KR100414184B1 - 사슴 정액 냉동 보존액 및 이를 이용하여 사슴정액을 냉동보존하는 방법, 및 사슴의 인공수정방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사슴의 번식과 개량수단을 자연교미에서 인공수정으로 대체하기 위하여 사슴정액을 장기간 보존할 수 있는 냉동 보존액 및 이를 이용한 사슴정액 냉동보존방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 사슴 냉동정액을 이용하여 인위적으로 사슴을 수태시킬 수 있도록 번식시기를 조절하여 발정 및 배란을 유도한 후 정액을 주입하는 사슴의 인공수정 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사슴의 번식과 개량수단을 자연교미에서 인공수정으로 대체하기 위하여 사슴정액을 장기간 보존할 수 있는 냉동 보존액 및 이를 이용한 사슴정액 냉동보존방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 사슴 냉동정액을 이용하여 인위적으로 사슴을 수태시킬 수 있도록 번식시기를 조절하여 발정 및 배란을 유도한 후 정액을 주입하는 사슴의 인공수정 방법에 관한 것이다.
사슴은 불과 10~20년전 쯤부터 상업적으로 축화(가축으로 기르기 시작한 때)되기 시작하였으며, 인공수정과 같은 번식기술은 불과 몇 년전부터 시작되어 양록 선진국인 호주, 캐나다, 뉴질랜드 등에서 전략적으로 기술개발을 시도하여 우리나라를 비롯한 동남아에 수출하고 있는 실정이다. 즉, 국내에서는 아직까지 인공수정기술이 확립되어 있지 않기 때문에 외국시술자에 의해서 극히 제한적으로 인공수정이 이루어지고 있다(1997년 약 400두의 사슴 인공수정 시술료 지불에 의한 외화 낭비; 연간 4억 이상).
더구나, 일반농가에서는 사슴의 번식생리에 대한 이해부족으로 사슴의 인공수정은 엄두도 못내고 있는 실정이며, 사슴 번식생리의 특정상 계절번식 때문에 수태에 성공하기란 여간 어려운 실정이 아니다.
따라서, 사슴의 인공수정을 위해서는 정액의 채취, 정액의 동결보존, 암사슴의 발정 및 배란 유도, 정액 주입, 임신진단 등 일련의 과정이 체계적으로 이루어져야만 번식률을 높일 수 있다.
그러므로, 본 발명자들은 인공수정에 의해 사슴의 번식률을 높일 수 있는 방법을 연구하게 되었고, 그 결과, 사슴정액의 냉동보존액, 이를 이용한 정액의 냉동보존 방법, 및 사슴정액을 이용하여 사슴을 인공수정시키는 방법을 개발하였다.
즉, 종래 사슴 냉동 보존액의 경우 동결 융해시키면 사슴정자의 정상 두모 손상율이 매우 높아 인공수정시 수태율이 저조한 문제점이 있으므로, 이를 해결할 수 있는 방법을 개발하게 되었다.
아울러, 종래 자연교미(natural mating)시 사슴의 번식생리상 계절번식에 따른 계획교배가 어려워 수태율이 저하되는 문제점을 해결한 인공수정(artificial insemination) 방법을 개발하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 동결 융해 후, 정자의 활력 및 정상두모율을 향상시켜 인공수정시 수태율을 높일 수 있는 사슴정액의 냉동보존액을 제공하는 것이며, 상기한 냉동보존액을 이용하여 사슴정액을 냉동보존하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 번식률을 높이고 번식시기를 조절하기 위하여 발정동기화 및 배란유기를 통한 사슴의 인공수정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적, 적용 및 특징은 하기 발명의 구성에서 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 냉동 보존액은 1차 희석액(mBF5F 보존액; 증류수 100㎖당 20%(v/v) 난황, 1.6%(w/v) 글루코스, 1.6%(w/v) 프럭토스, 1.2% Tes-N-tris, 0.5% 합성청정제(OEP; orvus es paste; NOVA Chemical Ltd.), 1,000Iu/㎖ 페니실린 및 1㎎/㎖ 황산스크렙토마이신을 함유)과 2차 희석액(1차 희석액에 16% 글리세롤을 첨가한 후, 숫사슴 혈청, 녹용액기스, 소혈청알부민 및 헤파린(heparine)으로 이루어진 생리활성물질군에서 선택된 1종 이상을 함유시킨 액)으로 이루어짐을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 사슴 정액의 냉동 보존액 조성물은 공지의 냉동 보존액에 생리활성물질을 더 첨가하여 동결융해 후, 정자의 활력과 정상두모율(normal apical ridge; NAR)을 향상시킨 것이다.
