CN109996535B - 细胞药物组合物、疾病治疗用试剂盒和细胞悬浮用溶液 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供能够良好地保持细胞的状态、将存活率长时间维持在较高水平的细胞药物组合物。本发明为一种细胞药物组合物，其含有：(A)细胞、以及(B)包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液，(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质包含Na⁺和Cl^‑、实质上不包含K⁺。(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质另外优选实质上仅为Na⁺和Cl^‑、或实质上仅为Na⁺、Cl^‑和Lac^‑。

Description

细胞药物组合物、疾病治疗用试剂盒和细胞悬浮用溶液

技术领域

本发明涉及细胞药物组合物、疾病治疗用试剂盒和细胞悬浮用溶液。

背景技术

将包含细胞的药物用于疾病治疗的技术正逐年进步。特别是对于iPS细胞、造血干细胞、间充质干细胞等干细胞、皮肤细胞、心肌细胞等而言，由基础研究阶段转移到开发阶段，且目前也存在用于实际临床现场的细胞。对于通过细胞进行的疾病治疗，可期待如下情形：将细胞本身所具有的功能直接或间接地用于治疗疾病；通过由干细胞新分化的细胞、脏器来补充受到损伤的患者的细胞、组织的功能等。

例如，间充质干细胞是由Friedenstein(1982)首次从骨髓分离的具有多分化能力的前体细胞(非专利文献1)。已经明确了该间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种各样的组织中，间充质干细胞移植有望成为针对各种难治性疾病的新型治疗方法(专利文献1～4)。最近，已知存在具有与脂肪组织、胎盘、脐带、胎膜等胎儿附属物的基质细胞同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2002-506831号公报

专利文献2：日本特表2000-508911号公报

专利文献3：日本特开2012-157263号公报

专利文献4：日本特表2012-508733号公报

非专利文献

非专利文献1：Pittenger F.M.et al.，Science，1999,284，pp.143-147

发明内容

发明要解决的问题

对于包含间充质干细胞等细胞的药物，出于确保安全性的、使细胞的给药变得容易等的目的，有时将细胞悬浮于溶液中来使用。在将间充质干细胞等细胞作为悬浮液，并利用点滴、注射等的方法移入/注入生物体内的情况下，存在发生如下不良情况的担心：悬浮液中的细胞的存活率逐渐降低而无法获得充分的药理作用、细胞彼此聚集而在插管中堵塞、在患者的肺静脉等形成塞栓等。因此，本发明的目的在于提供能够将细胞的存活率长时间维持在较高水平的细胞药物组合物。

用于解决问题的方案

为了解决上述课题而进行了深入研究，结果本发明人等发现：将疾病治疗用的细胞悬浮于包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺的溶液中来进行点滴注入等时，使给药时的细胞的存活率降低得以显著地抑制，完成了本发明。根据本发明，包含细胞的药物组合物能够良好地保持细胞的状态、将存活率长时间维持在较高水平，因此能够对各种各样的疾病发挥优异的治疗效果。即，本发明的主旨如下所述。

[1]一种细胞药物组合物，其含有：

(A)细胞、以及

(B)包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液，

(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺。

[2]根据[1]所述的细胞药物组合物，其中，(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质实质上仅为Na⁺和Cl^-、或实质上仅为Na⁺、Cl^-和Lac^-。

[3]根据[1]或[2]所述的细胞药物组合物，其中，(B)细胞悬浮用溶液中的Na⁺和Cl^-的浓度分别为30.0mEq/L以上。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞药物组合物，其中，(B)细胞悬浮用溶液中的糖质包含葡萄糖。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的细胞药物组合物，其中，(B)细胞悬浮用溶液中的糖质浓度为1％～5％。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细胞药物组合物，其中，(A)细胞为间充质干细胞或外周血单核细胞。

[7]根据[6]所述的细胞药物组合物，其中，上述间充质干细胞为脂肪来源、脐带来源或骨髓来源。

[8]一种疾病治疗用试剂盒，其含有：

(A)细胞、以及

(B)包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液，

(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺。

[9]一种细胞药物组合物用的细胞悬浮用溶液，其包含电解质和糖质，上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺。

发明的效果

本发明的细胞药物组合物能够良好地保持细胞的状态，将其存活率长时间维持在较高的状态下，因此可以期待对各种各样的疾病的优异的治疗效果。

具体实施方式

对本发明的细胞药物组合物、疾病治疗用试剂盒和注射剂用的细胞悬浮用溶液进行详细说明。

＜细胞药物组合物＞

本发明的细胞药物组合物含有：(A)细胞、以及(B)包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液，(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺。需要说明的是，本发明中“细胞药物组合物”是指含有细胞的药物用的组合物，是通过细胞所具有的功能而发挥对疾病的治疗效果的物质。本发明的细胞药物组合物通过将细胞悬浮于上述特定的溶液中，从而能够将细胞的存活率长时间维持在较高的状态下，因此可以期待对各种各样的疾病发挥优异的治疗效果。本发明的细胞药物组合物除了作为上述必须成分的(A)细胞和(B)细胞悬浮用溶液之外，还可以含有对疾病具有治疗效果的其它药剂。进而，在不损害本发明的效果的范围内还可以含有其它成分。以下对本发明的细胞药物组合物所含有的(A)细胞、(B)细胞悬浮用溶液、其它药剂、其它成分进行详细说明。

[(A)细胞]

本发明中(A)细胞只要是对疾病的治疗发挥效果的细胞就没有特别限定，例如可列举出：间充质干细胞、外周血单核细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等)、红细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、NKM细胞、LAK细胞、树突状细胞、成纤维细胞、造血干细胞、iPS细胞、ES细胞、骨髓细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、皮肤细胞、脂肪细胞、其它构成各组织的细胞。这些当中，从由后述的(B)细胞悬浮用溶液带来的存活率维持效果优异这样的观点出发，优选间充质干细胞、外周血单核细胞、骨髓细胞。

(间充质干细胞)

本发明中间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质系统的一种以上、优选为两种以上、进一步优选为三种以上的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的能力，并在维持该能力的状态下能够增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞的术语是指与基质细胞相同的细胞，不对两者进行特别区分。另外，有时也简记为间充质细胞。作为包含间充质干细胞的组织，例如可列举出：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等。例如脂肪组织来源间充质干细胞是指脂肪组织中含有的间充质干细胞，还可称为脂肪来源间充质干细胞。这些当中，从对各种疾病治疗的有效性的观点、获得容易性的观点等出发，优选脂肪来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、牙髄来源间充质干细胞，更优选脂肪来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞可以是与被处置的对象(被检体)为同种来源或异种来源。作为本发明中的间充质干细胞的种类，可列举出：人、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠，优选为与被处置的对象(被检体)为同种来源细胞。本发明中的间充质干细胞可以源自被处置的对象(被检体)、即为自体细胞(同种同系)，或可以源自同种的其它对象、即为异体细胞(同种异体)。优选为异体细胞(同种异体)。

