CN109287622A

CN109287622A - 一种骨髓回输治疗伴hiv感染的结直肠癌和失代偿肝硬化合并小肝癌用的组织保存液

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Publication number: CN109287622A
Application number: CN201811425046.2A
Authority: CN
Inventors: 陈真真; 徐念沁
Original assignee: Nanjing Sansheng Biotechnology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Nanjing Sansheng Biotechnology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明公开一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.0‑2.5％w/v泊洛沙姆，1.0‑2.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮，0.2‑1.0％w/v的葡萄糖，15‑40％w/v复方氨基酸注射液，5‑30％w/v丙二醇，10‑40％w/v PBS维生素E 0.1‑1.5％w/v，维生素C 0.1‑1.0％w/v，注射用水溶剂。因冻存液中无DMSO、无蛋白，避免了DMSO回输人体产生的毒性以及血清、蛋白对临床应用安全性产生的疑虑，安全性高。

Description

一种骨髓回输治疗伴HIV感染的结直肠癌和失代偿肝硬化合并小肝癌用的组织保存液

技术领域

本发明涉及骨髓组织低温保存及骨髓移植技术领域，具体涉及一种组织冻存液及其制备方法和临床应用。

背景技术

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，可形成人体各种组织器官，近年来利用干细胞治疗疾病的研究成为热点，干细胞技术是生物治疗的前沿技术，被称之为再生医学。在干细胞治疗技术中，高质量及大规模的干细胞供应是关键也是难题。骨髓是人体的造血组织，位于身体的许多骨骼内，其中含有造血干细胞、间充质干细胞等多种细胞，是干细胞的主要来源之一。早前人们就想到通过输注骨髓组织来达到治疗疾病的目的，即骨髓移植技术。骨髓移植是指将供者的骨髓造血干细胞通过静脉输注给受体(患者)，重建患者正常造血与免疫系统，从而治疗一系列疾病的治疗方法。

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。若肝脏损害进一步加重，超出肝脏的代偿能力，则称为肝硬化失代偿。如果失代偿期肝硬化合并小肝癌，手术切除或介入栓塞治疗都会加重肝脏损伤，可能引起肝衰竭。专家发现对患者进行自体骨髓输注可改善肝硬化，再进行栓塞或射频治疗，可取得良好的疗效。

结肠直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，而HIV感染者因免疫功能本就低下，患恶性肿瘤几率更大。手术切除结合化疗是目前结直肠癌的主要治疗方法。但化疗药物会造成脏器损害和骨髓抑制，对HIV感染者化疗可能会造成更严重的免疫损害。化疗前对结直肠癌患者采集自体骨髓进行保存，化疗后输注自体骨髓，有促进骨髓重建及免疫重建的趋势。

在骨髓移植治疗中，骨髓组织的采集和保存至关重要。一是由于化疗、放疗等治疗手段会对患者的骨髓造成损伤，影响骨髓中细胞的质量及效果，因此在放化疗前先把骨髓组织取出并保存是必要的；二是具有选择性：可以选择在患者生理状态较好的情况下采集骨髓组织，同时对骨髓组织的质量也可以有所控制。保存的骨髓组织可以根据患者的需要及身体状态选择使用的时间和剂量。

为了保证细胞的有效性和一致性，骨髓体外培养进行到一定阶段时，必须进行低温保存，在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。因此，细胞冻存液中需要加入冻存保护剂，

冻存保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。

渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

目前广泛使用的冻存液多含血清和二甲基亚砜(DMSO)成分。血清含有多种成分，不仅可以作为细胞的营养来源，还可以起到调节渗透压，酸碱缓冲，保护细胞膜和细胞完整性的作用；而DMSO作为一种渗透性保护剂，在冻存液中加入它，可使细胞冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前析出细胞外，减少冰晶的形成，减轻细胞损伤。虽然有人尝试多种冻存方案，但目前市售冻存液仍以添加不同比例的血清和/或DMSO效果最好。

