ES2611021T3 - Método de crecimiento celular y preparación farmacéutica para reparación y regeneración de tejido - Google Patents
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Abstract
Un método para hacer crecer células en un fluido de médula ósea o muestra de sangre recogida de un sujeto vivo cultivando las células en un medio, comprendiendo el método cultivar las células, sin contacto sustancial con un anticoagulante, en un medio que contiene suero alogénico, en el que las células se han recogido sin contacto sustancial con un anticoagulante del sujeto vivo, en el que el anticoagulante es heparina, un derivado de heparina o una sal de la misma, y en el que la cantidad de anticoagulante en el medio durante el cultivo es menos de 0,02 U/ml, con respecto al volumen del medio.
Description
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DESCRIPCION
Metodo de crecimiento celular y preparacion farmaceutica para reparacion y regeneracion de tejido Campo tecnico
La presente invencion se refiere a: un metodo para hacer crecer, rapida y masivamente ex vivo, celulas recogidas de un sujeto vivo. Este metodo es adecuado particularmente para autotrasplante de celulas madre mesenquimatosas y es aplicable particularmente a la reparacion y regeneracion de un tejido del sistema nervioso.
Tecnica anterior
Hasta ahora, la recuperacion de las funciones de tejidos nerviosos danados se ha considerado muy diffcil. Sin embargo, en los ultimos anos se han encontrado neurocitoblastos que conservan la capacidad de crecer de manera autonoma y la pluripotencia en el cerebro adulto. Basandose en este hallazgo, tambien se ha estudiado activamente la medicina regenerativa en el sistema nervioso central. Se ha pensado que la terapia celular para reponer celulas danadas es lo mas proximo al uso practico como medicina regenerativa usando celulas madre. En la terapia celular, las celulas proporcionadas por un donante (a continuacion en el presente documento, denominadas celulas de donante) se cultivan, se hacen crecer y/o se induce su diferenciacion ex vivo. Las celulas se administran en una forma apropiada a un sujeto vivo como receptor para reponer las celulas de tejido danadas del receptor.
Para la enfermedad neurologica cerebral, se ha realizado un intento en modelos de isquemia o traumatismo, en los
que se extraen de tejidos celulas que tienen potencial de diferenciacion en celulas del sistema nervioso, A continuacion se cultivan y se trasplantan a un individuo. Por ejemplo, los presentes inventores han descubierto ya que una fraccion celular que contiene celulas capaces de diferenciarse en celulas neuronales esta presente en celulas de la medula osea y han demostrado ademas que el trasplante de estas celulas a modelos de medula
espinal desmielinizada de rata, vuelve a mielinizar los axones desmielinizados (documento de patente 1).
Para usar celulas de donante en el tratamiento de una enfermedad, particularmente en el tratamiento de una enfermedad que tiene smtomas en la fase aguda, tal como encefalopatfa isquemica atribuida a infarto cerebral, es importante hacer crecer las celulas de donante rapida y masivamente. Se han realizado diversos intentos para hacer crecer celulas ex vivo para mejorar la tasa de supervivencia celular y potenciar la tasa de crecimiento.
Por ejemplo, se usan medios complementados con diversas sustancias que promueven el crecimiento para mejorar la tasa de crecimiento celular. Por ejemplo, el documento de patente 2 divulga que los factores inhibidores de leucocitos aumentan la tasa de crecimiento celular. El documento de patente divulga un medio que contiene albumina serica humana recombinante para hacer crecer celulas hematopoyeticas. El documento de patente 4 divulga un metodo para cultivar celulas madre mesenquimatosas en un medio que contiene vitamina C y un factor de crecimiento basico de fibroblastos. Tambien se conoce en la tecnica el uso de otros factores de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento de celulas epiteliales, factores de crecimiento de celulas nerviosas, factores de crecimiento de celulas hepaticas, trombopoyetina e interleucina).
Se han desarrollado tambien sustratos de cultivo que potencian mucho mas la tasa de crecimiento celular. Por ejemplo, el documento de patente 5 divulga un metodo para cultivar celulas madre mesenquimatosas en matriz extracelular de membrana basal.
Ademas, el suero tambien se usa generalmente como sustancia promotora del crecimiento. Hasta ahora, se ha usado ampliamente un medio complementado con aproximadamente del 10 % al 20 % de suero animal exogeno incluyendo suero fetal bovino (FBS) u otros factores de crecimiento celular en el cultivo de celulas madre. Sin embargo, las celulas animales tales como FBS difieren en composicion de un lote a otro y tambien tienen el problema de posible contaminacion con patogenos tales como virus o priones.
Para hacer frente a tales problemas, se han desarrollado tambien medios libres de suero (veanse por ejemplo, los documentos de patente 2 y 3). Sin embargo, el cultivo en tales medios libres de suero apenas produce un crecimiento equivalente al de un medio complementado con suero en las presentes circunstancias.
Por otro lado, en un intento por usar suero humano, se usa suero de adulto humano porque el uso de suero fetal es diffcil desde el punto de vista etico (veanse por ejemplo, los documentos de patente 6 a 8). La ventaja del uso de suero de adulto es que puede usarse el propio suero de un individuo del que se recogen las celulas de donante. El uso de autosuero es muy preferible desde el punto de vista de la compatibilidad y la seguridad.
La desventaja del uso del suero de adulto es una actividad promotora del crecimiento mas baja que la obtenida usando, por ejemplo, FBS. El suero de adulto presenta actividad promotora del crecimiento celular insuficiente por sf mismo y por tanto, requiere inevitablemente adicion adicional de FBS (documento de patente 6) o adicion de otros factores de crecimiento (documento de patente 7) para obtener un crecimiento equivalente al obtenido usando FBS. Sin embargo, aun cuando se obtienen efectos equivalentes a los obtenidos usando FBS mediante la adicion de
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factores de crecimiento o similares, no puede obtenerse el crecimiento rapido y masivo que es aplicable al tratamiento de enfermedades en fase aguda tal como se describio anteriormente.
Por otro lado, los metodos convencionales para el cultivo/crecimiento de celulas recogidas de un sujeto vivo comprenden anadir heparina durante la recogida de tejidos o celulas que contienen componentes sangumeos de un donante para evitar la coagulacion de la sangre (vease por ejemplo, el documento de patente 9 y los documentos no de patente 1 y 2). En un caso tfpico (por ejemplo, recogida de celulas de medula osea para trasplante habitual de medula osea), la cantidad de heparina administrada es de aproximadamente decenas de U/ml (aproximadamente de 20 a 40 U/ml) con respecto al volumen de la disolucion celular. Por ejemplo, el documento de patente 8 divulga la adicion, a un fluido de medula osea, de una disolucion heparina/tampon que contiene heparina en el intervalo de aproximadamente de 5 a 15 U/ml. El documento de patente 2 divulga un metodo, en el que la heparina esta contenida ademas en un medio de cultivo.
La heparina tambien se usa como ayuda al crecimiento, ademas de la aplicacion para evitar la coagulacion de la sangre tal como se describio anteriormente. Por ejemplo, el documento de patente 4 divulga que la heparina tiene el efecto de mejorar la afinidad de un factor de crecimiento basico de fibroblastos (bFCF) para su receptor. Ademas, el documento de patente 10 divulga una forma modificada de glucosaminoglucano sulfatado que contiene heparina, como una ayuda para el crecimiento de neurocitoblastos. Sin embargo, incluso estos metodos que usan heparina no pueden alcanzar una tasa de crecimiento suficientemente rapida y masiva en las presentes circunstancias.
Mientras, los sujetos vivos, cuando se lesionan, tienen un mecanismo en el que el sitio de lesion se repara de manera autonoma. Por tanto, puede repararse un determinado grado de lesion sin dejar el dano funcional. Sin embargo, el mecanismo endogeno de reparacion no es suficiente para un amplio grado de lesion. En este caso, la recuperacion puede retrasarse, o la lesion puede repararse de manera incompleta, dejando dano funcional. Se ha pensado de manera convencional que los tejidos biologicos, particularmente tejidos nerviosos o similares, que reciben tal lesion, son diffciles de reparar. Sin embargo, con el reciente hallazgo de que las celulas madre tienen pluripotencia, se ha realizado un intento por reponer celulas danadas con tales celulas madre. Por ejemplo, el documento de patente 11 divulga que se administraron celulas madre mesenquimatosas a ratas modelo de infarto cerebral en la fase aguda de la enfermedad (tras de 3 a 24 horas de induccion de isquemia) y por consiguiente produjeron efectos terapeuticos significativos.
Sin embargo, queda por notificarse un enfoque, que sea eficaz para recuperar funciones perdidas en la fase subaguda o posterior en el que el sitio de lesion se estabilice en cierta medida debido al paso del tiempo desde la lesion.
Documento de patente 1: Documento de patente de WO02/00849A1
Documento de patente 2: Publicacion nacional de solicitud de patente internacional n.° 2002-518990 Documento de patente 3: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2005-204539
Documento de patente 4: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2006-136281
Documento de patente 5: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2003-52360
Documento de patente 6: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 10-179148
Documento de patente 7: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.°. 2003-235548
Documento de patente 8: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.°. 2006-55106
Documento de patente 9: Documento de patente de WO01/48147A1
Documento de patente 10: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2005-218308 Documento de patente 11: Documento de patente de WO2005/007176
Documento no de patente 1: F. Takaku, “Manual of Bone Marrow Transplantation”, primera edicion, CHUGAI- IGAKUSHA, 1996, pag. 86
Documento no de patente 2: Y. Miura, ed., “Method of Hematopoietic Stem Cell Culture” primera impresion de la 2a edicion revisada, CHUGAI-IGAKUSHA, 1989, pag. 38
Divulgacion de la invencion
Problemas que ha de resolver la invencion
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Por tanto, un objeto de la presente invencion es resolver los problemas de las tecnicas convencionales en hacer crecer celulas ex vivo para trasplante celular y para hacer crecer celulas rapida y masivamente a una tasa de crecimiento mas alta que la de los metodos convencionales. Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar una preparacion altamente practica para ayudar en la reparacion de tejido, usando las celulas crecidas. Esta preparacion tiene efectos terapeuticos aun cuando se administra en la fase de la lesion subaguda o posterior.
Medios para resolver los problemas
Para alcanzar el objeto, los presentes inventores han examinado diversas condiciones y procedimientos para el cultivo celular y, en el proceso, han realizado estudios centrandose en la heparina usada habitualmente con el proposito de evitar la coagulacion de la sangre. Por consiguiente, los presentes inventores han encontrado que la heparina tiene efectos inhibidores significativos sobre el crecimiento celular. Como resultado de estudios adicionales, los presentes inventores han encontrado que siempre que las celulas se cultivan en condiciones que no implican contacto con heparina, pueden obtenerse celulas que tienen una eficacia de crecimiento excelente (crecen rapidamente) incluso en un metodo de cultivo que usa suero alogenico (incluyendo autologo) en vez de FBS, y que las celulas obtenidas son seguras con una potencia de diferenciacion alta. Basandose en estos hallazgos, se ha completado la presente invencion.
Espedficamente, la presente invencion se refiere a un metodo para hacer crecer celulas en una muestra recogida de un sujeto vivo cultivando las celulas en un medio, comprendiendo el metodo cultivar las celulas, sin contacto sustancial con un anticoagulante, en un medio que contiene suero alogenico tal como se define adicionalmente en la reivindicacion 1. En este contexto, se prefiere que el suero alogenico se determine como negativo para un marcador tumoral y/o un factor infeccioso. Ademas, se prefiere que el suero alogenico sea autosuero del sujeto del que se recogen las celulas.
En este contexto, los ejemplos del marcador tumoral serico pueden incluir ferritina, CEA, AFP, BFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CA72-4, STN, DUPAN-2, SLX, ST-439, SPAN-1, SCC, PSA, G-seminoprotema, TPA, CYFRA, PAP, NSE, peptido C, PIVKA, Pro-GRP, HCGp, elastasa, p2 microglobulina, S-NTX, un anticuerpo anti-p53 y HER2. Los ejemplos de factores infecciosos pueden incluir VIH, ATL, HB, HC, sffilis y parvovirus humano B19.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, en el que la cantidad del anticoagulante anadido a la muestra recogida es menos de 0,2 U/ml con respecto al volumen de la muestra.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, en el que la cantidad del anticoagulante en el medio al inicio del cultivo es menos de 0,02 U/ml.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo de crecimiento celular, en el que el anticoagulante es heparina, un derivado de heparina o una sal de la misma.
La presente invencion se refiere al metodo, en el que se hacen crecer las celulas en un medio que contiene suero.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, en el que se hacen crecer las celulas en un medio que contiene suero de un individuo animal de la misma especie que la del animal del que se derivan las celulas.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, en el que se hacen crecer las celulas en un medio que contiene autosuero.
