CN106967675A - 一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法 - Google Patents

一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，包括如下步骤：（1）在无菌手术室环境下采集胎盘，用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；（2）用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；（3）将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；（4）将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，离心后取细胞沉淀；（5）将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；（6）将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，冻存。本发明的方法能够有效提高造血干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，大大缩短的从制备到应用的周期。

Description

一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。
背景技术
造血干细胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植是指对病人进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血干细胞经血管输注给病人，使重建正常的造血和免疫功能。
一般来说，造血干细胞存在于三个部位，分别是骨髓、外周血和脐带血，根据其来源分别称之为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘里含有大量的造血干细胞，与上述三种来源的造血干细胞相比，胎盘中所含造血干细胞的数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，且移植后反应较轻且不需要采用药物。此外，作为胎盘造血干细胞来源-胎盘，来源广泛，孕妇生产后往往成为废弃物，其采集不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。诸多优点使胎盘造血干细胞有望取代骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞用于造血干细胞移植中。
人类足月胎盘存在大量的造血干细胞，比脐带血有更多的造血干细胞，而且这些胎盘造血干细胞在冷冻储存前后都可以分离出来。胎盘造血干细胞菌落形成单位(CFU)的活性是确定的，在免疫缺陷鼠中的移植实验已经证明胎盘细胞在移植中的潜力。这些结果有力地表明，人类足月胎盘有可能成为一种新型的用于移植的造血干细胞的来源。并且胎盘中有大量的造血干细胞，胎盘血干细胞是较为早期的干细胞，能在体内分化成各种细胞，胎盘血内含有丰富的各种阶段早期造血干细胞，其含量大约是脐带血的十几倍，一个胎盘中的造血干细胞可完全满足于两个成年人的需求，若能和脐带血细胞一起应用于病人，无疑大大增加了造血干细胞的含量，使这造血干细胞可完全应用于所有的适用人群。
然而本领域仍然期待有新的、更有效的方法获取造血干细胞，例如期待有新的、更有效的从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，该方法节省了制备时间，能够有效提高造血干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率；操作方便，效率高，大大缩短的从制备到应用的周期；且造血干细胞损伤小，数量多，纯度高，活性高，可以应用于自体或者异体的造血干细胞的移植，并且有助于受损组织的修复。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）胎盘预处理：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，对采集的胎盘进行病原微生物检测，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；
（2）胎盘灌洗：用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；
（3）胎盘酶解：将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；
（4）混合离心：将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，将混合液离心后加入DEME培养液混合均匀，得到细胞悬液，将细胞悬液离心后取细胞沉淀；
（5）重悬离心：将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；
（6）细胞冻存：将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
优选的，所述步骤（1）中，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型检测、造血干/祖细胞定性检测。
优选的，所述步骤（1）中，清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:0.8-1.2混合制得，浓度为80-120mg/L。
优选的，所述步骤（2）中，所述灌洗液由100-300mg青霉素-链霉素双抗、0.05-0.09g酚妥拉明，40-80mg赖氨酸、1-3g维生素C、1-5mg AMD3100、2支肝素钠注射液、2支硝酸甘油注射液、30-70mL质量分数为8%-12%的PBS缓冲液和1L DEME培养液制得。
优选的，所述步骤（3）中，酶解液中由0.06-0.10g胶原酶Ⅷ、0.06-0.10g胰酶、1000-5000U肝素钠、0.1-0.5g酚妥拉明、4-8g维生素C和1L DEME培养液制得。
本发明酶解液比较温和，同时使用胶原酶Ⅷ和胰酶，不仅减少对细胞的损伤，还可以在短时间内更好的消化胎盘组织，释放出组织里面的造血干细胞，提高分离得到的胎盘造血干细胞的数量和活率；酶解液中血管扩张剂酚妥拉明具有良好的血管扩张作用。
优选的，所述步骤（3）中，胎盘剪碎至3-6cm，酶解液室温酶解0.5-1.5h。
优选的，所述步骤（4）中，将混合液在6-10℃温度下、1200-1800r/min转速下离心10-20min，弃上清，加入DEME培养液，得到细胞悬液。
优选的，所述步骤（5）中，依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞10-20min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置30-50min，取上层液体离心后弃去上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，得到造血干细胞。
优选的，所述步骤（6）中，造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：
二甲基亚砜 10-20mL
羟乙基淀粉 6-10g
细胞培养基 4-8mL
人血清白蛋白 6-10mL
人自体血浆 60-100mL。
