CN105154404A - 黄芪提取物fqr-8及其在肿瘤细胞免疫治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄芪提取物FQR-8及其制备和用途，并提供了FQR-8诱导培养CIK或DC-CIK细胞的方法，其包括外周血采集、肿瘤抗原获取、单个核细胞分离、洗涤、DC-CIK细胞的诱导、培养等步骤；本发明获得的黄芪提取物FQR-8，可以有效提高CIK细胞的增殖、提高DC-CIK细胞杀瘤活性、延长DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠的带瘤生存期。

Description

黄芪提取物FQR-8及其在肿瘤细胞免疫治疗中的应用

技术领域：

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及利用黄芪提取物FQR-8诱导DC-CIK细胞增殖与分化，使其杀瘤活性得到提高。

背景技术：

健康和生命，如何提高恶性肿瘤病人的生命质量已成为本领域研究的热恶性肿瘤已经成为我国目前死亡原因的第一位，严重威胁着人们的健点。

肿瘤细胞的生物治疗是除化学治疗、放射治疗和手术治疗以外新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自体免疫细胞抗癌的新型治疗方法。它是被国家卫生计生委列入允许临床应用的三类技术。生物疗法包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗和抗体靶向治疗等。其核心技术是肿瘤患者自体外周血CIK/DC-CIK细胞体外培养及其回输技术，其中应用最广泛的治疗技术是应用肿瘤患者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK/DC-CIK细胞)治疗技术。

自体CIK细胞是指在体外由多种细胞因子诱导患者自体外周血单个核细胞(PBMC)而生成的异质细胞群。恶性肿瘤患者的免疫机能存在不同程度的受损害，CD3+、CD8+、CD56+细胞数量降低。NKT细胞是CIK异质细胞群中最具细胞毒活性的细胞，增殖后的CIK细胞具有T细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤的特点。与PBMC相比，CIK细胞中CD3+、CD8+、CD56+细胞比例明显升高，CIK细胞对肿瘤细胞有很强的杀伤力，而且NKT细胞越多，杀瘤效果越好。CIK细胞己成为过继细胞免疫治疗的主要方法。

自体外周血DC-CIK细胞是自体DC细胞和CIK细胞共同培养后生成的异质细胞群，DC和CIK共培养24h后，IL12的分泌量是CIK细胞单独培养的6.93倍；可以高表达CD3+、CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞，低表达CD4+CD25+Treg细胞，尽管DC细胞不具备直接杀伤肿瘤细胞作用，但DC细胞可刺激CIK细胞的增殖，分泌多种肿瘤杀伤细胞因子，比如TNFα和干扰素等。自体外周血DC-CIK细胞抗肿瘤效果一般比CIK细胞好，但制备成本高。自身DC细胞与自身肿瘤抗原共刺激后，可增强抗肿瘤免疫应答，目前常用于肿瘤细胞疫苗的临床预防。

CIK细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下四种途径：

CIK细胞能通过不同的机制识别肿瘤细胞，从而通过细胞毒作用杀死肿瘤细胞；

CIK细胞能够诱导肿瘤细胞凋亡，达到杀死肿瘤细胞的目的；

CIK细胞分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子；

肿瘤生物治疗的目标是通过人为的干预，调节机体自身的免疫系统，从而调节机体免疫系统对肿瘤细胞进行识别、抑制的功能。

肿瘤的免疫治疗具有以下的优势：

免疫治疗不仅可以直接产生抗肿瘤作用，同时还可以纠正患者的免疫系统，促进机体抗肿瘤的免疫能力；

无放疗，化疗副作用，减轻患者痛苦；

可用于已产生耐药性肿瘤患者的治疗；

对于晚期肿瘤患者能够迅速缓解症状，提高生存质量；

对术后肿瘤患者防复发效果较好，远期抗肿瘤效果良好；

对术后肿瘤患者防复发效果较好，远期抗肿瘤效果良好；

可单独使用，也可与其它治疗方法联合使用。单次有效，多次使用效果更佳。本发明所述黄芪提取物FQR-8及其在肿瘤细胞免疫治疗中的应用，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种利用黄芪提取物FQR-8诱导DC-CIK的方法，经该法制备的FQR-DC-CIK细胞杀瘤活性较常规诱导的DC-CIK显著提高

