CN107372461A - 一种经黄芪提取物fqr‑8诱导的dc‑cik细胞的高效活性保存方法 - Google Patents

一种经黄芪提取物fqr‑8诱导的dc‑cik细胞的高效活性保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种经黄芪提取物FQR‑8诱导的DC‑CIK细胞的高效活性保存方法，包括如下步骤：用冻存液悬浮DC‑CIK细胞，配制DC‑CIK细胞悬浮液，然后对细胞悬液进行冻存。冻存液的配制方法是：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆1％、二甲基亚砜5～10％、右旋糖苷1～5％、香菇多糖2～10％、羟乙基淀粉3～5％和黄芪提取物FQR‑8 1～3％。本发明提供的高效活性保存方法，具有投入成本低、冻存效果好、复苏时间短、细胞存活率高和复苏后细胞活性高等优点，会极大的增加DC‑CIK细胞的应用范围，具有很重要的临床应用意义。

Description

一种经黄芪提取物FQR-8诱导的DC-CIK细胞的高效活性保存 方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及黄芪提取物FQR-8诱导的DC-CIK细胞的高效活性保存方法及其应用。
背景技术
肿瘤细胞的生物治疗是除化学治疗、放射治疗和手术治疗以外新兴的具有显著疗效的肿瘤治疗模式。它已被国家卫生计生委列入允许临床应用的三类技术。
DC-CIK细胞是自体DC细胞和CIK细胞共同培养后生成的异质细胞群。通过申请号为201510707389.8的发明专利，我们可以看出经黄芪提取物FQR-8诱导的DC-CIK细胞具有杀瘤效果优异的优点，其杀瘤活性较常规方法诱导的DC-CIK细胞有较大提升，极具有应用潜力。但是，经常规冻存液冻存复苏后，其杀瘤活性降低，尤其且当冻存期限超过3个月时，其杀瘤活性大打折扣。
目前常用的冻存液是在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆和二甲基亚砜，使自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％。但是，该种冻存液具有复苏时间长、细胞存活率低和复苏后细胞活性差等不足。
因此，开发一种应用于黄芪提取物FQR-8诱导的DC-CIK细胞的高效活性保存方法，对于DC-CIK细胞的大规模应用有重大意义。
发明内容
本发明目的是提供一种经黄芪提取物FQR-8诱导的DC-CIK细胞的高效活性保存方法。
本发明所述的高效活性保存方法，包括以下步骤：用冻存液悬浮DC-CIK细胞，配制成DC-CIK细胞悬浮液，然后对细胞悬液进行冻存。
其中，冻存的步骤：将细胞悬浮液4℃放置30min，零下20℃放置2h，零下40℃放置1h，零下80℃放置过夜，迅速转入液氮中冻存。
其中，冻存液的配制方法是：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和黄芪提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为5～10％，右旋糖苷的浓度为1～5％，香菇多糖的浓度为2～10％，羟乙基淀粉的浓度为3～5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1～3％；
所述的在液氮中保存的具体时间是180天。
所述的淋巴细胞无血清培养基的名称为 Medium CTSTM#087-0112DK，购置于美国Gibco公司；
本发明所述的保存方法应用于DC-CIK细胞的保存。
本发明与用常规冻存的DC-CIK细胞相比，本发明提供的高效活性保存方法具有投入成本低、冻存效果好、复苏时间短、细胞存活率高和复苏后细胞活性高等优点，会极大的增加DC-CIK细胞的应用范围，具有很重要的临床应用意义。
附图说明
图1为实施例中各组DC-CIK细胞的细胞增殖曲线
图2为实施例中各组DC-CIK细胞的细胞毒性比较
具体实施方式
以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
《实施例1》冻存液的配制
细胞冻存液A的制备方法：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为5％，香菇多糖的浓度为5％，羟乙基淀粉的浓度为5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1％；
细胞冻存液B的制备方法：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为3％，香菇多糖的浓度为3％，羟乙基淀粉的浓度为3％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1％；