본 발명의 조성물에 사용된 생리활성물질은 숫사슴혈청, 녹용엑기스, 소혈청 알부민 및 헤파린(heparine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이지만, 정자의 활력을 증진시키기 위해서는 숫사슴의 혈청을, 정자의 손상을 감소시키기 위해서는소혈청알부민과 헤파린을 첨가하는 것이 특히 바람직하다. 한편, 상기 생리활성물질 중, 숫사슴 혈청은 절각 시기인 수사슴으로부터 혈액을 경정맥으로부터 채혈하고 채혈된 혈액을 12시간 이상 4℃ 냉장고에 보관한 후, 1500 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액인 혈청(serum)을 분리하여 냉동고(- 20℃)에 보관한 것으로, 정액에 첨가하기 전에 56℃ 항온수조에서 30분간 비동화시켜 사용한다. 또한, 녹용엑기스는 절각된 생녹용을 -80℃의 냉동건조기(Freezer dryer, 일신랩, 한국)에서 1주일 이상 건조시켜 추출된 수분으로, 상기 혈청과 같은 방법으로 보관하며, 정액 첨가시에는 비동화시킨 것을 사용한다.
이들 활성물질인 숫사슴혈청, 녹용엑기스 및 소혈청 알부민의 첨가는 각각 0.1~ 0.5% 수준이고, 헤파린은 5~10㎍/㎖ 수준이다.
본 발명의 사슴정액의 냉동 보존액은 공지의 보존액보다 동결융해 후, 정자의 생존율, 정자의 활력, 정자의 정상두모율이 우수하기 때문에, 이를 이용하여 사슴을 인공수정시키면, 사슴의 번식률 또한 향상시킬 수 있다.
상기한 냉동보존액을 사용하여 사슴의 정액을 냉동 보존하는 방법은, 사슴 정액을 상기 1차 희석액을 사용하여 1:5~10의 비율로 희석하고 정자농도가 최종 1.6∼3.2 x 108sperm/㎖가 되도록 추가 희석하여 이를 냉각하는 단계; 냉각된 정액을 상기 2차 희석액을 사용하여 약 1:1의 비율로 희석하는 단계; 및 상기 희석된 정액을 예비동결 및 냉동시키는 단계로 이루어진다.
본 발명에 따라 사슴을 인공수정하는 방법은 사슴의 번식계절 도래 약 20일전에 CIDR(intravaginal progestrone-impregnated controlled internal drug releasing device)를 질내에 삽입한 후, 이를 10~14일 후에 제거하고 PMSG(pregnant mare serum gonadotropin) 200~250IU를 근육 주사하여 발정을 동기화시키는 단계; 상기 PMSG 투여 24시간 후에 GnRH(gonadotropin releasing hormone)를 근육주사하거나 또는 수정직전 LHRH(Luteinizing hormone releasing hormone; 황체형성호르몬 방출 호르몬)을 근육주사하여 배란을 동시에 유기시키는 단계; 및 사슴의 경관 또는 자궁에 냉동-융해된 정액을 주입하여 인공수정시키는 단계로 이루어진다.