本发明采用的技术方案是：利用黄芪提取物FQR-8诱导DC-CIK细胞培养，其特征在于向CIK或DC-CIK细胞培养液中，加入黄芪提取物FQR-8，诱导CIK或DC-CIK细胞增殖与分化，以提高CIK或DC-CIK细胞的杀瘤作用。

所述向CIK或DC-CIK培养液中加入黄芪提取物FQR-8诱导DC-CIK细胞增殖与分化，具体依次包含以下步骤：

步骤1：外周血采集：无菌抽取肿瘤疾病患者外周血75ml，肝纳素抗凝并充分混匀，避免凝血；

步骤2：肿瘤抗原的获得：室温条件下2000rpm离心10分钟，收集10ml上层血浆，将收集的血浆灭活后加入FQR-DC-CIK诱导培养基中。所得细胞沉淀用于分离单个核细胞；

步骤3：单个核细胞分离：所得细胞沉淀用生理盐水加至50ml洗涤，2500rpm离心10分钟。弃上清，再次洗涤。轻轻加至淋巴细胞分离液表面，2000rpm条件下离心20分钟。用灭菌的巴氏收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀。再次洗涤离心；

步骤4：FQR-DC-CIK细胞培养：离心后弃上清，沉淀用含黄芪提取物FQR-8的诱导培养基重悬，并用稀释液稀释计数，均分至4个75cm²一次性的细胞培养瓶中，放入37℃、5％CO₂(v/v)饱和湿度的培养箱中培养，培养期间根据细胞生长情况适时换液和扩增。直至细胞数达到回输所需。所述FQR-DC-CIK诱导培养液中，黄芪提取物FQR-8的浓度为0.01ug/ml～1mg/ml。

本发明的积极效果为：本发明获得的黄芪提取物FQR-8，可以有效提高CIK细胞的增殖；体外实验显示，通过FQR-8诱导培养的DC-CIK细胞，杀瘤活性高于常规培养的DC-CIK细胞；动物实验显示，经该法制备的FQR-DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠，其肿瘤负荷可明显降低或消失，延长其带瘤生存期。

附图说明：

图1：FQR-8诱导免疫细胞CIK的增殖

图2：显微镜观察FQR-8诱导DC-CIK细胞密度的增加

图3：FQR-8诱导DC-CIK杀肿瘤细胞的活性

图4：FQR-8诱导DC-CIK治疗荷瘤小鼠后的生存期

实施方案：

发以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本明。

《实施例1》黄芪提取物FQR-8的制备

利用颗粒粉碎机将黄芪生药粉碎，经过炒制为熟黄芪，加入适量的去离子水后打成浆液，加入纤维素酶(国药集团化学试剂有限公司)30min后灭活、高速离心、取上清液，上清液经过浓缩后制成浓缩液，再次离心。上清液加入乙醇，4℃过夜沉淀后离心得到沉淀物。沉淀物用去离子水溶解后，以一定的流速加到预处理的大孔吸附树脂XAD-16柱的上端进行吸附。先用去离子水缓慢清洗，以除去树脂表面或内部残留的多糖或无机盐等非极性或水溶性较大的强极性杂质，然后依次用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇4℃下以，流速0.18～0.20cm/min进行洗脱，分别收集洗液。利用紫外分光光度计检测洗脱液在420nm下的OD值，将有最大吸收的组分用旋转蒸发仪适当蒸去甲醇和部分水分，冷冻后，真空冷冻干燥，获得白色粉末即为FQR-8。

《实施例2》免疫细胞DC-CIK和CIK的分离、诱导、培养

患者准备：根据免疫细胞DC-CIK和CIK治疗的适应症和禁忌症，选择适合该治疗的肿瘤患者，告知该治疗所涉及的各种相关信息和注意事项，获得患者及家属的理解和配合，签署知情同意书，检测血常规；

外周血动员：采血前24小时，应皮下注射集落刺激因子(GM-CSF)150ug；

外周血采集：病人采血前应清淡饮食，无菌抽取肿瘤疾病患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；

肿瘤抗原获取：室温2000rpm离心沉淀10分钟，收集适量的上层血浆，加入诱导培养基(Gibico)诱导DC-CIK和CIK细胞培养。细胞沉淀物用于分离单个核细胞；

