CN106279726B

CN106279726B - 交联透明质酸钠凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN106279726B
Application number: CN201610648838.0A
Authority: CN
Inventors: 代金明; 孙乐青; 袁源; 张婷婷; 李湘杰; 李次会
Original assignee: Beijing Daqing Biotechnology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Beijing Daqing Biotechnology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2036-08-09
Also published as: CN106279726A

Abstract

本发明提供一种交联透明质酸钠凝胶及其制备方法，在超声条件下，向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂进行交联反应，反应结束后，用酸调节体系pH值7.1‑7.5，搅拌1‑2h，然后用无水乙醇沉淀，即得交联透明质酸钠凝胶。有效解决了传统交联技术中交联修饰度占比低(约10％)的不足，将其提高至60％左右，且占比大小可控。本发明引入超声交联技术，可有效提高交联透明质酸中的交联修饰度比例，降低悬挂修饰度比例，延长材料的体内降解时间。

Description

交联透明质酸钠凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及材料工程技术领域，具体地说，涉及一种交联透明质酸钠凝胶及其制备方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)又名玻尿酸，是粘多糖中最具有代表性的一种，广泛分布于人体各部位，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。此外，透明质酸具有特殊的锁水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(Natural moisturizing factor，NMF)，例如2％的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98％水分。

人类皮肤中含有大量的透明质酸，用于改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、富有弹性。但随着年龄的增长，皮肤中的透明质酸含量会逐渐降低，导致皮肤褶皱，萎缩，此时需注射透明质酸以起到填充美容的作用。但由于天然中提取的透明质酸注射于人体内时，降解非常迅速，约24小时之内完成降解，一般将透明质酸钠交联后注射于皮下，以延长降解时间，降解时间与交联度密切相关，因此，对透明质酸进行交联改性以延长其在体内的降解时间具有重要的现实意义。

目前常用的交联方法是将透明质酸钠和交联剂，如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(1,2,7,8-diepoxyoctane,DEO)、二乙烯基砜(divinyl sulfone,DVS)等，在碱性条件交联而得，区别主要集中于透明质酸钠与交联剂的比例以及交联反应的温度，通过这些条件一定程度上控制了交联度，从而控制降解时间。

由于1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)毒性相对较小，且分子中含有烷氧基键，聚合后烷氧基键聚合后可自由旋转而使材料柔软，特别适用于软组织的填充，所以目前市面上绝大多数产品都采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)作为交联剂交联而得。

透明质酸交联度的表征主要有总交联度，包括悬挂修饰度和交联修饰度，悬挂修饰度主要影响组织毒性的大小，而交联修饰的透明质酸基本无组织毒性，主要影响体内降解时间。故理想的交联透明质酸是交联修饰度占比越大而悬挂修饰度占比越小越好，因此提高交联修饰度降低悬挂修饰度对于是交联透明质酸具有非常重要的意义，然而现有的交联剂技术无法控制悬挂修饰度和交联修饰度的比例，目前常见的交联剂术只能通过控制总修饰度来平衡组织毒性和降解时间。

例如，传统交联技术中，悬挂修饰度与交联修饰度基本维持在9:1的比例，由于悬挂修饰所占比例大，因此会出现明显的组织毒性，此条件下降解时间一般维持在6～8个月左右，若能提高交联修饰度的比例而降低悬挂修饰度的比例，可在保证无组织毒性的情况下有效延长材料的降解时间。

