CN102487939A - 一种间充质干细胞储存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞储存液，涉及细胞生物学领域，包括葡萄糖、氯化钠、白蛋白、丙二醇、胆固醇、碳酸氢钠等成分，还可以包括肝素成分。本发明提供的间充质干细胞储存液能够实现间充质干细胞在-20～4℃储存14～20天而活率保持85％以上，便于细胞的运输和暂时储存；并且该储存液成分均来自对人体安全的医药用可注射试剂，解冻后可直接注射，从而极大方便了间充质干细胞制剂的远距离供应和临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种间充质干细胞储存液。
背景技术
间充质干细胞(MSC，Mesenchymal Stem Cell)来源于发育早期的中胚层和外胚层，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞最初在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中，如骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血、胎盘等。
间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可用于生命科学研究、药物筛选测试、组织器官修复研究等多种用途。国内外已有多项间充质干细胞治疗人类疾病的研究进入动物试验或临床试验阶段，根据对美国食品药品监督管理局(FDA)临床试验网站的检索，世界范围内间充质干细胞相关的临床试验已超过160项。
目前间充质干细胞在科研、工业和临床上的应用还存在一些问题，如运输不便、临时储存不便等。间充质干细胞脱离培养条件后在常温下很快死亡变质，非培养状态下一般冻存于液氮罐中长期保存，小量长途运输的成本非常高，这大大限制了间充质干细胞的远距离供应。在临床试验或动物试验中，间充质干细胞制剂需要完成无菌试验后才能注射到人体或动物体内，无菌试验一般要14天才能获得可靠结果，而深低温冻存对细胞损伤较大、冻存液成分复杂(常含血清或DMEM细胞培养液)，解冻后不能直接注射人体或动物，在从完成制剂到获得无菌试验结果期间间充质干细胞制剂的保存成为问题。
因此本领域需要一种便于运输且能较长时间(大于14天)保存的间充质干细胞储存液，并且储存液的成分对人体安全，储存的间充质干细胞制剂可用于直接注射人体或动物。特别是，如果能够在-20～4℃温度范围内实现间充质干细胞14-20天的储存，将极大增加间充质干细胞制剂在运输和应用上的便利性。
发明内容
为了解决间充质干细胞制剂运输和暂时储存的问题，本发明提供了一种间充质干细胞储存液的配方，使用该储存液能够实现间充质干细胞在-20～4℃储存14～20天而活率保持85％以上，并且该储存液成分均来自对人体安全的医药用可注射试剂。
本发明的技术方案如下：
一种间充质干细胞储存液，是含有葡萄糖、氯化钠、白蛋白、碳酸氢钠、丙二醇、胆固醇成分的水溶液，各成分的浓度可以为：
葡萄糖， 10～100g/L；
氯化钠， 8.5～9g/L；
白蛋白， 10～100g/L；
碳酸氢钠， 10-30g/L；
丙二醇， 2～10％(V/V)；
胆固醇， 0.1～0.5g/L。
一种优选的配方是，各成分的浓度分别为：
葡萄糖， 50g/L；
氯化钠， 9g/L；
白蛋白， 50g/L；
碳酸氢钠， 20g/L；
丙二醇， 5％(V/V)；
胆固醇， 0.3g/L。
前述的一种间充质干细胞储存液，还可以含有肝素成分，各成分的浓度可以为：
葡萄糖， 10～100g/L；
氯化钠， 8.5～9g/L；
白蛋白， 10～100g/L；
碳酸氢钠， 10-30g/L；
丙二醇， 2～10％(V/V)；
胆固醇， 0.1～0.5g/L；
肝素， 0.05～0.2g/L。