所述二甲基亚砜为SIGMA型号为472301的二甲基亚砜。二甲基亚砜能提高细胞膜对水的通透性，降低溶液的冰点，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
羟乙基淀粉是大分子非通透性细胞保护剂，可使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用。
本发明采用在造血干细胞冻存液中添加人血白蛋白作为细胞冻存稳定剂使用，有利于在冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，并且冻存液成本低，可进一步提高冻存细胞的存储稳定性，避免由于细胞存储供者血质问题导致过程储存活性不稳定或细胞复苏率下降。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用二甲基亚砜、羟乙基淀粉及人血清白蛋白联合应用，可以有效地使干细胞冻存实现通透性保护作用，不仅降低冰点并延缓细胞冷冻过程，还增加干细胞的非通透性细胞保护作用，少细胞内冰晶形成，有效保护细胞膜，同时实现对干细胞的直接保护作用。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用上述原料，并严格控制各原料的重量配比，制得的造血干细胞冻存液能有效保护造血干细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高造血干细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了造血干细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了造血干细胞的存活期。
优选的，所述细胞培养基为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、GT-T561培养基和Stemspan培养基中的任意一种。
所述细胞培养基的种类为本领域技术人员熟知的细胞培养基即可，并无特殊的限制，本发明中优选为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基或RPMI-1640培养基。AIM-V培养基购于美国Invitrogen公司，其中主要含有L-谷氨酰胺、硫酸链霉素和硫酸庆大霉素等，用以保持造血干细胞活性，使得造血干细胞复苏后能够维持其细胞活性，并延长造血干细胞存活期。细胞培养基具有保持细胞渗透压、酸碱平衡体系和提供营养等作用。
优选的，所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1500-2000rpm转速下离心4-8min，取上层血浆在56-60℃温度下灭活28-32min后，转移至新的离心管中，2500-3500rpm转速下离心15-25min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
人自体血浆为营养保护剂，其中包括血清蛋白、葡萄糖、无机盐离子、胰岛素、肾上腺皮质激素，类固醇激素等，不仅能够为造血干细胞提供所需的营养物质，而且血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤。
本发明的细胞冻存液添加人自体血浆，人自体血浆与血清成分相似，亦含有造血干细胞生长所需的各种细胞因子及营养物质，且属于造血干细胞分离的副产物，方便获取，不存在异源性，避免了外源血清存在的安全隐患。
本发明中所述造血干细胞冻存液中含有的重组人白介素-2和人自体血浆具有显著的协同作用，可以显著提高造血干细胞的活性和复苏后的存活率。
本发明所述造血干细胞冻存液中采用人自体血浆作为血清替代物，不含有动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，也不会对人体过继免疫治疗产生影响。
优选的，所述造血干细胞冻存液还包括糖类1-3g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4组成的混合物。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用海藻糖，可以减少二甲基亚砜的使用，保证细胞在接近冰点时胞内的水分不会结晶，能有效的保护细胞，并有效降低细胞毒性。
本发明添加α-1 ,4-葡聚糖能够有效的降低冻存、复苏中细胞的损伤，并能够保证复苏后细胞增殖的活力。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用香菇多糖和葡萄糖，可以保证复苏后细胞增殖活力不受影响。
优选的，所述造血干细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.2-0.6g和维生素C 0.1-0.5g。
所述非必须氨基酸为本领域技术人员熟知的非必须氨基酸即可，并无特殊的限制，本发明优选为多种非必需氨基酸组合而成，更优选为购买自GIBCO试剂的非必须氨基酸。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用非必须氨基酸和维生素C，可以保证复苏后细胞增殖活力不受影响。
优选的，所述造血干细胞冻存液还包括丙二醇0.2-0.6mL和聚乙二醇0.4-0.8mL。
本发明在造血干细胞冻存液中添加聚乙二醇和1,2-丙二醇，可以替代现用的二甲基亚砜为基础的冻存液，减少二甲基亚砜的用量，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
优选的，所述造血干细胞冻存液还包括重组人白介素4000-8000U。所述重组人白介素可以采用注射用重组人白介素-2。
通常，外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2(IL-2)受体，IL-2与其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成；促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，目前主要是将IL-2作为体外刺激培养物用于造血干细胞的扩增培养，而本发明采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到造血干细胞冻存液中，可大幅度提高所述造血干细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使造血干细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接应用和进一步扩展的关键问题。
本发明添加重组人白介素-2能够有效维持细胞的活性，保证细胞复苏后正常的生物学功能。
优选的，所述造血干细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3-0.7g和勃脉力A 0.8-1.2g。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用白酒草皂苷R与二甲基亚砜结合制备造血干细胞的冻存液，可以降低二甲基亚砜的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用勃脉力A，可以维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近于体内环境的溶液中。
优选的，所述造血干细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.1-0.5mL和氯化钠0.4-0.8g。
