CN112806354A

CN112806354A - 一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112806354A
Application number: CN202110061776.4A
Authority: CN
Inventors: 张旭辉; 胡向军; 李胜华; 修冰水; 徐绍梅
Original assignee: Shengzhi Tonghe Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shengzhirunhe Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明提供了一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用，该免疫细胞冻存液具体由人血白蛋白、细胞平衡液、细胞稳定剂、细胞保护剂、氨基酸液组成。本发明的免疫细胞冻存液，含有多种细胞保护成分，避免了免疫细胞在冻存时由冰晶所造成的内外损伤，提高了免疫细胞解冻后的复苏率。本发明的免疫细胞冻存液，不含有血清成分和DMSO等，避免了引入异种外源成份和有害成分，使得在临床应用中更加安全可靠。

Description

一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

目前，免疫细胞治疗可以广泛应用于病毒性疾病、恶性血液系统疾病，肝癌、肺癌等实体瘤的治疗，疗效非常显著，而且免疫细胞治疗相对于传统治疗，有非常显著的优势。免疫细胞治疗，指的是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。目前该疗法主要包括有：细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、树突状细胞(DC)疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法、DC-T细胞疗法、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)疗法等。这些疗法都需要在体外直接分离提取并保存免疫细胞。

一项研究表明，随着年龄的增长，免疫器官老化、免疫细胞及细胞因子降低，机体的免疫功能逐渐减弱，感染性疾病、肿瘤发病率、死亡率逐渐增高。免疫的衰老还会进一步加速机体的衰老，研究发现，TCR(T细胞受体)多样性随年龄增长而降低，适应性免疫细胞功能降低致使对外界的防御能力相应降低。另一项研究表明将存储的免疫细胞活化、扩增后回输给患者，可以显著提高患者的免疫力，因此，保存免疫细胞在基础临床和临床应用研究上具有重要意义。

现有的免疫细胞冻存液主要组分是采用免疫细胞基础培养基、胎牛血清和DMSO等，此外还有采用替代DMSO的冻存液，主要组分为甘油/乙二醇或/聚乙二醇/1，2-丙二醇/丙三醇等。亦有采用替代胎牛血清的冻存液，主要组分为人供体血浆/血清等。采用DMSO、甘油等，尽管成本低效果好，但它能与蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，对细胞具有一定的毒副作用，不能用于治疗用细胞的冻存。采用胎牛血清，虽不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，亦不会对人体过继免疫治疗产生影响，但该冷冻液的免疫细胞存活率低。而采用人供体血浆/血清，虽安全可靠，但是由于个体差异，导致冻存液的质量不一致，冻存/复苏效果亦有差异等，不利于规模化冻存免疫细胞。

发明内容

鉴于以上现有技术存在的问题，本发明提供了一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

本发明提供的一种免疫细胞冻存液，由人血白蛋白、细胞平衡液、细胞稳定剂、细胞保护剂、氨基酸液组成。

优选地，上述免疫细胞冻存液中，所述的人血白蛋白的含量可为0.1-0.3ml/ml。

优选地，上述免疫细胞冻存液中，所述的细胞平衡液可以是格氏液或乳酸钠林格氏液；更优选地，含量可为0.1-0.3ml/ml。

优选地，上述免疫细胞冻存液中，所述的细胞稳定剂包含有维生素C、维生素E、胰岛素-转铁蛋白-硒、重组人白介素2、重组人白介素4、还原性谷胱甘肽；更优选地，其含量(即每ml免疫细胞冻存液中各组分对应的含量)可为20-300μg/ml的维生素C、20-300μg/ml的维生素E、10-50μl/ml的胰岛素-转铁蛋白-硒、20-300U/ml的重组人白介素2、20-300U/ml的重组人白介素4、0.2-2mg/ml的还原性谷胱甘肽。

优选地，上述免疫细胞冻存液中，所述的细胞保护剂包含有透明质酸、海藻糖、右旋糖酐、葡萄糖、羟乙基淀粉；更优选地，其含量(即每ml免疫细胞冻存液中各组分对应的含量)可为2-10mg/ml的透明质酸、0.1-0.8mg/ml的海藻糖、1-5mg/ml的右旋糖酐、20-80mg/ml的葡萄糖、1-6mg/ml的羟乙基淀粉。