细胞冻存液C的制备方法：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为5％，香菇多糖的浓度为5％，羟乙基淀粉的浓度为5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为2％；
对照组冻存液的制备方法：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆和二甲基亚砜，使自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％。
《实施例2》黄芪提取物FQR-8的制备
利用颗粒粉碎机将黄芪生药粉碎，经过炒制为熟黄芪，加入适量的去离子水后打成浆液，加入纤维素酶(国药集团化学试剂有限公司)30min后灭活、高速离心、取上清液，上清液经过浓缩后制成浓缩液，再次离心。上清液加入乙醇，4℃过夜沉淀后离心得到沉淀物。沉淀物用去离子水溶解后，以一定的流速加到预处理的大孔吸附树脂XAD-16柱的上端进行吸附。先用去离子水缓慢清洗，以除去树脂表面或内部残留的多糖或无机盐等非极性或水溶性较大的强极性杂质，然后依次用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇4℃下以，流速0.18～0.20cm/min进行洗脱，分别收集洗液。利用紫外分光光度计检测洗脱液在420nm下的OD值，将有最大吸收的组分用旋转蒸发仪适当蒸去甲醇和部分水分，冷冻后，真空冷冻干燥，获得白色粉末即为FQR-8。
《实施例3》DC-CIK细胞的制备
患者准备：根据免疫细胞DC-CIK治疗的适应症和禁忌症，选择适合该治疗的肿瘤患者，告知该治疗所涉及的各种相关信息和注意事项，获得患者及家属的理解和配合；
签署知情同意书；检测血常规；
外周血动员：采血前24小时皮下注射GM-CSF 150ug；
外周血采集：病人采血前应清淡饮食，无菌抽取肿瘤患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；
自体血浆制备：室温2000rpm离心沉淀10min，收集适量的上层血浆，放于玻璃瓶中并于-20℃下冻存，待自体血浆完全冻结后，放置于-80℃低温冰箱中冻存备用；
FQR-8诱导的DC-CIK细胞的培养：细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加到淋巴细胞分离液(购置于GE公司)表面，2500rpm离心20min；用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀，室温1500rpm离心沉淀10min，弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1300rpm离心7min，弃上清；细胞沉淀物用RPMI1640培养液(购置于美国Gibco公司)调整细胞密度为(4～6)×106个/ml，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养2小时；收集非贴壁细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为(1～2)×106个/ml，进行体外诱导，在含浓度为10ug/ml的人参提取物FQR-8、1000U/ml rhIFN-γ的完全培养基中悬浮培养24小时后，加入rhIL-1α100U/ml、鼠抗人CD3McAb 50ng/ml、rhIL-2 1000U/ml，继续培养，以后隔天更换新鲜培养液一次，补充rhIL-2，细胞密度维持在(1～2)×106个/ml；将贴壁细胞接种于6孔培养板，加入含rhIL-4 500U/ml、rhGM-CSF 100ng/ml、FQR-8 10ug/ml的RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，隔日半量换液，适时补充培养基及细胞因子；在培养第6天，加入终浓度为100ng/ml的rhTNF-α；分别收获CIK、CD细胞，计数后1:5的比例混合后，体外培养5天，获得DC-CIK细胞。
《实施例4》DC-CIK细胞的冻存
1、DC-CIK细胞分组冻存
实验组A：用实施例1中的细胞冻存液A悬浮实施例3中的DC-CIK细胞，得到107个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管中，每个冻存管中吸入1ml的细胞悬液；
实验组B：用实施例1中的细胞冻存液B悬浮实施例3中的DC-CIK细胞，得到107个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管中，每个冻存管中吸入1ml的细胞悬液；
实验组C：用实施例1中的细胞冻存液A悬浮实施例3中的DC-CIK细胞，得到107个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管中，每个冻存管中吸入1ml的细胞悬液；