目前的透明质酸钠交联相关技术中，仅限于总交联度的控制，暂未涉及到提高交联修饰度而抑制悬挂修饰度这种方式，如CN101036808B公开了一种交联HA凝胶制剂的制备工艺，将二乙烯基砜与HA分子的羟基发生反应，形成醚键，其步骤为：HA原料加入碱试剂中，搅拌，使其彻底溶解，将碱性的HA溶液与二乙烯基砜混合，形成交联HA凝块；反应液中加入富含羟基的物质，将交联HA凝胶块取出并放入电动搅拌机中搅拌，交联HA块状凝胶变成微粒状凝胶。CN101056891B公开了可以简便地制备交联剂含量少且黏弹性好的交联HA凝胶的方法。其是在酸性或碱性条件下将含有透明质酸10W/V％以上、交联剂和水的混合物搅拌混合。该方法主要靠增加HA的浓度的方式，减少交联剂用量，未综合考虑其他反应物质的影响。CN101878230B公开了一种乳液中的交联透明质酸的方法，其步骤为：(a)提供包含透明质酸或其盐的碱性水溶液；(b)在有机相或油相中，从步骤(a)的混合溶液中形成具有所期望尺寸的微滴，以形成有机物包水或油包水(W/O)的乳液；向乳液中加入包含交联剂的溶液，由此透明质酸与所述交联剂发生反应以提供交联的透明质酸微珠；并且(d)任选地加工步骤(c)中所得的交联的透明质酸微珠的分散体。此方法反应体系中需要添加有机试剂，可能会带来有机试剂残留等风险。WO97/04012提供了一种多糖(包括透明质酸)凝胶组合物的制备方法，包括：形成水溶性可交联的多糖水溶液；在多官能交联剂的存在下开始交联；在凝胶反应发生前，立体阻碍交联反应防止其终止(例如通过稀释溶液)；向所述活化的多糖中再引入未立体阻碍的条件(例如通过蒸发溶液)，继续交联反应，形成黏弹凝胶。WO2006/0194758A1公开了将高、低分子量的透明质酸混合反应，产生一种单相的具良好机械性质的胶体，改良了可注射性，但此方法在50℃交联反应结束后，未经透析纯化前残留大量未反应的交联剂，其浓度超过300ppm以上，之后通过透析法以纯化试图去除交联剂，但其效果不佳，难以有效去除未反应的交联剂。CN101925348A提出了一种可生物降解的粘性水凝胶，制备方法是将X种具有相同或不同交联度的聚合物均质混合。此方法仅是将X种聚合物进行物理混合，聚合物之间没有交联键，不能形成致密的交联网络结构。CN100582146C提到一种的生物相容性交联凝胶，通过添加一定量的交联剂，将预订量的至少一种聚合物在溶液中交联，然后加入另外量的分子量大于500kDa的液态聚合物，使液态聚合物的总浓度降低，并交联。

以上方法通过控制总修饰度来调节组织毒性和降解时间，均属于传统交联技术范畴，无法有效提高交联修饰度在总交联度中的占比。

发明内容

本发明的目的是提供一种交联透明质酸钠凝胶及其制备方法。

本发明基于以下构思：在透明质酸钠交联技术中，总交联度等于悬挂修饰度和交联修饰度的总和，其中，交联修饰度的大小直接影响着材料在体内的降解时间，交联修饰度越大，其在体内的停留时间越长；悬挂修饰度的大小直接影响着材料的组织毒性，悬挂修饰度越大，安全性越差。因此理想的交联透明质酸钠为悬挂修饰度越小，交联修饰度越大越好。传统的交联技术中，总修饰度可以通过控制实验条件有所提高，但交联修饰度所占总交联度的比例无法得到有效提高，仅约10％。本发明引入超声交联技术，有效提高交联透明质酸中的交联修饰度比例，降低悬挂修饰度比例，延长材料的体内降解时间。

超声波在介质中传播时，与介质相互作用时，使介质发生物理的和化学的变化，从而产生一系列特殊效应，主要是因为超声波在介质中的空化作用，即存在于液体中微小气泡在超声场中被激活，表现为泡核的形成，震荡，生长，收缩乃至崩溃等一系列动力学过程，及其引发的物理和化学效应。气泡在几微秒之内突然崩溃，气泡破裂类似于一个小小的爆炸过程，产生极其短暂的高能环境，由此产生局部的高温高压。同时这种局部的高温高压存在时间非常短，仅几微秒，所以温度的变化率非常大，这就为一般条件下难以实现或者不可能实现的化学反应提供了一种非常特殊的环境。高温条件有利于反应物的裂解和自由基的形成，提高了化学反应速率。高压有利于气相中的反应；另一方面，当气泡破裂产生高压的同时，还伴随着强烈的冲击波，其速度可达100m/s的微射流，对于固体参加的非均相体系起到很好的冲击作用，导致分子间强烈的相互碰撞和聚集，对固体表面的形态、表面组成产生极为重要的作用。因此空化作用可以看做聚集声能的一种形式，能够在微观尺度模拟反应器内的高温高压，促进反应的进行。

