JP3165863B2 - 凍結保存溶液 - Google Patents

凍結保存溶液

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JP3165863B2 JP52705396A JP52705396A JP3165863B2 JP 3165863 B2 JP3165863 B2 JP 3165863B2 JP 52705396 A JP52705396 A JP 52705396A JP 52705396 A JP52705396 A JP 52705396A JP 3165863 B2 JP3165863 B2 JP 3165863B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は凍結保存溶液に関する。更に特定すると、本
発明は血液中に又は造血幹細胞又は前駆（progenitor）
細胞のような骨髄中に見出されるいろいろの型の細胞を
凍結保存するために使用されるのに特に適している凍結
保存溶液に関する。
本発明は又細胞を凍結保存する方法又は凍結保存した
細胞を回収する方法にも関する。
本発明の背景 血液 血液中を循環する形態学的に認識でき、機能的に作用
できる細胞は、赤血球、好中球、好酸球及び好塩基球、
Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球
及び血小板を包含する。これらの成熟細胞は、必要に応
じて、赤血球系のための赤血芽球、顆粒系のための骨髄
芽球、前骨髄球と骨髄球、及び血小板のための巨核球の
ような各々の系列のための形態学的に認識可能な分化す
る前駆細胞から派生するか又はそれらにより置換され
る。
造血幹細胞と前駆細胞 二つの主要な亜群；前駆細胞は、幹細胞と前駆細胞に
簡単に分離できる、より原始的細胞から分化する。幹細
胞と前駆細胞の定義は、作用的であり、形態学的な範疇
に依存するよりむしろ機能的な範疇に依存する。幹細胞
は広範な自己更新的又は自己保存的な能力を持つ。ある
種の幹細胞は必要上分化するが、ある種の幹細胞又はそ
れらの娘細胞は他の種類の幹細胞を生産してこれら細胞
の貴重なプールを維持する。斯くしてそれら自身の種を
維持するのに加えて、多能的幹細胞は更に限定された能
力又は自己更新能力のない前駆細胞の幾つかの亜群に分
化できる。これらの前駆細胞は最終的には、形態学的に
認識できる前駆細胞に立ち上がる。前駆細胞は骨髄系の
分化経路の一つ又は二つ以上に沿って増殖又は分化する
ことができる。
幹細胞と前駆細胞は骨髄、脾臓と血液内の核化した細
胞の非常に僅かの％になる。これらの細胞は、成人血液
にはさらに少なく存在するにも係わらず骨髄に対比して
約10分の１が脾臓に存在する。例えば、1000個の核化し
た骨髄細胞中の約１個が前駆細胞であり；幹細胞はより
低い頻度で存在する。
造血系の再構成は、骨髄移植により実施されてきた。
ローレンツとその協同研究者は、マウスが致死的照射に
対して骨髄の静脈注射により防護されることを示した
（Lorenz,20E.,et al.,1951,J.Natl.Cancer Inst.12:
197−201）。その後の研究は、その防護は、注入細胞に
よるレシピエントの骨髄の転移増殖によるものであるこ
とが示された（Lindsley,D.L.,et al.,1955,Proc.Soc.