La presente invencion tambien se refiere al metodo, en el que el medio tiene un contenido en suero del 1 al 20 % en volumen.
La presente invencion se refiere al metodo, en el que se hacen crecer celulas madre.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, en el que se hacen crecer celulas madre mesenquimatosas.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, en el que se hacen crecer celulas humanas.
La presente invencion se refiere al metodo, en el que se hacen crecer las celulas madre en un estado indiferenciado.
La presente invencion tambien se refiere al metodo, en el que las celulas madre mesenquimatosas se subcultivan en el momento en que la densidad de las celulas en el medio alcanza las 5.500 celulas/cm2 o mas.
Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, en el que se reemplaza el medio al menos una vez a la semana.
La presente invencion tambien se refiere al metodo, en el que se repite el subcultivo hasta que el numero total de celulas alcanza las 100.000.000 celulas o mas.
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La presente memoria descriptiva describe celulas humanas cultivadas aisladas cultivadas por cualquiera de los metodos, caracterizadas porque las celulas estan libres de expresion de CD24.
La presente memoria descriptiva describe celulas humanas cultivadas aisladas cultivadas por cualquiera de los metodos, caracterizadas porque las celulas tienen expresion de al menos el 90 % de antigenos CD en un grupo positivo descrito en la tabla 1 estan libres de expresion de al menos el 90 % de antigenos CD en un grupo negativo descrito en la misma.
Las celulas se caracterizan ademas porque las celulas estan libres de expresion aberrante de todos los diversos genes relacionados con cancer cuya expresion no es preferible en humanos, por ejemplo, EWI-FLI-1, FUS-CHOP, EWS-ATF1, SYTSSX1, PDGFA, FLI-1, FEV, ATF-1, WT1, NR4A3, CHOP/DDIT3, FUS/TLS, BBF2H7, CHOP, MDM2, CDK4, HGFR, c-met, PDGFa, HGF, GFRA1, FASN, HMGCR, RGS2, PPARy, YAP, BIRC2, lumican, caldesmon, ALCAM, Jam-2, Jam- 3, cadherina II, DKK1, Wnt, nucleostemina, neurofibromina, RB, CDK4, p16, MYCN, telomero, hTERT, ALT, Ras, TK-R, CD90, CD105, CD133, VEGFR2, CD99, ets, ERG, ETV1, FEV, ETV4, MYC, EAT-2, MMP-3, FRINGE, ID2, CCND1, TGFBR2, CDKNIA, p57, p19, p16, p53, IGF-1, c-myc, p21, ciclina D1, y p21. Esta expresion aberrante significa una expresion significativamente mayor que el nivel de expresion correspondiente en individuos sanos.
La presente memoria descriptiva describe un metodo para producir una preparacion farmaceutica para reparacion/regeneracion de tejido usando las celulas.
Ademas, la presente memoria descriptiva describe una preparacion farmaceutica para reparacion/regeneracion de tejido que comprende las celulas.
La presente memoria descriptiva describe una preparacion farmaceutica para ayudar en la reparacion de un sitio de lesion o para ayudar en la reparacion de un sitio envejecido atribuido al envejecimiento, en la que las celulas son celulas madre mesenquimatosas, y la preparacion farmaceutica se administra por via intravenosa, mediante puncion lumbar, por via manera intracerebral, por via intracerebroventricular, de manera local o por via intraarterial. El tejido no esta particularmente limitado y puede ejemplificarse mediante tejidos del sistema nervioso incluyendo cerebro o medula espinal, rinon, pancreas, hfgado, intestino, estomago, organos digestivos, pulmon, corazon, bazo, vasos sangumeos, sangre, piel, hueso, cartflago, dientes y prostata. Las celulas son preferentemente celulas autologas.
Preferentemente la preparacion farmaceutica para reparacion/regeneracion de tejido descrita en el presente documento se administra en la fase subaguda o posterior de la enfermedad o el trastorno y ayuda en la reparacion de un sitio de lesion mediante secrecion de citocinas, angiogenesis y/o regeneracion nerviosa.
La memoria descriptiva describe que el sitio de lesion es el rinon, y que la preparacion farmaceutica promueve la reparacion del sitio de lesion mejorando el valor de BUN y/o el valor de creatinina.
La memoria descriptiva describe que el sitio de lesion es el pancreas, y que la preparacion farmaceutica promueve la reparacion del sitio de lesion mejorando la glucemia, la concentracion serica de Glu A1 y/o la concentracion serica de HbA1C.
La memoria descriptiva describe que el sitio de lesion es el corazon, y que la preparacion farmaceutica promueve la reparacion del sitio de lesion mejorando la concentracion serica de prostaglandina-D sintasa y/o la concentracion serica de homocistema.
La memoria descriptiva describe que el sitio de lesion es el tngado, y que la preparacion farmaceutica promueve la reparacion del sitio de lesion mejorando el valor de GOT, el valor de GPT y/o el valor de y-GTP.
La memoria descriptiva describe que el sitio de lesion es el cerebro, y que la preparacion farmaceutica puede tratar la afasia o demencia promoviendo la mejora en el valor de SLTA que sirve como mdice para la afasia y/o el valor de WAIS-R que sirve como mdice para la recuperacion intelectual.
La memoria descriptiva describe que el sitio de lesion es la prostata, y que la preparacion farmaceutica promueve la reparacion del sitio de lesion mejorando el valor de PSA.
Los ejemplos de la enfermedad o el trastorno elegido como diana por la preparacion farmaceutica para reparacion/regeneracion de tejido descrito en el presente documento pueden incluir espedficamente, pero no se limitan a, dano renal, dano hepatico, trastorno pancreatico incluyendo diabetes mellitus, hiperplasia prostatica benigna, hiperlipidemia, disfuncion cerebral mayor incluyendo afasia y demencia, encefalopatfa tras reanimacion, enfermedad cardiaca y lesion de medula espinal.
La presente memoria descriptiva describe un kit para preparar las celulas tal como se describe en el presente documento, comprendiendo el kit un recipiente lleno con un medio caracterizado porque contiene un anticoagulante
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en una cantidad menor de 0,5 U/ml. El kit puede comprender otros reactivos, instruments o materiales necesarios para preparar las celulas. Por ejemplo, la heparina se usa como anticoagulante, si lo hay, en el kit.
Ademas, la presente memoria descriptiva describe terapia celular para reparacion/regeneracion de tejido que comprende las etapas de: cultivar, mediante el metodo de la presente invencion, celulas aisladas de un sujeto; examinar las celulas obtenidas en la etapa anterior, para determinar su expresion de genes relacionados con cancer; y administrar al sujeto celulas que se confirmo en el examen que eran seguras. En este contexto, los ejemplos de los genes relacionados con cancer que van a examinarse pueden incluir los facilitados a modo de ejemplo anteriormente.
En un aspecto preferible, la terapia celular es un tratamiento de la enfermedad neurologica isquemica en el que el tejido es un tejido del sistema nervioso, y las celulas son celulas madre mesenquimatosas autologas y se administran por via intravenosa, mediante puncion lumbar, por via intracerebral, por via intracerebroventricular o por via intraarterial.
Ventajas de la invencion
La presente invencion consigue una mejora significativa en la tasa de crecimiento incluso usando en cultivo suero alogenico (por ejemplo, autosuero de un sujeto del que se recogen celulas) en vez de suero exogeno (FBS), aun cuando se anade un anticoagulante considerado convencionalmente esencial o util para el crecimiento celular en una cantidad traza o esta sustancialmente ausente. Ademas, segun la presente invencion, se obtienen celulas que tienen una eficacia de crecimiento excelente (crecen rapidamente). Estos efectos sorprendentes eran totalmente inesperados a partir del conocimiento convencional. Las celulas obtenidas mediante el metodo de cultivo libre de autosuero son mucho mas excelentes en seguridad y potencia de diferenciacion que las obtenidas mediante los metodos de cultivo convencionales que usan FBS.
Una preparacion farmaceutica descrita en el presente documento tiene efectos terapeuticos aun cuando se administra en la fase subaguda o posterior de la enfermedad, en la que se ha supuesto que su administracion es ineficaz. Por tanto, las celulas que van a administrarse no tienen que prepararse antes del desarrollo de la enfermedad y solo es necesario recogerlas de un sujeto tras el desarrollo y cultivarlas. Por tanto, la preparacion farmaceutica puede reducir drasticamente la carga del sujeto. Ademas, la preparacion farmaceutica puede ayudar, mediante inyeccion intravenosa, en la reparacion de un sitio de lesion arbitrario en el cuerpo y por tanto, es menos invasiva para el sujeto. Ademas, la preparacion farmaceutica puede administrarse en una sala de curas habitual o similar, sin cirugfa y por tanto, puede reducir la carga de donantes medicos y el coste medico. Ademas, la preparacion farmaceutica tiene efectos de reparacion-ayuda en una pluralidad de tejidos diferentes y por tanto es aplicable en un intervalo mas amplio. En particular, la preparacion farmaceutica puede tratar simultanea y eficazmente una pluralidad de diferentes sitios de lesion en el sujeto.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es una grafica que muestra el crecimiento de celulas madre mesenquimatosas humanas cuando la cantidad de heparina anadida a un fluido de medula osea fue de 0,1 U/ml (♦) o 267 U/ml (■);
la figura 2 es una grafica que muestra el numero de celulas tras 4 dfas en cultivo cuando se anadio una cantidad traza (izquierda) o 2 ml (derecha) de heparina al fluido de medula osea. El numero de celulas fue aproximadamente 40 veces mayor por la adicion de trazas de heparina;
la figura 3 es una grafica que muestra un crecimiento de celula madre mesenquimatosa en un medio complementado con suero de adulto humano (♦) o FBS (■) cuando la cantidad de heparina anadida fue de 0,1 U/ml;
la figura 4 es una grafica que muestra la tasa de crecimiento cuando se cultivaron celulas madre mesenquimatosas de rata en un medio que contiene el 10 % de FBS complementado con cantidades variables de heparina (1 U/ml, 10 U/ml, 100 U/ml y 1000 U/ml en este orden de arriba abajo);
la figura 5 es una grafica que muestra la tasa de crecimiento cuando se cultivaron celulas madre mesenquimatosas de rata en un medio complementado con heparina (♦) o cuando se anadio la misma cantidad de esa heparina a un fluido de medula osea, seguido por cultivo en un medio (■);
la figura 6 es una grafica que muestra el crecimiento de celulas madre mesenquimatosas humanas en un medio aMEM complementado con o bien autosuero de adulto humano (lmea continua) o bien FBS (lmea discontinua) cuando la cantidad de heparina anadida fue de 0,1 U/ml;
la figura 7 es una grafica que muestra el crecimiento de celulas madre mesenquimatosas humanas obtenido mediante la adicion de glutamina (♦) o en la ausencia de glutamina (■) cuando la cantidad de heparina anadida fue menor de 0,1 U/ml;
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la figura 8 es una grafica que muestra la tasa de crecimiento cuando se cultivaron celulas madre mesenquimatosas de rata no tratadas con heparina (♦), tratadas con heparina (■) o tratadas con heparina+protamina (▲) en un medio que contiene FBS;
la figura 9 es un diagrama que muestra el mecanismo terapeutico de una preparacion farmaceutica descrita en el presente documento. La ordenada representa la gravedad de los smtomas. La abscisa representa el tiempo transcurrido desde el desarrollo. La flecha representa el momento de la administracion de la preparacion farmaceutica. La curva superior situada en el lado derecho de la flecha representa cambios en los smtomas de un sujeto que recibio la administracion de la preparacion. La curva inferior representa cambios en los smtomas de un sujeto que no recibio la administracion;
la figura 10 es una imagen IRM del cerebro de un paciente con enfermedad neurologica isquemica antes de la administracion de la preparacion farmaceutica (izquierda) y tras 2 semanas de administracion (derecha). El sitio de lesion se indica en la parte blanca;
la figura 11 es una grafica que muestra cambios en el nivel de infarto cerebral (escala NIHSS: National Institutes of Health Stroke Scale (escala de accidente cerebrovascular de los institutos nacionales de salud) (•), escala JSS: Japan Stroke Scale (escala de accidente cerebrovascular japonesa) (■) y escala MRS: Modified Ranking Scale (escala de clasificacion modificada) (▲)) de un paciente con enfermedad neurologica isquemica durante el periodo que se centra en la administracion de la preparacion farmaceutica. La flecha representa el momento de la administracion de las celulas;
la figura 12 es una imagen termografica de un paciente con enfermedad neurologica isquemica antes de la administracion de la preparacion farmaceutica (izquierda) y tras 1 semana de administracion (derecha). La region de color oscuro que representa una alta temperatura se redujo significativamente tras 1 semana de administracion;
la figura 13 es una grafica que muestra cambios en la glucemia (BS: ♦), la concentracion serica de Glu A1 (■) y la concentracion serica de HbA1C (▲) de un paciente con diabetes mellitus antes y tras la administracion de la preparacion farmaceutica. Las ordenadas izquierda y derecha representan mg/dl y %, respectivamente. La abscisa representa una fecha con el dfa de la administracion como dfa 0. La flecha representa el momento de la administracion de las celulas (la preparacion farmaceutica);
