CN107410288A

CN107410288A - 一种人脐带间充质干细胞的储存液

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Publication number: CN107410288A
Application number: CN201710746062.0A
Authority: CN
Inventors: 刘劼; 朱益辉; 孙毅; 胡敏; 曾赤佳; 陆军; 薛婷; 陈彩琴; 廖方圆; 黄明辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-08-26
Filing date: 2017-08-26
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2037-08-26
Also published as: CN107410288B

Abstract

本发明提供一种人脐带间充质干细胞的储存液，属于干细胞生物学领域，是适合临床应用的干细胞储存液的组合物。采用多种活性成分对储存条件进行优化，是含有氯化钠、白蛋白、腺苷、血管紧张素‑II、氯化锂、黄酮类化合物、肝素以及人脐带间充质干细胞来源的外泌体、短肽和多肽类化合物的混合水溶液。在上述储存液中，人脐带间充质干细胞在4℃条件下在3天内的细胞活性保持在90%以上，且细胞表型稳定；在‑20℃条件下在7天内的细胞活性仍能保持在90%以上，细胞表型同样稳定。这种储存液保证了干细胞的质量稳定，能够实现干细胞的远距离运送，为临床干细胞的广泛应用奠定了基础。

Description

一种人脐带间充质干细胞的储存液

技术领域

本发明涉及干细胞生物学领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞储存液。

背景技术

人脐带间充质干细胞作为一种广泛应用的干细胞，其取材方便，易于分离，免疫原性低，具有多向分化潜能等优点，可应用于临床疾病治疗，同时也可应用于机体的抗衰老。随着干细胞技术在生物治疗领域的规范化应用，尤其是在治疗高血压、冠状动脉粥样硬化等慢性疾病方面的优势，能从整体上提高机体功能和生活质量，已被人们广泛关注并越来越多的应用到临床。

人脐带间充质干细胞的储存坏境与细胞的长期活性有密切关系，储存液的微环境对人脐带间充质干细胞有着重要影响，当储存环境出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老，并且细胞的生物学特性和遗传稳定性都可能发生变化，因此优化干细胞的储存条件将为干细胞技术的规范化应用起到积极意义。

目前人脐带间充质干细胞在临床上已经广泛应用，但也存在受储存条件限制而不能大规模应用的问题。人脐带间充质干细胞在目前常用的储存液条件下，常温下很快衰老，限制了人脐带间充质干细胞在临床应用上的规模化生产和远距离供应。另外，在临床应用中，人脐带间充质干细胞制剂需要完成无菌、活性等质量检验后才能注射到人体，这些检验需要较长的时间才能获得可靠结果。而现在常用的低温冻存对细胞损伤较大且解冻后不能直接注射到人体，因此在干细胞制剂的质量检验期间，合适的储存液是临床应用的基础。

在临床应用过程中，人脐带间充质干细胞常常做为种子细胞在损伤部位聚集、增殖、分化，以及分泌多种修复营养因子，而目前的储存液缺乏必要的生存条件及营养成分，使人脐带间充质干细胞在保存过程中活性下降，进而影响实际治疗效果。在实际临床应用中如果将人脐带间充质干细胞保存在专门配制的储存液中，将会有效发挥人脐带间充质干细胞的治疗作用。

因此需要一种专门配制的储存液能实现以下优势：1）在3天（72小时）内，4℃条件下保存的人脐带间充质干细胞的活性维持在90%以上，并且储存液的成分符合医用标准对人体安全可靠，这样储存的人脐带间充质干细胞制剂复温以后可直接注射到人体；2）7天（168小时）内，-20℃条件下保存的人脐带间充质干细胞的活性维持在90%以上，在应用上能够实现规模化生产和远距离运送。

发明内容

为了解决人脐带间充质干细胞在储存过程中的上述问题，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞储存液的配比组合方案，该储存液的各种成分均为经过临床验证可直接用于人体的成分或干细胞自身的产物。

本发明的技术方案如下：

一种人脐带间充质干细胞的储存方案,其中采用多种活性成分对干细胞储存条件进行优化，是含有氯化钠、白蛋白、腺苷、血管紧张素-II、氯化锂、黄酮类化合物、肝素、人脐带间充质干细胞来源的外泌体、短肽和多肽类化合物的混合水溶液。各成分的浓度可以为：