Exp.Biol.Med.90:512−515;Nowell,P.C.,et al.,1956,
Cancer Res.16:258−261;Mitchison,N.A.,1956,Br.J.E
xp.Pathol.37:239−247;Thomas,E.D.,et al.,1957,N.E
ngl.J.Med.257−491−496）。かくして、供与された骨
髄中の幹細胞と前駆細胞は防護免疫、組織修復、凝固及
び他の血液の機能に関与する血液細胞を増殖しそして交
換することができる。成功した骨髄移植例では、血液、
骨髄、脾臓、胸腺と免疫に関する他の器官はドナーから
供給される細胞により元通りになる。
下記のような或る型の貧血症と症状を含むいろいろの
致死的又は重大な症状を治療するのに骨髄は使用されて
成功例が増加している；形成不全貧血症（Thomas,E.D.,
et al.,Feb.5,1972,Lancet,pp.284−289）,Fanconi's
anemia（Gluckman,E.,et al.,1980,Brit J.Haemato
l.45:557−564;Gluckman,E.,et.al.,1983,Brit J.Haem
atol.54:431−440;Gluckman,E.,et al.,1984,Seminars
in Hematology:21（１）:20−26），免疫不全（Goo
d,R.A.,et al.,1985,Cellular Immunol.82:36−5
4），リンパ種又は白血病のようなガン（Cahn,J.Y.,et
al.,1986,Brit.J.Haematol.63:457−470;Blume,K.J.a
nd Forman S.J.,1982,J.Cell.Physiol.Supp.1:99−10
2;Cheever,M.A.,et al.,1982,N.Engl.J.Med.307
（８）:479−481），癌腫（Blijhan,G.,et al.,1981,E
ur.J.Cancer 17（４）:433−441），いろいろの固形腫
瘍（Ekert,H.,et al.,1982,Cancer 49:603−609;Spit
zer,G.,et al.,1980,Cancer 45:3075−3085）及び造
血の遺伝的欠陥。
骨髄移植は、近年下記の症状にも適用されて来てい
る：遺伝性貯蔵症（Hobbs,J.R.,Lancet 2:735−73
9），サラセミアメジャー（Thoma,E.D.,et al.,1982,L
ancet 2:227−229），鎌状赤血球（Johson,F.J.,et a
l.,1984,N.Engl.J.Med.311:780−783）及び骨石化症（C
ossia,P.F.,et al.,1980,N.Engl.J.Med.302:701−70
8）（一般議論については、Storb,R.and Thomas,E.D.,
1983,Immunol.Rev.71:77−102:O'Reilly,R.,et al.,19
84,Sem.Hematol.21（３）:188−221;1969,Bone−Marrow
Conservation,Culture and Transplantion,Proceed
ings of ａ Panel,Moscow,July 22−26,1968,Inter
national Atomic Energy Agency,Vienna;McGlave,P.
B.,et al.,1985,in Recent Advances in Heamatol
ogy.Hoffbrand,A.V.,ed.,Churchill Livingstone,Lond
on,pp.171−197を参照）。
現在骨髄移植の利用は、厳密に制限されている；とい
うのは完全に合致している（遺伝的に同一）ドナーを得
ることは、同じ双子である場合又は緩和すべき患者の骨
髄細胞が生存した凍結状態で入手できる場合を除き、非
常に稀であるからである。そのような自系的なシステム
においてすら悪性細胞による検出できない汚染による危
険、そして患者を骨髄獲得を実施するのに十分に健康に
することの必要性が深刻な制限を招いている。そのよう
な自系的な場合を除くと、ある程度の回避できない非適
合が存在し、それが重大なそしてある場合には致死的な
合併症の危険を残す。このような合併症は二重にある。
第一に、患者は通常は、外来の骨髄細胞の免疫拒否（移
植片対宿主症候）を回避するために、予め免疫学的に不
能にされる。第二番目に、供与された骨髄細胞が生着し
た時、それらは患者を外敵として認識して攻撃し得るか
らである。非常に近い家族ドナーの場合ですら、部分的
ミスマッチの合併症は実質的な死亡の原因になりそして
遺伝的に異なる個人からの骨髄移植は病的状態の直接的
な原因になっている。
末梢血液も造血再構成のための幹細胞源として研究さ
れてきている（Nothdurtt,W.,et al.,1977,Scand.J.Ha
ematol.19:470−471;Sarpel,S.C.,et al.,1976,Exp.Ha
ematol.7:113−120;Ragharachar,A.,et al.,1983,J.Ce
ll.Biochem.Suppl.7A:78;Juttner,C.A.,et al.,1985,B
rit.J.Haematol.61:739−745;Abrams,R.A.,et al.,J.C
ell.Biochem.Suppl.7A:53,Prummer,o.,et al.,1985,Ex
p.Heamtol.13:891−898）．或る研究では、下記の病気
の患者のために将来有望な結果が得られている：いろい
ろの白血病（Reiffers,J.,et al.,1986,Exp.Hematol.1
4:312−315（凍結保存した細胞を使用する）;Goldman,
J.M.,et al.,1980,Br.J.Haematol.45:223−231;Tilly
et al.,Jul.19,1986,The Lancet.pp.154−155;To,
L.B.and Juttner,C.A.,1987,Brit.J.Haematol.66:285
−288とその中の引用文献も参照）；リンパ腫（Korblin
g,M.,et al.,1986,Blood 67:529−532）。ある種の癌
患者に観察されるように、自系の末梢成人血液の造血系
を再構成する能力は、強い化学療法及び／又は照射によ
る細胞減少の後に生成される末梢血液中の更に多数の循
環前駆細胞に伴うことが暗示されている（リバウンド現
象）（To,L.B.and Juttner,C.A.,1987,Annot.,Brit.J.