对照组：用实施例1中的对照组冻存液悬浮实施例3中的DC-CIK细胞，得到1×107个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管中，每个冻存管中吸入1ml的细胞悬液；
2、将步骤1中的冻存管，放入程控降温仪的冻存盒中进行冻存，随后取出冻存管迅速放置于液氮中；
3、步骤2中，程控降温仪的设定参数是：4℃～-20℃，1℃/每分钟；-20℃等待20min；-20℃～-40℃，4℃/每分钟；-40℃等待30min；-40℃～-80℃，8℃/每分钟；-80℃等待2h。
《实施例5》DC-CIK细胞的复苏
1、取出冻存于-80℃的自体血浆，放置于4℃解冻，然后2000rpm离心5分钟，取上清液备用；
2、迅速取出冻存于液氮中的冻存管，立即放置于37～40℃的水浴中，振荡使其冻融，用生理盐水洗涤冻存管中的DC-CIK细胞；
3、将步骤二中的细胞悬液分别接种到含有rhIL-1α100U/ml、CD3McAb 50ng/ml、rhIL-2 1000U/ml、rhIL-4 500U/ml、rhGM-CSF 100ng/ml、rhTNF-α100ng/ml和FQR-8 10ug/ml的RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24小时，即完成DC-CIK细胞复苏的目的。
《实施例6》复苏后DC-CIK细胞的存活率检测
按实施例5中的操作步骤，取步骤3中的细胞，用台盼蓝拒染法计算复苏后细胞存活率，每组设三个平行对照。结果如表1所示。
《实施例7》DC-CIK细胞的细胞增殖测定
1、实施例5的步骤3中，从接种DC-CIK细胞开始计时，每24小时取样计数细胞数，并绘制细胞增殖曲线，每次取样设三个平行组；
2、将冻存前的DC-CIK细胞接种于含有1rhIL-1α100U/ml、CD3McAb 50ng/ml、rhIL-2 1000U/ml、rhIL-4 500U/ml、rhGM-CSF 100ng/ml、rhTNF-α100ng/ml和FQR-810ug/ml的RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，每24小时取样计数细胞数，并绘制细胞增殖曲线，每次取样设三个平行组。结果如图1所示。
《实施例8》DC-CIK细胞的细胞表型检测
1、将复苏后培养七天的DC-CIK细胞调整浓度为1×106个/ml，各取100ul加入Falcon管中，依次加入FITC-CD83及同型对照IgG1/IgG1和FITC标记的鼠抗人CD3+CD8+与CD3+CD56+及同型对照各20ul，混匀，在4℃暗室反应30min后，PBS洗涤2次，上流式细胞仪检测。
2、取实施例7步骤3中培养七天的DC-CIK细胞，按照步骤1的操作，对其细胞表型进行检测。结果如表2所示。
表1复苏后DC-CIK细胞的存活率(％，x±s，n＝3)
表2冻存前和冻存后DC-CIK细胞的细胞表型流式检测结果(％，x±s，n＝3)
《实施例9》DC-CIK细胞的细胞毒性测定
1、收集冻存前和复苏后的DC-CIK细胞；
2、利用MTT比色法，以K562细胞(购置于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)为靶细胞，检测效应细胞(冻存前和复苏后的DC-CIK细胞)的杀伤活力。
将冻存前、复苏后的DC-CIK细胞细胞浓度调整为0.5×106个/ml，1×106个/ml，2×106个/ml作为效应细胞，同时取K652细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，效靶比为5:1,10:1和20:1，在96孔反应板加入效应细胞和靶细胞各100ul/孔，同时设靶细胞、效应细胞对照孔，均设3个平行孔，对照孔为单纯靶细胞100ul+100ul RPMI1640培养液和单纯效应细胞(DC-CIK细胞)100ul+100ul RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO2(V/V)培养箱中培养24小时。培养后用MTT比色法检测其杀瘤活性。结果如图2所示。

Claims (6)

1.一种经黄芪提取物FQR-8诱导的DC-CIK细胞的高效活性保存方法，包括如下步骤：用冻存液悬浮DC-CIK细胞，配制成DC-CIK细胞悬浮液，然后对细胞悬浮液进行冻存，
其中，冻存过程：将细胞悬浮液4℃放置30min，零下20℃放置2h，零下40℃放置1h，零下80℃放置过夜，迅速转入液氮中冻存。
2.权利要求1所述的保存方法，其特征在于，冻存液的配制方法是：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和黄芪提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为5～10％，右旋糖苷的浓度为1～5％，香菇多糖的浓度为2～10％，羟乙基淀粉的浓度为3～5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1～3％。