由于间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以使用对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞作为本发明的细胞药物组合物中的(A)细胞的间充质干细胞。因此，与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比，商品化也容易且容易稳定地得到恒定效果，从这样的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。

本发明中间充质干细胞是指：包含间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为间充质干细胞。

本发明中脂肪组织是指：含有脂肪细胞和包含微血管细胞等的基质细胞的组织，例如，是将哺乳动物的皮下脂肪外科切除或吸引哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。脂肪组织可以由皮下脂肪获得。优选从与后述的脂肪来源间充质干细胞的给药对象为同种的动物获得、考虑到对人给药，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是存活或死亡的，但本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集时，吸脂例如可示例出：PAL(动力辅助)吸脂、Erchonia激光吸脂或Body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波。

本发明中脐带是连接胎儿和胎盘的白色的管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；Wharton’s Jelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的细胞药物组合物的被检体(给药对象)为同种的动物获得，考虑到将本发明的细胞药物组合物对人给药，更优选为人的脐带。

本发明中骨髓是指填充骨的内腔的实质组织(parenchyma)，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将存在于其中的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外，包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。

本发明中，所谓脂肪来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞是指：分别包含所谓脂肪来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为所谓脂肪来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞还可以利用生长特征(例如，从传代至老化为止的群体的倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、通过流式细胞仪(例如，FACS分析)进行的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录PCR、实时PCR、传统型PCR等聚合酶链式反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝血解析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组学解析)、本领域中公知的其它方法等而赋予特征。

(间充质干细胞的制备方法)

间充质干细胞可以通过本领域技术人员利用公知的方法来制备。以下作为一个例子对脂肪来源间充质干细胞的制备方法进行说明。脂肪来源间充质干细胞可以利用例如美国专利第6,777,231号中记载的制造方法得到，例如，可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法来制造：

(i)通过酶消化脂肪组织而得到细胞悬浮物的工序；

(ii)使细胞沉淀，将细胞再悬浮于适合的培养基的工序；以及

(iii)在固体表面培养细胞，去除不显示出与固体表面结合的细胞的工序。

工序(i)中使用的脂肪组织优选使用经清洗的脂肪组织。清洗可以通过使用生理学允许的生理盐水溶液(例如磷酸缓冲盐水(PBS))，并剧烈地搅拌使其沉淀来进行。其原因在于，从组织中去除脂肪组织中包含的杂质(也称为残骸(debris)，例如损伤组织、血液、红细胞等)。因此，通常重复进行清洗和沉淀直至从上清液中整体上去除了残骸。残留的细胞以各种各样的尺寸的块的形式存在，因此为了将细胞本身的损伤抑制在最小限度并且使其解离，而优选用使细胞间结合变弱或破坏细胞间结合的酶(例如，胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等)对清洗后的细胞块进行处理。这样的酶的量和处理期间依赖于所使用的条件而变化，在本技术领域中是已知的。可以替代这样的酶处理或组合地利用机械的搅拌、超声波能量、热能等其它处理法将细胞块分解，但为了将细胞的损伤抑制在最小限度而优选仅通过酶处理进行。使用了酶的情况，为了将对细胞的有害作用抑制在最小限度，期望的是在经过适合的期间后使用培养基等使酶失活。

通过工序(i)而得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞的浆料或悬浮物、以及各种夹杂细胞、例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。因此，接着，还可以分离、去除聚集状态的细胞和它们的夹杂细胞，但由于能够通过后述的工序(iii)中的粘接和清洗来去除，因此还可以省略该分离、去除。在分离、去除夹杂细胞时，可以通过将细胞强制分成上清液和沉淀的离心分离来实现。将包含得到的夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学允许的溶剂中。虽然有悬浮状的细胞中包含红细胞的担心，但由于红细胞会通过后述的由粘附于个体表面进行的选择而被排除，因此未必一定需要溶解的工序。作为选择性地溶解红细胞的方法，可以使用本技术领域中公知的方法例如：通过用氯化铵溶解在高渗培养基或低渗培养基中进行孵育等。溶解后，还可以通过例如过滤、离心沉淀或密度分级从期望的细胞分离溶解物。

工序(ii)中，对于悬浮状的细胞，为了提高间充质干细胞的纯度，还可以进行1次或连续多次清洗、离心分离，并再悬浮于培养基中。此外，还可以基于细胞表面标记物曲线或基于细胞的尺寸和颗粒性对细胞进行分离。

再悬浮时使用的培养基只要是能培养间充质干细胞的培养基就没有特别限定，这样的培养基还可以通过如下方式制作：在基础培养基中添加血清、和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物。这些培养基还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。

作为上述基础培养基，例如可列举出：IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium，DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、MCDB201培养基以及它们的混合培养基等。

作为上述血清，例如可列举出：人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以相对于基础培养基添加5v/v％～15v/v％、优选添加10v/v％。

作为上述脂肪酸，可示例出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸(palmitoyl acid)、棕榈酸(palmitic acid)和硬脂酸等，但不限定于这些。脂质可示例出：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限定于这些。氨基酸例如包括：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限定于这些。蛋白质例如可示例出：大肠杆菌素、还原型谷胱甘肽、纤维连接蛋白和β2-微球蛋白等，但不限定于这些。多糖可示例出糖胺聚糖，糖胺聚糖中尤其可示例出透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限定于这些。生长因子例如可示例出：血小板来源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，但不限定于这些。从将本发明中得到的脂肪来源间充质干细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用血清等不包含异种来源成分(无异源，xeno-free)的培养基。这样的培养基例如以由PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&DSystems公司、Corning公司和Rohto公司等作为间充质干细胞(基质细胞)用预先制备的培养基的形式提供。

接着，工序(iii)中，对于工序(ii)中得到的细胞悬浮液中的细胞，不使之分化而在固体表面上、在适合的细胞密度和培养条件下使用上述的适合的细胞培养基对其进行培养。本发明中，“固体表面”是指：能够结合/粘附本发明中的脂肪来源间充质干细胞的任意材料。在特定的方式中，这样的材料是为了促进哺乳类细胞与该表面的结合/粘附而经处理的塑料材料。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜地使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片，在孵育后清洗细胞。

本发明中，可以选择最终以与固体表面结合/粘附的状态滞留的细胞作为脂肪来源间充质干细胞的细胞群体。

对于所选择的细胞，为了确认为本发明中的脂肪来源间充质干细胞，还可以使用流式细胞仪等利用现有的方法对表面抗原进行解析。进而，还可以对分化为各细胞系列的能力进行检测，这样的分化可以利用现有的方法进行。

本发明中的间充质干细胞可以如上所述进行制备，但还可以定义为具有以下特性的细胞；

(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘接性、

(2)表面抗原CD44、CD73、CD90为阳性，CD31、CD45为阴性、和

(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。

(外周血单核细胞)