본 발명의 방법은 발정을 동기화시킨 후, 동시에 배란을 유기하여 인공수정하는 방법으로, 번식계절 도래 약 20일전부터 발정동기화 처리가 가능하기 때문에 다음해 분만시기를 앞당길 수 있어 자록이 강건하며 어미와 자록의 번식생리상 둘다 매우 유리한 방법이다.
이하 본 발명을 각종 예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 사슴정액의 채취
사슴의 정액채취를 위하여 사슴을 전신마취하였다. 예를 들면, 엘크(대형 사슴 품종)의 경우는 Fentazin-10(동방주식회사, 한국)을 체중 100㎏당 0.5㎖를 근육 주사하여 전신 마취시킨다.
그 다음, 외부 생식기를 세척, 소독하고, 음경을 외부로 돌출시켜 가제로 살며시 감싸쥔 후, 전기자극 정액채취기를 직장내로 삽입하여 천추 부위를 2~5초간통전, 2~5초간 절전으로 수회 반복 자극하여 정액을 채취하였다.
[실시예 2] 동결정액의 제조
공지의 BF5F 보존액을 변경한 mBF5F 보존액(증류수 100㎖당 20%(v/v) 난황, 1.6%(w/v) 글루코스, 1.6%(w/v) 프럭토스, 1.2% Tes-N-tris, 0.5% 합성청정제(OEP; orvus es paste; NOVA Chemical Ltd.), 1,000 unit/㎖ 페니실린 및 1㎎/㎖ 황산스크렙토마이신을 함유)을 1차 희석액으로 하고, 기본적인 1차 희석액에 16% 글리세롤을 포함시키고(최종 농도 8%) 여기에 다시 0.1~0.5% 숫사슴 혈청, 0.1~0.5% 녹용액기스, 0.1~0.5% 소혈청알부민 및 5~10㎍/㎖ 헤파린으로 이루어진 생리활성물질군에서 선택된 1종 이상을 첨가한 것을 2차 희석액으로 사용하여 정액을 동결 처리하였다.
사슴 정액의 동결처리방법은 Monfort 등(1993. Successful interauterine insemination of Eld's deer with frozen-thawed spermatozoa. J. Reprod. Fert. 99:459-465.)의 방법에 준하되, 채취 직후, 상온(20~25℃)에서 1차 희석액으로 정액과 1:5~10으로 희석하고, 정자농도가 1.6~ 3.2×108sperm/㎖ 되게 추가 희석한 다음, 5℃에서 1~2시간에 걸쳐 냉각시켰다. 그 다음, 냉각된 정액을 동해방지제(glycerol) 및 생리활성물질이 포함된 2차 희석액(5℃)을 사용하여 약 1:1의 비율로 서서히 희석하였다. 최종 2차 희석된 정액을 0.25㎖ straw에 분주, 봉합한 다음, 구경 2㎝×길이 30㎝ 수직 철제파이프(밑은 밀폐됨) 내에 케니스터와 함께 정치시키고, 액체질소내에서 10분동안 예비동결한 후, 액체 질소에 침적시켜동결하였다.