血清的使用存在许多弊端，一是由于血清成分复杂，所含的蛋白、因子、激素等成分都是不确定的，会对干细胞的分化造成干扰，如无血清培养的大鼠神经干细胞更多的分化为神经元，而含血清培养的则更多的分化为星形胶质细胞和少突细胞，血清对脐血来源、骨髓来源的干细胞增殖、分化的影响也屡见报导；二是有报道认为干细胞会将血清内吞入胞内，可能会造成干细胞蛋白表达发生变化，引起异源蛋白免疫反应；三是血清含有的因子和激素会改变细胞的黏附性，可能改变了细胞的表面物质表达，影响干细胞的特性；四是本实验室发现，含血清培养的间充质干细胞换用无血清培养基后，培养两代仍能检测到血清残留物，可见血清对干细胞影响很大。加上血清质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。

而研究表明，DMSO存在细胞毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性,具有血管毒性和肝肾毒性，直接回输人体的安全性不好，不利于临床应用。因此为体外高质量保存骨髓组织，并安全有效的应用于临床回输，开展有效的骨髓组织冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种更优更安全的低温保存骨髓组织的方法对于骨髓移植技术的临床研究和应用具有重大意义。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种骨髓组织冻存液，其不含血清和二甲基亚砜(DMSO)成分，又能达到很多的冻存效果。

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.0-2.5％w/v泊洛沙姆，1.0-2.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮，0.2-1.0％w/v的葡萄糖，15-40％w/v复方氨基酸注射液，5-30％ w/v丙二醇，10-40％w/v PBS维生素E 0.1-1.5％w/v，维生素C 0.1-1.0％w/v，注射用水溶剂。

在本发明的冻存液中所述的复方氨基酸注射液含有18种氨基酸，所述的复方氨基酸注射液包括以下组分：丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、缬氨酸、脯氨酸、胱氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、醋酸赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸，各组分质量比为1.6、1.25、0.28、0.80、0.75、0.05、0.49、 0.68、0.88、0.63、0.68、0.75、0.60、0.85、1.28、0.77、0.05和0.20。

在本发明的冻存液中，该保存液中所有原料均为药用级别，符合临床应用标准。

本发明还提供了一种骨髓组织冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。

本发明还提供了一种骨髓组织冻存方法，包括以下步骤：

1)冻存液制备：制备所述的细胞冻存液，首称取所需量的泊洛沙姆缓慢加入注射用水中，边加边搅拌，使其完全溶解；然后加入所需量的聚乙烯吡咯烷酮，同样边加边搅拌，使其完全溶解；将剩余组分葡萄糖、复方氨基酸注射液、丙二醇、PBS、维生素 E、维生素C，按照相应的比例加入，混合摇匀，用注射用水定容即可获得。

2)骨髓组织采集与冷冻保存：局部麻醉后在患者髂前上棘穿刺，用特制的多孔骨髓采集器采集患者骨髓40ml，将骨髓注入含有50ml骨髓组织冻存液的塑料袋中，放置-80℃冰箱中保存；若骨髓组织冻存液为冷冻状态(0至-80℃)，需提前24小时取出至2～8℃水浴箱中回温，并充分摇匀后使用。

3)骨髓组织复苏：取出低温保存的骨髓组织，放置在37℃恒温水浴箱中，手持骨髓保存袋轻轻摇动，直至骨髓组织完全解冻(解冻后骨髓组织可直接回输)。

有益效果：

(1)本发明的骨髓组织冻存液无DMSO，成分泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇具有保护细胞膜，减少细胞冻存过程中冰晶形成的作用，此三种成分按照一定比例混合使用，可以起到冻存液中渗透和非渗透的作用，效果可以媲美DMSO，还可避免DMSO回输人体产生的毒性，安全性高；

(2)维生素C、维生素E具有抗氧化的作用，也可抵御外来伤害对细胞的损伤，延长细胞的活性；

(3)氨基酸混合物可以提供细胞增殖代谢需要的营养物质，提高细胞复苏后活力，替代常规冻存液中血清的作用，避免了血清、蛋白对临床应用安全性产生的疑虑；

(4)本发明的骨髓组织冻存液复苏细胞存活率可达95％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有显著提高；

(5)本发明的骨髓组织冻存液可以长期低温保存骨髓组织，保持造血干细胞、间充质干细胞等细胞活性；

(6)本发明骨髓组织冻存液使用操作简单可行，可实际解决骨髓组织临床回输过程中的保存难题，具有较好的实用价值。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.0％w/v泊洛沙姆，1.0％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.2％w/v的葡萄糖，20％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇，10％ w/vPBS，0.5％w/v维生素E，0.1％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例2