Haematol.66:285−288;Brit.J.Haematol.67:252−0253
とそれに引用されている文献を参照）。末梢血液を使用
する他の研究は再構成を実験できなかった（Hershko,
C.,et al.,1979,The Lancent 1:945−947;Ochs,H.
D.,et al.,1981,Pediatr.Res.15（４ Part ２）:60
1）。
下記の細胞移植を造血再構成のための幹細胞源として
使用する研究が成されている：胎児肝細胞移植（Cain,
G.R.,et al.,1986,Transplantation 41（１）:32−3
5;Ochs,H.D.,et al.,1981,Pediatr.Res.15（４ part
２）:601;Paige,C.J.,et al.,1981,J.Exp.Med.153:1
54−165;Touraine,J.L.,1980,Excerpta Med.514:277;T
ouraine,J.L.,1983,Birth Defects 19:139;Good,R.
A.,et al.,1983,Cellular Immunol.82:44−45とその
中で引用されている参考文献も参照）；又は新生児の脾
臓細胞の移植（Yunis,E.J.,et al.,1974,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.72:4100）。
新生児の胸腺細胞も造血再構成実験で移植されている
（Vickery,A.C.,et al.,1983,J.Parasitol 69（３）:
478−485;Hirokawa,K.,et al.,1982,Clin.Immunol.Imm
unopathol.22:297−304）。
凍結保存溶液と技術 凍結は、血液細胞のような生存細胞をそのドナー生体
から取り出し又は分離した後、保存するために長い間使
用されてきた。とはいうものの、生存細胞の凍結保存と
回収又は非常に厄介なものであることが判明している。
細胞は、凍結保存の間に含まれる凍結と解凍の間の周期
の間の比較的苛酷な条件に曝され、その結果生き残りの
率が低い。
凍結は殆どの生存細胞に破壊的である。外側の媒体が
凍結するに従って、細胞は平行を維持しようとして水分
を喪失し、かくして細胞内凍結が約−10〜−15℃で起き
るまでに、細胞内溶質濃度が増加する。細胞内凍結と溶
液効果は細胞損傷の原因であると一般に信じられてい
る。例えば、細胞外にある氷が原因の凍結破壊は、実質
的には、細胞の浸透脱水により起こるプラズマ膜（plas
ma membrane）損傷であると提案されている。
解凍した細胞の生存率を最大にするための時間と努力
が費やされた。そのような努力は主に凍結保護剤の開発
と最適冷却速度の確率に集中された。
溶質添加による凍結保存は二つの潜在機構によると考
えられている；（ｉ）細胞内；細胞内で形成される氷の
量を減らす；及び／又は（ii）細胞外；細胞を囲む溶質
内の氷の形成が原因になる減少した蒸気圧に応答する細
胞からでる水流を減少する。
いろいろの最適の冷却速度がいろいろの細胞について
記載されている。いいろいろの研究グループが、凍結し
た骨髄細胞と赤血球の生き残り又は移植効率について注
目してきている（Lovelock,J.E.,and Bishop,M.W.H.,1
959,Nature 183:1394−1395;Ashwood−Smith,M.J.,196
1,Nature 190:1204−1205;Rowe,A.W.and Rinfret,A.