所述青霉素和链霉素双抗溶液为GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液每毫升包含10000单位青霉素（碱）和 10000µg链霉素（碱），利用0.85%盐液形式的青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素，其抗菌谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。青霉素和链霉素双抗溶液可保证细胞储存过程中处于无菌状态，且对造血干细胞无不良影响，安全可靠。
本发明的造血干细胞冻存液通过采用氯化钠，可以维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近于体内环境的溶液中。
优选的，所述步骤（6）中，细胞重悬液的细胞密度为5×106-5×107个/mL；程序降温先以1-2℃/min的降温速度降温至-23～-27℃，再以5-7℃/min的降温速度降温至-78～-82℃。
本发明的有益效果在于：本发明的方法节省了制备时间，能够有效提高造血干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率；操作方便，效率高，大大缩短的从制备到应用的周期；且造血干细胞损伤小，数量多，纯度高，活性高，可以应用于自体或者异体的造血干细胞的移植，并且有助于受损组织的修复。
本发明的整个操作过程简单有效，实验操作时间短，显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量大大提高，细胞数量较稳定；同时优化提取分离的条件，尽可能的提高造血干细胞的存活率，细胞污染率极低。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）胎盘预处理：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，对采集的胎盘进行病原微生物检测，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；
（2）胎盘灌洗：用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；
（3）胎盘酶解：将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；
（4）混合离心：将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，将混合液离心后加入DEME培养液混合均匀，得到细胞悬液，将细胞悬液离心后取细胞沉淀；
（5）重悬离心：将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；
（6）细胞冻存：将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（1）中，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型检测、造血干/祖细胞定性检测。
所述步骤（1）中，清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:0.8混合制得，浓度为80mg/L。
所述步骤（2）中，所述灌洗液由100mg青霉素-链霉素双抗、0.05g酚妥拉明，40mg赖氨酸、1g维生素C、1mg AMD3100、2支肝素钠注射液（1mL：5mg）、2支硝酸甘油注射液（2mL：12500U）、30mL质量分数为8%的PBS缓冲液和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，酶解液中由0.06g胶原酶Ⅷ、0.06g胰酶、1000U肝素钠、0.1g酚妥拉明、4g维生素C和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，胎盘剪碎至3cm，酶解液室温酶解0.5h。
所述步骤（4）中，将混合液在6℃温度下、1200r/min转速下离心20min，弃上清，加入DEME培养液，得到细胞悬液。
所述步骤（5）中，依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞10min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置30min，取上层液体离心后弃去上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，得到造血干细胞。
所述步骤（6）中，造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：
二甲基亚砜 10mL
羟乙基淀粉 6g
细胞培养基 4mL
人血清白蛋白 6mL
人自体血浆 60mL。
所述步骤（6）中，细胞重悬液的细胞密度为5×106个/mL；程序降温先以1℃/min的降温速度降温至-23℃，再以5℃/min的降温速度降温至-78℃。
实施例2
一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）胎盘预处理：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，对采集的胎盘进行病原微生物检测，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；
（2）胎盘灌洗：用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；
（3）胎盘酶解：将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；
（4）混合离心：将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，将混合液离心后加入DEME培养液混合均匀，得到细胞悬液，将细胞悬液离心后取细胞沉淀；
（5）重悬离心：将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；
（6）细胞冻存：将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-79℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（1）中，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型检测、造血干/祖细胞定性检测。
所述步骤（1）中，清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:0.9混合制得，浓度为90mg/L。
所述步骤（2）中，所述灌洗液由150mg青霉素-链霉素双抗、0.06g酚妥拉明，50mg赖氨酸、1.5g维生素C、2mg AMD3100、2支肝素钠注射液（1mL：5mg）、2支硝酸甘油注射液（2mL：12500U）、40mL质量分数为9%的PBS缓冲液和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，酶解液中由0.07g胶原酶Ⅷ、0.07g胰酶、2000U肝素钠、0.2g酚妥拉明、5g维生素C和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，胎盘剪碎至4cm，酶解液室温酶解0.8h。
所述步骤（4）中，将混合液在7℃温度下、1400r/min转速下离心18min，弃上清，加入DEME培养液，得到细胞悬液。