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.5％w/v泊洛沙姆，1.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.5％w/v的葡萄糖，30％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇，10％ w/vPBS，0.5％w/v维生素E，0.5％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例3

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：2.0％w/v泊洛沙姆，2.0％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，1.0％w/v的葡萄糖，40％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇，10％ w/vPBS，0.5％w/v维生素E，0.5％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例4

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.5％w/v泊洛沙姆，1.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.5％w/v的葡萄糖，30％w/v复方氨基酸注射液，20％w/v丙二醇，20％ w/vPBS，0.5％w/v维生素E，0.5％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例5

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.5％w/v泊洛沙姆，1.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.5％w/v的葡萄糖，30％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇，20％ w/vPBS，1.0％w/v维生素E，0.25％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例6

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.5％w/v泊洛沙姆，1.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.5％w/v的葡萄糖，35％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇，20％ w/vPBS，1.0％w/v维生素E，0.35％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例7

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.5％w/v泊洛沙姆，1.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.1％w/v的葡萄糖，35％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇，20％ w/vPBS，1.0％w/v维生素E，0.35％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例8

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.5％w/v泊洛沙姆，1.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.2％w/v的葡萄糖，35％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇， 30％w/vPBS，1％w/v维生素E，0.35％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例9

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.5％w/v泊洛沙姆，1.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30，0.2％w/v的葡萄糖，35％w/v复方氨基酸注射液，10％w/v丙二醇，40％ w/vPBS，1％w/v维生素E，0.35％w/v维生素C,注射用水溶剂。

实施例10

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1％w/v泊洛沙姆，1％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30；0.2％w/v的葡萄糖，15％w/v复方氨基酸注射液；5％w/v丙二醇，10％w/v PBS，0.1％w/v维生素E；0.1％维生素C，注射用水溶剂。

实施例11

一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：2.5％w/v泊洛沙姆，2.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮K30；1％w/v的葡萄糖，40％w/v复方氨基酸注射液；30％w/v丙二醇，40％w/v PBS，1.5％w/v维生素E，1％维生素C，注射用水溶剂。

比较例

比较例冻存液，包括体积含量为10％DMSO(Mylan)和90％胎牛血清(hyclone)。

冻存液制备：制备所述的细胞冻存液，首称取所需量的泊洛沙姆缓慢加入注射用水中，边加边搅拌，使其完全溶解；然后加入所需量的聚乙烯吡咯烷酮，同样边加边搅拌，使其完全溶解；将剩余组分葡萄糖、复方氨基酸注射液、丙二醇、PBS、维生素E、维生素C，按照相应的比例加入，混合摇匀，用注射用水定容即可获得。

比较例冻存液的制备：将DMSO(Mylan)和胎牛血清(hyclone)按照体积比1:9，充分混合即可获得。

以上实施例1-11及比较例冻存液，分别按照下述方法对造血干细胞和间充质干细胞进行细胞冻存和复苏实验。

1)保存造血干细胞冻存及复苏

准备：将制备好的造血干细胞悬液与实施例1-11和比较例冻存液以体积份1:1比例分别混合，分装入无菌的冻存管中，1mL/管，每组3管。

冷冻:将冻存管放入程序降温盒中，放入-80℃冰箱中冻存。

复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，轻轻震荡直至悬液完全融化。

2)保存间充质干细胞冻存及复苏

准备：将培养成单层、汇合度约80％的人脐带间充质干细胞弃掉上清，加入生理盐水清洗细胞表面2次。加入0.25％胰蛋白酶液消化约3分钟，弃胰酶液，加入DMEM-F12 完全培养液终止消化，收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，分别加入实施例 1-11和比较例所制备的冻存液，重悬混均，以细胞浓度5×10⁶/管，置入无菌的冻存管内，每组3管。

冷冻:将冻存管放入程序降温盒中，再放入-80℃冰箱中冻存。

实施例1-11冻存液的效果验证(一)