本发明中外周血单核细胞是指：从人或动物的外周血获得的、包含淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞的级分。外周血单核细胞可以利用使用了Ficoll-hypaque(注册商标)等的密度梯度离心法从外周血分离。作为本发明中的(A)细胞的外周血单核细胞可以是从外周血分离的状态的细胞，还可以是根据需要将它们与各种因子、低分子化合物、抗体等一同进行培养等使其增殖/活化而得到的细胞。

((A)细胞的冷冻保存)

本发明中的(A)细胞只要具备针对各种疾病的治疗效果就可以是适宜重复进行了冷冻保存和融解的细胞。本发明中，冷冻保存可以通过如下方式进行：本领域技术人员将(A)细胞悬浮于公知的冷冻保存液中进行冷却。悬浮可以通过如下方式进行：根据需要用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，转移至冷冻保存容器中进行适宜处理后，加入冷冻保存液。

冷冻保存液作为冷冻保护剂还可以含有二甲基亚砜(DMSO：Dimethylsulfoxide)，但DMSO具有细胞毒性，因此优选减少DMSO含量。需要说明的是，还已知DMSO对于间充质干细胞具有分化诱导的特性。作为DMSO的替代物，可示例出：丙三醇、丙二醇或多糖类。使用DMSO时，含有5％～20％的浓度、优选含有5％～10％的浓度、更优选含有10％的浓度。此外还可以包含WO2007/058308中记载的添加剂。作为这样的冷冻保存液，例如还可以使用由Bioverde Inc.、NIPPON Genetics Co,Ltd.、REPROCELL Inc.、ZENOAQ公司、CosmoBio Co.,Ltd.、Kohjin Bio Co.,Ltd.、Thermo Fisher Scientific Inc.等提供的冷冻保存液。

冷冻保存上述悬浮的细胞时，在-80℃～-100℃之间的温度(例如，-80℃)下保存为宜，可以使用能达到该温度的任意的冷冻仪来进行。没有特别限定，为了避免急剧的温度变化，还可以使用程序冷冻仪来适宜控制冷却速度。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分进行适宜选择，可以依据冷冻保存液的制造者指示来进行。

保存期间只要在上述条件下经冷冻保存的细胞融解后保持与冷冻前同等性质就没有特别限定，例如可列举出：1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或更长时间。通过在更低的温度下保存而能够抑制细胞毒性，因此还可以移至液氮上的气相(从-180℃以上至约-150℃以下)中进行保存。在液氮上的气相中保存时，可以使用本领域技术人员公知的保存容器来进行。没有特别限定，例如保存2周以上时，优选在液氮上的气相中进行保存。

融解的(A)细胞还可以适宜培养至接下来的冷冻保存。例如，间充质干细胞的培养使用能培养上述的间充质干细胞的培养基进行，没有特别限定，还可以在30～40℃、优选为在约37℃的培养温度下、在含有CO₂的空气气氛下进行。CO₂浓度为约2～5％、优选为约5％。在培养时，在相对于培养容器到达适合的汇合(例如可列举出相对于培养容器，细胞占50％至80％的情况)后，还可以用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，以适合的细胞密度接种于另行准备的培养容器中继续进行培养。在接种细胞时，作为典型的细胞密度，可示例出：100细胞/cm²～100000细胞/cm²、500细胞/cm²～50000细胞/cm²、1000～10000细胞/cm²、2000～10000细胞/cm²等。在特定的方式中，细胞密度为2000～10000细胞/cm²。优选为3天～7天到达适合的汇合的方式进行调节。在培养时，还可以根据需要适宜更换培养基。

经冷冻保存的细胞的融解可以通过本领域技术人员利用公知的方法来进行。例如可示例出通过在37℃的恒温槽内或热水浴中静置或振荡来进行的方法。

((A)细胞的形态)

本发明的细胞药物组合物所含有的(A)细胞可以是任意状态的细胞，例如可以是将培养中的细胞剥离并回收的细胞，还可以是在冷冻保存液中已冷冻的状态的细胞。使用将扩大培养而得到的相同批次的细胞分成小部分进行冷冻保存后的细胞时，在稳定地得到同样的作用效果方面、操作性优异方面等是优选的。

冷冻保存状态的(A)细胞还可以在即将使用之前进行融解并悬浮于冷冻保存液中的状态下直接混合于后述的(B)细胞悬浮用溶液中。另外，还可以利用离心分离等方法去除冷冻保存液后悬浮于(B)细胞悬浮用溶液中。

本发明的(A)细胞的用量(给药量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及剂型等而不同，从发挥充分的治疗效果的观点出发，有优选大量的倾向，另一方面，从抑制副作用的表现的观点出发，有优选小量的倾向。通常，在对成人给药时，作为细胞数，为1×10³～1×10¹²个/次、优选为1×10⁴～1×10¹¹个/次、进一步优选为1×10⁵～1×10¹⁰个/次、特别优选为5×10⁶～1×10⁹个/次。需要说明的是，可以将本用量作为1次量来进行多次给药，还可以将本用量分成多次进行给药。

本发明的(A)细胞的用量(给药量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)、及本发明的组合物的剂型等而不同，通常，在对成人给药时，作为细胞数，为1×10～5×10¹⁰个/kg、优选为1×10²～5×10⁹个/kg、进一步优选为1×10³～5×10⁸个/kg、特别优选为1×10⁴～5×10⁷个/kg。需要说明的是，可以将本用量作为1次量来进行多次给药，还可以将本用量分成多次进行给药。

[(B)细胞悬浮用溶液]

本发明的(B)细胞悬浮用溶液的特征在于：包含电解质和糖质，作为上述电解质包含Na⁺和Cl^-，实质上不包含K⁺。通过采用这种组成的(B)细胞悬浮用溶液，从而使本发明的细胞药物组合物能够良好地保持(A)细胞的状态，将其存活率长时间维持在较高的状态下。

(B)细胞悬浮用溶液中作为上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺。Na⁺和Cl^-的浓度为低于生理盐水且高于术后恢复液(4号输液)等的范围。具体而言，为30mEq/L以上且130mEq/L以下、优选为50mEq/L以上且120mEq/L以下、更优选为60mEq/L以上且100mEq/L以下。进一步优选：Na⁺浓度为70mEq/L以上且100mEq/L以下、Cl^-的浓度为70mEq/L以上且80mEq/L以下。需要说明的是，Na⁺的浓度和Cl^-的浓度可以相同或不同。

由于(B)细胞悬浮用溶液如上所述电解质浓度低，因此可配混后述的糖质来等渗地制备。需要说明的是，实质上不包含K⁺的是指：不包含使由(B)细胞悬浮用溶液带来的上述效果降低的量的K⁺，优选为检出限以下。

作为(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质，优选实质上仅为Na⁺和Cl^-，但除了Na⁺和Cl^-之外，还可以包含一定量的Lac^-。作为Lac^-的浓度，为0～30mEq/L、优选为0～20mEq/L。

