容器中注入2.0ml的0.25%胶原溶胶,重复进行2次凝胶化、胶原凝胶内的游离水的流出、在10.0℃40%湿度的条件下的游离水的完全除去、利用10ml的细胞培养液的再水化的一连串的操作(最后的再水化用20ml的PBS代替10ml的细胞培养液来进行)后,多次用PBS进行冲洗,由此以PBS进行平衡化。由此,能够制作4个具有环状尼龙膜支撑体且胶原玻璃质凝胶膜重叠化的层叠体(来自0.25%胶原溶胶2.0ml×3层)。
该胶原玻璃质凝胶膜重叠化的层叠体含有15.0mg胶原,反映出壁面铸型的直径为34mm的内圆的形状。
此外,对于胶原玻璃质凝胶膜重叠化的层叠体(来自0.25%胶原溶胶2.0ml×3层),安装到千分尺上测量厚度,结果为65±2μm(3次测定平均)。与通过实施例3的方法制作的胶原玻璃质凝胶(来自0.25%胶原溶胶6.0ml)的厚度69±5μm(3次测定平均)相等。
进而,将该胶原玻璃质凝胶膜的层叠体移入在底面铺有石蜡膜的100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿中,在10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在取下盖子的状态下在胶原凝胶内放置1天左右使其完全干燥。之后,盖上培养皿的盖子后在室温下无菌地保管维持而进行玻璃化,由此制作胶原玻璃质凝胶膜干燥体重叠化的层叠体。
然后,通过该工序制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体每单位面积(1.0cm2)含有1.65mg胶原。
<实施例7>将分别制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体重叠化的层叠体的制作
作为基板,使用100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底面,作为壁面铸型,使用4个外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm且高度为30mm的丙烯酸树脂。通过在1个基板上设置4个壁面铸型,制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器。向各容器中注入2.0ml的0.25%胶原溶胶后,插入按照实施例4制作的玻璃质凝胶膜干燥体(来自0.25%胶原溶胶10.0ml),向其中再次注入2.0ml的0.25%胶原溶胶后,进一步插入按照实施例4制作的玻璃质凝胶膜干燥体(来自0.25%胶原溶胶10.0ml),最后注入2.0ml的0.25%胶原溶胶,在基板上盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化,从而在1个基板上制作4个胶原凝胶。
自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时,通过使壁面铸型上下稍微移动而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。之后,由于至第3小时为止1/3左右的游离水流出到壁面铸型的外侧,所以从基板上除去壁面铸型。将流出的游离水除去后,移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下将残留在胶原凝胶内的游离水通过2天的自然干燥而完全除去,得到胶原凝胶干燥体重叠化的层叠体。对于该已玻璃化的胶原凝胶干燥体的层叠体,在基板的培养皿内添加20ml的PBS而进行再水化,从基板上剥离,由此制作4个胶原玻璃质凝胶膜的层叠体。然后,多次用PBS进行冲洗,由此制作4个以PBS平衡化的胶原玻璃质凝胶膜的层叠体。该胶原玻璃质凝胶膜的层叠体含有65.0mg胶原,反映出壁面铸型的直径为34mm的内圆的形状。
此外,对于这样制作的胶原玻璃质凝胶膜的层叠体(来自0.25%胶原溶胶2.0ml+10.0ml+2.0ml+10.0ml+2.0ml(总计26ml)),按照实施例6的方法测量厚度,结果为336±20μm(3次测定平均)。
进而,将该胶原玻璃质凝胶膜的层叠体移入在底面铺有石蜡膜的100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿中,在10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在取下盖子的状态下在胶原凝胶内放置1天左右使其完全干燥。之后,盖上培养皿的盖子后在室温下无菌地保管维持而进行玻璃化,由此制作胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体。
通过该工序制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体每单位面积(1.0cm2)含有7.15mg胶原。
<实施例8>含有FITC标记山羊抗小鼠抗体的玻璃质凝胶膜干燥体的制作