所述步骤（5）中，依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞12min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置35min，取上层液体离心后弃去上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，得到造血干细胞。
所述步骤（6）中，造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：
二甲基亚砜 12mL
羟乙基淀粉 7g
细胞培养基 5mL
人血清白蛋白 7mL
人自体血浆 70mL。
所述步骤（6）中，细胞重悬液的细胞密度为8×106个/mL；程序降温先以1.5℃/min的降温速度降温至-24℃，再以6℃/min的降温速度降温至-79℃。
实施例3
一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）胎盘预处理：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，对采集的胎盘进行病原微生物检测，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；
（2）胎盘灌洗：用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；
（3）胎盘酶解：将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；
（4）混合离心：将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，将混合液离心后加入DEME培养液混合均匀，得到细胞悬液，将细胞悬液离心后取细胞沉淀；
（5）重悬离心：将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；
（6）细胞冻存：将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-80℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（1）中，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型检测、造血干/祖细胞定性检测。
所述步骤（1）中，清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:1混合制得，浓度为100mg/L。
所述步骤（2）中，所述灌洗液由200mg青霉素-链霉素双抗、0.07g酚妥拉明，60mg赖氨酸、2g维生素C、3mg AMD3100、2支肝素钠注射液（1mL：5mg）、2支硝酸甘油注射液（2mL：12500U）、50mL质量分数为10%的PBS缓冲液和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，酶解液中由0.08g胶原酶Ⅷ、0.08g胰酶、3000U肝素钠、0.3g酚妥拉明、6g维生素C和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，胎盘剪碎至4.5cm，酶解液室温酶解1h。
所述步骤（4）中，将混合液在8℃温度下、1500r/min转速下离心15min，弃上清，加入DEME培养液，得到细胞悬液。
所述步骤（5）中，依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞15min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置40min，取上层液体离心后弃去上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，得到造血干细胞。
所述步骤（6）中，造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：
二甲基亚砜 15mL
羟乙基淀粉 8g
细胞培养基 6mL
人血清白蛋白 8mL
人自体血浆 80mL。
所述步骤（6）中，细胞重悬液的细胞密度为1×107个/mL；程序降温先以1.5℃/min的降温速度降温至-25℃，再以6℃/min的降温速度降温至-80℃。
实施例4
一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）胎盘预处理：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，对采集的胎盘进行病原微生物检测，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；
（2）胎盘灌洗：用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；
（3）胎盘酶解：将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；
（4）混合离心：将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，将混合液离心后加入DEME培养液混合均匀，得到细胞悬液，将细胞悬液离心后取细胞沉淀；
（5）重悬离心：将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；
（6）细胞冻存：将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-81℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（1）中，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型检测、造血干/祖细胞定性检测。
所述步骤（1）中，清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:1.1混合制得，浓度为110mg/L。
所述步骤（2）中，所述灌洗液由250mg青霉素-链霉素双抗、0.08g酚妥拉明，70mg赖氨酸、2.5g维生素C、4mg AMD3100、2支肝素钠注射液（1mL：5mg）、2支硝酸甘油注射液（2mL：12500U）、60mL质量分数为11%的PBS缓冲液和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，酶解液中由0.09g胶原酶Ⅷ、0.09g胰酶、4000U肝素钠、0.4g酚妥拉明、7g维生素C和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，胎盘剪碎至5cm，酶解液室温酶解1.2h。
所述步骤（4）中，将混合液在9℃温度下、1600r/min转速下离心12min，弃上清，加入DEME培养液，得到细胞悬液。
所述步骤（5）中，依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞18min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置45min，取上层液体离心后弃去上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，得到造血干细胞。
所述步骤（6）中，造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：