作为(B)细胞悬浮用溶液所包含的上述糖质，例如可列举出：葡萄糖、糊精、麦芽糊精、低聚糖、蔗糖等，可以使用这些当中的1种或组合使用2种以上。这些当中，作为糖质，优选葡萄糖。糖质的浓度可以根据Na⁺和Cl^-的浓度来制备以使(B)细胞悬浮用溶液成为等渗。具体而言，为0.1w/v％～10w/v％、优选为1.0w/v％～5.0w/v％。

本发明的(B)细胞悬浮用溶液可以称为电解质输液制剂，初始溶液或以1号输液的名称已知的物质优选满足上述的(B)细胞悬浮用溶液的条件。具体而言，作为(B)细胞悬浮用溶液，还可以使用：SOLITA(注册商标)-T1号输液(AY Pharmaceuticals Co.,Ltd.)、YDSOLITA(注册商标)-T1号输液(阳进堂株式会社)、KN1号输液(大冢制药株式会社工厂)、DENOSALIN(注册商标)1输液(Terumo Corporation)、SOLDEM(注册商标)1输液(TerumoCorporation)、Replas(注册商标)1号输液(扶桑药品工业株式会社)等市售品。另外，作为2.5％葡萄糖和0.45％氯化钠注射液USP、和5％葡萄糖和0.45％氯化钠注射液USP，可以使用收载于美国药典(U.S.Pharmacopeial Convention(USP))中的、在美国、加拿大等由BAXTER HEALTHCARE LIMITED等贩卖的输液。进而，作为用于输液的氯化钠0.45％w/v&葡萄糖2.5％w/v溶液BP、用于输液的氯化钠0.45％w/v和葡萄糖5.0％w/v溶液BP等，可以使用收载于英国药典(British Pharmacopoeia(BP))中的、在UK、比利时、爱尔兰、卢森堡、马耳他共和国等由BAXTER HEALTHCARE LIMITED等贩卖的输液。作为氯化钠0.45％w/v和葡萄糖2.5％w/v的静脉的输液BP等，可以使用收载于BP中的、由Braun Melsungen AG等贩卖的输液。

[其它药剂]

本发明的细胞药物组合物还可以含有1种或2种以上的、对疾病具有治疗效果的其它药剂。作为其它药剂，可列举出：能够作为肝疾病治疗药、心脏病治疗药、炎症性肠病治疗药、呼吸系统用药、神经系统用药、循环系统用药、脑循环改善药、免疫抑制药使用的任意药剂。

作为肝疾病治疗药，例如可列举出：乙型肝炎治疗药(拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韦(Adefovir)、恩替卡韦(Entecavir)、替诺福韦(Tenofovir)等)；干扰素制剂(干扰素α、干扰素α-2b、干扰素β、PEG干扰素α-2a、PEG干扰素α-2b等)；丙型肝炎治疗药(利巴韦林(Ribavirin)、特拉匹韦(Telaprevir)、司美匹韦(simeprevir)、伐尼瑞韦(Vaniprevir)、达卡他韦(Daclatasvir)、阿那匹韦(Asunaprevir)、索非布韦(Sofosbuvir)等)；糖皮质激素(泼尼松龙(Prednisolone)、甲基泼尼松龙琥珀酸钠等)；抗凝固剂(干燥浓缩人抗凝血酶III、甲磺酸加贝酯(Gabexate Mesilate)、血栓调节蛋白α等)；解毒剂(依地酸钙二钠水合物、谷胱甘肽(Glutathione)、2,3-二巯基-1-丙醇、硫代硫酸钠水合物、舒更葡糖钠(Sugamadex sodium)等)；人血清白蛋白；肝脏提取物；熊去氧胆酸；甘草酸；硫唑嘌呤；苯扎贝特(Bezafibrate)；氨基酸(甘氨酸、L-半胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸和它们的盐等)；维生素(生育酚、黄素腺嘌呤二核苷酸、硫胺素二硫化物磷酸盐(Thiamine disulfide phosphate)、吡哆醇(Pyridoxine)、维生素B12(Cyanocobalamin)和它们的盐等)；抗生素(舒巴坦钠(Sulbactam sodium)、头孢哌酮钠(Cefoperazonesodium)、美洛培南(Meropenem)水合物、盐酸万古霉素(Vancomycin hydrochloride)等)等。

作为心脏病治疗药，例如可列举出：ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β阻滞剂、抗血小板药物、华法林、钙拮抗剂、硝酸药、利尿剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、盐酸胺碘酮等。

作为炎症性肠病治疗药，例如可列举出：柳氮磺吡啶(Salazosulfapyridine)、美沙拉嗪(Mesalazine)等。

作为呼吸系统用药，例如可列举出：双吗啉胺(Dimorpholamine)、多沙普仑(Doxapram)盐酸盐水合物、西维来司钠(Sivelestat sodium)水合物、甲苯吡啶酮(Pirfenidone)、肺表面活性物质(Lung surfactant)、阿法链道酶(Dornase alfa)等。

作为神经系统用药，例如可列举出：依达拉奉(Edaravone)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、盐酸芬戈莫德、利鲁唑(Riluzole)、他替瑞林(Taltirelin)水合物等。

作为循环系统用药，例如可列举出：癸烟酯(Hepronicate)、盐酸米多君(Midodrine hydrochloride)、甲磺酸氨苯哒嗪(Amezinium Metilsulfate)、盐酸乙苯福林(Etilefrine hydrochloride)、盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine hydrochloride)等。

作为脑循环改善药，例如可列举出：酒石酸艾芬地尔(Ifenprodil tartrate)、尼麦角林(Nicergoline)、异丁地特(Ibudilast)、甲磺酸二氢麦角碱(Dihydroergotoxinmesylate)、富马酸尼唑苯酮(Nizofenone Fumarate)、盐酸法舒地尔(Fasudilhydrochloride)水合物等。

作为免疫抑制药，例如可列举出：环孢菌素、硫唑嘌呤、咪唑立宾(Mizoribine)、巴利昔单抗(Basiliximab)、他克莫司(Tacrolimus)水合物、盐酸胍立莫、霉酚酸酯、依维莫司(Everolimus)等。

本发明的细胞药物组合物含有上述其它药剂的情况下，在保存时，可以将其他药剂保存在与(A)细胞、(B)细胞悬浮用溶液不同的容器中，还可以以任意配混的形式含有。根据疾病的种类、治疗方法、患者的状态等还可以将其它药剂及(A)细胞和(B)细胞悬浮用溶液同时给药，还可以隔开一定的间隔给药。

本发明的胞药物组合物只要在不损害本发明的效果的范围内，除了上述(A)细胞和(B)细胞悬浮用溶液以外，还可以根据其用途、形态，按照常规方法含有药学上可接受的载体、添加物等其它成分。可以在(B)细胞悬浮用溶液中含有这样的载体、添加物，还可以与(B)细胞悬浮用溶液分开含有这样的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，例如可列举出：等渗剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定化剂、螯合剂、油性基质、凝胶基质、表面活性剂、悬浮化剂、结合剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、发泡剂、流动化剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清涼化剂等，但不限定于这些。