优选地，上述免疫细胞冻存液中，所述的氨基酸液可以是复方氨基酸注射液、KBM581培养基、X-VIVO15培养基、RPMI1640培养基中的任意一种；更优选地，其含量可为0.4-0.8ml/ml。

本发明还提供了上述免疫细胞冻存液的制备方法，包括：

取细胞稳定剂(优选维生素C、维生素E、胰岛素-转铁蛋白-硒、还原性谷胱甘肽、重组人白介素2和重组人白介素4)、细胞保护剂(优选透明质酸、海藻糖、右旋糖酐、葡萄糖和羟乙基淀粉)，溶解(优选根据其各自溶解特性分类溶解)，过滤(优选0.22μm过滤)，然后用氨基酸液混合，并调节pH值在7.1-7.6之间，再然后加入细胞平衡液、人血白蛋白，最终得到免疫细胞冻存液。

本发明还提供了上述免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。

优选地，将免疫细胞与免疫细胞冻存液混匀后按照程序降温的方法进行冻存；或者将免疫细胞冻存液在2-8℃预冷之后，与免疫细胞混合，置于-80℃中进行直接冻存。

本发明的有益效果如下：

本发明的免疫细胞冻存液含有多重保护成份，如透明质酸、海藻糖、右旋糖酐、葡萄糖、羟乙基淀粉，这些组分从细胞内和细胞外同时保护免疫细胞免受冻存时冰晶的损伤，大大提高了免疫细胞的冻存复苏率，适应于多种免疫细胞冻存。本发明的免疫细胞冻存液中为完全无血清、无DMSO冻存液，避免了引入异种外源成份和有害成分，使得在临床应用中更加安全可靠。

本发明的免疫细胞冻存液既可以按照免疫细胞的程序降温冻存，亦可以在2-8℃预冷之后，与免疫细胞混合，置于-80℃中进行直接冻存，其免疫细胞的冻存复苏率均在95％以上。

附图说明

图1：程序降温冻存14天后，免疫细胞复苏率比较。

图2：-80℃过夜冻存转入液氮14天后，免疫细胞复苏率比较。

图3：免疫细胞复苏后的形态观察。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：1ml免疫细胞冻存液的制备

(1)取维生素C、维生素E、胰岛素-转铁蛋白-硒、还原性谷胱甘肽、重组人白介素2、重组人白介素4、透明质酸、海藻糖、右旋糖酐、葡萄糖、羟乙基淀粉，根据其各自溶解特性分类溶解，0.22μm过滤；

(2)用0.6ml复方氨基酸注射液混合，并调节pH至7.4；

(3)加入0.1ml乳酸钠林格氏液、0.3ml人血白蛋白混匀，即得到免疫细胞冻存液1ml，且该冻存液中各组分终浓度如下：100μg/ml维生素C、100μg/ml的维生素E、50μl/ml的胰岛素-转铁蛋白-硒、100U/ml的重组人白介素2、100U/ml的重组人白介素4、1mg/ml的还原性谷胱甘肽、10mg/ml的透明质酸、0.8mg/ml的海藻糖、5mg/ml的右旋糖酐、80mg/ml的葡萄糖、6mg/ml的羟乙基淀粉。

实施例2：免疫细胞的获取

(1)取50ml离心管，加入Ficoll分离液15ml；

(2)沿管壁缓慢添加30ml混合均匀的外周血悬液(该外周血由自愿者捐赠所得，仅限用于研发需要，已签署知情同意书)；

(3)缓慢移至离心机中，650g，升1降1，离心30min；

(4)离心结束后，每管分4层，从下而上，依次为红细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆层，吸取血浆层移入50ml无菌离心管中备用，直至距白膜层5毫米处；

(5)小心将单个核细胞层转移至50ml无菌离心管中；

(6)加PBS至50ml，混匀；

(7)650g，离心10min，收集细胞沉淀，即为免疫细胞。

(8)采用NK细胞培养试剂盒、CIK细胞培养试剂盒、DC细胞培养试剂盒等提取相应的NK细胞、CIK细胞、DC细胞。

实施例3：免疫细胞的冻存与复苏

(1)取新培养收集的免疫细胞5*10⁶，加入实施例1中制备的免疫细胞冻存液1ml混匀，置于1ml冻存管中；同时，以传统细胞冻存液1(配方为：10％DMSO+90％的胎牛血清)为对照1；以传统细胞冻存液2(配方为：10％DMSO+90％的自体血浆)为对照2；用量相同。