P.,1962,Blood 20:636;Rowe,A.W.and Fellig,J.,196
2,Fed Proc.21:157;Rowe,A.W.,1966,Cryobiology ５
（１）:12−18;Lewis,J.P.,et al.,1967,Transfusion
７（１）;17−32;Rapaz,G.,et al.,1968,Cryobiolog
y ５（１）:18−25;Mazur,p.,1970,Science 168:939
−949;Mazur,P.,1977,Cryobiology 14:251−272;Rowe,
A.W.,and Lenny,L.L.,1983,Cryobiology 20:717;Stif
f,P.J.,et al.,1983,Cryobiology 20:17−24;Gorin,
N.C.,1986,Clinics in Haematology 15（１）:19−4
8）。概して、造血幹細胞と前駆細胞のための最適の結
果は最終貯蔵温度が−70ないし約−196℃の場合、分当
り約１−２℃の冷却速度であり、他の血液細胞に就いて
も概してこれらと同じ温度範囲内である。
液体窒素中での長期貯蔵後のヒト骨髄細胞の成功裏の
回収が記載されている（1983,American Type Culture
Collection,Quarterly Newslettter ３（４）:
1）。更に、骨髄中に幹細胞は凍結保存と解凍に耐え得
ることが示されている（Fabian,I.,et al.,1982,Exp.H
ematol,10（１）:119−122）。
全血、臍帯の血液、骨髄、顆粒球、好中球、血小板及
び造血幹細胞と前駆細胞を含む殆どの細胞の凍結保存に
使用するための広く容認されている工業的標準凍結剤は
ジメチルスルホキシド（DMSO）である。これは、DMSOを
ベースとする凍結保存溶液の広範囲の経験と知識とDMSO
が優れた保護力と最大の細胞生存性を付与するという認
識に概して依ることができる。DMSOがこれらの目的のた
めに概して効果的であるというもの、DMSOが特に高い濃
度では生理学的に有毒でありそしてそれにより、凍結保
存工程に関与した人々と凍結保存された細胞が注入され
た患者の両方を刺戟する傾向がある結果、高血圧、嘔吐
と悪心を起こすことも知られている。DMSOの有害な性質
は、凍結保存した細胞のin vitroでの生存率を低下す
る結果にもなると考えられてもいる。
従って、in vitroとin vitroの両方の細胞の生存性
を対比できるレベルまであげることのできる、簡単な、
生理学的に適合できる、別の凍結保存溶液に対する大き
い需要がある。
発明の概要 本発明者は、簡単な、経費の低い、生理学的に適合で
きる凍結保存溶液であって、（ｉ）グリセリン、（ii）
アルカリ金属塩化物、（iii）単糖類及び（iv）血漿ア
ルブミンの無毒な成分を含有する凍結保存溶液を開発し
た。
凍結保存溶液の主要な成分は、凍結保存性のグリセリ
ン（グリセロールともいう）である。アルカリ金属塩化
物は凍結−解凍周期を通じて細胞生存度を高める。単糖
類は細胞のための炭素栄養源として機能する。血漿アル
ブミンは、凍結細胞の凍結−解凍周期と貯蔵の間、細胞
膜を保護することができるように、標的細胞の膜の周辺
の被膜を提供するためのタンパク質として機能する。血
漿アルブミンは、標的細胞例えば上述の赤血球、好中
球、好酸顆粒球及び好塩基顆粒球、Ｂリンパ球、Ｔリン
パ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球及び血小板のような
細胞の生存性に悪影響を与えることで知られている酸素
遊離ラジカルのスカベンジャーとして機能するとも信じ
られている。血漿アルブミン源は、好ましくは、保護さ
れる標的細胞が導入されるだろうと意図される対象の種
と合致している。
凍結保存溶液は、濃厚型の又は十分に希釈された形態
のどちらかで供給されてもよい。濃厚型は、使用強度
に、単に注射のために適切に処理される水のような希釈
剤を溶液に添加することにより希釈されてよい。希釈剤
は、好ましくは、生理食塩水のように生理学的にバラン
スがとれている塩溶液である。
標的細胞、例えばCD34＋細胞として同定される細胞を
包含する、全血、臍帯の血液、骨髄、顆粒球、好中球、
血小板及び造血幹細胞と前駆細胞のような細胞の保存と
その後の医療的使用における凍結保存溶液の使用は、下
記のステップを含む：（ｉ）必要に応じて濃厚凍結保存
溶液を希釈する、（ii）標的細胞を希釈した溶液に導入