本发明的细胞药物组合物根据目的还可以以各种形态、例如注射剂(包括输液剂、嵌入式注射剂、缓释型注射、使用时制备型的注射剂)、透析用剂、贴剂、巴布剂等的形态加以利用。本发明的细胞药物组合物还可以通过喷雾来用于患部，本发明的细胞药物组合物还可以以喷雾后在患部被凝胶化或片化的形态加以利用。本发明的细胞药物组合物还可以在将上述(A)细胞制成片状或立体结构体后用于患部。

本发明的细胞药物组合物可以将(A)细胞、(B)细胞悬浮用溶液、其它药剂、其它成分封入不同的容器中进行保管，在使用时将它们混合来使用。需要说明的是，在保管时，上述(A)细胞、(B)细胞悬浮用溶液、其它药剂、其它成分只要在各自适宜的条件下保管即可，例如可以是冷冻条件、冷藏条件、室温条件等中的任意者。

本发明的细胞药物组合物的pH只要在药物上、药理学上(制药上)或生理学上可接受的范围内就没有特别限定，作为一个例子，可列举出：2.0～9.0、优选为2.5～8.5、更优选为3.0～8.0的范围。

对于本发明的细胞药物组合物的渗透压而言，只要在生物体允许的范围内就没有特别限制。作为本发明的细胞药物组合物的渗透压比的一个例子，可列举出优选为0.7～5.0、更优选为0.8～3.0、进一步优选为0.9～1.4的范围。渗透压的调节可以使用上述的电解质、糖质等，利用该技术领域中已知的方法进行。渗透压比是基于第十五次修订日本药典、试样的渗透压相对于286mOsm(0.9w/v％氯化钠水溶液)的渗透压之比，渗透压参考日本药典中记载的渗透压测定法(冰点下降法)进行测定。需要说明的是，对于渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)，可以如下制备：将氯化钠(日本药典标准试剂)在500～650℃下干燥40～50分钟后，在干燥器(硅胶)中进行自然冷却，准确称量其0.900g，溶解于纯化水中准确地制成100mL，或使用市售的渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)。

本发明的细胞药物组合物中的(A)细胞的浓度、即将(A)细胞悬浮于(B)细胞悬浮用溶液中进行制备而用于给药时的浓度根据细胞的种类、细胞悬浮用溶液而不同，通常为1×10²～2.5×10⁸个/mL、优选为1×10³～2.5×10⁷个/mL、更优选为1×10⁴～2.5×10⁶个/mL。

作为本发明的细胞药物组合物的一个优选方式，在细胞悬浮用溶液中以1×10⁴～2.5×10⁶个/mL的密度包含人源间充质干细胞，细胞悬浮用溶液包含70～100mEq/L的钠离子和70～80mEq/L的氯离子，实质上不包含钾离子，相对于生理盐水的渗透压比为0.9～1.4，pH为3.0～8.0。

本发明的细胞药物组合物向对象给药的途径可列举出：皮下给药、肌肉给药、静脉内给药、动脉内给药、髄腔内给药、腹腔内给药、直肠给药、阴道给药、经皮给药、植入物、向脏器内的直接给药等，从本发明的细胞药物组合物的有效性的观点出发，优选为植入物、动脉内给药、静脉内给药和向脏器内的直接给药，进一步优选为静脉内给药和向脏器内的直接给药。

本发明的细胞药物组合物向对象给药的速度根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)和本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂的给药途径等而不同，通常，向成人给药的情况，为50mL/小时～1000mL/小时、优选为75mL/小时～500mL/小时、更优选为100mL/小时～250mL/小时。

本发明的细胞药物组合物向对象给药的温度根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)和本发明的细胞药物组合物的给药途径等而不同，通常为4℃～45℃、优选为15℃～37℃、更优选为室温～37℃。

本发明的细胞药物组合物可以使用输液套组来进行向对象的给药。具体而言作为输液套组，可以使用：Wand disposable infusion tube set(吉田制作所株式会社制)、输液套组(FORTE GROW MEDICAL Co.,Ltd.制)、Terufusion(R)输液套组(TerumoCorporation制)、JMS输液套组(JMS Co.,Ltd.制)、SURPLUG输液套组(Terumo Corporation制)、输液套组(Nipro Corporation制)、TOP输液套组NP(TOP Corporation制)、带有过滤器的输液套组(EX型)(Toray Medical Co.,Ltd.制)等市售品。

本发明的细胞药物组合物可以使用输液管对对象进行给药。具体而言作为输液管，可以使用：Lectro-Cath(SUMIC International Inc.制)、JMS外接镜管(JMS Co.,Ltd.制)、SAFEED延长管(Terumo Corporation制)、延长管(TOP Corporation制)、联接管(中厚)(MEDICO’S HIRARA INC.)、Safety AP管(川澄化学工业株式会社制)、带有延长管的Bionector 2(Toray Medical Co.,Ltd.)、Medicut延长管套组B(Nippon Sherwood制)、Wand disposable infusion tube set(吉田制作所株式会社制)、输液管(FORTE GROWMEDICAL Co.,Ltd.制)等市售品。

作为将本发明的细胞药物组合物向对象给药时使用的输液管的材质，可以使用：聚氯乙烯、热塑性弹性体、TPE热塑性弹性体、有机硅、有机硅橡胶、聚乙烯、聚丁二烯、Teflon(注册商标)、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、天然橡胶、聚烯烃、PVC(增塑剂：TOTM、DOA)、无增塑剂PVC和它们的混合物。

本发明的细胞药物组合物可以适宜地用于各种疾病的治疗。例如优选对于内脏疾病来使用，具体而言是指：心脏病、胃/十二指肠疾病、小肠/大肠疾病、肝疾病、胆道疾病、胰脏疾病、肾疾病、肺部疾病、纵隔胸膜疾病、横隔胸膜疾病、胸膜疾病、腹膜疾病、眼病、神经疾病、中枢神经系统(CNS)障碍、外周动脉疾病、外周静脉疾病。