一种优选的配方是，各成分的浓度分别为：
葡萄糖， 50g/L；
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白蛋白， 50g/L；
碳酸氢钠， 20g/L；
丙二醇， 5％(V/V)；
胆固醇， 0.3g/L；
肝素， 0.1g/L。
在上述技术方案中，储存液各组分的作用如下：
葡萄糖(Glucose)，是细胞生长必须的碳源和能源物质，在细胞代谢过程中起着重要作用，在短暂储存中加入适量的葡萄糖可增加细胞活性；同时也是非渗透性冷冻保护剂，能通过主动运输进入到细胞内，最终使细胞内外保持等渗，脱水效能不持久。
氯化钠(NaCl)，在生理盐水浓度下可有效调节溶液的渗透压，保持液体渗透压相对平衡，从而使细胞不受渗透压影响。
白蛋白(Albumin)，主要调节细胞内水分动态平衡，维持细胞溶液渗透压作用，也是一种非渗透性冷冻保护剂。
碳酸氢钠(NaHCO3)，在适量的情况下可对间充质干细胞提供部分碳源以及调节液体PH值，从而保持细胞高活性状态。
丙二醇(1，2-Propanediol，Propylene Glycol)，渗透性冷冻保护剂，可以扩散透过细胞膜、渗透到细胞内，平衡细胞内外渗透压，降低细胞内外溶液中电解质的浓度，避免细胞过分脱水，保护细胞免受高浓度电解质的损伤。
胆固醇(Cholesterol)，是细胞膜的重要组成成分，温度低时可干扰其有序化，阻止冰晶形成，保持其流动性，使细胞保持正常的生理功能及活性。
肝素(Heparin)，一种酸性黏多糖，主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，肺、心、肝、肌肉等组织中含量丰富，常用作抗凝剂，具有抗凝血、抗血栓作用，近年研究还表明其具有抗炎、免疫调节、调节多肽生长因子、抑制细胞增殖、抗肿瘤转移等多种生物学活性和药理作用。间充质干细胞制剂中加入肝素还有利于防止静脉注射后细胞凝集和炎症反应。
上述各成分均是生物医药领域常用的化学试剂或生物制品、原料药，在用于注射人体时，优选使用国家食品药品监督管理局批准的药用级产品，白蛋白优选使用人血白蛋白。
非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内，可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。
渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内，其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。
本发明中组合了葡萄糖、白蛋白等非渗透性冷冻保护剂和丙二醇等渗透性保护剂，并添加了调节渗透压、pH的氯化钠、碳酸氢钠等成分，以及胆固醇、肝素等有保护细胞膜、抗凝集、抗炎等作用的成分。实验表明，本发明提供的间充质干细胞储存液能够实现间充质干细胞在-20～4℃储存14～20天而活率保持85％以上，便于细胞的运输和暂时储存；并且该储存液成分均来自对人体安全的医药用可注射试剂，解冻后可直接注射，从而极大方便了间充质干细胞制剂的远距离供应和临床应用。
附图说明
无。
具体实施方式
使用方法
(1)配置间充质干细胞储存液：将葡萄糖、氯化钠、白蛋白、丙二醇、胆固醇、肝素、碳酸氢钠等各成分按照前述浓度添加到水中溶解，制成间充质干细胞储存液；
(2)制备间充质干细胞制剂：将培养液中的细胞放到离心管中离心，弃上清，用生理盐水洗涤2遍，将步骤(1)制备的储存液添加到离心管中，重悬细胞，使细胞在溶液中的浓度达到1.0×10^6个细胞/ml，分装到冻存血袋中，每袋10ml，制成间充质干细胞制剂；
(3)储存：将步骤(2)制备的间充质干细胞制剂储存于4℃冰箱中，或按照“4℃1小时→-20℃1小时”的步骤储存于冰箱中；