3.权利要求1所述的保存方法，其特征在于，在液氮中保存的时间是180天。
4.权利要求2所述的保存方法，其特征在于，淋巴细胞无血清培养基的名称为AIM-Medium CTSTM#087-0112DK，购置于美国Gibco公司。
5.权利要求1所述的保存方法，应用于DC-CIK细胞的保存。
6.权利要求1所述的保存方法，其特征在于，
冻存液的配制：
在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为5％，香菇多糖的浓度为5％，羟乙基淀粉的浓度为5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1％；
或者，
在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为3％，香菇多糖的浓度为3％，羟乙基淀粉的浓度为3％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1％；
或者，
在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为5％，香菇多糖的浓度为5％，羟乙基淀粉的浓度为5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为2％；
黄芪提取物FQR-8的制备：
利用颗粒粉碎机将黄芪生药粉碎，经过炒制为熟黄芪，加入适量的去离子水后打成浆液，加入纤维素酶30min后灭活、高速离心、取上清液，上清液经过浓缩后制成浓缩液，再次离心，上清液加入乙醇，4℃过夜沉淀后离心得到沉淀物，沉淀物用去离子水溶解后，以一定的流速加到预处理的大孔吸附树脂XAD-16柱的上端进行吸附，先用去离子水缓慢清洗，以除去树脂表面或内部残留的多糖或无机盐等非极性或水溶性较大的强极性杂质，然后依次用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇4℃下以，流速0.18～0.20cm/min进行洗脱，分别收集洗液，利用紫外分光光度计检测洗脱液在420nm下的OD值，将有最大吸收的组分用旋转蒸发仪适当蒸去甲醇和部分水分，冷冻后，真空冷冻干燥，获得白色粉末即为FQR-8，
FQR-8诱导的DC-CIK细胞的培养：
细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加到淋巴细胞分离液表面，2500rpm离心20min；用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀，室温1500rpm离心沉淀10min，弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1300rpm离心7min，弃上清；细胞沉淀物用RPMI1640培养液调整细胞密度为(4～6)×106个/ml，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养2小时；收集非贴壁细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为(1～2)×106个/ml，进行体外诱导，在含浓度为10ug/ml的人参提取物FQR-8、1000U/ml rhIFN-γ的完全培养基中悬浮培养24小时后，加入rhIL-1α100U/ml、鼠抗人CD3McAb 50ng/ml、rhIL-2 1000U/ml，继续培养，以后隔天更换新鲜培养液一次，补充rhIL-2，细胞密度维持在(1～2)×106个/ml；将贴壁细胞接种于6孔培养板，加入含rhIL-4 500U/ml、rhGM-CSF 100ng/ml、FQR-8 10ug/ml的RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，隔日半量换液，适时补充培养基及细胞因子；在培养第6天，加入终浓度为100ng/ml的rhTNF-α；分别收获CIK、CD细胞，计数后1:5的比例混合后，体外培养5天，获得DC-CIK细胞，
DC-CIK细胞的冻存
用细胞冻存液悬浮DC-CIK细胞，得到107个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管中，每个冻存管中吸入1ml的细胞悬液；
将上述步骤中的冻存管，放入程控降温仪的冻存盒中进行冻存，随后取出冻存管迅速放置于液氮中，程控降温仪的设定参数是：4℃～-20℃，1℃/每分钟；-20℃等待20min；-20℃～-40℃，4℃/每分钟；-40℃等待30min；-40℃～-80℃，8℃/每分钟；-80℃等待2h。
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