具体的疾病，例如可列举出：自身免疫性肝炎、重型肝炎、慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD))、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis(NASH))、非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfatty liver(NAFL))、肝纤维化、肝硬化、肝癌、脂肪肝、药剂过敏性肝损伤、血色沉着病、含铁血黄素沉着症、血铜蓝蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、胆道闭锁、肝脓疡溃、慢性活动性肝炎、慢性持续性肝炎等肝疾病；心肌梗塞、心力衰竭、心律不齐、心悸、心肌病、缺血性心肌病、心绞痛、先天性心脏病、心脏瓣膜病、心肌炎、家族性肥厚型心肌病、舒张型心肌症、急性冠脉综合征、动脉粥样硬化血栓形成、再狭窄等心脏病；急性胃炎、慢性胃炎、胃/十二指肠溃疡、胃癌、十二指肠癌等胃/十二指肠疾病；缺血性肠炎、炎症性肠病、溃疡性大肠炎、Crohn病(克罗恩病)、单纯性溃疡、肠白塞病、小肠癌、大肠癌等小肠/大肠疾病；急性胆嚢炎、急性胆管炎、慢性胆嚢炎、胆管癌、胆嚢癌等胆道疾病；急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌等胰脏疾病；急性肾炎、慢性肾炎、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭等肾疾病；肺炎、肺气肿、肺纤维化、间质性肺炎、特发性间质性肺炎、剥离性间质性肺炎、急性间质性肺炎、非特异的间质性肺炎、药物导致的肺部疾病、嗜酸性粒细胞性肺部疾病、肺动脉高压、肺结核、肺结核后遗症、急性呼吸窘迫综合征、囊肿性纤维化、肺慢性阻塞性疾病、肺塞栓症、肺痈、尘肺、吞咽性肺炎肺纤维化、急性上呼吸道感染、慢性下呼吸道感染、气胸、肺胞上皮细胞中发现损伤的疾病、淋巴管平滑肌瘤、淋巴性间质性肺炎、肺泡蛋白沉积症、肺朗格汉斯细胞性肉芽肿等肺部疾病；纵隔肿瘤、纵隔囊性疾病、纵隔炎等纵隔胸膜疾病；膈疝等横隔胸膜疾病；胸膜炎、脓胸、胸膜肿瘤、癌性胸膜炎、胸膜间皮瘤等胸膜疾病；腹膜炎、腹膜肿瘤等腹膜疾病；包括小儿脑性瘫痪在内的脑瘫综合征、无菌性脑膜炎、格林-巴利综合征、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、重症肌无力、单神经病变、多发性神经病、脊髓性肌萎缩症、脊椎障碍、急性横贯性脊髓炎、脊髓梗死(脊髓缺血性损伤)、颅内肿瘤、脊柱肿瘤等神经疾病；阿尔茨海默病、认知障碍、中风、多发性硬化症、帕金森病等CNS障碍；肌纤维发育不良、外周动脉疾病(PAD)、闭塞性血栓血管炎(伯格病)、川崎病(KD)等外周动脉疾病；深静脉血栓形成、慢性静脉功能不全、静脉炎后综合征、浅静脉血栓形成等外周静脉疾病；移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease：GVHD)、继发性免疫缺陷病、原发性免疫缺陷病、B细胞的缺损、T细胞衰竭、B和T细胞复合缺损、吞噬细胞缺陷、经典途径补体缺乏、MBL途径补体缺乏、替代途径补体缺乏、补体调节蛋白缺陷、补体受体缺陷等免疫缺陷疾病。

这些当中，优选确认了利用间充质干细胞充分地得到了治疗效果的肝疾病、心脏病、肺部疾病、神经疾病、外周动脉疾病、免疫缺陷疾病，其中，可以更适宜地用于肝纤维化、肝硬化、心肌梗塞、心力衰竭、肺纤维化、间质性肺炎、小儿脑性瘫痪、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、外周动脉疾病(PAD)、移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease：GVHD)的治疗，可以进一步适宜地用于肝纤维化、肝硬化、心肌梗塞、心力衰竭、肺纤维化、间质性肺炎。另外，可以适宜地用于确认了利用外周血单核细胞充分地得到了治疗效果的各组织的癌中。

＜疾病治疗用试剂盒＞

本发明还包括疾病治疗用试剂盒，其含有：(A)细胞、以及(B)包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液，(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺。本发明的疾病治疗用试剂盒是包含上述的本发明的细胞药物组合物的试剂盒，对于(A)细胞、(B)细胞悬浮用溶液、其它本发明的细胞药物组合物可含有的成分而言可以适用细胞药物组合物项目中的说明。根据本发明的疾病治疗用试剂盒，能够良好地保持细胞的状态、将存活率长时间维持在较高水平，因此能够对各种各样的疾病发挥优异的治疗效果。

另外，本发明的疾病治疗用试剂盒还可以表示为包括本发明的细胞药物组合物、容器和标签。作为本发明的疾病治疗用试剂盒所包含的适合的容器，没有特别限定，例如可列举出：细胞冷冻用的内旋盖冻存管、细胞悬浮用溶液用的瓶、小瓶、试验管、透析袋等。这些容器可以由玻璃、金属、塑料或它们的组合等多种材料形成。这些容器上的标签记载了对作为内容物的细胞、细胞悬浮用溶液等进行说明的内容。

本发明的疾病治疗用试剂盒可以包括其它添加剂、其它药剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、记载了使用方法的随附文档在内的、从商业和利用者的观点出发所期望的其它材料。

＜细胞悬浮用溶液＞

包含电解质和糖质且上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺的细胞药物组合物用的细胞悬浮用溶液也在本发明的范围内。本发明人等新发现了如下见解：作为细胞药物的注射/点滴用的细胞悬浮用溶液，通过采用包含电解质和糖质且上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺的溶液，从而能够将细胞的存活率长时间地维持在较高水平。对于细胞悬浮用溶液的详细内容，可以适用细胞药物组合物项目中的(B)细胞悬浮用溶液的说明。

＜疾病的治疗方法＞

本发明还包括如下治疗方法，其特征在于，其为将(A)细胞悬浮于(B)包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液中并对患者进行给药的疾病的治疗方法，(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质包含Na⁺和Cl^-、实质上不包含K⁺。根据本发明的治疗方法，能够将细胞的存活率长时间维持在较高水平，因此能够对各种各样的疾病发挥优异的治疗效果。本发明的疾病方法是使用了上述的本发明的细胞药物组合物的治疗方法，对于(A)细胞、(B)细胞悬浮用溶液、其它本发明的细胞药物组合物可含有的成分而言，可以适用细胞药物组合物项目中的说明。

实施例

以下列举实施例和试验例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些实施例等限定。

[实施例1]

(脂肪来源间充质干细胞的制备)

获得人供体的同意后，用生理盐水清洗利用吸脂法得到的皮下脂肪组织。为了实现细胞外基质的破坏和细胞的分离，添加胶原酶(Roche diagnostics公司)(溶剂为生理盐水)，在37℃下振荡90分钟使其分散。接着，将该上述悬浮液以800g进行5分钟离心分离而得到间质血管细胞群的沉淀。在上述细胞的沉淀中加入间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)，将该细胞悬浮液以400g进行5分钟离心分离，去除上清液后再悬浮于间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，将细胞接种于烧瓶中。将细胞在37℃下5％CO₂中培养数天。数天后用PBS清洗培养物来去除培养液中包含的血球、脂肪组织的残留等，得到贴壁于塑料容器中的间充质干细胞。

将得到的脂肪来源间充质干细胞分注在离心管中，以400g进行5分钟、离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后加入适量细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER(ZENOAQ公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于内旋盖冻存管中后，在冷冻仪内以-80℃保存，然后转移至液氮上的气相中继续进行保存。