する、（iii）保護した標的細胞の凍結、（iv）凍結し
た溶液の環境条件への解凍及び（ｖ）解凍した標的細胞
の、そのような標的細胞を必要とする対象への導入。解
凍した細胞と同伴する凍結保存溶液は対象に導入される
前に好ましくは体温（即ち約37℃）に温められる。凍結
保存溶液の生理学的適合性は、解凍された標的細胞が標
的細胞と凍結保存溶液とを分離しないで対象中へ導入さ
れるようにする。
最良の実施形態を含む本発明の詳細な説明 本発明者は、簡単な、経費の低い、生理学的に適合で
きる凍結保存溶液であって、（ｉ）グリセリン、（ii）
アルカリ金属塩化物、（iii）単糖類及び（iv）血漿ア
ルブミンの無毒な成分からなる凍結保存溶液を開発し
た。
請求の範囲を除く明細書で使用され、凍結保存溶液と
の関係で使用される場合の「重量％」は、他に記述の無
い限り濃厚凍結保存溶液の全重量を基準にしている。
グリセリン（C3H8O3）は、アメリカ合衆国で市販され
ている、J.T.Bakerを含む多数の供給者からの食品のグ
レードのポリオールである。
濃厚凍結保存溶液は約60ないし約80重量％のグリセリ
ンを含有する。約60重量％より低いグリセリン濃度は細
胞生存率を下げ、他方約80重量％より多いグリセリンを
含有する溶液は受容できない高い重量オスモル濃度（os
molality）（即ち約2,000mOsm/kgより大きい）を持つ溶
液になる。
本発明の使用に適しているアルカリ金属塩化物は、塩
化ナトリウムと塩化カリウムを包含する。アルカリ金属
塩化物は凍結保存溶液の重量オスモル濃度を約500と2,0
00mOsm/kgの間に調節することにより凍結−解凍周期を
通しての細胞生存率を高めると信じられる（上記の重量
オスモル濃度はウエスコーア5500型蒸気圧浸透圧計（We
scor5500Model Vapor Pressure Omsometer）を、こ
の機器のための指導／サービス・マニュアルに記載され
ている指針に従って、使用して測定した。）。参照によ
ると、血液の生理浸透圧は概して約260と320mOsm/kgの
間にある。この一般的範囲内の最適重量オスモル濃度
は、特定の標的細胞、凍結保存溶液の特定組成と凍結−
解凍速度を含む幾つかの要因に依存する。例えば、約70
0と約1,700の間の重量オスモル濃度は概して造血幹細胞
と前駆細胞の凍結保存のために通常要求される。
濃厚凍結保存溶液は約５重量％ないし約10重量％のア
ルカリ金属塩化物を含有する。約５重量％よりすくない
アルカリ金属塩化物と約10重量％より多いアルカリ金属
塩化物濃度は、凍結−解凍周期の間の細胞生存度を下げ
そして約10重量％より多いアルカリ金属塩化物濃度は、
損傷を与える結晶化を受ける。
グルコースのような単糖類は、細胞のための炭素栄養
源として機能する。単糖類が利用できることは、凍結細
胞の凍結−解凍と貯蔵の保存を、細胞内の十分な栄養の
存在を保証することにより促進する。
血漿アルブミンは、凍結細胞の凍結−解凍周期と貯蔵
の間、細胞膜を保護することができるように、標的細胞
の膜の周辺の被膜を提供するためのタンパク質として機
能する。血漿アルブミンは、標的細胞例えば上述の赤血
球、好中球、好酸顆粒球及び好塩基顆粒球、Ｂリンパ
球、Ｔリンパ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球及び血小
板のような細胞の生存性に悪影響を与えることで知られ
ている酸素遊離ラジカルのスカンベンジャーとして機能
するとも信じられている。血漿アルブミン源は、好まし
くは、保護される標的細胞が導入されるだろう意図され
る対象の種と合致している。
有効濃度は、濃厚凍結保存溶液に約0.2ないし約１重
量％の単糖類を配合することにより達成される。約0.2
重量％より少ない添加は、不十分な濃度となり凍結−解
凍周期の間の細胞生存度を下げるが、他方約１重量％よ
り多い濃度は細胞の生存度を濃度に比例して上げるもの
ではなく他の成分の濃度に悪影響を与える。
血漿アルブミンは、凍結細胞の凍結−解凍周期と貯蔵
の間、細胞膜を保護することができるように、標的細胞
の膜の周辺の被膜を提供するためのタンパク質として機
能する。
有効濃度は、約20ないし30重量％の血漿アルブミンき
配合により達成され得る。約20重量％より低いアルブミ
ン濃度は不十分な濃度となるが、他方約30重量％より高
い濃度は細胞生存度を比例的には上げることにはならず
溶液の重量オスモル濃度を約2,000mOsm/kgの所望上限よ
り上の重量オスモル濃度に増やす傾向がある。