(2)一部分免疫细胞按照程序降温的方法进行冻存，即4℃预置20min；-20℃预置30min；-80℃过夜冻存，之后直接置于液氮保存。

(3)另一部分免疫细胞，直接置于-80℃冻存，过夜冻存后直接置于液氮保存。

(4)待所有免疫细胞在液氮中保存超过14天后，取出复苏，进行冻存复苏率的测试(见图1,2)，具体为37℃水浴中快速解冻复苏，加新鲜培养液，离心取出保护液，再次添加新鲜培养液，取样加台盼蓝，镜下计数。

通过比较在程序降温液氮冻存14天后的免疫细胞的复苏率，可知，采用本发明所制备的免疫细胞冻存液的PBMC细胞复苏率均在96％以上，高于传统细胞冻存液1的88％及传统细胞冻存液2的89％；NK细胞复苏率均在97％以上，高于传统细胞冻存液1的87％及传统细胞冻存液2的91％；CIK细胞复苏率均在96％以上，高于传统细胞冻存液1的85％及传统细胞冻存液2的91％；DC细胞复苏率均在95％以上，高于传统细胞冻存液1的86％及传统细胞冻存液2的90％。

通过比较在-80℃过夜冻存转入液氮14天后的免疫细胞的复苏率，可知，采用本发明所制备的免疫细胞冻存液的PBMC细胞复苏率均在95％以上，高于传统细胞冻存液1的90％及传统细胞冻存液2的90％；NK细胞复苏率均在96％以上，高于传统细胞冻存液1的89％及传统细胞冻存液2的91％；CIK细胞复苏率均在96％以上，高于传统细胞冻存液1的90％及传统细胞冻存液2的89％；DC细胞复苏率均在95％以上，高于传统细胞冻存液1的88％及传统细胞冻存液2的90％。

通过对复苏后的免疫细胞的显微观察发现，相比于传统细胞冻存液复苏后的细胞，免疫细胞平衡冻存液复苏后的形态良好、碎片少，活力高。

Claims

1.一种免疫细胞冻存液，由人血白蛋白、细胞平衡液、细胞稳定剂、细胞保护剂、氨基酸液组成。

2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的人血白蛋白在免疫细胞冻存液中的含量为0.1-0.3ml/ml。

3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞平衡液是格氏液或乳酸钠林格氏液；优选地，所述的细胞平衡液在免疫细胞冻存液中的含量为0.1-0.3ml/ml。

4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞稳定剂包含有维生素C、维生素E、胰岛素-转铁蛋白-硒、重组人白介素2、重组人白介素4、还原性谷胱甘肽；优选地，所述的细胞稳定剂中各组分在免疫细胞冻存液中的含量为20-300μg/ml的维生素C、20-300μg/ml的维生素E、10-50μl/ml的胰岛素-转铁蛋白-硒、20-300U/ml的重组人白介素2、20-300U/ml的重组人白介素4、0.2-2mg/ml的还原性谷胱甘肽。

5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞保护剂包含有透明质酸、海藻糖、右旋糖酐、葡萄糖、羟乙基淀粉；优选地，所述的细胞保护剂中各组分在免疫细胞冻存液中的含量为2-10mg/ml的透明质酸、0.1-0.8mg/ml的海藻糖、1-5mg/ml的右旋糖酐、20-80mg/ml的葡萄糖、1-6mg/ml的羟乙基淀粉。

6.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的氨基酸液选自复方氨基酸注射液、KBM581培养基、X-VIVO15培养基、RPMI1640培养基中的任意一种；优选地，所述的氨基酸液在免疫细胞冻存液中的含量为0.4-0.8ml/ml。

7.权利要求1-6任意一项所述的一种免疫细胞冻存液的制备方法，包括：取细胞稳定剂、细胞保护剂，溶解，过滤，然后用氨基酸液混合，并调节pH值在7.1-7.6之间，再然后加入细胞平衡液、人血白蛋白，最终得到免疫细胞冻存液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述过滤为0.22μm过滤。

9.权利要求1-6任意一项所述的一种免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将免疫细胞与免疫细胞冻存液混匀后按照程序降温的方法进行冻存；或者将免疫细胞冻存液在2-8℃预冷之后，与免疫细胞混合，置于-80℃中进行直接冻存。