高分子量的透明质酸钠分子链较长，普通机械搅拌使分子的运动受到局限，并使其沿一个方向单一运动，导致其与交联剂的碰撞机会减少，交联剂一端连接于透明质酸钠分子链上后，另一端由于位阻作用，在分子碰撞机会减少的情况下，很难连接到另一分子链上而在碱液中分解，使其较大概率的成为悬挂修饰。

由于超声的空化作用不断产生微小气泡，气泡在不断的形成和破裂过程中产生瞬间的高能高压，并对分子运动起到冲击，改变分子运动轨迹，从而增加透明质酸钠分子的运动程度，增加了分子间的碰撞机会，使的交联修饰度有所增加，另一方面，反应位点瞬间产生的高能高压能克服位阻效应，而使交联剂和大分子的反应点瞬间完成反应。故超声应用于大分子量透明质酸钠的交联，可提高其交联修饰度，并通过控制超声频率的大小来调节交联修饰度的大小。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种制备交联透明质酸钠凝胶的方法，在(室温)超声条件下，向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂进行交联反应，反应结束后，用酸调节体系pH值7.1-7.5，平衡搅拌1-2h，然后用有机溶剂沉淀，即得交联透明质酸钠凝胶。

本发明采用的超声条件为：温度15～30℃，超声频率25-45KHz，超声时间10-50min。

所述透明质酸钠的碱性水溶液制备如下：将1.0克透明质酸钠溶于1％的碱性水溶液中，即得；其中，所述碱性水溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、季铵碱水溶液中的至少一种。

所述交联剂包括1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷、二乙烯基砜等中的至少一种；使用时将交联剂用水稀释150～1000倍。稀释后的交联剂在10min内滴加完毕。

前述的方法，透明质酸钠与交联剂的质量比为5-50:1。

前述方法中所用酸包括有机酸或无机酸，优选稀盐酸，更优选0.005M的盐酸溶液。

前述方法中所用有机溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、乙醚或丙酮等中的至少一种；优选无水乙醇。

前述的方法，按1.0克透明质酸钠加入100mL有机溶剂的用量，进行沉淀。

在本发明的一个有效实施方式中，交联透明质酸钠凝胶的制备方法如下：

(1)取一定量的透明质酸钠溶于碱性溶液中(氢氧化钠、氢氧化钾、季铵碱等溶液)室温下搅拌至完全溶解。

(2)取一定量的交联剂(如BDDE、DEO、DVS等)按一定比例稀释后保存备用。

(3)将反应体系置于一定功率的超声环境中进行反应，缓慢将稀释后的交联剂滴加到透明质酸的氢氧化钠溶液中反应一段时间。

(4)将反应后体系用稀盐酸溶液调节pH至7.1～7.5之间，平衡1～2小时，然后用95％的乙醇进行沉淀得块状固体，经后处理加工(冷冻干燥工艺，在-50℃压力100Pa条件下冷冻干燥12小时)，即得到交联透明质酸钠凝胶成品。

本发明进一步提供由上述方法制备的交联透明质酸钠凝胶。

所述交联透明质酸钠凝胶的总修饰度为2％～50％，优选2％～20％，其中交联修饰度占总修饰度的50％-70％。

本发明具有以下优点：

(一)有效解决了传统交联技术中交联修饰度占比低(约10％)的不足，将其提高至60％左右，且占比大小可控。

(二)解决了传统交联技中无法解决的交联度和安全性之间的矛盾；

(三)提高交联修饰度，降低悬挂修饰度，不仅可以延长材料在体内的降解时间，有效降低组织毒性，而且安全性有很大程度的提高。

(四)采用超声工艺交联，反应时间短，成本低，效率高。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE，纯度95％)购自百灵威科技有限公司，透明质酸钠购自山东华熙福瑞达生物科技有限公司。可磁力搅拌器，购自上海越众仪器有限公司，型号ZNCL-500。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

以下实施例中修饰度的测试方法如下：取样品各0.1g，加入到5mL300U/mL的HAase-B酶(购自上海第一生化药业有限公司)解液中，晃匀，于42℃水浴中孵化24小时。然后将酶解液煮沸5分钟，25000r/min转速下离心除酶，0.22μm滤膜过滤后稀释至10mL进行SEC-MS测试。

色谱条件：色谱柱：Superdex Peptide 10/300GL；流动相：0.05％醋酸铵：乙腈＝4:1；流速：0.3mL/min；进样量：25μL；柱温度：25℃；检测器：质谱检测器；