<시험예 1> 정액 보존액이 정자활력에 미치는 영향
2차 희석액으로 희석시, 하기 표 1에서와 같은 생리활성물질을 첨가한 후, 정액을 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 동결처리하여 액체질소통에 보관한 후 동결된 정액을 38℃ 항온수조에서 20초간 융해시켜 200배율의 현미경하에서 수정능력을 가진 살아 움직이는 정자의 백분율로 정자 활력을 조사(즉, 100~200마리의 정자 중에 살아 움직이는 활력 있는 정자수의 비율)하였으며, 정상두모율은 동결과정 중 정자의 두부가 손상되지 않고 정상적인 첨체를 가진 살아 있는 정자(live sperm with normal apical ridge)의 비율을 400배율의 현미경하에서 조사하여, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| 보존액 | 동결융해후 성상 | |
| 활력(%) | 정상두모율(%) | |
| mBF5F | 56.2 | 52.5 |
| mBF5F+0.1% 소혈청알부민(BSA) | 68.3 | 48.3 |
| mBF5F+10㎍/㎖ 헤파린 | 63.5 | 60.8 |
| mBF5F+0.1% BSA+10㎍/㎖ 헤파린 | 69.4 | 59.8 |
| mBF5F+0.1% 숫사슴 혈청 | 70.0 | 57.5 |
| mBF5F+0.1% 녹용엑기스 | 67.5 | 58.4 |
상기 표 1로부터, 2차 희석액에 생리활성 물질을 첨가하여 동결보존한 정액의 융해 후 정자 활력 및 정상두모율이 높게 나타나 정액의 질(質)이 향상되는 것을 알 수 있다. 특히, 사슴 정액의 동결융해 후 정자의 활력개선을 위해서는 숫사슴의 혈청을 첨가하는 것이 바람직하고, 정자 손상을 감소시키기 위해서는 소혈청 알부민과 헤파린을 동시에 첨가하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3> 사슴의 인공수정
농가에서 사육중인 엘크 암컷을 보정틀에 보정시킨 후 CIDR(intravaginal progesterone-impregnated controlled internal drug releasing device)을 질내 삽입하고 10~14일이 경과된 후에 CIRD를 제거한 다음, PMSG(pregnant mare serum gonadotropin) 200~250IU를 근육주사하여 발정을 동기화시켰다. 발정동기화처리에 따른 발정발현 확인을 위하여 암사슴의 등쪽 정중성의 미근부 약 20㎝ 상단에 KAMAR(동물약품)을 붙이고 인공수정 직전 KAMAR의 파열과 승가흔적 여부로 발정발현 상태를 확인하였다. CIDR 제거 또는 PMSG 투여 24시간 후에 GnRH(gonadotropin releasing hormone; 리셉탈 2㎖/1두)를 근육주사하거나 LHRH(항체 형성 호르몬(LH) releasing hormone; 콘셉탈 2㎖/1두)를 수정 직전에 근육주사하여 배란을 동시에 유기시킨 후, CIDR 제거로부터 60~64시간 때에 보정된 암사슴의 경관내 또는 자궁내에 정액을 주입하여 인공수정시켰다.
<시험예 2> 발정동기화 처리후 발정발현율
상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 사슴의 발정을 동기화시키고 발정 발현율을 조사한 결과는 표 2에 나타낸 바와 같았다.
| 농장명 | 공시두수 | 발정발현두수 | 발정발현율(%) | ||
| Kamar 파열(%) | 승가흔적(%) | 계 | |||
| A(중소) | 16 | 6(42.9 ) | 8 (57.1) | 14 | 87.5 |
| B(비룡) | 23 | 9 (40.9) | 13 (59.1) | 22 | 95.7 |
| C(유원) | 21 | 6 (30.0) | 14 (70.0) | 20 | 95.2 |
| D(화성) | 15 | 5 (33.3) | 10 (66.7) | 15 | 100.0 |
| E(약초) | 16 | 7 (46.7) | 8 (53.3) | 15 | 93.8 |
| 계 | 91 | 33(28.1) | 53 (58.2) | 86 | 94.5 |
표 2에서 나타낸 바와 같이 CIDR로 발정을 동기화시켰을 경우 대상농장에 87.5∼100.0%의 발정발현을 나타내었다(평균 94.5%).