濃厚凍結保存溶液は適当な希釈剤（例えば限外ろ過し
た水からの0.9％食塩水、注射用水及び自系血漿）の、
濃厚凍結保存溶液１部に対して約１ないし10部、典型的
には１ないし２部の率での添加により、使用濃度まで希
釈され得る。概して、希釈した凍結保存溶液は実質的に
は、希釈した凍結保存溶液に基づいて、（ｉ）約20ない
し40重量％のグリセリン、（ii）約1.5ないし約５重量
％のアルカリ金属塩化物、（iii）約0.1ないし約0.5重
量％の単糖類及び（iv）約６ないし約15重量％の血漿ア
ルブミンである。残部は希釈剤である。
凍結保存溶液は、約７と7.5の間のpHになるように調
節されるべきである。
標的細胞を、希釈した凍結保存溶液を使用して単に
（ｉ）標的細胞を希釈した凍結保存溶液に導入しそして
（ii）保護された標的細胞を凍結又は凍結保存すること
により、好都合に凍結保存してもよい。標的細胞に添加
されなければならない希釈した凍結保存溶液の体積は、
標的細胞を含む溶液の凍結保存溶液に対する体積比率と
標的細胞の凍結保存溶液に対する体積比率の両方に依存
する。標的細胞を含む溶液の凍結保存溶液に対する体積
比率は概して約1:1ないし1:10の間であるべきであり、
標的細胞の凍結保存溶液に対する比率は約１×105細胞/
mlないし約１×109/ml、好ましくは概して約２×108細
胞/mlないし３×108細胞/mlの間の比率である。上述よ
り大きい比率は、不十分な凍結保存溶液による生存細胞
の通乗の減少になる傾向があり、他方上述より小さい比
率は単に凍結保存溶液の非効率な使用を招きそして標的
細胞の有効量を導入するために対象に過剰の凍結保存溶
液を導入する必要があるのみである。
標的細胞では、頻繁に、生理学的液体中の組成として
の希釈型でのみ保存のために入手できる（例えば末梢血
液から濃縮された幹細胞は、血漿と血小板のような他の
成分を含有する残部（balance）を使用して普通は約１
×106細胞/mlないし約３×108細胞/mlの濃度で幹細胞を
含有する。）。これらの生理学的に希釈した試料は、標
的細胞の凍結保存溶液に対する最適比率を実現するため
には、概して約2:1ないし1:4の体積比（凍結保存溶液の
特定製剤、生理学的に希釈した試料中の標的細胞の濃
度、標的細胞の型等を含む幾つかの要因に勿論依存す
る）で凍結保存溶液と配合されなければならない。最後
の標的細胞を含む溶液は概して約４ないし12重量％のグ
リセリンと約２ないし10重量％のアルブミン（これらの
一般的範囲外の変法も或る種の適用には考慮される）を
含有する。
凍結保存により保護された標的細胞は、対象中への標
的細胞の導入に先立って解凍されなければならない。凍
結保存溶液の生理学的適合性により、解凍された標的細
胞は標的細胞と凍結保存溶液を分割しないで対象中に導
入させることができる。解凍した標的細胞は、細胞生存
性の認識できる程度の損失なしに室温に数時間置くこと
ができる。解凍した溶液を生理食塩水又は他の適当なイ
オン性溶液で薄めて、重量オスモル濃度の急激な変化が
原因になる細胞膜への衝撃を減少できる程度に所望の凍
結保存範囲:500ないし2,000mOsm/kgから260ないし320mO
sm/kgへ溶液の重量オスモル濃度を低下させる。
制御された遅い冷却速度は、最適の細胞生存度を実現
するのにしばしば有効であり得る。異なる細胞型は異な
る最適冷却速度を持つことは一般に信じられている
（（骨髄幹細胞の生存度とそれらの移植潜在力に与える
冷却速度の影響について）参照：例えば、Rowe,A.W.and
Rinfret,A.P.,1962,Blood 20:636;Rowe,A.W.,1966,C
ryoBiology ３（１）:12−18,Lewis,J.P.,et al.,196
7,tranfusion ７（１）:17−32;及びMazur,P.,1970 S
cience 168:939−949）。
凍結保存溶液は使用前に室温に維持することができそ
して混和した標的細胞は凍結を開始する前に30分間は細
胞生存度の認識できる喪失なしに室温に保つことができ
る。これは毒性のある凍結保護剤DMSOを使用する場合と
は対照的であり、その場合はDMSOを標的細胞の添加前に
凍結工程を容易にするために約４℃に冷却しなければな
らずそしてDMSOの存在により誘導される細胞死を最小に
するため、DMSOを添加した直後凍結工程を開始すること
を要求される。
制御冷却はプログラム化できる凍結装置の使用により
実施できる。プログラム化できる凍結装置は最適の冷却