作为基板,使用100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底面,作为壁面铸型,使用4个外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm且高度为30mm的丙烯酸树脂。通过在1个基板上设置4个壁面铸型,制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器。向各容器中插入1张环状尼龙膜支撑体,注入2.0ml的0.25%胶原溶胶并在基板上盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化,由此在1个基板上制作4个胶原凝胶。
自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时,通过使壁面铸型上下稍微移动而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。之后,由于至第4-6小时为止1/3左右的游离水流出到壁面铸型的外侧,所以从基板上除去壁面铸型。将流出的游离水除去后,移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下将残留在胶原凝胶内的游离水通过2天的自然干燥而完全除去,得到胶原凝胶干燥体。
对于该已玻璃化的胶原凝胶干燥体,在基板的培养皿内添加10ml的细胞培养液(与实施例1同样的组成)进行再水化,从基板上剥离,由此制作4个带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。除去细胞培养液后,按照在各容器中插入1张该带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜的方式,在1个基板上设置4个壁面铸型,由此再次制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器。
进而,向各容器中注入含有2.0ml的1%的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体溶液的0.25%胶原溶胶,进行凝胶化、胶原凝胶内的游离水的流出、10.0℃40%湿度的条件下的游离水的完全除去、利用10ml的细胞培养液的再水化的一连串的操作。由此,使带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜与含有FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体的胶原玻璃质凝胶膜重叠化。
进而,通过在1个基板上设置4个壁面铸型,再次制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器,除去已重叠化的胶原玻璃质凝胶膜的细胞培养液后,向各容器中插入1张。
然后,向各容器中注入2.0ml的0.25%胶原溶胶,进行凝胶化、胶原凝胶内的游离水的流出、10.0℃40%湿度的条件下的游离水的完全除去、利用20ml的PBS的再水化的一连串的操作,之后,多次用PBS进行冲洗,由此以PBS平衡化。
由此,能够在2张胶原玻璃质凝胶膜之间夹持含有FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体的胶原玻璃质凝胶膜的状态下制作重叠成3层的层叠体。该层叠体含有15.0mg胶原,反映出壁面铸型的直径为34mm的内圆的形状。
对于这样制作的胶原玻璃质凝胶膜的层叠体(0.25%胶原溶胶2.0ml+2.0ml+2.0ml(总计6ml),按照实施例6的方法测量厚度。其结果为60±3μm(3次测定平均)。
此外,将该胶原玻璃质凝胶膜的层叠体移入在底面铺有石蜡膜的100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿中,在10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在取下盖子的状态下在胶原凝胶内放置1天左右使其完全干燥。之后,盖上培养皿的盖子后在室温下无菌地保管维持而进行玻璃化,由此制作在2张胶原玻璃质凝胶膜干燥体之间夹持含有FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体的胶原玻璃质凝胶干燥体的状态下重叠化的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体。通过该工序制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体每单位面积(1.0cm2)含有1.65mg胶原。
此外,将该胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体用PBS进行再水化,用荧光显微镜(Nikon)观察。其结果是,可以观察到FITC特有的荧光(绿色)(图11(A))。另外,通过实施例6的方法制作的层叠体无法观察到FITC特有的荧光(图11(B)倍率10倍)。