二甲基亚砜 18mL
羟乙基淀粉 9g
细胞培养基 7mL
人血清白蛋白 9mL
人自体血浆 90mL。
所述步骤（6）中，细胞重悬液的细胞密度为3×107个/mL；程序降温先以1.5℃/min的降温速度降温至-26℃，再以6℃/min的降温速度降温至-81℃。
实施例5
一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）胎盘预处理：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，对采集的胎盘进行病原微生物检测，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；
（2）胎盘灌洗：用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；
（3）胎盘酶解：将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；
（4）混合离心：将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，将混合液离心后加入DEME培养液混合均匀，得到细胞悬液，将细胞悬液离心后取细胞沉淀；
（5）重悬离心：将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；
（6）细胞冻存：将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（1）中，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型检测、造血干/祖细胞定性检测。
所述步骤（1）中，清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:1.2混合制得，浓度为120mg/L。
所述步骤（2）中，所述灌洗液由300mg青霉素-链霉素双抗、0.09g酚妥拉明，80mg赖氨酸、3g维生素C、5mg AMD3100、2支肝素钠注射液（1mL：5mg）、2支硝酸甘油注射液（2mL：12500U）、70mL质量分数为8%-12%的PBS缓冲液和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，酶解液中由0.10g胶原酶Ⅷ、0.10g胰酶、5000U肝素钠、0.5g酚妥拉明、8g维生素C和1L DEME培养液制得。
所述步骤（3）中，胎盘剪碎至6cm，酶解液室温酶解1.5h。
所述步骤（4）中，将混合液在10℃温度下、1800r/min转速下离心10min，弃上清，加入DEME培养液，得到细胞悬液。
所述步骤（5）中，依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞20min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置50min，取上层液体离心后弃去上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，得到造血干细胞。
所述步骤（6）中，造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：
二甲基亚砜 20mL
羟乙基淀粉 10g
细胞培养基 8mL
人血清白蛋白 10mL
人自体血浆 100mL。
所述步骤（6）中，细胞重悬液的细胞密度为5×107个/mL；程序降温先以2℃/min的降温速度降温至-27℃，再以7℃/min的降温速度降温至-82℃。
实施例6
本实施例与上述实施例1的不同之处在于：
所述细胞培养基为X-VIVO15培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1500rpm转速下离心8min，取上层血浆在56℃温度下灭活32min后，转移至新的离心管中，2500rpm转速下离心15min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述造血干细胞冻存液还包括糖类1g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8：1.5：2组成的混合物。
所述造血干细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.2g和维生素C 0.1g。
所述造血干细胞冻存液还包括丙二醇0.2mL和聚乙二醇0.4mL。
所述造血干细胞冻存液还包括重组人白介素4000U。
所述造血干细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3g和勃脉力A 0.8g。
所述造血干细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.1mL和氯化钠0.4g。
实施例7
本实施例与上述实施例2的不同之处在于：
所述细胞培养基为AIM-V培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1600rpm转速下离心7min，取上层血浆在57℃温度下灭活31min后，转移至新的离心管中，2800rpm转速下离心22min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述造血干细胞冻存液还包括糖类1.5g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.9：1.8：2.5组成的混合物。
所述造血干细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.3g和维生素C 0.2g。
所述造血干细胞冻存液还包括丙二醇0.2-0.6mL和聚乙二醇0.4-0.8mL。
所述造血干细胞冻存液还包括重组人白介素5000U。
所述造血干细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.4g和勃脉力A 0.9g。
所述造血干细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.2mL和氯化钠0.5g。
实施例8
本实施例与上述实施例3的不同之处在于：
所述细胞培养基为DMEM/F12培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1800rpm转速下离心6min，取上层血浆在58℃温度下灭活30min后，转移至新的离心管中，3000rpm转速下离心20min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述造血干细胞冻存液还包括糖类2g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1：2：3组成的混合物。
所述造血干细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.4g和维生素C 0.3g。
所述造血干细胞冻存液还包括丙二醇0.4mL和聚乙二醇0.6mL。
所述造血干细胞冻存液还包括重组人白介素6000U。
所述造血干细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.5g和勃脉力A 1g。
所述造血干细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.3mL和氯化钠0.6g。