氯化钠，8.5-10g/L；

白蛋白，10-80g/L；

腺苷，0.5-2mmol/L；

血管紧张素-II，50-400ng/mL；

氯化锂，1-8mmol/L；

黄酮类化合物，40-320umol/L；

肝素，0.05-0.20mol/L；

人脐带间充质干细胞来源的外泌体，50-400ng/mL；

人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物，1-8×10^-7mol/L。

一种优选配方的各成分的浓度分别为：

氯化钠，8.5-9g/L；

白蛋白，40-80g/L；

腺苷，1-1.5mmol/L；

血管紧张素-II，100-200ng/mL；

氯化锂，2-4mmol/L；

黄酮类化合物，80-160umol/L；

肝素，0.1-0.15mol/L；

人脐带间充质干细胞来源的外泌体，100-200ng/mL；

人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物，2-4×10^-7mol/L。

一种优选配方的各成分的浓度分别为：

氯化钠，9g/L；

白蛋白，40g/L；

腺苷，1mmol/L；

血管紧张素-II，100ng/mL；

氯化锂，2mmol/L；

黄酮类化合物，160umol/L；

肝素，0.10mol/L；

人脐带间充质干细胞来源的外泌体，400ng/mL；

人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物，4×10^-7mol/L。

在上述技术方案中，储存液各组分的作用如下：

在储存液中加入适宜浓度的氯化钠，在生理盐水浓度下可有效调节溶液的渗透压，保持液体渗透压相对平衡，从而使细胞不受渗透压影响，保持细胞的正常形态。

在储存液中加入适宜浓度的白蛋白，主要是调节细胞内水分动态平衡，维持细胞渗透压相对稳定，也是一种细胞的防冻保护剂。储存液中加入适量的医用白蛋白，保证了人脐带间充质干细胞临床应用的安全性和可靠性。

在储存液中加入适宜浓度的腺苷，可在储存过程中保持细胞内ATP 水平的稳定，为细胞生长必须的能量物质，在细胞的代谢过程中起着非常重要的营养作用，能够增强细胞活性，同时发挥细胞保护作用，防止低糖条件下造成的功能损伤。

在储存液中加入适宜浓度血管紧张素-II，主要调节细胞的活性状态，可提高人脐带间充质干细胞的活性，促进其增殖并减少细胞凋亡，有效发挥人脐带间充质干细胞的治疗作用。

在储存液中加入适宜浓度的氯化锂，可促进人脐带间充质干细胞的存活与迁移，且添加的氯化锂具有良好的辅助治疗作用，为临床应用提供了一种新的治疗途径。

在储存液中加入适宜浓度的黄酮类化合物，对人脐带间充质干细胞具有抗氧化保护作用，本发明选择抗氧化作用较强的木犀草素，对人脐带间充质干细胞具有良好的抗氧化保护作用，可显著提高人脐带间充质干细胞的存活率、抑制其调亡、降低细胞内自由基水平。

在储存液中加入适宜浓度的肝素，临床上主要用于抗凝血和抗血栓，同时，临床应用及研究显示，肝素还具有其他多种生物活性和临床用途，包括抗炎、抗过敏、抗病毒等作用。人脐带间充质干细胞制剂中加入肝素可预防静脉注射后的炎症反应。

在储存液中加入适宜浓度的人脐带间充质干细胞P3-P6代来源的外泌体，可以促进人脐带间充质干细胞的增殖及迁移，抑制细胞的凋亡信号通路，可在临床应用中促进创面的修复，在创伤修复机制上有重要的临床应用价值。

在储存液中加入适宜浓度的人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物，可显著提高人脐带间充质干细胞的存活率，抑制细胞的凋亡信号通路，在抗衰老的修复机制上有重要的临床应用价值。

上述各成分均是生物医药领域常用的化学试剂、生物制品或原料药，在用于人体注射时，优选使用国家食品药品监督管理局批准的药用级产品，白蛋白优选使用人血白蛋白，外泌体、短肽和多肽类化合物为人脐带间充质干细胞的自身产物，通过无菌质量检测。

实验表明，本发明提供的人脐带间充质干细胞储存液能够实现细胞在4℃储存1-3天而活率保持90%以上，便于细胞的运输和暂时储存，并且该储存液成分均来自对人体安全的医药用可注射试剂，解冻后可直接注射，从而极大方便了人脐带间充质干细胞制剂的临床应用。特别是能够在-20℃温度条件下实现7天的储存，且细胞的活性保持90%以上，为细胞的远距离运送和临床广泛推广提供了更多方便。

附图说明

无。

具体实施方式

使用方法：

（1）配置储存液

根据上述方案中各成分的浓度，将氯化钠、白蛋白、腺苷、血管紧张素-II、氯化锂、黄酮类化合物、肝素、人脐带间充质干细胞来源的外泌体、短肽和多肽类化合物加到医用级的注射水中溶解，制成人脐带间充质干细胞的储存液。