然后,对于制作的胶原玻璃质凝胶膜的层叠体,观察FITC标记山羊抗小鼠抗体在玻璃质凝胶膜中如何局部存在。具体而言,将该胶原玻璃质凝胶膜的层叠体包埋入Tissue-Tek O.C.T.Compound中进行冷冻。将冷冻的试样在低温恒温器内薄切成厚度为5μm,结果能够观察到在3层结构的胶原玻璃质凝胶膜的中间层残存FITC特有的荧光(图12、倍率40倍)。
进而,确认是否从制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体中缓释出FITC标记山羊抗小鼠抗体。具体而言,将胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体放入容器中,注入5ml的PBS后,保持在37.0℃的保湿孵化器中。在第3天回收PBS并重新注入5ml的PBS后,同样地保持,第6天再次回收PBS,用荧光读板仪(Molecular Devices)测定各PBS。其结果是,第3天在PBS中检测出5.53±0.21%(3次测定平均),第6天在PBS中检测出1.62±0.08%(3次测定平均)的FITC标记山羊抗小鼠抗体(设制作中使用的FITC标记山羊抗小鼠抗体量为100%时)。另外,在胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体的制作工序(再水化的PBS中)中,也检测出8.33%的FITC标记山羊抗小鼠抗体。由以上的内容明确,所制作的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体中的中间层中残存的FITC标记山羊抗小鼠抗体介由层叠体的外层向PBS中缓释。
<实施例9>中间层中具有琼脂糖玻璃质凝胶膜的胶原玻璃质凝胶膜的干燥体的制作
作为基板,使用100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底面,作为壁面铸型,使用4个外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm且高度为30mm的丙烯酸树脂。通过在1个基板上设置4个壁面铸型,制作能够将基板与壁面铸型分离的4个容器。向各容器中插入1张环状尼龙膜支撑体,注入2.0ml的0.25%胶原溶胶并在基板上盖上培养皿的盖子后,在5.0%CO2/95%空气存在下的37.0℃的保湿孵化器内进行凝胶化,由此在1个基板上制作4个胶原凝胶。
自移入37.0℃的保湿孵化器内起第2小时,通过使壁面铸型上下稍微移动而解除胶原凝胶与壁面铸型间的粘接。之后,由于至第4-6小时为止1/3左右的游离水流出到壁面铸型的外侧,所以从基板上除去壁面铸型。将流出的游离水除去后,移入10.0℃40%湿度的条件下的超净台内,之后在取下培养皿的盖子的状态下将残留在胶原凝胶内的游离水通过2天的自然干燥而完全除去,得到胶原凝胶干燥体。
对于该已玻璃化的胶原凝胶干燥体,在基板的培养皿内添加10ml的细胞培养液(与实施例1同样的组成)进行再水化,从基板上剥离,由此制作4个带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。
进而,通过在基板上(直径为60mm疏水性聚苯乙烯培养皿)设置1个壁面铸型,制作能够将基板与壁面铸型分离的1个容器,向该容器中插入1张带环状尼龙膜支撑体的胶原玻璃质凝胶膜。
然后,向该容器中注入2.0ml的含有1%的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体的2%琼脂糖。含有1%的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体的2%琼脂糖通过将在9.9ml的PBS中添加0.2g的琼脂糖(NIPPON GENE)并利用加热而溶解调制的2%琼脂糖冷却至37℃左右,进一步添加0.1ml的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体溶液并充分混合而调制。
在室温下凝胶化后,进行10.0℃40%湿度的条件下的游离水的完全除去、利用10ml的细胞培养液的再水化的一连串的操作,制作胶原玻璃质凝胶膜与含有FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体的琼脂糖凝胶膜重叠化的层叠体(带环状尼龙膜支撑体的胶原-琼脂糖玻璃质凝胶膜)。
进而,除去细胞培养液后,在1个基板上设置1个壁面铸型,从而再次制作能够将基板与壁面铸型分离的容器,向该容器中插入1张该层叠体(带环状尼龙膜支撑体的胶原-琼脂糖玻璃质凝胶膜)。
与之前同样地向各容器中注入2.0ml的0.25%胶原溶胶,进行凝胶化、胶原凝胶内的游离水的流出、10.0℃40%湿度的条件下的游离水的完全除去、利用20ml的PBS的再水化的一连串的操作,制作在2张胶原玻璃质凝胶膜之间夹持含有FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体的琼脂糖玻璃质凝胶膜重叠成3层的玻璃质凝胶膜的层叠体(带环状尼龙膜支撑体的胶原-琼脂糖玻璃质凝胶膜)。然后,通过将该层叠体多次用PBS进行冲洗,制作1个以PBS平衡化的玻璃质凝胶膜的层叠体。该玻璃质凝胶膜的层叠体含有10.0mg胶原和40.0mg琼脂糖,反映出壁面铸型的直径为34mm的内圆的形状。