实施例9
本实施例与上述实施例4的不同之处在于：
所述细胞培养基为RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或GT-T561培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1900rpm转速下离心5min，取上层血浆在59℃温度下灭活29min后，转移至新的离心管中，3200rpm转速下离心18min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述造血干细胞冻存液还包括糖类2.5g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.1：2.2：3.5组成的混合物。
所述造血干细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.4g和维生素C 0.3g。
所述造血干细胞冻存液还包括丙二醇0.4mL和聚乙二醇0.6mL。
所述造血干细胞冻存液还包括重组人白介素6000U。
所述造血干细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3-0.7g和勃脉力A 0.8-1.2g。
所述造血干细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.3mL和氯化钠0.6g。
实施例10
本实施例与上述实施例5的不同之处在于：
所述细胞培养基为Stemspan培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中， 2000rpm转速下离心4min，取上层血浆在60℃温度下灭活28min后，转移至新的离心管中，3500rpm转速下离心15min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述造血干细胞冻存液还包括糖类3g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.2：2.5：4组成的混合物。
所述造血干细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.6g和维生素C 0.5g。
所述造血干细胞冻存液还包括丙二醇0.6mL和聚乙二醇0.8mL。
所述造血干细胞冻存液还包括重组人白介素8000U和肝素钠5000U。
所述造血干细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.7g和勃脉力A 1.2g。
所述造血干细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.5mL和氯化钠0.8g。
将实施例1-5的方法从胎盘中分离提取造血干细胞，经1个月、3个月、6个月、12个月冻存后依次取出复苏，检测造血干细胞存活率，实验结果如下表所示：
从上表可以看出，本发明的方法节省了制备时间，能够有效提高造血干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率；操作方便，效率高，大大缩短的从制备到应用的周期；且造血干细胞损伤小，数量多，纯度高，活性高，可以应用于自体或者异体的造血干细胞的移植，并且有助于受损组织的修复。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）胎盘预处理：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，对采集的胎盘进行病原微生物检测，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；
（2）胎盘灌洗：用灌洗液分别灌洗胎盘脐静脉、脐动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；
（3）胎盘酶解：将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；
（4）混合离心：将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，将混合液离心后加入DEME培养液混合均匀，得到细胞悬液，将细胞悬液离心后取细胞沉淀；
（5）重悬离心：将细胞沉淀经过多次重悬离心处理，获得造血干细胞；
（6）细胞冻存：将造血干细胞等体积加入到造血干细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
2.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型检测、造血干/祖细胞定性检测。
3.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:0.8-1.2混合制得，浓度为80-120mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述灌洗液由100-300mg青霉素-链霉素双抗、0.05-0.09g酚妥拉明，40-80mg赖氨酸、1-3g维生素C、1-5mg AMD3100、2支肝素钠注射液、2支硝酸甘油注射液、30-70mL质量分数为8%-12%的PBS缓冲液和1L DEME培养液制得。
5.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，酶解液中由0.06-0.10g胶原酶Ⅷ、0.06-0.10g胰酶、1000-5000U肝素钠、0.1-0.5g酚妥拉明、4-8g维生素C和1L DEME培养液制得。
6.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，胎盘剪碎至3-6cm，酶解液室温酶解0.5-1.5h。
7.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，将混合液在6-10℃温度下、1200-1800r/min转速下离心10-20min，弃上清，加入DEME培养液，得到细胞悬液。
8.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（5）中，依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞10-20min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置30-50min，取上层液体离心后弃去上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，得到造血干细胞。
9.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（6）中，造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：
二甲基亚砜 10-20mL
羟乙基淀粉 6-10g
细胞培养基 4-8mL
人血清白蛋白 6-10mL
人自体血浆 60-100mL。
10.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（6）中，细胞重悬液的细胞密度为5×106-5×107个/mL；程序降温先以1-2℃/min的降温速度降温至-23～-27℃，再以5-7℃/min的降温速度降温至-78～-82℃。
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