速度を決定しそして標準的再現性冷却を容易にする。
細胞を保持する容器は凍結温度において安定でなけれ
ばならずそして凍結と解凍の両方の効果的制御のための
迅速な熱伝導をしなければならない。密封プラスチック
製小ビン（例えば、Nunc and Wheaton cryules）又
はガラスアンプルは多数の少量（１ないし2ml）のため
に使用できるが、100ないし200mlの大容量はFenwalから
得られるような金属板の間に支持したポリオレフィンバ
ック中で凍結できる。
次いで凍結した細胞した細胞は長期凍結貯蔵容器に移
される。好ましい実施態様では、試料は液化窒素（−19
6℃）又は液体窒素蒸気（−105℃）中に凍結的に貯蔵さ
れる。そのような貯蔵は高効率液体窒息凍結機の購入が
可能であることにより多いに容易になる。
必要とする場合は、凍結した細胞は好ましくは急速に
解凍されそして使用されるまで約37℃で維持される。
凍結保護溶液は生理学的に適合性であるので、対象へ
の導入に先立って除く必要がない。
凍結保存して解凍した臍帯細胞、血小板及び造血幹細
胞又は前駆細胞は、適当な患者の造血系の再構成のため
に医療的に使用できる。細胞は、当業技術ではよく知ら
れている一般に好ましい全身導入法のいずれかにより導
入できる。
造血系（又は免疫システム）の再構成は、多数の病気
と障害のために医療的に価値があり得る。凍結保存した
造血−幹細胞と前駆細胞の造血再構成のための導入は、
現在自系骨髄移植により治療できると知られているそれ
らの疾患に対して有益に使用できる。
幹細胞の導入により治療できる患者は、五つの広いカ
テゴリーを含むが、それらに限定されるものではない。
第１は、正常赤血球増殖と成熟の不全又は機能疾患から
くる疾患である（即ち、形成不全貧血症と増殖不全幹細
胞疾患）。第二群は、造血器官における悪性腫瘍疾患
（例えば、白血球とリンパ腫）である。第三の疾患群
は、非造血器官の悪性固形腫瘍の広範囲のスペクトルの
患者を含む。これらの患者の幹細胞導入は骨髄救済方法
として機能し、その方法は悪性腫瘍の他の方法である致
死的治療又は照射に次いで患者に提供される。第四の疾
患群は、自家免疫状態からなり、その状態では幹細胞は
異常免疫系の置換源として機能する。第五の疾患群は、
多数の遺伝疾患からなり、それらは造血幹細胞好ましく
は同系のそれの導入により補正され得て、それらは移植
の前に遺伝治療を受けている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開91／3935（ＷＯ，Ａ１) ＶＥＬＥＲＩ Ｃ．Ｒ．，ｅｔ．ａ ｌ．，ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ，1991, Ｖｏｌ．15，Ｎｏ．３，ｐ195−218 ＳＣＨＭＥＨＬ Ｍ．Ｋ．，ｅｔ．ａ ｌ．，ＺＯＯ ＢＩＯＬ．，1990，Ｖｏ ｌ．９，Ｎｏ．６，ｐ431−436 ＴＡＭＡＳＨＩＴＡ Ｔ．，ＣＲＹＯ ＢＩＯＬＯＧＹ，1980，Ｖｏｌ．17，Ｎ ｏ．２，ｐ112−119 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01N 1/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）グリセリン； （ｂ）細胞生存度を高めるのに十分な量のアルカリ金属
    塩化物； （ｃ）環境条件下で細胞維持を支持するのに有効な量の
    生理学的に代謝し得る単糖類； 及び （ｄ）プラズマ膜（plasma membrane）構造完全性を維
    持するために有効な量の血漿アルブミンからなる濃厚凍
    結保存溶液。
  2. 【請求項２】更に稀釈剤を含有している請求項１記載の
    凍結保存溶液。
  3. 【請求項３】溶液のpHが７と7.5の間である請求項１記
    載の凍結保存溶液。
  4. 【請求項４】濃厚液が（ａ）60ないし80重量％のグリセ
    リン、（ｂ）５ないし10重量％のアルカリ金属塩化物、
    （ｃ）0.2ないし１重量％の単糖類；及び（ｄ）20ない
    し30重量％の血漿アルブミンからなり、（ａ）、
    （ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の合計が100重量％である請
    求項１記載の凍結保存溶液。
  5. 【請求項５】溶液が（ａ）20ないし40重量％のグリセリ
    ン、（ｂ）1.5ないし５重量％のアルカリ金属塩化物、