在液氮气相下从液氮中取出保存的脂肪来源间充质干细胞，将玻璃小瓶放入设定在15℃或30℃的保管库中，静置1小时，将细胞融解后摇动玻璃小瓶，使内部的细胞悬浮液均匀。分别在50mL离心管(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.、型号：MS-56500)中注入：大冢生食注500mL(日本药典生理盐水；大冢制药株式会社工厂、Lot：5A81N)、Physio(注册商标)140输液(细胞外液补充液、含有1％葡萄糖的醋酸林格液；大冢制药株式会社工厂、Lot：M5C73)、大冢糖液5％(日本药典葡萄糖注射液；大冢制药株式会社工厂、Lot：4L83S)、KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：M5K81)各30mL后，在KN1号输液中加入375μL细胞悬浮液，在其它输液中各加入300μL细胞悬浮液，使用了KN1号输液后的细胞在悬浮溶液中的浓度为1.25×10⁵个细胞/mL，在使用了其它溶液的悬浮液为1.0×10⁵个细胞/mL的方式进行制备。通过倾倒混合使其悬浮后，保管于15℃或30℃的保管库中，在刚制备后、2小时后、3小时后和4小时后利用带有21G的注射针的5mL注射器从中层分取出1mL，移至1.5mL管中。相对于细胞悬浮液10μL加入台盼蓝(Trypan Blue Stain(0.4％)；Lifetechnologies、15250-061)10μL，来区分活细胞和死细胞并通过相位差显微镜(OLYMPUS、型号：CKX41SF)进行计数。需要说明的是，细胞的计数使用一次性细胞计数板(WAKEN、型号：WC2-100)，对18分区进行5次计数，使用除了用最大数值和最少数值之外的3次计数值的平均值，利用下式计算出细胞存活率。需要说明的是，将各输液的组成示于下述表1，将细胞存活率的结果示于下述表2。

细胞存活率(％)＝活细胞数/总细胞数×100

[表1]

[表2]

将脂肪来源间充质干细胞悬浮于大冢生食注中时，细胞存活率为70％以上的细胞仅为：15℃保存、30℃保存下均是刚制备后的细胞。将脂肪来源间充质干细胞悬浮于Physio(注册商标)140输液中时，细胞存活率为70％以上的细胞仅为：15℃保存下刚制备后和2小时后的细胞；30℃保存下刚制备后的细胞。将脂肪来源间充质干细胞悬浮于大冢糖液5％中时，细胞存活率为70％以上的细胞仅为30℃保存下刚制备后的细胞。相对于此，将脂肪来源间充质干细胞悬浮于KN1号输液中时，在15℃和30℃保存的所有保存时间下，细胞存活率均为70％以上。通过将脂肪来源间充质系统细胞悬浮于KN1号输液中，从而明确了显著的细胞存活率的上升。

[实施例2]

在15mL离心管(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.、型号：MS-56150)中分别注入KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：M6C77)、KN2号输液(2号液(脱水补给液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：K6E92)、KN3号输液(3号液(维持液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：K6D96)、KN4号输液(4号液(术后恢复液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：K6D80)、Physio(注册商标)70输液(大冢制药株式会社工厂、Lot：M6D91)、含有1％葡萄糖的1号液(以下称为“Glu1％”)和含有5％葡萄糖的1号液(以下称为“Glu5％”)各5mL后，将经冷冻保存的脂肪来源间充质干细胞在热水(37±1℃)中迅速融解，然后加入脂肪来源间充质干细胞的细胞悬浮液各62.5μL，以使以细胞在悬浮溶液中的浓度为1.23×10⁵个细胞/mL的方式来制备。需要说明的是，Glu1％和Glu5％使用大冢生食注500mL(日本药典生理盐水；大冢制药株式会社工厂、Lot：5A81N)、大冢糖液50％(大冢制药株式会社工厂、Lot：M5G83)和注射用水(大冢制药株式会社工厂、Lot：6098)来制备。通过倾倒混合使细胞悬浮后，在室温下保管，与实施例1同样地计数刚制备后、2小时后、4小时后和7小时后的活细胞和死细胞，与实施例1同样地计算出细胞存活率。需要说明的是，4小时后的细胞存活率低于70％，未进行7小时后的计数。需要说明的是，将各输液的组成示于下述表3，将细胞存活率的结果示于下述表4。

[表3]

[表4]

将脂肪来源间充质干细胞悬浮于KN2号输液和Physio(注册商标)70输液中时，4小时后的细胞存活率低于70％。将脂肪来源间充质干细胞悬浮于KN3号输液和KN4号输液中时，7小时后的细胞存活率低于70％。相对于此，将脂肪来源间充质干细胞悬浮于KN1号输液、Glu1％和Glu5％中时，在所有的保存时间下能够维持高的细胞存活率，7小时后也为80％左右。由以上结果可知：含有葡萄糖且仅包含Na⁺、Cl^-作为电解质的KN1号输液、Glu1％和Glu5％能够将脂肪来源间充质干细胞的细胞存活率长时间维持在显著高的状态下。

[实施例3]

使用SOLDEM(注册商标)1输液(1号液(初始溶液)；Terumo Corporation、Lot：160519TA)，以以细胞在悬浮溶液中的浓度为1.23×10⁵个细胞/mL的方式来制备，与实施例2同样地进行试验，计算出刚制备后、2小时后和4小时后的细胞存活率。将SOLDEM(注册商标)1输液的组成示于下述表5，将细胞存活率的结果示于下述表6。

[表5]

[表6]

将脂肪来源间充质干细胞悬浮于SOLDEM(注册商标)1输液中时，4小时后的细胞存活率也为90％左右。因此，可知含有葡萄糖且仅包含Na⁺、Cl^-、Lac^-作为电解质的SOLDEM(注册商标)1输液够将脂肪来源间充质干细胞的细胞存活率长时间维持在显著高的状态下。

[实施例4]

将实施例2的脂肪来源间充质干细胞替换为骨髓来源间充质干细胞(Lonza公司制)，使用KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：M6C77)，以以细胞在悬浮溶液中的浓度为1.1×10⁵个细胞/mL的方式来制备，利用与实施例2同样的方法进行试验。与实施例2同样地计数刚制备后、2小时后、4小时后和7小时后的活细胞和死细胞，计算出细胞存活率。将结果示于下述表7。

[表7]

在将骨髓来源间充质干细胞悬浮于KN1号输液中的情况下，7小时后的细胞存活率也为90％以上。因此，可知含有葡萄糖、仅包含Na⁺、Cl^-作为电解质的KN1号输液对于骨髓来源间充质干细胞而言也能够与脂肪来源间充质干细胞同样地将细胞存活率长时间维持在显著高的状态下。

[实施例5]