（2）制备细胞制剂与质检

将培养在无血清培养基中的人脐带间充质干细胞转移至离心管中进行离心，弃上清，用生理盐水洗涤2遍，获得细胞，将上述步骤制备的储存液添加到离心管中，重悬细胞，使细胞浓度达到5×10⁵/mL，然后分装到100mL的干细胞专用制品袋中，制成人脐带间充质干细胞制剂，每袋制剂的溶液体积为100mL，细胞总量为5×10⁷个。另外，每袋细胞制剂抽取5mL细胞悬液进行细胞活性、微生物、内毒素、干细胞表型等质量检测。

（3）储存细胞制剂

将按照上面步骤制备的人脐带间充质干细胞制剂储存于4℃冰箱中，或在冰箱的4℃条件下放置1小时后转移至冰箱的-20℃进行储存。

（4）复苏细胞输注

细胞质检合格后，可将上述步骤中储存的人脐带间充质干细胞制剂从冰箱中取出，于37℃条件下进行细胞复苏，恢复细胞活性，然后开始细胞输注。

实施例1

（1）原代细胞培养

1）将经过消化酶消化处理后的新鲜人脐带标本（来源于同济大学附属同济医院产科捐献，供者所有筛查指标均合格）中加入适量完全培养基终止消化；

2）加入完全培养基至 10mL，滴管反复吹打，充分离散细胞；

3）70μm细胞筛过滤，去除未消化完全的组织块成分；

4）1500rpm，离心10min；

5）用滴管小心吸去上清，保留较粘稠液体部分；

6）用完全培养基洗涤 2 次，方法同前；

7）将收获的细胞沉淀重悬于完全培养基，接种到 T-25cm²细胞培养瓶，加入 5mL完全培养基，置于含5% CO²的 37℃饱和湿度细胞培养箱中培养；

8）3 天后第一次换液，去除非贴壁细胞；

9）以后每3天换一次液，细胞培养基换成无血清培养基。

（2）细胞传代培养

1）当细胞达到 70-80%融合时，弃去旧培养基；

2）使用生理盐水漂洗2次；

3）加入适量0.25% 胰蛋白酶消化液于 37℃消化3min，镜下观察细胞边缘发生皱缩、细胞间隙增大时，弃去消化液，加入完全培养基终止消化；

4）用移液枪轻轻吹打细胞，使其从细胞培养瓶底部脱落，按 1:3 比例进行传代接种，记为P1 代；

5）后续培养、传代方法同前，分别记作 P2、P3、P4……；

6）将 P3-P6 代细胞利用细胞储存液制备成干细胞制剂封装于 100mL 的干细胞专用制品袋中，同时为了方便后续检测，将一部分干细胞制剂分装于若干个 2mL 体积的冻存管内，每管 1mL，然后将冻存管随机均分为两份，分别储存在 4℃与-20℃条件下，用于后续实验。

（3）细胞质量检测

1）活性检测

将在 4℃条件下储存和在-20℃条件下储存的人脐带间充质干细胞制剂在观察时间节点（12h，24h, 48h，72h，120h，168h）分别取样 1ml，采用血球计数法和苔盼蓝染色法对细胞进行活性检测，未着色的细胞为活细胞，染成蓝色的细胞为死细胞。

2）凋亡检测

将储存后的人脐带间充质干细胞制剂在观察时间节点（12h，24h, 48h，72h，120h，168h）分别取样2mL，采用Annexin V方法，通过流式细胞术进行细胞凋亡测定，可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

3）表型检测

分别取在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂1ml，采用荧光素偶联抗体与标本中的单个细胞膜表面相应的抗原结合，通过流式细胞术进行干细胞表型检测，可以测定细胞四阳（CD44、CD105、CD73和CD90）的表达率和细胞五阴（CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR）的表达率。

4）真菌、细菌检测

分别取在 4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂2mL，采用TTC-沙保罗培养基培养法和哥伦比亚血琼脂培养基培养法分别进行真菌、细菌检测，培养24h、48h后用透射光观察培养基背面或正面有无菌落生长。有菌落生长则为阳性，无菌落生长则为阴性。

5）支原体检测

分别取在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂1mL，采用PCR法进行支原体检测。通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测会跑出条带，出现阳性结果。反之当没有支原体污染时，则跑不出条带，出现阴性结果。