la figura 14 es una grafica que muestra cambios en el valor de PSA de un paciente con hiperplasia prostatica benigna antes y tras la administracion de la preparacion farmaceutica de la presente invencion. La flecha representa el momento de la administracion de las celulas (la preparacion farmaceutica);
la figura 15 es una grafica que muestra cambios en los valores de y-GTP (izquierda), GOT (derecha: ♦) y GPT (derecha: ■) de un paciente con dano hepatico antes y tras la administracion de la preparacion farmaceutica. La flecha representa el momento de la administracion de las celulas (la preparacion farmaceutica);
la figura 16 es una grafica que muestra cambios en el valor de p2-microglobulina de un paciente con dano renal antes y tras la administracion de la preparacion farmaceutica. La flecha representa el momento de la administracion de las celulas (la preparacion farmaceutica);
la figura 17 es una grafica que muestra cambios en la grasa neutra de un paciente con hiperlipidemia antes y tras la administracion de la preparacion farmaceutica. La flecha representa el momento de la administracion de las celulas (la preparacion farmaceutica);
la figura 18 es una grafica que muestra cambios en los resultados de las pruebas SLTA y WAIS-R de un paciente con disfuncion cerebral mayor (demencia y afasia) antes y tras la administracion de la preparacion farmaceutica;
la figura 19 muestra los resultados de comparar los efectos terapeuticos provocados por la administracion de la preparacion farmaceutica en modelos de infarto cerebral en rata, en la que se realizo la comparacion entre grupos a partir de los aspectos de IRM y angiogenesis. En el diagrama, las barras representan (i) un grupo sin trasplante, (ii) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas (1,0x106), (iii) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de angiopoyetina (1,0x106), (iv) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de vEgF (1,0x106) y (v) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de angiopoyetina/VEGF (1,0x106) de izquierda a derecha: * p<0,05,
** p<0,01;
la figura 20 muestra los resultados de comparar los efectos terapeuticos provocados por la administracion de la preparacion farmaceutica en modelos de infarto cerebral en rata, en la que se realizo la comparacion entre grupos a partir de aspectos de comportamiento. En el diagrama, las barras representan (i) un grupo sin trasplante, (ii) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas (1,0x106), (iii) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de angiopoyetina (1,0x106), (iv) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de vEgF (1,0x106) y (v) un grupo en el que se inyectaron por via
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intravenosa celulas transfectadas con el gen de angiopoyetina/VEGF (1,0x106) de izquierda a derecha: * p<0,05, ** p<0,01;
la figura 21 muestra los resultados de evaluar los efectos terapeuticos provocados por la administracion de la preparacion farmaceutica en modelos de parada cardiorrespiratoria en rata (encefalopatfa tras reanimacion), en la que se realizo la evaluacion basandose en el numero de celulas positivas para Tunel (figura 21A) y el numero de celulas neuronales (figura 21B). En el diagrama, las barras izquierda y derecha representan un grupo de control y un grupo al que se le administraron celulas, respectivamente: * p<0,05;
la figura 22 muestra los resultados de evaluar los efectos terapeuticos provocados por la administracion de la preparacion farmaceutica en modelos de parada cardiorrespiratoria en rata, en la que se realizo la evaluacion segun la prueba del laberinto de agua de Morris (* p<0,05); y
la figura 23 es una grafica que muestra los resultados de evaluar la recuperacion en la funcion motora de ratas modelo con lesion en la medula espinal trasplantadas con celulas madre mesenquimatosas humanas segun la presente invencion, en la que se realizo la evaluacion segun la prueba de cinta rodante. En el diagrama, las barras representan un trasplante tras 6 horas, 1 dfa, 3 dfas, 7 dfas y 14 dfas de izquierda a derecha.
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
A continuacion en el presente documento, se describira en detalle un metodo de crecimiento celular segun la presente invencion.
El metodo de la presente invencion es un metodo para hacer crecer celulas en una muestra recogida de un sujeto vivo cultivando las celulas en un medio, estando caracterizado el metodo porque comprende cultivar las celulas, sin contacto sustancial con un anticoagulante, en un medio que contiene suero alogenico tal como se define adicionalmente en la reivindicacion 1. En este contexto, se prefiere que el suero alogenico se determine como negativo para un marcador tumoral y/o un factor infeccioso. Ademas, se prefiere que el suero alogenico sea autosuero del sujeto del que se recogen las celulas.
En este contexto, los ejemplos del marcador tumoral serico que va a examinarse en la presente invencion pueden incluir ferritina, CEA, AFP, BFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CA72-4, STN, DUPAN-2, SLX, ST-439, SPAN-1, SCC, PSA, G-seminoprotema, TPA, CYFRA, PAP, NSE, peptido C, PIVKA, Pro-GRP, HCGp, elastasa, p2 microglobulina, S-NTX, un anticuerpo anti-p53 y HER2. Los ejemplos de factores infecciosos pueden incluir HIV, ATL, HB, HC, sffilis y parvovirus humano B19.
La muestra usada en la presente invencion es un fluido de medula osea, o sangre (sangre periferica o sangre del cordon umbilical). La muestra recogida de un sujeto vivo se somete como muestra completa o, si es necesario, tras tratamiento (por ejemplo, retirada de componentes innecesarios, purificacion de una fraccion celular particular y tratamiento enzimatico) al metodo de crecimiento segun la presente invencion.
En la presente memoria descriptiva, la expresion “sin contacto sustancial (de las celulas) con un anticoagulante” significa que el anticoagulante se usa en una cantidad sustancialmente disminuida en cualquier momento desde la recogida de las celulas hasta el periodo de cultivo completo. Por ejemplo, esto significa un estado obtenido cuando: el anticoagulante se anade hasta el grado en el que la pared interna de un recipiente para recogida de celulas (tubo de recogida de sangre, etc.) se humedece con una disolucion de anticoagulante; no se anade anticoagulante; o el anticoagulante en la muestra se retira sustancialmente antes del inicio del cultivo.
Para obtener crecimiento celular mas rapido y masivo, se prefiere que la cantidad del anticoagulante anadido durante la recogida de la muestra fuese pequena. Para evitar la coagulacion, se trasladan inmediatamente las celulas recogidas (por ejemplo, en el plazo de 30 minutos) tras la recogida a la etapa de cultivo. Mas preferentemente, se evita el contacto sustancial de las celulas con el anticoagulante. Estos procedimientos producen una tasa de crecimiento sorprendentemente alta, que es de 3 a 100 veces mas alta que una convencional.
En un aspecto preferible de la presente invencion, la cantidad del anticoagulante anadido a la muestra recogida de un sujeto vivo (es decir, colocada previamente en un tubo de recogida de sangre para contener la muestra recogida) es menos de 0,2 U/ml, con respecto al volumen de la muestra.
La cantidad del anticoagulante presente en el medio durante el cultivo de las celulas en la muestra recogida de un sujeto vivo es menos de 0,02 U/ml, con respecto al volumen del medio. Mas espedficamente, la cantidad del anticoagulante anadido al tubo de recogida de sangre para recogida de muestras se reduce de antemano y/o la cantidad del anticoagulante anadido al medio se ajusta de manera que la cantidad del anticoagulante al inicio del cultivo es menos de 0,5 U/ml con respecto al volumen del medio.
Ademas, en la presente memoria descriptiva, el termino “anticoagulante” se refiere a una sustancia que, cuando esta presente en el fluido corporal o el medio, interacciona uniendose a la superficie de la celula con protemas de la
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matriz extracelular lo que tiene efectos de anti-coagulacion de la sangre e inhibe la adhesion entre las celulas y la matriz extracelular, entre las celulas, o entre las celulas y los sustratos. Segun la invencion se usan heparina y un derivado de heparina (por ejemplo, glucosaminoglucano que puede obtenerse por desulfatacion en la posicion 6 de la D-glucosamina que constituye la heparina; divulgado en la patente japonesa abierta a consulta por el publico n.°. 2005-218308A), o una sal de la misma.
En el metodo de la presente invencion, el medio para crecimiento celular no esta particularmente limitado siempre que el medio se use habitualmente en el campo del cultivo celular. Para obtener crecimiento mas rapido y masivo, es preferible un medio que contiene suero. El medio que contiene suero usado se basa en un medio convencional tal como se describe a continuacion en otros parrafos en el presente documento y se prepara anadiendo suero en una cantidad menor del 12 % al medio. Es mas preferible la cantidad mas pequena de suero teniendo en cuenta la carga de un individuo como un donante de suero. La cantidad del suero es preferentemente del 1 % al 20 % en volumen, mas preferentemente del 3 al 12 %, incluso mas preferentemente del 5 al 10 %, teniendo en cuenta el intervalo que produce el efecto deseado de promover rapidamente el crecimiento celular.
En el metodo de la presente invencion, el suero usado es suero de un mairnfero y suero de un individuo del que derivan las celulas (autosuero). Sin embargo, cuando las celulas que van a cultivarse son celulas humanas, puede ser diffcil recoger el autosuero. En un caso de este tipo, siempre que las celulas se cultiven sin contacto sustancial con el coagulante, puede conseguirse una elevada eficacia de crecimiento incluso usando suero de otro individuo de la misma especie que el humano (suero alogenico). Los efectos de la presente invencion provocados por la ausencia del anticoagulante se obtienen mas significativamente usando suero humano que usando, por ejemplo, FBS. El suero puede ser suero derivado de sangre periferica o puede ser suero derivado de la sangre cordon umbilical.
Las celulas que van a hacerse crecer mediante el metodo de la presente invencion solo necesitan ser celulas que se preparan a partir de una muestra que contiene componentes sangumeos y se cultivan por adhesion. Los ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a: celulas madre somaticas tales como celulas mesenquimatosas, celulas madre mesenquimatosas, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre de la sangre del cordon umbilical, celulas madre corneales, celulas madre hepaticas y celulas madre pancreaticas; monocitos de celulas madre embrionarias (excepto embriones humanos) tales como celulas madre fetales; y osteoblastos, fibroblastos, celulas de ligamento, celulas epiteliales y celulas endoteliales vasculares.
En un aspecto, el metodo de la presente invencion es adecuado para el crecimiento de celulas madre y se usa, por ejemplo, para hacer crecer celulas madre mesenquimatosas.
Las celulas madre mesenquimatosas son celulas madre que estan presentes en una cantidad traza en celulas intersticiales en tejidos mesenquimatosos y tienen pluripotencia y capacidad de autorreplicarse. Se ha encontrado en los ultimos anos que las celulas no solo se diferencian en celulas del tejido conjuntivo tales como osteocitos, condrocitos y adipocitos sino que tambien tienen potencia de diferenciacion en celulas neuronales o celulas miocardicas.
En un aspecto, el metodo de la presente invencion puede usarse para hacer crecer celulas humanas.
En otro aspecto de la presente invencion, las celulas que se hacen crecer pueden ser celulas de animales distintos de humanos (por ejemplo: roedores tales como ratones, ratas, cobayas y hamsteres; primates tales como chimpances; animales del orden Artiodactyla tales como vacas, cabras y ovejas; animales del orden Perissodactyla tales como caballos; y conejos, perros y gatos).
Ademas, en un aspecto del metodo de la presente invencion, las celulas madre pueden hacerse crecer en un estado indiferenciado.
En general, las celulas madre en un estado indiferenciado tienen una tasa de crecimiento mayor y una tasa de supervivencia mayor tras su introduccion en sujetos vivos. Por ejemplo, para el tratamiento de la encefalopatfa isquemica, que requiere un crecimiento celular rapido y masivo, pueden hacerse crecer las celulas madre recogidas hasta el numero necesario en un periodo de tiempo corto haciendolas crecer en un estado indiferenciado.
De forma alternativa, cuando se desea celulas diferenciadas en una especie celular dada, pueden hacerse crecer celulas madre o blastocitos masivamente en un estado indiferenciado y posteriormente inducirse a diferenciarse en la especie celular deseada, por ejemplo, mediante la adicion de un factor de crecimiento conocido que induce tal diferenciacion o mediante la transfeccion de un gen que tiene tales propiedades, para obtener una gran cantidad de celulas diferenciadas.
En un aspecto de la presente invencion, se prefiere que las celulas madre mesenquimatosas se subcultiven en el momento en que la densidad de las celulas en el medio alcanza las 5.500 celulas/cm2 o mas.