将实施例2的脂肪来源间充质干细胞替换为脐带来源间充质干细胞(LifelineCell Technology、LifeLine(注册商标)UCMSC、Lot.160907)，使用KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：M6C77)，以以细胞在悬浮溶液中的浓度为1.23×10⁵个细胞/mL的方式来制备，利用与实施例2同样的方法进行试验。利用与实施例2同样的方法计数刚制备后、2小时后、4小时后和6小时后的活细胞和死细胞，计算出细胞存活率。将结果示于下述表8。

[表8]

在将脐带来源间充质干细胞悬浮于KN1号输液中的情况下，6小时后的细胞存活率也为90％以上。因此，可知含有葡萄糖且仅包含Na⁺、Cl^-作为电解质的KN1号输液对于脐带来源间充质干细胞而言也能够与脂肪来源间充质干细胞同样地将细胞存活率长时间维持在显著高的状态下。

[实施例6]

将实施例2的脂肪来源间充质干细胞替换为外周血单核细胞(ACCUCELL(注册商标)正常供体来源PBMC、Precision Bioservices公司(PRECISION FOR MEDICINE公司)制、Lot.13134-10)，使用KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂、Lot：M6C77)，以细胞在悬浮溶液中的浓度为1.23×10⁵个细胞/mL的方式来制备，利用与实施例2同样的方法进行试验。利用与实施例2同样的方法计数刚制备后、2小时后、4小时后和6小时后的活细胞和死细胞，计算出细胞存活率。将结果示于下述表9。

[表9]

在将外周血单核细胞悬浮于KN1号输液中的情况下，6小时后的细胞存活率为80％左右。因此，可知含有葡萄糖且仅包含Na⁺、Cl^-作为电解质的KN1号输液对于外周血单核细胞而言也能够与脂肪来源间充质干细胞同样地将细胞存活率长时间维持在显著高的状态下。

[实施例7]

与实施例1同样地制备脂肪来源间充质干细胞，在液氮气相下从液氮中取出保存的脂肪来源间充质干细胞，使用恒温槽(37℃)将细胞融解。融解后在室温下静置30分钟，然后添加KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂)，然后将输液袋倾倒混合。在室温温度下将输液袋挂在输液架上进行静置，然后在刚制备后、2小时后、3小时后和4小时后计算出细胞存活率(％)。需要说明的是，混合液以每30分钟1次的频率进行折叠混合。另外，刚制造后的总细胞浓度：样品1～3为1.8×10⁵～1.9×10⁵，样品4～6为6.3×10⁵～7.3×10⁵。将结果示于下述表10。

[表10]

将脂肪来源间充质干细胞悬浮于KN1号输液中时，可知：在所有的保存时间下均能够维持高的细胞存活率，KN1号输液够将脂肪来源间充质干细胞的细胞存活率长时间维持在显著高的状态下。

[实施例8]

与实施例1同样地制备脂肪来源间充质干细胞，在液氮气相下从液氮中取出保存的脂肪来源间充质干细胞，使用恒温槽(37℃)将细胞融解。融解后在室温下静置30分钟，然后以成为1.25×10⁵个细胞/mL和5×10⁵个细胞/mL的方式添加KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂)，然后将输液袋倾倒混合。在室温温度下将输液袋挂在输液架上进行静置，经过3小时后将输液管(聚氯乙烯(增塑剂：偏苯三酸三(2-乙基己酯))、聚丁二烯)与输液袋连接，滴加混合液。在滴加开始后30分钟、60分钟和120分钟、或111分钟计算出混合液的细胞存活率(％)。需要说明的是，混合液以每30分钟1次的频率进行了折叠混合进行。将结果示于下述表11。

[表11]

将脂肪来源间充质干细胞悬浮于KN1号输液中时，明确了即使通过输液管也能够维持高的细胞存活率。

[实施例9]

与实施例1同样地制备脂肪来源间充质干细胞，在液氮气相下从液氮中取出保存的脂肪来源间充质干细胞，使用恒温槽(37℃)将细胞融解。融解细胞后分别添加至KN1号输液(1号液(初始溶液)；大冢制药株式会社工厂)、无血清培养基(ROHTO PharmaceuticalCo.,Ltd.)和或生理盐水(大冢制药株式会社工厂)中，然后在4℃下保存，计算出刚制备后、16小时后、24小时后和99小时后的细胞存活率(％)。将结果示于下述表12。

[表12]

将脂肪来源间充质干细胞悬浮于生理盐水中，在4℃下保存时，16小时后的细胞存活率低于50％，99小时后的细胞存活率低于25％。相对于此，将脂肪来源间充质干细胞悬浮于KN1号输液中时，在所有的保存时间下均能够维持高的细胞存活率，其存活率与用于细胞培养的无血清培养基为同等。根据以上结果可知：KN1号输液即使在4℃下保存也能够将脂肪来源间充质干细胞的细胞存活率长时间维持在显著高的状态下。

产业上的可利用性

本发明的细胞药物组合物能够良好地保持细胞的状态，将其存活率长时间维持在较高的状态下，因此对各种各样的疾病可期待优异的治疗效果。

Claims (3)

1.一种细胞药物组合物，其由组分(A)和组分(B)组成：

(A)细胞、以及

(B)仅包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液，

(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质实质上仅为Na⁺和Cl^-、或实质上仅为Na⁺、Cl^-和Lac^-，

Na⁺的浓度为70mEq/L以上且100mEq/L以下、Cl^-的浓度为70mEq/L以上且80mEq/L以下，

上述(A)细胞为间充质干细胞或外周血单核细胞，上述间充质干细胞为脂肪来源、脐带来源或骨髓来源，

(B)细胞悬浮用溶液中的糖质包含葡萄糖，

(B)细胞悬浮用溶液中的糖质浓度为1％～5％。

2.一种疾病治疗用试剂盒，其由组分(A)和组分(B)组成：

(A)细胞、以及

(B)仅包含电解质和糖质的细胞悬浮用溶液，

(B)细胞悬浮用溶液中的上述电解质实质上仅为Na⁺和Cl^-、或实质上仅为Na⁺、Cl^-和Lac^-，

Na⁺的浓度为70mEq/L以上且100mEq/L以下、Cl^-的浓度为70mEq/L以上且80mEq/L以下，

上述(A)细胞为间充质干细胞或外周血单核细胞，上述间充质干细胞为脂肪来源、脐带来源或骨髓来源，

(B)细胞悬浮用溶液中的糖质包含葡萄糖，

(B)细胞悬浮用溶液中的糖质浓度为1％～5％。

3.一种细胞药物组合物用的细胞悬浮用溶液，其仅包含电解质和糖质，上述电解质实质上仅为Na⁺和Cl^-、或实质上仅为Na⁺、Cl^-和Lac^-，

Na⁺的浓度为70mEq/L以上且100mEq/L以下、Cl^-的浓度为70mEq/L以上且80mEq/L以下，

上述细胞为间充质干细胞或外周血单核细胞，上述间充质干细胞为脂肪来源、脐带来源或骨髓来源，

(B)细胞悬浮用溶液中的糖质包含葡萄糖，

(B)细胞悬浮用溶液中的糖质浓度为1％～5％。