6）内毒素检测

分别取在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂1mL，采用鲎试剂定性检测方法进行内毒素检测。鲎试剂为东方鲎血液变形细胞溶解物，含凝固酶原、凝固酶，在适宜条件下可被微量细菌内毒素激活产生浊度和凝胶反应，从而检测细胞培养液中的内毒素含量是否合格。

7）毒性检测

分别取在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂30mL，对20只SD大鼠进行尾静脉注射。将大鼠随机平均分为两组，每组10只并进行标记，对每只大鼠进行细胞注射，剂量为3mL/只，观察大鼠的生活状况。

（4）质量检测结果

1）通过细胞活性检测，在 4℃条件下 12h、24h、48h、72h、120h、168h 的细胞活性分别为98%、96%、93%、92%、89%、78%，在 3 天（72h）内的细胞活性均维持在 90%以上，符合干细胞输注条件；在-20℃条件下 12h、24h、48h、72h、120h、168h 的细胞活性分别为 99%、98%、95%、94%、93%、91%，7 天（168h）内的细胞活性均维持在 90%以上，符合干细胞输注条件。

2）通过细胞凋亡检测，24小时内的死细胞主要是坏死细胞，48小时以上的死亡细胞中凋亡细胞增加，但跟目前常用的储存液比较，凋亡的细胞数量明显下降。

3）通过细胞表型检测，在 4℃条件下储存 72h 和在-20℃条件下储存 168h 人脐带间充质干细胞制剂的细胞表型：细胞四阳（CD44、CD105、CD73 和 CD90）的表达均大于95%；细胞五阴（CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR）的表达均小于2%，符合干细胞输注条件。

4）通过真菌、细菌检测，在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂的检测结果均为阴性，符合干细胞输注条件。

5）通过支原体检测，在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂检测的结果均为阴性，符合干细胞输注条件。

6）通过内毒素检测，在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂检测的结果均为阴性，符合干细胞输注条件。

7）通过毒性检测，注射了在4℃条件下储存72h和在-20℃条件下储存168h的人脐带间充质干细胞制剂的20只SD大鼠，均无一例出现异常反应，初步证明了该人脐带间充质干细胞储存液安全可靠。

（5）结论

该人脐带间充质干细胞储存液不仅能够很好的保持干细胞的活性，减少细胞的凋亡，维持细胞的表型稳定，而且在微生物、内毒素以及细胞毒性等方面都表现十分安全，为临床干细胞的广泛应用奠定了基础。

Claims

1.一种人脐带间充质干细胞的储存液，是含有氯化钠、白蛋白、腺苷、血管紧张素-II、氯化锂、黄酮类化合物、肝素、人脐带间充质干细胞来源的外泌体、短肽和多肽类化合物的混合水溶液。

2.根据权利要求1要求的储存液体系中氯化钠的配制，可以选择不同优化浓度的氯化钠建立储存体系，分别配制8.5g/L、9g/L、9.5g/L、10g/L的储存液体系。

3.根据权利要求1要求的储存液体系中白蛋白的配制，可以选择不同优化浓度的白蛋白建立储存体系，分别配制10g/L、20g/L、40g/L、80g/L的储存液体系。

4.根据权利要求1要求的储存液体系中腺苷的配制，可以选择不同优化浓度的腺苷建立储存体系，分别配制 0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L的储存液体系。

5.根据权利要求1在储存液体系中血管紧张素-II的配制，可以选择不同优化浓度的血管紧张素-II建立储存体系，分别配制 50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL的储存体系。

6. 根据权利要求1在储存液体系中氯化锂的配制，可以选择不同优化浓度的氯化锂建立储存体系，分别配制 1mmol/L、2mmol/mL、4mmol/L、8mmol/L 的储存体系。

7.根据权利要求1在储存液体系中黄酮类化合物的配制，可以选择不同优化浓度的黄酮类化合物建立储存体系，分别配制40um/mL、80umol/mL、160umol/mL、320umol/mL的储存体系。

8.根据权利要求1在储存液体系中肝素的配制，可以选择不同优化浓度的肝素建立储存体系，分别配制0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.20mol/L 的储存体系。

9.根据权利要求1 在储存液体系中人脐带间充质干细来源的外泌体的配制，可以选择不同优化浓度的外泌体建立储存体系，分别配制 50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL的储存体系。

10.根据权利要求1在储存液体系中人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物的配制，可以选择不同优化浓度的短肽和多肽类化合物建立储存体系，分别配制1×10^- ⁷mol/L、2×10^-7mol/L、4×10^-7mol/L、8×10^-7mol/L的储存体系。