La densidad de las celulas en el medio influye en las propiedades de la celula y en la direccion de diferenciacion. Por ejemplo, en el cultivo de las celulas madre mesenquimatosas, las propiedades de las celulas se alteran cuando la
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densidad de las celulas en el medio supera las 8.500 celulas/cm2. Por tanto, se prefiere que las celulas se subcultiven a una densidad celular de 8.500 celulas/cm2 o menos como maximo, mas preferentemente, en el momento en que la densidad celular alcanza las 5.500 celulas/cm2 o mas.
Ademas, en un aspecto preferible de la presente invencion, se reemplaza el medio al menos una vez a la semana.
Se requiere el reemplazo del medio para suministrar un nutriente, un factor de crecimiento, una sustancia promotora del crecimiento y similares necesarios para el crecimiento y el cultivo celular y para retirar productos de desecho tales como el acido lactico formado por el metabolismo celular y mantener de ese modo el pH del medio a un nivel constante. El reemplazo del medio se realiza con un periodo seleccionado dependiendo del tipo de las celulas, las condiciones de cultivo, etc. En particular, cuando se usa un medio que contiene suero humano, son deseables menos reemplazos de medio teniendo en cuenta la carga del donante de suero. Por ejemplo, cuando se cultivan las celulas madre mesenquimatosas mediante el metodo de la presente invencion, el reemplazo del medio se realiza al menos una vez a la semana, mas preferentemente de una a dos veces a la semana. El metodo de la presente invencion reduce el periodo de cultivo requerido para obtener el numero de celulas necesario. Por tanto, puede reducirse la cantidad de suero que se usa mediante el reemplazo del medio.
En un aspecto preferible del metodo de la presente invencion, el subcultivo puede repetirse hasta que el numero total de celulas alcanza 100.000.000 celulas o mas.
El cultivo celular usando el metodo de la presente invencion produce una tasa de crecimiento de 3 a 100 veces mayor que la habitual. Por tanto, pueden obtenerse las celulas masivamente en un corto periodo. El numero necesario de celulas puede diferir dependiendo del proposito de uso de las celulas. Por ejemplo, se piensa que el numero de celulas madre mesenquimatosas que se requiere para trasplante para el tratamiento de la encefalopatfa isquemica atribuida a infarto cerebral es de 10.000.000 de celulas o mas. El uso del metodo de la presente invencion puede ofrecer normalmente 10.000.000 de celulas madre mesenquimatosas en 12 dfas. Hasta ahora no se ha conseguido un crecimiento celular tan rapido y se ha conseguido por primera vez mediante el metodo de la presente invencion. Ademas, las propias celulas obtenidas mediante este metodo tienen una eficacia de crecimiento excelente. Es sorprendente para los expertos en la tecnica que el cultivo en un medio que contiene suero sustancialmente libre de heparina pueda ofrecer celulas que tienen crecimiento celular tan rapido o una eficacia de crecimiento alta (crecimiento rapido).
Las celulas obtenidas mediante el metodo de la presente invencion son seguras con una potencia de diferenciacion alta. Los presentes inventores designaron las celulas como “celulas madre somaticas fundamentales”. Las “celulas madre somaticas fundamentales” obtenidas mediante el metodo de la presente invencion contienen genes particulares con niveles de expresion diferentes (la presencia o ausencia de expresion o expresion reducida/aumentada) de las celulas obtenidas mediante cultivo usando suero exogeno (por ejemplo, FBS).
Por ejemplo, la tabla 1 muestra el grupo de antigenos de la superficie celular (antigenos CD) expresados en las celulas cultivadas en autosuero y el grupo de antigenos CD no expresados en las celulas madre cultivadas en autosuero. Las celulas obtenidas mediante el metodo de la presente invencion se caracterizan porque al menos el 90 % de los antigenos CD se expresan en un grupo positivo descrito en la tabla 1 y al menos el 90 % de los antigenos CD en un grupo negativo no se expresan en las celulas. Las celulas obtenidas mediante el metodo de la presente invencion se caracterizan porque no se expresa el marcador de diferenciacion CD 24 expresado en celulas cultivadas en suero exogeno (por ejemplo, FBS). Esto muestra que las celulas segun la presente invencion mantienen un estado mas indiferenciado.
La tabla 3 muestra citocinas que presentaron expresion aumentada o disminuida en comun en los 5 casos. Ademas, la tabla 4 muestra un grupo de genes cuyo nivel de expresion difirio en dos veces o mas en comun en los 5 casos. Tal como se muestra en estas tablas, se expresan una serie de factores de crecimiento en las celulas obtenidas mediante el metodo de la presente invencion, y, particularmente para EGF, su nivel de expresion es mayor que en un metodo de cultivo que usa suero exogeno (por ejemplo, FBS). Esto sugiere probablemente la causa para la ventaja de que las celulas de la presente invencion crezcan.
Ademas, la tabla 2 muestra factores relacionados con factores de crecimiento que presentaron expresion aumentada o disminuida en comun en los 5 casos que implican las celulas cultivadas en FBS y las celulas cultivadas en autosuero. Tal como se muestra en esta tabla, las celulas obtenidas mediante el metodo de la presente invencion tienen una expresion mas baja de un grupo de genes relacionados con cancer o un nivel de expresion de los mismos mas bajo que el obtenido en un metodo de cultivo que usa suero exogeno (por ejemplo, FBS). Los ejemplos de los genes relacionados con cancer que no son preferibles pueden incluir EWI-FLI-1, FUS-CHOP, EWS-ATF1, SYT-SSX1, PDGFA, FLI-1, FEV, ATF-1, WT1, NR4A3, CHOP/DDIT3, FUS/TLS, BBF2H7, CHOP, MDM2, CDK4, HGFR, c-met, PDGFa, HGF, GFRA1, FASN, HMGCR, RGS2, PPARy, YAP, BIRC2, lumican, caldesmon, ALCAM, Jam-2, Jam-3, cadherina II, DKK1, Wnt, nucleostemina, neurofibromina, RB, CDK4, p16, MYCN, telomero, hTERT, ALT, Ras, TK-R, CD90, CD105, CD133, VEGFR2, CD99, ets, ERG, ETV1, FEV, ETV4, MYC, EAT-2, MMP-3, FRINGE, ID2, CCND1, TGFBR2, CDKNIA, p57, p19, p16, p53, IGF-1, c-myc, p21, ciclina D1, y p21.
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En la presente memoria descriptiva, el termino “nivel de expresion disminuido (o aumentado)” quiere decir que la “razon de registro de senal” basandose en un algoritmo bien conocido en la tecnica (algoritmo GeneChip (AFFYMETRIX, Inc.) es “-1<” o “1<” (es decir, la razon del nivel de expresion del gen entre el nivel inicial y el conjunto de experimented es de dos veces o mas (tabla 5)), mas preferentemente, “-2<” o “2<” (es decir, la razon del nivel de expresion del gen entre el nivel inicial y el conjunto de experimented es de cuatro veces o mas). El termino “gen descrito en la tabla” usado en el presente documento quiere decir un gen identificado mediante “ID del conjunto de sonda” descrito en esta tabla (este gen incluye variantes que conservan las funciones del gen). Estos genes se corresponden con los genes representados por el sfmbolo del gen. El sfmbolo del gen es un nombre asociado unicamente con cada gen por NCBI, US. Los detalles de la ID del conjunto de sonda y el sfmbolo del gen se describen en la base de datos NetAffx de AFFYMETRIX, Inc. y los expertos en la tecnica los entienden facilmente. El termino “variantes” usado para genes se usa de manera intercambiable con el termino “variantes de gen” y quiere decir cualquiera de (i) los que comprenden una secuencia de nucleotidos derivada de la secuencia de nucleotidos del gen identificado mediante la delecion, sustitucion o adicion de una o mas bases, (ii) los que comprenden una secuencia de nucleotidos capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con el gen identificado, y (iii) los que comprenden una secuencia de nucleotidos que tiene al menos una identidad del 80 % con la secuencia de nucleotidos del gen identificado. Todas estas variantes conservan las funciones del gen identificado. El termino “funciones del gen” usado en el presente documento se usa de manera intercambiable con el termino “funciones de una protema codificada por el gen”. Una protema codificada por el “gen descrito en la tabla” es una protema que tiene funciones bien conocidas, y tambien son bien conocidos en la tecnica sistemas de ensayo para confirmar las funciones. Por consiguiente, los expertos en la tecnica pueden usar tecnicas bien conocidas en la tecnica para preparar facilmente tales variantes de gen y para confirmar facilmente sus funciones. Por ejemplo, los procedimientos espedficos de hibridacion y las condiciones de hibridacion “rigurosas” pueden realizarse segun metodos bien conocidos en la tecnica, tales como los metodos descritos en “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, J. Sambrook y D. W. Russell, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY (2001)” (incorporado en el presente documento como referencia).
En la presente invencion, se pretende que el grupo de antfgenos CD se confirme como “expresados” o “no expresados” basandose en los resultados obtenidos usando el modo analisis en el programa de funcionamiento GeneChip (GCOS) de Affymetrix, Inc. Ademas, las protemas codificadas por las variantes del gen que conservan las funciones del gen descrito en la tabla pueden ser variantes de la protema codificada por el gen descrito en la tabla. El termino “variantes” usado para protemas se usa de manera intercambiable con el termino “variantes de protema” y quiere decir los que comprenden una secuencia de aminoacidos derivada de la secuencia de aminoacidos de la protema codificada por el gen identificado, mediante la delecion, sustitucion o adicion de uno o mas aminoacidos. Los expertos en la tecnica pueden usar tambien tecnicas bien conocidas en la tecnica para preparar facilmente tales variantes de protema y para confirmar facilmente sus funciones.
Las celulas segun la presente invencion son celulas que tienen la capacidad de crecer disponibles para su uso en la reparacion y regeneracion de tejido. Los ejemplos de celulas de donante usadas en la reparacion y regeneracion de tejido incluyen celulas madre tisulares autologas o alogenicas o celulas madre somaticas o celulas madre embrionarias. Por consiguiente, las celulas segun la presente invencion pueden ser celulas derivadas de celulas madre tisulares, celulas madre somaticas o celulas madre embrionarias. Las celulas segun la presente invencion son preferentemente celulas autologas, particularmente, celulas derivadas de celulas madre somaticas (por ejemplo, celulas de medula osea) que pueden asegurar las celulas de donante de manera no invasiva, teniendo en cuenta problemas eticos, riesgos de infeccion, necesidad de usar agentes inmunosupresores, etc.
Las celulas madre tisulares, celulas madre somaticas o celulas madre embrionarias pueden suministrarse del tejido o el fluido corporal de un individuo mairnfero. Los ejemplos del tejido preferible como fuente de estas celulas incluyen tejidos musculares, tejidos oseos, tejidos adiposos, piel, tejidos linfaticos, conductos vasculares, organos digestivos, ratees del pelo, pulpa dental y embriones (excepto embriones humanos). Los ejemplos de los fluidos corporales preferibles como fuente incluyen un fluido de medula osea, sangre (sangre periferica o sangre del cordon umbilical), y linfa. En particular, cuando el sujeto que va a repararse y regenerarse es tejido del sistema nervioso, los ejemplos de la fuente de las celulas de donante incluyen medula osea, sangre periferica, sangre del cordon umbilical, embriones fetales y cerebro. Cuando el sujeto que va a repararse y regenerarse es un tejido hematopoyetico, los ejemplos de la fuente incluyen medula osea, sangre periferica, sangre del cordon umbilical y embriones fetales. Los expertos en la tecnica pueden usar tecnicas bien conocidas en la tecnica para preparar facilmente las celulas deseadas.
Las celulas segun la presente invencion son celulas disponibles para su uso en la reparacion y regeneracion de tejido y son por tanto, preferentemente, celulas adherentes, mas preferentemente celulas derivadas de, por ejemplo: celulas madre somaticas tales como celulas mesenquimatosas, celulas madre mesenquimatosas, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre de la sangre del cordon umbilical, celulas madre corneales, celulas madre hepaticas y celulas madre pancreaticas; monocitos de celulas madre embrionarias (excepto embriones humanos) tales como celulas madre fetales; y osteoblastos, fibroblastos, celulas de ligamento, celulas epiteliales y celulas endoteliales vasculares. Con el proposito de usar las celulas en el tratamiento de una enfermedad neurologica en la fase aguda, se prefiere que las celulas segun la presente invencion se deriven de celulas madre, particularmente, de celulas madre mesenquimatosas. Las celulas madre mesenquimatosas son celulas madre que estan presentes en
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una cantidad traza en las celulas intersticiales en tejidos mesenquimatosos y tiene pluripotencia y la capacidad de autorreplicarse. Se ha encontrado en los ultimos anos que las celulas no solo se diferencian en celulas del tejido conjuntivo tales como osteocitos, condrocitos y adipocitos sino que tambien tienen potencia de diferenciacion en celulas neuronales o celulas miocardicas. En este contexto, las celulas madre en un estado indiferenciado tienen una tasa de crecimiento mayor y una tasa de supervivencia mayor tras su introduccion en sujetos vivos. Por tanto, se prefiere que las celulas segun la presente invencion sean celulas en un estado indiferenciado derivadas de celulas madre.