将上述复苏的冻存液，用5倍体积生理盐水稀释，1000r/min离心5min，离心去除上清液，再重复3次，计算细胞存活率，细胞活率(％)如下表：

实施例2、6、9冻存液的效果验证(二)

选取实施例2、6、9和比较例冻存6个月的造血干细胞进行CFU-GM(1×10⁵cell) 检测，结果显示实施例集落数均大于53，而比较例小于50。说明实施例所保存的造血干细胞增殖能力大于比较例。

选取实施例2、6、9和比较例冻存6个月的间充质干细胞进行培养，其中所述的细胞能够正常进行增殖，实施例流式检测显示CD29，CD44，CD105都是强表达，在98％以上，而比较例流式检测显示为96.5％，说明间充质细胞未分化性保持比比较例的效果好。

实施例9冻存液的效果验证(三)

骨髓组织冻存液在临床上自体骨髓回输治疗伴HIV感染的结直肠癌和失代偿肝硬化合并小肝癌中的应用。

1)骨髓组织采集与冷冻保存：局部麻醉后在患者髂前上棘穿刺，用特制的多孔骨髓采集器采集患者骨髓40ml，将骨髓注入含有50ml实施例9骨髓组织冻存液的塑料袋中，放置-80℃冰箱中保存；

2)骨髓组织复苏：取出低温保存的骨髓组织，放置在37℃恒温水浴箱中，手持骨髓保存袋轻轻摇动，直至骨髓组织完全解冻。

3)回输：在患者化疗后3天，回输复苏的骨髓组织。

临床治疗效果显示：自体骨髓回输后可使失代偿期肝硬化逐步逆转，促进肝脏重建。在9例HIV感染合并结直肠癌患者治疗中未发生任何不良事件，且对促进白细胞数量的增加效果显著，有促进化疗后骨髓重建和免疫重建的趋势。

Claims

1.一种骨髓组织冻存液，包括以下组分及浓度：1.0-2.5％w/v泊洛沙姆，1.0-2.5％w/v聚乙烯吡咯烷酮，0.2-1.0％w/v的葡萄糖，15-40％w/v复方氨基酸注射液，5-30％w/v丙二醇，10-40％w/v PBS维生素E 0.1-1.5％w/v，维生素C 0.1-1.0％w/v，注射用水溶剂。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓组织冻存液，其特征在于，所述的复方氨基酸注射液含有18种氨基酸。

3.根据权利要求2所述的一种骨髓组织冻存液，其特征在于，所述的复方氨基酸注射液包括以下组分：丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、缬氨酸、脯氨酸、胱氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、醋酸赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸，各组分质量比为1.6、1.25、0.28、0.80、0.75、0.05、0.49、0.68、0.88、0.63、0.68、0.75、0.60、0.85、1.28、0.77、0.05和0.20。

4.权利要求1所述的一种骨髓组织冻存液在冻存骨髓组织中的应用。

5.权利要求3所述的一种骨髓组织冻存液在临床上自体骨髓回输治疗伴HIV感染的结直肠癌和失代偿肝硬化合并小肝癌中的应用。

6.一种骨髓组织冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)冻存液制备：将冻存液各组分按相应的比例混合摇匀，定容；

2)冷冻保存：将骨髓组织与骨髓组织冻存液以体积比4:5混合置于塑料袋，放置-80℃冰箱中保存；

3)复苏：取出低温保存的塑料袋，放置在37℃恒温水浴箱中，手持骨髓保存袋轻轻摇动，直至完全解冻。

7.根据权利要求6所述的一种骨髓组织冻存方法，其特征在于，所述步骤1)中冻存液制备过程为：将泊洛沙姆缓慢加入注射用水中，边加边搅拌，使其完全溶解；然后加入聚乙烯吡咯烷酮，同样边加边搅拌，使其完全溶解；将剩余组分葡萄糖、复方氨基酸注射液、丙二醇、PBS、维生素E、维生素C，按照相应的比例依次加入，混合摇匀，用注射用水定容即可获得。

8.根据权利要求6所述的一种骨髓组织冻存方法，其特征在于，所述步骤3)复苏过程中，骨髓组织冻存液为冷冻状态，需提前24小时取出至2～8℃水浴箱中回温，并充分摇匀后使用。