    （ｃ）0.1ないし0.5重量％の単糖類；（ｄ）６ないし15
    重量％の血漿アルブミン及び（ｅ）残部稀釈剤（balanc
    e of diluent）からなる請求項２記載の凍結保存溶液。
  6. 【請求項６】アルカリ金属塩化物が塩化ナトリウムであ
    る請求項１記載の濃厚凍結保存溶液。
  7. 【請求項７】アルカリ金属塩化物が塩化ナトリウムであ
    る請求項２記載の凍結保存溶液。
  8. 【請求項８】単糖類がグルコースである請求項１記載の
    濃厚凍結保存溶液。
  9. 【請求項９】単糖類がグルコースである請求項２記載の
    凍結保存溶液。
  10. 【請求項１０】血漿アルブミンがヒト血漿アルブミンで
    ある請求項１記載の濃厚凍結保存溶液。
  11. 【請求項１１】血漿アルブミンがヒト血漿アルブミンで
    ある請求項２記載の凍結保存溶液。
  12. 【請求項１２】（ａ）60ないし80重量％のグリセリン； （ｂ）５ないし10重量％のアルカリ金属塩化物； （ｃ）0.2ないし１重量％のグルコース；及び （ｄ）20ないし30重量％の血漿アルブミン からなり、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の合計が
    100重量％である濃厚凍結保存溶液。
  13. 【請求項１３】（ａ）20ないし40重量％のグリセリン； （ｂ）1.5ないし５重量％のアルカリ金属塩化物； （ｃ）0.1ないし0.5重量％のグルコース； （ｄ）６ないし15重量％の血漿アルブミン；及び （ｅ）残部稀釈剤（balance of diluent）からなる凍結
    保存溶液。
  14. 【請求項１４】（ｉ）請求項２記載の凍結保存溶液に標
    的細胞を導入し、そして （ii）保護された標的細胞を凍結保存することからなる
    細胞を凍結保存する方法。
  15. 【請求項１５】標的細胞を含む溶液の、凍結保存溶液に
    対する体積比が1:1ないし1:10でありそして標的細胞
    の、凍結保存溶液に対する比率が１×105細胞/mlないし
    ×109細胞/mlである請求項14記載の方法。
  16. 【請求項１６】標的細胞が造血幹細胞又は前駆細胞であ
    る請求項14記載の方法。
  17. 【請求項１７】標的細胞が血液の血小板である請求項14
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】標的細胞がCD34＋細胞であると同定され
    ている細胞である請求項14記載の方法。
  19. 【請求項１９】標的細胞が臍帯の血液から採取される請
    求項14記載の方法。
  20. 【請求項２０】（ｉ）請求項13に記載の凍結保存溶液に
    標的細胞を導入し、そして （ii）保護された標的細胞を凍結保存することからなる
    細胞を凍結保存する方法。
  21. 【請求項２１】標的細胞を含む溶液の、凍結保存溶液に
    対する体積比が1:1ないし1:10でありそして標的細胞
    の、凍結保存溶液に対する比率が１×105細胞/mlないし
    １×109細胞/mlである請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】保護された標的細胞が分当り１−２℃の
    速度で−70と−196℃の間の温度まで冷却される請求項2
    0記載の方法。
  23. 【請求項２３】（ｉ）請求項２記載の凍結保存溶液に標
    的細胞を導入し、（ii）保護された標的細胞を凍結保存
    し、そして（iii）保護された標的細胞を解凍すること
    からなる生存細胞を凍結保存しそして回収するための方
    法。
  24. 【請求項２４】標的細胞を含む溶液の、凍結保存溶液に
    対する体積比が1:1ないし1:10の間であり標的細胞に対
    する凍結保存溶液の比が１×105細胞/mlないし１×109
    細胞/mlの間にある請求項23記載の方法。
  25. 【請求項２５】標的細胞が造血幹細胞又は前駆細胞であ
    る請求項23記載の方法。
  26. 【請求項２６】請求項２記載の凍結保存溶液中に凍結保
    存された標的細胞を、該標的細胞の解凍後それを該溶液
    から分離しないで、ヒト以外の動物に導入することから
    なる細胞の医療的使用のための方法。
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