Las celulas segun la presente invencion son preferentemente celulas derivadas de humano y pueden ser celulas derivadas de mairnferos distintos de humanos (por ejemplo: roedores tales como ratones, ratas, cobayas y hamsteres; primates tales como chimpances; animales del orden Artiodactyla tales como vaca, cabras y ovejas; animales del orden Perissodactyla tales como caballos; y conejos, perros, y gatos).
El autosuero usado en el presente documento es suero de un individuo del que se derivan las celulas (autosuero). Sin embargo, puede obtenerse tambien una tasa de crecimiento elevada usando suero de otros humanos adultos cuando el uso del autosuero es diffcil.
Tal como se describio anteriormente, las celulas segun la presente invencion tienen una tasa de crecimiento mayor en presencia de suero alogenico, particularmente, autosuero, que en presencia de suero exogeno. Ademas, las celulas segun la presente invencion son celulas seguras que se mantienen en un estado mas indiferenciado con alta potencia de diferenciacion. El medio usado en el cultivo celular segun la presente invencion se selecciona adecuadamente de entre diversos medios convencionales conocidos en la tecnica (por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), NPBM y aMEM) segun el tipo de las celulas, el nivel de diferenciacion y la direccion deseada, una tasa de crecimiento necesaria, etc. Preferentemente se usa DMEM.
En un aspecto, las celulas cultivadas mediante el metodo de la presente invencion pueden usarse en la produccion de una preparacion farmaceutica para reparacion/regeneracion de tejido.
Un farmaco terapeutico que comprende las celulas obtenidas mediante el metodo de crecimiento de la presente invencion como principio activo, cuando se administra a un sujeto, puede reparar y regenerar un tejido como un sujeto que ha perdido su funcion. En particular, cuando se usan celulas madre mesenquimatosas, puede repararse y regenerarse un tejido cerebral en encefalopatfa isquemica (vease el documento WO02/00849A1). La reparacion y regeneracion de tejido usadas en el presente documento son sinonimos de reparacion y regeneracion de las funciones. Los efectos terapeuticos de, por ejemplo, la reparacion/regeneracion de un tejido del sistema nervioso abarca efectos neuroprotectores (por ejemplo, nueva mielinizacion de axones), efectos neurotroficos (por ejemplo, reposicion de neurogliocitos), angiogenesis cerebral, regeneracion nerviosa, etc. Espedficamente, los efectos terapeuticos de la preparacion farmaceutica que comprende las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion significan la reparacion/regeneracion de tejido como entidad y la reparacion/regeneracion de la disfuncion del tejido como fenomeno. Cuando se usan las celulas crecidas para reparacion/regeneracion de tejido, se prefiere que la fuente de celulas de donante se confirme de antemano mediante examen de la sangre periferica para no infectarse con HIV, ATL, HB, HC, sffilis, parvovirus humano B19, y similares.
Ademas, en un aspecto, las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion pueden usarse en el diagnostico de una enfermedad o infeccion con patogenos. Por ejemplo, puede diagnosticarse el riesgo de cancer examinando el estado de los genes relacionados con cancer contenidos en las celulas que se recogen de un sujeto y se hacen crecer ex vivo.
Ademas, es diffcil detectar una enfermedad prionica en un sujeto mediante los metodos de examen habituales. Sin embargo, puede diagnosticarse tal enfermedad prionica haciendo crecer celulas mediante el metodo de la presente invencion y de este modo amplificar rapidamente los priones anomalos hasta un nivel igual a o mayor que la sensibilidad de deteccion.
De forma alternativa, las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion pueden usarse en experimentos in vivo o in vitro.
Los ejemplos de la preparacion farmaceutica para la reparacion/regeneracion de tejido que comprende las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, inyecciones (por ejemplo, inyecciones que contienen celulas progenitoras neurales, celulas madre hematopoyeticas, celulas hepaticas, celulas pancreaticas o linfocitos) e implantes para trasplante (por ejemplo, capas de celulas miocardicas, piel artificial, cornea artificial, rafces dentales artificiales y articulaciones artificiales) que comprenden las celulas crecidas ex vivo usando el metodo de la presente invencion en combinacion con diluyentes, excipientes y/o bases farmaceuticamente aceptables.
La preparacion farmaceutica que comprende las celulas cultivadas mediante el metodo de la presente invencion puede usarse para la reparacion/regeneracion de un tejido del sistema nervioso. Por ejemplo, pueden hacerse crecer celulas madre mesenquimatosas autologas y usarse en una preparacion farmaceutica para el tratamiento de
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enfermedad neurologica isquemica. En un aspecto preferible, las celulas contenidas en la preparacion farmaceutica son celulas derivadas de un sujeto al que se le administran las celulas (celulas autologas).
Los ejemplos de enfermedad del sistema nervioso seleccionada como diana por tal terapia celular incluyen, pero no se limitan a, enfermedades desmielinizantes centrales y perifericas, enfermedades degenerativas centrales y perifericas, apop^a cerebral (incluyendo infarto cerebral, hemorragia cerebral y hemorragia subaracnoidea), tumor cerebral, disfuncion superior que incluye demencia, enfermedades psiquiatricas, epilepsia, enfermedad traumatica del sistema nervioso (incluyendo traumatismo craneoencefalico, contusion cerebral y lesion de medula espinal), fractura de la medula espinal, y enfermedades prionicas (por ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, enfermedad de kuru, encefalopatfa espongiforme bovina, y encefalopatfa espongiforme ovina).
Las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion son utiles tambien para el tratamiento de enfermedades distintas de enfermedades del sistema nervioso. Para el tratamiento de, por ejemplo, la leucemia aguda, pueden hacerse crecer celulas madre hematopoyeticas ex vivo y trasplantarse en medula osea. El trasplante habitual de medula osea requiere normalmente 2x108 celulas para autotrasplante y 4x108 celulas para alotrasplante, por peso corporal de un receptor, y por tanto la cantidad de un fluido de medula osea recogido de un donante de celulas puede alcanzar los 1000 ml. Sin embargo, la carga ffsica del donante de celulas puede reducirse haciendo crecer rapidamente las celulas ex vivo usando el metodo de la presente invencion. Ademas, para el tratamiento de una infeccion viral o similar, pueden hacerse crecer ex vivo linfocitos T recogidos de la sangre periferica de un paciente usando el metodo de la presente invencion y trasplantarse a este paciente.
La fuente de celulas de donante usadas en la reposicion de celulas para reparacion/regeneracion de tejido puede derivarse de celulas madre tisulares autologas o alogenicas o celulas madre somaticas, o celulas madre embrionarias. Es preferible una terapia de autotrasplante que usa celulas autologas, particularmente, celulas derivadas de celulas madre somaticas (por ejemplo, celulas de medula osea) que pueden asegurar las celulas de donante de manera no invasiva teniendo en cuenta problemas eticos, riesgo de infeccion y dificultad tal como la necesidad de usar agentes inmunosupresores. Pueden usarse las celulas derivadas de otros humanos u otros animales cuando la terapia de autotrasplante es diffcil. Las celulas de donante pueden ser celulas contenidas en una muestra recogida inmediatamente antes del cultivo o pueden ser celulas conservadas criogenicamente siempre que la cantidad del anticoagulante contenido en la muestra al inicio del cultivo sea de menos de 5 U/ml. De forma alternativa, pueden hacerse crecer celulas autologas de antemano, despues conservarse criogenicamente y administrarse en el momento del tratamiento de la enfermedad, tal como se muestra en, por ejemplo, un modelo terapeutico que usa un sistema de soporte de administracion celular terapeutico descrito en el documento WO 2005/001732A1.
La fuente de las celulas es de manera deseable aquella que contiene celulas que ya se sabe que se diferencian en una especie celular de un tejido particular que va a repararse/regenerarse, por ejemplo, celulas de la misma capa germinativa o celulas madre totipotenciales. Sin embargo, se ha encontrado tambien que las celulas madre diferenciadas en cierto grado en una capa germinativa diferente (por ejemplo, celulas el tngado fetal) vuelven a diferenciarse en otras celulas tisulares tales como celulas del sistema nervioso (por ejemplo, celulas descritas en el documento WO 02/00849A1). Teniendo en cuenta este hallazgo, pueden usarse tejidos que contienen celulas de una capa germinativa diferente siempre que pueda inducirse que las celulas se diferencien en la especie de celula deseada usando un factor inductor de diferenciacion o similar conocido en la tecnica.
Cuando el tejido que va a repararse es un tejido del sistema nervioso, los ejemplos de la fuente de las celulas de donante incluyen celulas derivadas de medula osea, sangre periferica, sangre del cordon umbilical, embriones fetales y cerebro. Cuando el tejido que va a repararse es un tejido hematopoyetico, los ejemplos de la fuente incluyen celulas madre hematopoyeticas y celulas madre de la sangre del cordon umbilical contenidas en medula osea, sangre periferica, sangre del cordon umbilical o embriones fetales.
El uso de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea para la reparacion de un tejido del sistema nervioso tiene, por ejemplo, las siguientes ventajas: 1) puede esperarse que las celulas produzcan efectos significativos, 2) conllevan riesgo bajo de efectos secundarios, 3) puede esperarse que se suministren suficientes celulas de donante, 4) consiguen tratamiento no invasivo y autotrasplante; por tanto 5) tal terapia celular conlleva riesgo de infeccion bajo, 6) no esta en peligro de rechazo inmunologico, 7) no produce problemas eticos, 8) se acepta facilmente por la sociedad y 9) se establece amplia y facilmente como atencion medica general. Ademas, la terapia de trasplante de medula osea es un tratamiento que ya se usa en la practica clmica y que se ha confirmado que es seguro. Ademas, las celulas madre derivadas de medula osea, que tienen elevadas propiedades de migracion, pueden llegar al tejido danado deseado no solo mediante trasplante local sino tambien mediante administracion intravenosa para ejercer luego sus efectos terapeuticos en el mismo.
El fluido de medula osea puede recogerse, por ejemplo, anestesiando de manera local o sistemica animales que sirven como fuente de recogida (incluyendo humanos) e insertando una aguja en el esternon o en el ilion, seguido por succion usando una jeringa. Ademas, una tecnica establecida para la sangre del cordon umbilical comprende insertar directamente una aguja en el cordon umbilical de un bebe recien nacido, recoger a continuacion la sangre del cordon umbilical por succion usando una jeringa, y almacenar la sangre del cordon umbilical recogida. En
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metodos convencionales, se usa un anticoagulante para evitar que componentes sangumeos coagulen en el fluido de medula osea recogido. En cambio, en el metodo de la presente invencion, no tiene que usarse un anticoagulante de este tipo, tal como se describio anteriormente.
Un posible metodo para administrar, a un tejido danado, la preparacion farmaceutica que comprende las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion es, por ejemplo, trasplante local por medios quirurgicos, administracion intravenosa, administracion mediante puncion lumbar, administracion mediante inyeccion local, administracion hipodermica, administracion intradermica, administracion intraperitoneal, administracion intramuscular, administracion intracerebral, administracion intracerebroventricular o administracion venosa. Ademas, las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion pueden contenerse o sembrarse en implantes, bases de capa celular, articulaciones artificiales o similares y trasplantarse a un sujeto vivo.
Por ejemplo, cuando se usan las celulas para la reparacion del sistema nervioso, el trasplante celular a un paciente mediante inyeccion puede realizarse: llenando una jeringa con las celulas que van a trasplantarse, en un estado flotante usando un lfquido cefalorraqrndeo artificial, solucion salina, o similar; exponiendo un tejido nervioso danado por cirugfa; e inyectando directamente el contenido de la jeringa a este sitio de lesion. Las celulas que tienen propiedades de migracion suficientemente altas para poderse mover en un tejido (por ejemplo, celulas describas en el documento WO 02/00849A1) pueden trasplantarse en las proximidades de un sitio de lesion. Ademas, puede esperarse que tales celulas ejerzan sus efectos incluso mediante inyeccion en lfquido cefalorraqrndeo. En este caso, las celulas pueden inyectarse mediante puncion lumbar habitual y son por tanto preferibles porque el paciente no tiene que operarse y can puede tratarse solo con anestesia local en una sala de hospital. Ademas, tambien puede esperarse que las celulas ejerzan sus efectos mediante inyeccion intravenosa. Por tanto, las celulas son preferibles desde el punto de vista de permitir el trasplante por la manera habitual de transfusion y conseguir procedimientos de trasplante en una sala.