此外,对于这样制作的玻璃质凝胶膜的层叠体(0.25%胶原溶胶2.0ml+2%琼脂糖溶胶2.0ml+0.25%胶原溶胶2.0ml(总计6ml),按照实施例6的方法测量厚度,结果为556±13μm(3次测定平均)。
进而,将该层叠体移入在底面铺有石蜡膜的100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿中,在10.0℃40%湿度的条件下的超净台内在取下盖子的状态下在胶原凝胶内放置1天左右使其完全干燥。之后,盖上培养皿的盖子后在室温下无菌地保管维持而进行玻璃化,制作在2张胶原玻璃质凝胶膜干燥体之间夹持含有FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体的琼脂糖玻璃质凝胶膜干燥体而重叠成3层的层叠体(带环状尼龙膜支撑体的胶原-琼脂糖玻璃质凝胶膜干燥体)。
通过该工序制作的玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体每单位面积(1.0cm2)含有1.1mg胶原、4.4mg琼脂糖。
进而,将所制作的玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体用PBS进行再水化,用荧光显微镜(Nikon)进行观察。其结果是,能够观察到FITC特有的荧光(绿色)(图13、倍率10倍)。
<实施例10>关于厚的玻璃质凝胶膜的透明性的改善的研究
由于实施例4中,能够制作厚度比以往厚的玻璃质凝胶膜,所以为了进一步提高实用性,对改善玻璃质凝胶膜的特性之一的透明性进行研究。
准备10张按照实施例1的方法制作的玻璃化期间长的(3个月以上)玻璃质凝胶膜干燥体(来自0.25%胶原溶胶2ml),分别用3ml的PBS进行再水化。再水化后,按照不进入空气的方式1张1张地重叠。
在逐渐重叠的过程中对于玻璃质凝胶膜的透明度,使用分光光度计(日本分光)进行吸光度(测定波长400nm)的测定。其结果是,各吸光度为:1张时为0.148、2张时为0.208、5张时为0.415、10张时为0.803(图14)。
此外,此时,将按照实施例4的方法制作的玻璃化期间长(3个月以上)且厚度厚的玻璃质凝胶膜干燥体(来自0.25%胶原溶胶20ml)用PBS进行再水化后,同样地进行吸光度的测定。其结果是,吸光度为1.67。
重叠玻璃质凝胶膜的张数越多,则吸光度越增加,透明性越降低,但重叠10张时的吸光度为1张厚的玻璃质凝胶膜干燥体(来自0.25%胶原溶胶20ml)的吸光度的1/2,更透明。通过重叠进行玻璃化而没有被一体化的玻璃质凝胶膜,能够改善再水化时的透明性(图15)。因此,重叠多张玻璃质凝胶膜而达到所期望的厚度,能够作为透明性优异的构成角膜的主要实质的胶原的模仿物利用。
<实施例11>透明性优异的厚的玻璃质凝胶膜的制作
作为基板,使用100mm×100mm的疏水性聚苯乙烯制培养皿的底面,作为壁面铸型,使用外圆的直径为38mm且内圆的直径为34mm且高度为18mm的丙烯酸树脂容器。向容器中注入1.0ml的0.25%胶原溶胶后,插入9张按照实施例1制作的玻璃化期间长的(3个月以上)玻璃质凝胶膜干燥体(来自0.25%胶原溶胶2ml)。插入后,注入1.0ml的0.25%胶原溶胶,在基板上盖上培养皿的盖子后,在5.0%·CO2/95%空气存在下的37℃的保温孵化器内进行2小时凝胶化。
在凝胶化2小时后,通过使壁面铸型上下稍微移动,从而解除胶原溶胶与壁面铸型间的粘接。至第2小时为止,由于1/2左右的游离水流出到壁面铸型的外侧,所以从基板上除去壁面铸型。除去流出的游离水后,移入10℃·40%湿度的条件下的超净台内,在取下培养皿的盖子的状态下将残留在胶原溶胶内的游离水用2天完全除去。除去游离水后,将10ml PBS加入培养皿中,多次冲洗。冲洗后,再次移入10℃·40%湿度的条件下的超净台内,在取下培养皿的盖子的状态下将残留在胶原溶胶内的游离水除去,得到通过重叠化而一体化的胶原玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体。
对于将该玻璃质凝胶膜干燥体的层叠体(插入9张:来自0.25%胶原溶胶1.0ml+0.25%胶原溶胶2.0ml×9层+0.25%胶原溶胶1.0ml)进行再水化的玻璃质凝胶膜的透明度,使用分光光度计(日本分光)进行吸光度(测定波长400nm)的测定。其结果是,吸光度为1.06(3次的平均值)。
此外,此时,将按照实施例4制作的厚度厚的玻璃质凝胶膜干燥体(来自0.25%胶原溶胶20ml)用PBS进行再水化后,同样地进行吸光度的测定。其结果是,吸光度为2.12(3次的平均值)。
由此获知,关于厚度厚的玻璃质凝胶膜的透明性,与单次制作法相比较,利用重叠一体化的制作法得到改善(图16)。因此,通过重叠多张玻璃质凝胶膜而一体化,达到所期望的厚度,能够作为透明性优异的构成角膜的主要实质的胶原的模仿物利用。