<시험예 3> 발정동기화처리한 사슴의 인공수정 후 수태율
발정동기화처리 및 배란을 유기한 사슴 각각 22, 23 및 40두에 대해서, 정액을 주입하고 40~60일 경과 후에 초음파진단으로 임신을 확인한 결과 표 3에서 보는바와 같이 50두가 임신되어 58.8%의 수태율을 얻었다. 발정동기화 및 배란유기방법에 따른 수태율은 CIDR + PMSG + LHRH 처리구가 67.5%로 가장 높게 나타났다. 발정동기화 및 배란유기방법에 따른 분만율은 오히려 CIDR + PMSG + GnRH처리구에서 43.5%로 가장 높게 나타났으며 전체 처리두수에 대한 분만율은 37.6%였다.
| 발정동기화처리 | 처리두수 | 임신두수 | 수태율(%) | 분만율(두수) |
| CIDR + PMSG | 25 | 22 | 11 (47.8) | 36.4 (8) |
| CIDR + PMSG+ GnRH | 25 | 23 | 12 (52.2) | 43.5 (10) |
| CIDR + PMSG+ LHRH | 42 | 40 | 27 (67.5) | 35.0 (14) |
| Total | 92 | 85 | 50 (58.8) | 37.6 (32) |
이러한 결과는 발정동기화처리시 GnRH 및 LHRH에 의해 배란까지도 유기됨으로써 수태율을 향상시킬 수 있었으나, 분만율이 수태율보다 다소 낮게 나타난 것은 시험처리에 따른 스트레스 유발에 의한 조기 배아폐사 및 유, 사산에 기인된 것으로 사료되며, 특히 사슴의 경우 임신말기 유, 사산된 어미는 야생성이 존재하여 새끼 사체 또는 태반 등을 먹어 치우므로써 분만흔적이 남아있지 않은 관계로 조사두수에 누락되었을 가능성으로 분만 성적이 다소 낮게 평가 될 수 있는 원인이 된 것으로도 여겨진다.
<시험예 4> 번식계절 전. 후 발정동기화 처리가 번식성적에 미치는 영향
사슴의 발정은 우리나라의 경우 일조시간이 짧아지고 기온이 서늘해지기 시작하는 9~10월 경에 번식계절이 시작하여 12~1월경까지 지속된다(뉴질랜드 및 호주와 같은 남반구에서는 우리나라와 반대적인 계절성을 나타냄). 일반적으로 사슴은 번식계절 초기에 수태되지만 우리나라와 같이 농가에서 집약적으로 사육되어지는 경우는 이보다 더 지속적으로 교미되어 늦은 시기까지 수태된다. 즉, 번시계절 초기에 전부 수태되지 못하고, 9월에서부터 1월까지 분산되어 수태되므로써 다음 5월부터 10월까지도 분만이 이루어진다.
따라서, 발정주기의 동기화 처리를 번식계절 도래 전에 실시하였을 때, 발정동기화 처리시기가 번식성적에 미치는 영향을 조사한 그 결과는 표 4와 같다.
| 발정처리개시일(CIDR 삽입일) | 처리두수 | 발정발현수(%) | 인공수정후, 수태두수 | 수태율(%) | 분만두수 | 분만율(%) |
| 1999. 8. 20 | 16 | 14 (87.5) | 6 | 42.9 | 3 | 21.4 |
| 1999. 8. 25 | 22 | 20 (90.9) | 14 | 70.0 | 7 | 35.0 |
| 1999. 8. 30 | 35 | 33 (94.3) | 20 | 60.6 | 13 | 39.4 |
| 1999. 9. 5 | 20 | 18 (90.0) | 9 | 50.0 | 7 | 38.9 |
| Total | 93 | 85 (91.4) | 47 | 55.3 | 30 | 35.3 |
표 4에서 보는 바와 같이, 우리나라 계절에 있어서 번식계절 도래 전인 8월20일부터 5일 간격으로 발정을 동기화시켰을 때, 발정발현율은 번식계절에 가까울 수록 높게 나타났으나 인공수정 후 수태율은 처리시기에 영향을 받지 않은 것으로 나타났다. 분만률은 첫 시기인 8월 20일을 제외하고는 큰 차이가 나타나지 않았다. 이와 같은 결과는 발정동기화 및 배란유기 처리를 다소 앞당겨서 유도하여도 번식성적에는 차이가 나타나지 않기 때문에 번식계절 도래 약 20여일 전 발정동기화 및 배란유기처리로도 수태가 이루어지며 결국 비번식계절에도 발정 및 배란유기에 의한 수태 가능성을 제시해 준다.