El medio adecuado para el crecimiento celular segun la presente invencion se selecciona segun el tipo de las celulas, el nivel diferenciacion y la direccion deseada, una tasa de crecimiento necesaria,, etc. Los ejemplos de un medio adecuado para hacer crecer celulas madre mesenquimatosas usado para la reparacion del sistema nervioso incluyen, pero no se limitan a, medio basal progenitor neural (NPBM: fabricado por Clontech) y medio aMEM, ademas del medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mostrado a continuacion. Un medio convencional de este tipo se complementa con suero tal como se describio anteriormente y se complementa adicionalmente, si es necesario, con un factor nutricional (por ejemplo, aminoacidos), un antibiotico, un factor de crecimiento y/o una sustancia promotora del crecimiento y similares.
Los ejemplos espedficos del medio convencional incluyen medio modificado por Dulbecco que contiene los siguientes componentes a las siguientes concentraciones (mg/l):
CaCl2 (anhidro): de 160 a 240
KCl: de 320 a 480
Fe(NOa)3-9H2O: de 0,08 a 1,2
MgSO4 (anhidro): de 80 a 120
NaCl: de 5120 a 7680
NaHCO3: de 2960 a 4440
NaH2PO4H2O: de 100 a 150
D-glucosa: de 3600 a 5400
Rojo de fenol: de 12 a 18
Piruvato de sodio: de 88 a 132
L-argininaHCl: de 67 a 101
L-cistema-2HCl: de 50 a 76
L-histidina HCl H2O: de 34 a 50
L-isoleucina: de 84 a 126
L-leucina: de 84 a 126
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L-lisinaHCl: de 117 a 175 L-metionina: de 24 a 36 L-fenilalanina: de 53 a 79 L-serina: de 34 a 50 L-treonina: de 76 a 114 L-triptofano: de 13 a 19 L-tirosina (sal disodica): de 83 a 125 L-valina: de 75 a 113 Cloruro de colina: de 3,2 a 4,8 Acido D-Ca-pantotenico: de 3,2 a 4,8 Acido folico: de 3,2 a 4,8 i-inositol: de 5,8 a 8,6 Niacinamida: de 3,2 a 4,8 PiridoxalHCl: de 3,2 a 4,8 Riboflavina: de 0,3 a 0,5 TiaminaHCl: de 3,2 a 4,8
Si se desea, pueden usarse antibioticos usados habitualmente en el campo del cultivo celular (por ejemplo, penicilina y estreptomicina) solos o en combinacion. Es preferible el uso combinado de una pluralidad de antibioticos. Por ejemplo, cuando se usan penicilina y estreptomicina en combinacion, sus cantidades son respectivamente del 0,5 al 2 % en volumen, preferentemente del 0,8 al 1,2 % en volumen, con respecto al volumen del medio.
Los ejemplos de aminoacidos de escasa masa molecular contenidos en el medio incluyen L-alanina, L-aspartato, L- cistema, L-glutamina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-tirosina, L-valina, acido L-ascorbico y acido L-glutamico. Estos aminoacidos estan contenidos como nutrientes en un medio usado habitualmente en el campo del cultivo celular.
Ademas, los presentes inventores han encontrado que la adicion de glutamina en una cantidad del 0,1 al 2 % (peso/volumen) de la cantidad completa del medio es esencial para un rapido crecimiento de las celulas madre mesenquimatosas y han encontrado ademas que la reposicion de glutamina para mantener la cantidad del 0,1 al 2 % (peso/volumen) en el medio promueve ademas un rapido crecimiento.
El medio convencional puede complementarse, si es necesario, con un factor de crecimiento, una sustancia promotora del crecimiento y/o un factor inductor de diferenciacion. El factor de crecimiento, la sustancia promotora del crecimiento y el factor inductor de diferenciacion se seleccionan segun el nivel de diferenciacion y la direccion deseada, una tasa de crecimiento necesaria,, etc. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a: vitaminas tales como acido ascorbico y nicotinamida; factores neurotroficos tales como NGF y BDNF; factores osteogenicos tales como BMP; y citocinas tales como sustancias promotoras del crecimiento de celulas epiteliales, sustancia basica promotora del crecimiento de fibroblastos, sustancia promotora del crecimiento de tipo insulina e IL- 2.
El metodo de cultivo celular de la presente invencion se realiza espedficamente, por ejemplo, tal como sigue:
1. Se anade una muestra recogida de un sujeto vivo usando una jeringa cuya pared interna se humedece con una disolucion de heparina tal como se describio anteriormente a una razon de dilucion del orden de 100 veces o menos, preferentemente 10 veces o menos, de manera mas preferible aproximadamente de 2 veces a 6 veces, a un medio mantenido de antemano a 37+0,5 °C. Luego se siembra la disolucion en una placa de cultivo y se incuba a 37+0,5 °C en el 5 % de CO2. Se reemplaza el medio al menos una vez a la semana, normalmente de una a dos veces a la semana. Se prepara el medio anadiendo suero y los adyuvantes necesarios para un medio convencional adecuado,
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despues se esteriliza usando un esterilizador por filtracion y se divide en pequenas porciones, que se almacenan a continuacion en una caja fna a 4 °C. Se mantiene el medio a 37+0,5 °C de antemano y despues se usa. A una temperatura que supera 37,5 °C, muere el numero aumentado de celulas. En cambio, a una temperatura mas baja de 36,5 °C, las celulas crecen rapidamente. La concentracion de CO2 esta preferentemente en el intervalo del 5+1 %. En todas las etapas, se mantiene una disolucion en contacto con las celulas en este intervalo de temperatura. Como resultado, se promueve un rapido crecimiento.
2. Se confirma que las celulas se adhieren a la base de la placa de cultivo. Luego, se separan el medio y los componentes de celulas de la sangre que flotan en el medio y se extraen por succion. Posteriormente, la superficie de las celulas madre adherentes se lava con solucion salina tamponada con fosfato como lavado.
3. Se subcultivan las celulas en el momento en que la densidad de las celulas en la placa alcanza las 5.500 celulas/cm2 o mas, como directriz, es decir, en el momento en que las celulas alcanzan del 60 al 80 %, preferentemente del 65 al 75 % de confluencia para que no superen la densidad celular de 8.500 celulas/cm2. Para el subcultivo, se anade un agente de disociacion compuesto principalmente por tripsina y opcionalmente por EDTA (etilendiaminotetraacetato) en una cantidad de 3 ml/placa. Tras la incubacion a 37+5 °C durante de 3 a 5 minutos, se confirma que las celulas madre adherentes se disocian de la placa. El medio se reemplaza con una disolucion de separacion por decantacion, y se transfieren las celulas en el medio a un tubo de centnfuga predeterminado y sedimentan por centrifugacion, seguido de subcultivo. Se repite el ciclo que implica cultivo, reemplazo del medio y subcultivo al menos hasta que el numero total de las celulas madre mesenquimatosas alcance las 100.000.000 celulas o mas. El reemplazo del medio se realiza al menos una vez a la semana.
Se repite este ciclo para obtener rapidamente el numero de celulas previsto (por ejemplo, para celulas madre mesenquimatosas, pueden obtenerse 1x108 celulas en el plazo de 2 semanas).
Si se desea, puede usarse un material de soporte celular para facilitar la disociacion de las celulas tras el crecimiento. Los ejemplos preferibles del material de soporte incluyen, pero no se limitan a, ceramicas inorganicas porosas, micropilares (por ejemplo, la placa de cultivo celular Nanopillar fabricada por Hitachi, Ltd.), tela no tejida y pelfculas de membrana en panal de abeja.
En un aspecto de la presente invencion, las celulas que van a cultivarse pueden transfectarse de antemano con, por ejemplo, genes que inducen crecimiento y diferenciacion, tales como genes de BDNF, PLGF, GDNF o IL-2. De forma alternativa, las celulas que van a cultivarse pueden ser celulas inmortalizadas transfectadas con genes de inmortalizacion tales como genes de telomerasa. La transfeccion de tales genes se divulga en, por ejemplo, el documento WO03/038075A1.
Los expertos en la tecnica pueden seleccionar, sin problemas, una combinacion que produce la tasa de crecimiento deseada y/o induce diferenciacion en una especie celular particular, de entre los medios, los materiales de soporte, los adyuvantes, los factores de crecimiento y/o la transfeccion genica facilitados a modo de ejemplo anteriormente.
Las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion pueden administrarse directamente para reparacion/regeneracion de tejido. Para mejorar la eficacia terapeutica, pueden administrarse o trasplantarse las celulas como una composicion complementada de manera arbitraria con diversos agentes o tras la transfeccion genica. Los ejemplos de posibles enfoques para este fin incluyen, pero no se limitan a: adicion de sustancias que mejoran adicionalmente la tasa de crecimiento, en un tejido, de las celulas crecidas mediante el metodo de la presente invencion, sustancias que promueven su diferenciacion en las celulas deseadas, o sustancias que mejoran su tasa de supervivencia en un tejido y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos; adicion de sustancias que tienen el efecto de bloquear la mala influencia de un tejido biologico en las celulas trasplantadas y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos; adicion de sustancias que prolongan la vida de las celulas de donante y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos; adicion de sustancias que ajustan el ciclo de la celula y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos; adicion de sustancias destinadas a inhibir los inmunocitos y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos; adicion de sustancias que activan el metabolismo energetico y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos; adicion de sustancias que mejoran la actividad quimiotactica de las celulas de donante en un tejido y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos; y adicion de sustancias que mejoran el flujo sangumeo y/o transfeccion con genes que tienen tales efectos.
El cultivo celular se realiza, preferentemente, en un centro de procesamiento celular (CPC) segun las BPF. Se prefiere que se prepare un “grado clmico de celulas” que va a administrarse a un sujeto en una instalacion especial disenada para la manipulacion celular en un estado esteril, mas espedficamente, un CPC que tiene la limpieza garantizada usando aire acondicionado, control de presion de la camara, control de temperatura y humedad, contadores de partfculas, filtros HEPA, etc. Ademas, se prefiere que se garantice el rendimiento mediante validacion no solo para la propia instalacion CPC, sino tambien para todos los instrumentos usados en el CPC y sus funciones siempre deben monitorizarse y grabarse. Es deseable que todos los procedimientos de procesamiento de celulas en el CPC se controlen y registren estrictamente segun el “manual convencional”.
La preparacion farmaceutica descrita en el presente documento puede contener, como componente celular, una
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especie celular distinta de celulas madre mesenquimatosas. Sin embargo, es preferible que las celulas madre mesenquimatosas ocupen una elevada proporcion con respecto a los componentes celulares. Por tanto, en un aspecto preferible de la preparacion farmaceutica, la proporcion del numero de las celulas madre mesenquimatosas con respecto al numero total de celulas contenidas en la preparacion farmaceutica es el 50 % o mas, preferentemente el 75 % o mas, mas preferentemente el 80 % o mas, incluso mas preferentemente el 90 % o mas, preferentemente de manera adicional el 95 % o mas, preferentemente de manera particular el 98 % o mas. Lo mas preferentemente, el medio esta sustancialmente libre de una especie celular distinta de celulas madre mesenquimatosas, por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas. Puede determinarse facilmente la proporcion de las celulas madre mesenquimatosas en los componentes celulares, por ejemplo, etiquetando las celulas contenidas en la preparacion farmaceutica con anticuerpos de etiquetado frente a uno o mas marcadores (por ejemplo, antigenos de superficie tales como CD105, CD73, CD166, CD9 y CD157) espedficos para celulas madre mesenquimatosas y analizando las celulas etiquetadas mediante citometna de flujo o similar.
Es mas preferible un mayor numero de celulas madre mesenquimatosas contenidas en la preparacion farmaceutica. Sin embargo, el numero de las celulas es practicamente la cantidad eficaz minima teniendo en cuenta el momento de la administracion a un sujeto y el tiempo requerido para el cultivo. Por tanto, en un aspecto preferible de la preparacion farmaceutica, el numero de las celulas madre mesenquimatosas es 107 celulas o mas, preferentemente 5x107 celulas o mas, mas preferentemente 108 celulas o mas, incluso mas preferentemente 5x108 celulas o mas.
Las especies celulares distintas de celulas madre mesenquimatosas, cuando se desea que ayuden en la reparacion de un tejido nervioso, son celulas que se obtienen por separacion de, por ejemplo, medula osea, sangre del cordon umbilical, sangre periferica, o hngado fetal y son capaces de diferenciarse en celulas del sistema nervioso. Los ejemplos de las mismas pueden incluir, pero no se limitan a, celulas intersticiales caracterizadas por Lin-, Sca-1+, CD10+, CD11D+, CD44+, CD45+, CD71+, CD90+, CD105+, CDW123+, CD127+, CD164+, fibronectina+, ALPH+ y colagenasa-1+, y celulas caracterizadas por AC133+. De forma alternativa, pueden usarse otras especies celulares arbitrarias capaces de diferenciarse en celulas del sistema nervioso.