(4)注射前准备：使用前，将步骤(3)中储存的药用细胞注射液从冰箱中取出，放置于35℃中复溶，然后用于细胞移植。
实施例1
I.间充质干细胞储存液成分及浓度
II.实施步骤
(1)取人间充质干细胞(来源：从上海复旦大学附属中山医院产科病人捐献的胎盘中提取)2.0×10^8个，离心弃上清，用生理盐水洗涤2遍，加入200ml间充质干细胞储存液重悬，经自动细胞计数仪计数，调整细胞浓度为1.0×10^6个/ml，制成注射用间充质干细胞制剂，分装到20个冻存血袋，每袋活细胞量为1.0×10^7个。
(2)将10袋放到4℃储存，10袋放到-20℃储存。
(3)分别于储存3天后和15天后从4℃和-20℃各取出5袋间充质干细胞制剂，35℃复融溶。
(4)对复溶的细胞注射液进行细胞计数检测，检测结果如下：
4℃储存条件下，3天后平均每袋活细胞量0.96×10^7个，15天后平均每袋活细胞量0.88×10^7个；
-20℃储存条件下，3天后平均每袋活细胞量0.89×10^7个，15天后平均每袋活细胞量0.86×10^7个。
(5)分别用3天后和15天后从4℃、-20℃取出复溶的细胞注射液对5只SD大鼠进行静脉注射，每只大鼠注射量为3ml，经一周观察大鼠未产生异常反应。
实施例2
I.间充质干细胞储存液成分及浓度
II.实施步骤
(1)取人间充质干细胞(来源：从上海复旦大学附属中山医院产科病人捐献的胎盘中提取)2.0×10^8个，离心弃上清，用生理盐水洗涤2遍，加入200ml间充质干细胞储存液重悬，经自动细胞计数仪计数，调整细胞浓度为1.0×10^6个/ml，制成注射用间充质干细胞制剂，分装到20个冻存血袋，每袋活细胞量为1.0×10^7个。
(2)将10袋放到4℃储存，10袋放到-20℃储存。
(3)分别于储存3天后和15天后从4℃和-20℃各取出5袋间充质干细胞制剂，35℃复融溶。
(4)对复溶的细胞注射液进行细胞计数检测，检测结果如下：
4℃储存条件下，3天后平均每袋活细胞量0.94×10^7个，15天后平均每袋活细胞量0.90×10^7个；
-20℃储存条件下，3天后平均每袋活细胞量0.89×10^7个，15天后平均每袋活细胞量0.88×10^7个。
(5)分别用3天后和15天后从4℃、-20℃取出复溶的细胞注射液对5只SD大鼠进行静脉注射，每只大鼠注射量为3ml，经一周观察大鼠未产生异常反应。
Claims (6)
1.一种间充质干细胞储存液，是含有葡萄糖、氯化钠、白蛋白、碳酸氢钠、丙二醇、胆固醇成分的水溶液。
2.权利要求1的一种间充质干细胞储存液，其中所述成分的浓度分别为：
葡萄糖， 10～100g/L；
氯化钠， 8.5～9g/L；
白蛋白， 10～100g/L；
碳酸氢钠， 10-30g/L；
丙二醇， 2～10％(V/V)；
胆固醇， 0.1～0.5g/L。
3.权利要求2的一种间充质干细胞储存液，其中所述成分的浓度分别为：
葡萄糖， 50g/L；
氯化钠， 9g/L；
白蛋白， 50g/L；
碳酸氢钠， 20g/L；
丙二醇， 5％(V/V)；
胆固醇， 0.3g/L。
4.权利要求1的一种间充质干细胞储存液，还可以含有肝素成分。
5.权利要求4的一种间充质干细胞储存液，其中所述成分的浓度分别为：
葡萄糖， 10～100g/L；
氯化钠， 8.5～9g/L；
白蛋白， 10～100g/L；
碳酸氢钠， 10-30g/L；
丙二醇， 2～10％(V/V)；
胆固醇， 0.1～0.5g/L；
肝素， 0.05～0.2g/L。
6.权利要求5的一种间充质干细胞储存液，其中所述成分的浓度分别为：
葡萄糖， 50g/L；
氯化钠， 9g/L；
白蛋白， 50g/L；
碳酸氢钠， 20g/L；
丙二醇， 5％(V/V)；
胆固醇， 0.3g/L；
肝素， 0.1g/L。
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