质谱条件：负离子模式；DP-50，EP-10，TEM 500℃；IS-4000；MW范围：300～3000Da；

数据处理：采用面积归一法分析各修饰度的大小。

以下实施例中采用的冷冻干燥工艺的具体条件参数如下：冷冻温度-50℃，冷冻压力100Pa，冷冻时间12小时。

实施例1传统交联工艺中时间对交联度的影响

1、将分子量为200万道尔顿的透明质酸钠1.0g加入150mL 1％(w/w)的NaOH溶液中，室温下搅拌4小时至完全溶解。

2、取0.2mL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，用50mL蒸馏水稀释后保留备用。

3、将透明质酸钠的NaOH溶液置于可磁力搅拌器中，室温搅拌下将稀释后的BDDE溶液滴加到体系中，10分钟滴完，滴完后继续反应一定时间，反应时间见表1。

4、加入0.005mol/L盐酸溶液调节至pH＝7.2，搅拌下平衡2小时，然后加入500mL无水乙醇，沉淀2小时，取出块状固体。

将所得固体冷冻干燥后进行交联度测试，结果见表1。

表1传统交联工艺中反应时间对交联度的影响

实施例2传统交联工艺中交联温度对交联度的影响

3、将透明质酸钠的NaOH溶液置于可磁力搅拌器中，在25～45℃温度范围内，搅拌下将BDDE溶液滴加到体系中，10分钟滴完，滴完后继续反应36小时。

将所得固体冷冻干燥后进行交联度的测试，结果见表2。

表2传统交联工艺中反应温度对交联度的影响

实施例3超声交联工艺中反应时间对交联度的影响

3、将透明质酸钠的NaOH溶液置于频率可调的超声反应仪中，调节超声频率25KHz，室温下超声，并将BDDE溶液滴加到体系中，10分钟滴完，滴完后继续超声反应0～40min，观察反应时间对交联度的影响(表3)。

将所得固体冷冻干燥后进行交联度测试，结果见表3。

表3超声交联工艺中反应时间对交联度的影响

实施例4超声交联工艺中超声频率对交联度的影响

3、将透明质酸钠的NaOH溶液置于频率可调的超声反应仪中，调节超声频率25～45KHz，室温下超声，并将BDDE溶液滴加到体系中，10分钟滴完，观察反应时间对交联度的影响(表4)。

将所得固体冷冻干燥后进行交联度测试，结果见表4。

表4超声交联工艺中超声频率对交联度的影响

实施例5超声交联工艺中交联剂用量对交联度的影响

2、取一定量(具体用量见表5)的1,4-丁二醇二缩水甘油醚，用50mL蒸馏水稀释后保留备用。

3、将透明质酸钠的NaOH溶液置于频率可调的超声反应仪中，调节超声频率25～45KHz，室温下超声，并将BDDE溶液滴加到体系中，10分钟滴完，滴完后继续超声反应5分钟。

将所得固体冷冻干燥后进行交联度测试，结果见表5。

表5超声工艺中交联剂用量对交联度的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种制备交联透明质酸钠凝胶的方法，其特征在于，在超声条件下，向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂进行交联反应，反应结束后，用酸调节体系pH值7.1-7.5，平衡搅拌1-2h，然后用有机溶剂沉淀，即得交联透明质酸钠凝胶；

超声条件为：温度15～30℃，超声频率25-45KHz，超声时间10-50min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，透明质酸钠的碱性水溶液制备如下：将1.0克透明质酸钠溶于1％的碱性水溶液中，即得；其中，所述碱性水溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、季铵碱水溶液中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联剂包括1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷、二乙烯基砜中的至少一种；使用时将交联剂用水稀释150～1000倍，稀释后的交联剂在10min内滴加完毕。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，透明质酸钠与交联剂的质量比为5-50:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、乙醚或丙酮中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为无水乙醇。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸包括有机酸或无机酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酸为稀盐酸。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酸为0.005M的盐酸溶液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按1.0克透明质酸钠加入100mL有机溶剂的用量进行沉淀。

11.根据权利要求1-10任一项所述方法制备的交联透明质酸钠凝胶。

12.根据权利要求11所述的交联透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶的总修饰度为2％～50％，其中交联修饰度占总修饰度的50％-70％。

13.根据权利要求12所述的交联透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶的总修饰度为2％～20％。