Las celulas intersticiales pueden obtenerse, por ejemplo, seleccionando celulas que tienen un marcador de superficie celular tal como CD45, de una fraccion celular obtenida por centrifugacion de celulas de medula osea o celulas de la sangre del cordon umbilical. De forma alternativa, estas celulas pueden prepararse tambien sometiendo las celulas de medula osea o las celulas de la sangre del cordon umbilical recogidas de vertebrados a centrifugacion en gradiente de densidad a 800 g en una disolucion durante un tiempo suficiente para la separacion segun la gravedad y, tras la centrifugacion, recoger una fraccion celular que tiene una gravedad dada que cae en el intervalo de gravedad de 1,07 a 1,1 g/ml. En este contexto, el termino “tiempo suficiente para separacion segun la gravedad” significa un tiempo suficiente para que las celulas ocupen la posicion, segun su gravedad, en la disolucion para centrifugacion en gradiente de densidad y habitualmente es de aproximadamente 10 a 30 minutos. La gravedad de la fraccion celular que va a recogerse esta, preferentemente, en el intervalo de 1,07 a 1,08 g/ml, por ejemplo, 1,077 g/ml. Los ejemplos de la disolucion para centrifugacion en gradiente de densidad que pueden usarse pueden incluir, pero no se limitan a, soluciones Ficoll y Percoll.
Espedficamente, un fluido de medula osea o sangre del cordon umbilical recogido de vertebrados se mezcla en primer lugar con la misma cantidad de una disolucion (PBS+ BSA al 2 % + citrato de sodio al 0,6 % + penicilina- estreptomicina al 1 %). Una alfcuota de 5 ml de la misma se mezcla con una solucion Ficoll+Paque (1,077 g/ml) y se centrifuga (800 g durante 20 minutos) para extraer una fraccion de monocitos. Esta fraccion de monocitos se mezcla con una disolucion de cultivo para lavado celular (aMEM, FBS al el 12,5 %, suero de caballo el 12,5 %, i-inositol al 0,2 %, acido folico 20 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, L-glutamina 2 mM, hidrocortisona 1 |iM, y disolucion antibiotica-antimicotica al 1 %) y se centrifuga (2000 rpm durante 15 minutos). Posteriormente, se retira el sobrenadante tras la centrifugacion y, a continuacion, se recogen las celulas precipitadas y se cultivan (a 37 °C, el 5 % de CO2).
Pueden obtenerse las celulas AC133+, por ejemplo, seleccionando celulas que tienen un marcador de superficie celular AC133, de una fraccion celular obtenida por centrifugacion de celulas de medula osea, celulas de la sangre del cordon umbilical o celulas de la sangre periferica. Ademas, en un aspecto alternativo, estas celulas pueden prepararse tambien: sometiendo las celulas de tngado fetal recogidas de vertebrados a centrifugacion en gradiente de densidad a 2000 rpm en una disolucion durante un tiempo suficiente para separacion segun la gravedad; tras la centrifugacion, recogiendo una fraccion celular que tiene una gravedad dada que cae en el intervalo de gravedad de 1,07 a 1,1 g/ml; y recogiendo las celulas caracterizadas por AC133+, de esta fraccion celular. En este contexto, el termino “tiempo suficiente para separacion segun la gravedad” significa un tiempo suficiente para que las celulas ocupen la posicion, segun su gravedad, en la disolucion para centrifugacion en gradiente de densidad y habitualmente es de aproximadamente 10 a 30 minutos. Los ejemplos de la disolucion para centrifugacion en gradiente de densidad que pueden usarse pueden incluir, pero no se limitan a, soluciones Ficoll y Percoll.
Espedficamente, se lava en primer lugar un tejido hepatico recogido de vertebrados en una disolucion L-15, despues se trata enzimaticamente (a 37 °C durante 30 minutos en una disolucion que contiene L-15+ADNasa I al 0,01 %, tripsina al 0,25 % y colagenasa al 0,1 %), y se pipetea para preparar celulas individuales. Se centrifugan estas celulas individuales como celulas hepaticas fetales. Por tanto, las celulas obtenidas se lavan, y se recogen
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celulas AC133+ de las celulas lavadas, usando anticuerpos AC133. Como resultado, pueden prepararse celulas capaces de diferenciarse en celulas del sistema nervioso de celulas hepaticas fetales. La recogida de las celulas AC133+ usando los anticuerpos puede realizarse usando perlas magneticas o un sistema de clasificacion celular (por ejemplo, FACS).
La preparacion farmaceutica es preferentemente una preparacion administrada por via parenteral, mas preferentemente una preparacion administrada sistemicamente por v^a parenteral, particularmente, una preparacion administrada por via intravenosa. Los ejemplos de formas de dosificacion adecuadas para la administracion parenteral incluyen, pero no se limitan a: inyecciones tales como inyecciones solubles, inyecciones que pueden suspenderse, inyecciones que pueden emulsionarse e inyecciones que van a prepararse antes de su uso; e injertos. La preparacion para administracion parenteral puede estar en forma de disoluciones o suspensiones acuosas o no acuosas isotonicas esteriles. Espedficamente, la preparacion puede prepararse en una forma de dosificacion unitaria apropiada combinando apropiadamente, por ejemplo, portadores o vehmulos farmacologicamente aceptables, espedficamente, agua esterilizada o solucion salina, medios, solucion salina tamponada tal como PBS, aceites vegetales, agentes emulsionantes, agentes de suspension, tensioactivos, estabilizantes, excipientes, vehmulos, conservantes, aglutinantes y similares.
Los ejemplos de disoluciones acuosas inyectables incluyen, pero no se limitan a, solucion salina, medios, solucion salina tamponada tal como PBS, agentes de tonicidad que contienen glucosa u otros adyuvantes, por ejemplo, D- sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sodico. Estas disoluciones pueden usarse en combinacion con un agente de solubilizacion apropiado, por ejemplo, alcohol, espedficamente, etanol o polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol) y/o con un tensioactivo no ionico, por ejemplo, polisorbato 80 o HCO-50.
En la presente memoria descriptiva, la lesion significa que un sujeto vivo padece de algun dano local o sistemico producido por factores endogenos y/o exogenos. Por tanto, la lesion segun la presente memoria descriptiva abarca diversos estados tales como diversos traumatismos, infartos, lesiones degenerativas y destrucciones de tejido. Ademas, el sitio de lesion tambien abarca diversos tejidos en todo el cuerpo, por ejemplo, cerebro, nervios, rinon y pancreas, tngado, corazon, piel, hueso y cartflago. El sitio de lesion puede aparecer en una posicion o puede aparecer en una pluralidad de posiciones. La preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva tiene efectos sobre diversos tejidos y puede reparar simultaneamente una pluralidad de sitios de lesion mediante una administracion. Por tanto, la preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva es particularmente eficaz para el tratamiento de un sujeto que tiene una pluralidad de sitios de lesion. Los ejemplos de factores que producen la lesion incluyen, pero no se limitan a: fuerzas ffsicas externas tales como accidentes, quemaduras y bombardeos; diversas enfermedades isquemicas tales como enfermedad neurologica isquemica (infarto cerebral, infarto de medula espinal, etc.) y enfermedad cardiaca isquemica (por ejemplo, infarto de miocardio); diversas inflamaciones, diabetes mellitus, diversas infecciones, enfermedades autoinmunitarias, tumores, exposicion a venenos, enfermedades desmielinizantes centrales y perifericas, enfermedades degenerativas centrales y perifericas, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnoidea, tumor cerebral, disfuncion superior incluyendo demencia, enfermedades psiquiatricas, epilepsia y enfermedades prionicas (por ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, enfermedad de kuru, encefalopatfa espongiforme bovina, y encefalopatfa espongiforme ovina). La lesion segun la presente memoria descriptiva se refiere normalmente a las que implican perdida y/o reduccion de las funciones del tejido.
Los ejemplos de la perdida y/o reduccion de las funciones del tejido pueden incluir, pero no se limitan a: para tejidos nerviosos, trastornos sensoriales (por ejemplo, dolor, entumecimiento e hipoestesia), trastornos motores (por ejemplo, paralisis, calambres musculares, hemiplejia, miembros temblorosos, dificultad para caminar, bradicinesia e incomodidad ffsica), disfuncion cerebral (por ejemplo, cefalea, trastorno de la memoria, conciencia alterada, trastorno del habla, convulsion, temblores, demencia, alucinacion y comportamiento anomalo) y disautonoirna (por ejemplo, sensacion de mareo, vertigo, smcope, disuria y dishidrosis); para el rinon, perdida y/o reduccion de las funciones excretoras, funciones reguladoras para el equilibro de fluidos corporales tales como el equilibrio de electrolito/agua, y las funciones endocrinas; para el pancreas, perdida y/o reduccion de las funciones exocrinas y las funciones endocrinas; para el tngado, perdida y/o reduccion de las funciones metabolicas, funciones sinteticas y funciones exocrinas; y para el corazon, perdida y/o reduccion de funciones del flujo sangumeo y funciones endocrinas. El experto en la tecnica conoce la perdida y/o reduccion de funciones espedficas producida por dano en un determinado tejido asf como smtomas asociados con la misma.
Ademas, la reparacion y regeneracion del sitio de lesion son sinonimos de reparacion y regeneracion de las funciones. Los efectos terapeuticos de, por ejemplo, la reparacion/regeneracion de un tejido del sistema nervioso abarca efectos neuroprotectores (por ejemplo, nueva mielinizacion de axones), efectos neurotroficos (por ejemplo, reposicion de neurogliocitos), angiogenesis cerebral, regeneracion nerviosa, etc. Espedficamente, los efectos terapeuticos de la preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva significan la reparacion/regeneracion de tejido como entidad y la reparacion/regeneracion de la disfuncion de un tejido como fenomeno. Los efectos terapeuticos en, por ejemplo, lesion cerebral, aparecen como reduccion de edema, nueva mielinizacion de axones, aumento en el numero de neurogliocitos, angiogenesis, regeneracion nerviosa, etc. como entidad y aparece como recuperacion en el torrente sangumeo cerebral, recuperacion de paralisis, alivio del dolor o entumecimiento, etc. como fenomeno. Estos efectos pueden confirmarse mediante examen ffsico, por ejemplo, examen de rayos X, TAC,
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examen IRM, examen ultrasonico, examen endoscopico o biopsia, en el tejido danado. Ademas, pueden confirmarse tambien los efectos mediante diversos examenes hematologicos, examenes bioqmmicos, examenes de endocrinolog^a, examenes de la funcion motora, examenes de la funcion cerebral, examenes de la funcion cognitiva o similares.
La frase la preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva “ayuda en la reparacion” del sitio de lesion normalmente significa, pero no se limitan a, que mediante la administracion de la preparacion farmaceutica, los componentes en la presente preparacion ayudan o apoyan en el mecanismo de reparacion del sujeto vivo y promueven/potencian la reparacion del sitio de lesion, en comparacion con la ausencia de administracion de la presente preparacion. Esta frase tambien abarca la prevencion de que la lesion en el sitio de lesion se expanda o se vuelva mas grave, bloqueo de la lesion en progreso y recuperacion de la misma. La administracion de la presente preparacion construye, en el sitio de lesion, un entorno adecuado para las funciones del mecanismo de reparacion del sujeto vivo. Espedficamente, la ayuda en la reparacion provocada por la preparacion farmaceutica puede lograrse mediante, por ejemplo, pero no se limita a, secrecion de citocina, angiogenesis y/o regeneracion de tejido (vease la figura 9).
Ademas, la preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva puede provocar, por ejemplo: para el rinon danado que implique insuficiencia renal, mejora en el mdice de la funcion renal tal como BUN y/o los valores de creatinina; para el pancreas danado que implique reduccion de las funciones de secrecion de insulina del islote de Langerhans, mejora en la secrecion de insulina o en el mdice para diabetes mellitus tal como glucemia, concentracion serica de Glu A1 y/o concentracion serica de HbAIC; para el corazon danado atribuido a enfermedad cardiaca isquemica, mejora en la concentracion serica de prostaglandina-D sintasa y/o la concentracion serica de homocistema; y para tngado danado que implique insuficiencia hepatica, mejora en el mdice para la funcion hepatica tales como los valores de GOT, GPT y/o y-GTP.