单个核细胞分离：细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，2000rpm，离心20分钟；

收集单个核细胞：离心结束，用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀；

单个核细胞的洗涤：室温1500rpm离心沉淀单个核细胞5分钟。弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1300rpm离心沉淀5分钟；弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1100rpm离心沉淀5分钟；

DC-CIK和CIK细胞的诱导、培养：离心结束，弃上清，沉淀物用含浓度为10ug/ml的FQR-8的FQR-DC-CIK和CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液(上海哈灵生物科技有限公司)适当稀释计数。均分至4个75cm²的一次性塑料细胞培养瓶中，补充诱导培养基至50ml/瓶。置37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。其间，根据细胞的生长状况，适时换液扩增，直至细胞数量达到实验所需。

第1、4、7、14、21天分别计算FQR-CIK诱导培养基和CIK培养基中细胞数量，结果如(图1)所示。说明FQR-8能有效提高CIK细胞的增殖。同时，在免疫细胞显微镜下可以观察到FQR-8诱导DC-CIK细胞密度的增加(图2)。

《实施例3》诱导活化FQR-DC-CIK细胞的杀肿瘤细胞活性

RPMI-1640培养基(上海恪敏生物科技有限公司)调整细胞浓度为1×10⁵/ml，分别接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，每板8孔，共三板；

每孔分别加入150ul2×浓缩的FQR-DC-CIK细胞或2×浓缩的常规诱导的DC-CIK细胞，同时，按照1:10分别加入NK细胞敏感细胞株-K562细胞株(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。每板的前四孔标识为FQR-DC-CIK细胞组、后四孔标识为常规诱导的DC-CIK细胞组；

置37℃、5％CO₂(V/V)培养箱中共同培养；

培养后用MTT法检测其OD570杀瘤活性；

黄芪提取物FQR-8诱导免疫细胞FQR-DC-CIK杀伤肿瘤细胞K562活性结果如(图3)所示。表明通过FQR-8诱导培养的DC-CIK细胞，杀瘤活性高于常规培养的DC-CIK细胞。

《实施例4》FQR-DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠生存期检测

复苏小鼠黑色素瘤B16细胞株(上海通派生物技术有限公司)；

取C57小鼠(上海义森生物科技有限公司)脾脏，常规制备小鼠FQR-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞；

C57小鼠腋下接种小鼠黑色素瘤B16细胞，每只注射约2.5×10⁶个，共三十只，随机分为三组；

从第三天起每日腹腔注射诱导7天的FQR-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞，共五次，每次每只注射1×10⁶个/0.5ml，空白对照组注射生理盐水0.5ml；

观察并记录荷瘤小鼠的生存期，结果见(图4)，表明FQR-DC-CIK细胞可以延长荷瘤小鼠的生存期。

Claims (4)

1.一种黄芪提取物FQR-8，其特征是，所述提取物是将熟黄芪粉碎成浆液，经纤维素酶30分钟后灭活，高速离心，上清液浓缩后再次离心；将其加入乙醇，4℃过夜，离心得到沉淀；用去离子水溶解沉淀后，大孔吸附树脂XAD-16柱进行吸附；水清洗后，依次用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇，4℃下以流速0.18～0.20cm/min进行洗脱，分别接收洗液；收集OD_420nm最大吸收值的组分，旋转蒸发、冷冻后，真空冷冻干燥获得白色粉末即为FQR-8。

2.一种利用黄芪提取物FQR-8诱导DC-CIK的方法，其特征是，所述方法依次包括以下步骤：

外周血采集：无菌抽取肿瘤患者外周血，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；

肿瘤抗原的获取：室温离心沉淀外周血，收集上层血浆，灭活备用；

单个核细胞分离、收集：生理盐水稀释混匀所得细胞沉淀物，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，在650g条件下离心；离心结束后，加入生理盐水，混匀混匀；室温离心沉淀，弃上清，生理盐水再次悬浮混匀，室温离心沉淀；

FQR-DC-CIK细胞诱导培养：沉淀物用含黄芪提取物FQR-8的FQR-DC-CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液稀释计数，置饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，期间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到实验所需。

3.权利要求2所述的诱导方法，其特征是，FQR-DC-CIK细胞诱导培养液中，所用黄芪提取物FQR-8的浓度为0.01ug/ml～1mg/ml。

4.权利要求1所述黄芪提取物FQR-8在制备肿瘤细胞免疫治疗药物中的应用。