이상의 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 냉동 보존액을 사용하여 냉동보존한 사슴 정액은 융해 후, 정자의 활력이 우수하고, 정자의 손상율도 적기 때문에 이를 사용하여 인공수정을 하면 번식률을 향상시킬 수 있으며, 본 발명의 인공수정 방법으로 수태시키면 인공수정시간에 맞추어 발정 및 배란이 일어나게 되므로 수태율이 향상될 수 있다. 더구나, 번식계절 도래 20일 전부터 발정동기화 및 배란유기에 의한 인공수정이 가능하기 때문에 분만시기를 자연교미보다 앞당길 수도 있다.
Claims (3)
- 사슴정액을 냉동 보존하기 위한 보존액 조성물에 있어서,증류수 100㎖당 20%(v/v) 난황, 1.6%(w/v) 글루코스, 1.6%(w/v) 프럭토스, 1.2% Tes-N-tris, 0.5% 합성청정제(OEP; orvus es paste), 1,000Iu/㎖ 페니실린 및 1㎎/㎖ 황산스크렙토마이신을 함유하는 1차 희석액과,상기 1차 희석액에 16% 글리세롤 첨가한 후, 0.1∼0.5% 숫사슴 혈청, 0.1∼0.5% 녹용엑기스, 0.1∼0.5% 소혈청알부민 및 5∼10㎍/㎖ 헤파린으로 이루어진 생리활성물질군에서 선택된 1종 이상을 함유시킨 2차 희석액을 포함하는 것으로 특징으로 하는 보존액 조성물.
- 사슴 정액을 증류수 100㎖당 20%(v/v) 난황, 1.6%(w/v) 글루코스, 1.6%(w/v) 프럭토스, 1.2% Tes-N-tris, 0.5% 합성청정제(OEP; orvus es paste), 1,000Iu/㎖ 페니실린 및 1㎎/㎖ 황산스크렙토마이신을 함유하는 1차 희석액을 사용하여 1:5~10의 비율로 희석하고 정자농도가 최종 1.6 ∼ 3.2 x 108sperm/㎖가 되도록 추가 희석하여 이를 냉각하는 단계;냉각된 정액을 상기 1차 희석액에 16% 글리세롤을 첨가한 후, 0.1∼0.5% 숫사슴 혈청, 0.1∼0.5% 녹용엑기스, 0.1∼0.5% 소혈청알부민 및 5∼10㎍/㎖ 헤파린으로 이루어진 생리활성물질군에서 선택된 1종 이상을 함유시킨 2차 희석액을 사용하여 약 1:1의 비율로 희석하는 단계; 및상기 희석된 정액을 예비동결 및 냉동시키는 단계;를 포함함을 특징으로 하는 사슴 정액의 냉동 보존 방법.
- 사슴의 번식계절 도래 약 20일 전에 CIDR(intravaginal progestrone- impregnated controlled internal drug releasing device)를 질내 삽입한 다음, 이를 10~14일 후에 제거하고 PMSG(pregnant mare serum gonadotropin) 200~250IU 를 근육주사하여 발정을 동기화시키는 단계;상기 PMSG 투여 24시간 후에 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 근육주사하거나 또는 수정 직전 LHRH(luteinizing hormone releasing hormone; 황체형성호르몬 방출 호르몬)을 근육주사하여 배란을 동시에 유기시키는 단계; 및사슴의 경관 또는 자궁에 제 2항의 방법에 의해 제조된 냉동-융해된 정액을 주입하여 인공수정시키는 단계;를 포함함을 특징으로 하는 사슴의 인공수정 방법.
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