En un aspecto preferible de la preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva, la preparacion farmaceutica se administra tras el tratamiento del sitio de lesion. En este contexto, el tratamiento del sitio de lesion normalmente significa el tratamiento de la lesion en la fase aguda o hiperaguda y abarca, por ejemplo, tratamiento para evitar que la lesion se expanda y tratamiento quirurgico para la reparacion de la lesion. Ademas, en otro aspecto preferible, la preparacion farmaceutica se administra con el proposito de ayudar en el poder de reparacion autonomo que posee el sujeto vivo.
Ademas, la preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva se administra preferentemente en la fase subaguda o posterior de la lesion. La fase subaguda se refiere a la convalecencia posterior a la fase de agravamiento (fase aguda o hiperaguda) de smtomas producida por la lesion y se refiere a un periodo de desde 1 hasta 2 meses tras el desarrollo de, por ejemplo, infarto cerebral.
Las celulas madre mesenquimatosas en la preparacion farmaceutica de la presente memoria descriptiva son preferentemente celulas madre mesenquimatosas autologas derivadas de celulas recogidas de un sujeto que tiene el sitio de lesion. El uso de las celulas autologas puede evitar rechazo o riesgo de infeccion. Ademas, las celulas madre mesenquimatosas autologas pueden recogerse antes del comienzo de la lesion o tras el comienzo de la lesion. Cuando las celulas se recogen antes de la comienzo de la lesion, las celulas recogidas deben almacenarse mediante un enfoque tal como conservacion criogenica tras una ralentizacion arbitraria del crecimiento o el crecimiento. Esto es porque el comienzo de la lesion es habitualmente diffcil de predecir. Cuando las celulas se recogen tras el comienzo de la lesion, las celulas recogidas pueden administrarse directamente a un sujeto tras una ralentizacion arbitraria del crecimiento o el crecimiento o pueden almacenarse despues mediante un enfoque tal como conservacion criogenica (por ejemplo, en un congelador a -152 °C) y administrarse adecuadamente en un momento elegido. De forma alternativa, todas las celulas pueden administrarse simultaneamente, o algunas de ellas pueden almacenarse y administrarse adicionalmente, si es necesario.
En la presente invencion, el termino “sujeto” significa un organismo arbitrario individual y es preferentemente un animal, mas preferentemente un mamffero, mas preferentemente un individuo humano. En la presente invencion, el sujeto tiene normalmente algun sitio de lesion.
La presente invencion puede usarse en un metodo de evaluacion para evaluar si las celulas cultivadas ex vivo son o no celulas disponibles para su uso en reparacion y regeneracion de tejido biologico. El metodo de evaluacion segun la presente memoria descriptiva comprende la etapa de medir un nivel de expresion de un gen particular en las celulas que van a evaluarse. El metodo de evaluacion segun la presente memoria descriptiva puede comprende la etapa de medir un nivel de expresion de al menos uno de los genes descritos en las tablas 1 a 4 en las celulas que van a evaluarse. El metodo de evaluacion segun la presente realizacion puede comprender ademas la etapa de comparar el nivel de expresion de al menos uno de los genes descritos en las tablas 1 a 4 con el de las celulas de control.
En la presente memoria descriptiva, se usan como celulas de control celulas que se preparan a partir de la misma fuente que la de las celulas que van a evaluarse y cultivarse usando suero foraneo. El nivel de expresion del gen previsto en las celulas de control puede medirse simultaneamente con la medicion del nivel en las celulas que van a
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evaluarse o puede medirse de antemano. Espedficamente, el metodo de evaluacion segun la presente memoria descriptiva puede comprender ademas la etapa de medir el nivel de expresion del gen previsto en las celulas de control.
Aplicando la presente divulgacion al gen descrito en la caja B de las tablas 2 a 4 como gen previsto, se determina que las celulas que van a evaluarse son celulas disponibles para su uso en reparacion y regeneracion de tejido biologico cuando el nivel de expresion del gen previsto en estas celulas es menor que en las celulas de control. De forma alternativa, aplicando la presente divulgacion al gen descrito en la caja A de las tablas 2 a 4 como gen previsto, se determina que las celulas que van a evaluarse son celulas disponibles para su uso en reparacion y regeneracion de tejido biologico cuando el nivel de expresion del gen previsto en estas celulas es mayor que en las celulas de control.
En la presente memoria descriptiva, la medicion del nivel de expresion del gen puede realizarse basandose en un nivel de ARNm o basandose en un nivel de protema. Tal como se describio anteriormente, el “gen descrito en la tabla” que decir un gen identificado por “ID del conjunto de sonda” descrito en esta tabla (este gen incluye variantes que retienen las funciones del gen). Esto lo entienden facilmente los expertos en la tecnica basandose en el “tttulo del gen” en la tabla. Por tanto, los expertos en la tecnica pueden construir facilmente herramientas de secuencia (por ejemplo, cebadores o pruebas) necesarias para la medicion del nivel de ARNm y pueden obtener facilmente los anticuerpos necesarios para la medicion del nivel de protema. Ademas, el metodo de evaluacion segun la presente memoria descriptiva puede realizarse basandose en el mdice de que la razon del nivel de expresion del gen entre los alineamientos de referencia y experimental es de 4 veces o mas en un sistema descrito en los presentes ejemplos.
El metodo de evaluacion segun la presente memoria descriptiva puede comprender la etapa de comparar la tasa de crecimiento de las celulas que van a evaluarse en presencia de suero alogenico con la tasa en presencia de suero foraneo. La presente divulgacion es aplicable preferentemente a celulas derivadas de humanos. En este caso, el suero foraneo es preferentemente FBS. Se ha sabido previamente que el suero humano es significativamente inferior en actividad promotora del crecimiento a FBS y que presenta una actividad promotora del crecimiento celular insuficiente por sf mismo. Por tanto, es inesperado que si las celulas estan disponibles o no para su uso en reparacion y regeneracion de tejido biologico pueda evaluarse comparando una tasa de crecimiento celular obtenida usando suero humano (particularmente, autosuero) con la obtenida usando FBS.
Ejemplos
A continuacion se proporcionan ejemplos para describir mas espedficamente el crecimiento celular segun un metodo de la presente invencion y una preparacion farmaceutica para reparacion/regeneracion de tejido que comprende las celulas que se hicieron crecer mediante el metodo de la presente invencion y que no pretenden limitar alcance de la presente invencion de ninguna manera. Los expertos habituales en el campo de cultivo celular y/o terapia celular pueden hacer diversas modificaciones en los mismos.
Ejemplo 1
Se recogieron 60 ml de un fluido de medula osea de un paciente con enfermedad cerebral usando un tubo de recogida de sangre cuya pared interna se humedecio de antemano con trazas de heparina (0,1 U por ml de fluido de medula osea). Se anadio el fluido de medula osea recogido a 210 ml de un medio para llevar la cantidad total a 270 ml. Esta disolucion de cultivo que contema fluido de medula osea se dividio en 18 porciones, cada una de las cuales se sembro, a continuacion, en una cantidad de 15 ml en una placa de 150 mm de diametro (placa de cultivo tisular n.° 3030-150 fabricada por IWAKI). Se anadieron 5 ml del medio a la misma para llevar la cantidad total a 20 ml por placa. Tras la siembra, se dejan reposar estas placas en incubadoras separadas (9 placas por incubadora), seguido por cultivo a 37+0,5 °C, en una atmosfera del 5 % de CO2. Se confirmo de antemano mediante examen de sangre periferica que el fluido de medula osea no estaba infectado con VIH, ATL, HB, HC, sffilis, parvovirus humano B19, y similares.
Se preparo el medio anadiendo 56,8 ml de suero derivado de sangre periferica autologa, 5,7 ml de un antibiotico (que consiste en penicilina 10.000 U/ml y estreptomicina 10 mg/ml), y 5,7 ml de glutamina (292,3 mg/l) a 500 ml de un medio de Eagle modificado por Dulbecco, se esterilizo despues por filtracion, y se dividio en pequenas porciones, que se almacenaron despues en una caja de refrigeracion a 4 °C. Se mantuvo el medio a 37 °C de antemano y despues se uso.
En el dfa 4, se lavaron las celulas madre mesenquimatosas que se adhenan al recipiente de cultivo. Para este fin, se separaron el medio y los componentes celulares de la sangre que flotan en el medio y se retiraron por succion, y se lavo posteriormente la superficie de las celulas madre mesenquimatosas adherentes seis veces con 5 ml de solucion salina tamponada con fosfato como lavado.
En el dfa 8, se realizo el primer subcultivo. Para este fin, se anadieron a la placa 4 ml de una disolucion de separacion (tripsina al 0,25 %-EDTA 2,21 mM) para disociar las celulas madre adherentes asf lavadas con 5 ml de
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solucion salina tamponada con fosfato y se incubaron a 37 °C durante 3 minutes para confirmar la disociacion. Se anadio la misma cantidad de medio a la disolucion de separacion que contema las celulas separadas de la placa, y se recogio la cantidad completa de la disolucion por decantacion. Las celulas correspondientes a las 9 placas se transfirieron respectivamente a 9 tubos de centnfuga y se centrifugaron a 800 rpm durante 5 minutos en una centnfuga. Tras la centrifugacion, se retiro el sobrenadante de cada tubo de centnfuga y se recogieron las celulas mediante la adicion de DMEM. S centrifugo de nuevo la disolucion de celulas recogida a 800 rpm durante 5 minutos. Tras la centrifugacion, se retiro el sobrenadante de cada tubo de centnfuga y se recogieron las celulas mediante la adicion de 300 ml del medio. Se dividio esta disolucion de celulas en pequenas porciones correspondientes a las 15 placas y se incubaron para subcultivo a 37+0,5 °C a una concentracion del 5 % de CO2, como en el cultivo primario. Se realizaron los mismos procedimientos de subcultivo que anteriormente para las 9 placas restantes.
En el dfa 13, se realizaron el lavado, la disociacion y la centrifugacion de la misma manera que antes. Se midio el numero de celulas en cada pequena parte usando un hemocitometro y se determino por consiguiente que alcanzo 1,1x106 celulas, y por tanto las celulas se subcultivaron adicionalmente. Se continuo el cultivo y, en el dfa 20, se midio el numero de celulas de la misma manera que antes y se determino por consiguiente que alcanzo 1,0x108 celulas en terminos del numero total. Por tanto, se realizaron el lavado, la disociacion y la centrifugacion y se suspendieron las celulas en una disolucion de crioconservacion (20,5 ml de RPMI habitual esterilizado por filtracion, 20,5 ml de autosuero recogido del paciente, 5 ml de dextrano y 5 ml de DMSO) y se congelo a -150 °C. La razon de celulas madre mesenquimatosas con respecto a las celulas fue del 98 % o mas (positivas para CD105 (tasa positiva=99,9 %), negativas para CD34 (tasa negativa=98,8 %) y negativas para CD45 (tasa negativa=98,5 %).
Ejemplo comparativo 1
Se realizo el cultivo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 excepto porque el contenido de heparina en la muestra se cambio a 2 ml (267 U/ml). Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2. Cuando se anadio heparina solo en una cantidad traza (0,1 U/ml), se obtuvo un crecimiento hasta 8x105 celulas tras 4 dfas en cultivo. En cambio, cuando se anadieron 2 ml de heparina, se obtuvo un crecimiento hasta 2x104 celulas. Por tanto, la tasa de crecimiento obtenida usando trazas de heparina fue aproximadamente 40 veces mayor (figuras 1 y 2). En el cultivo continuado, el numero de celulas aumento tras 12 dfas en cultivo hasta 1,4x107 celulas mediante la adicion de trazas de heparina y, en cambio, hasta 2,9x106 celulas mediante la adicion de 2 ml de heparina (figura 1). Estos resultados muestran que la adicion de heparina tiene efectos inhibidores sobre el crecimiento celular y tambien demuestran que el metodo de la presente invencion puede hacer crecer las celulas rapidamente aun cuando se anade un anticoagulante en una cantidad traza o esta sustancialmente ausente. Estos resultados muestran ademas que la tasa de crecimiento se mejora significativamente fijando la cantidad de heparina en una muestra a una cantidad traza.
Ejemplo comparativo 2
Se realizo el cultivo durante 8 dfas en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 excepto porque se uso FBS en vez de suero derivado de sangre periferica humana. En la figura 3 se muestra la comparacion en la tasa de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas basandose en la medicion del numero de celulas. Cuando se cultivaron celulas madre mesenquimatosas humanas en las condiciones de la presente invencion, el uso de suero de adulto humano produjo tasas de crecimiento aproximadamente 2,6 veces mayores tras 5 dfas en cultivo y aproximadamente 6 veces mayores tras 8 dfas en el mismo que las obtenidas usando FBS. Estos resultados muestran que en el cultivo de celulas de medula osea humanas, el uso de suero de adulto humano produce una tasa de crecimiento mayor que la obtenida usando FBS, fijando la cantidad de heparina en una muestra a una cantidad traza.
Ejemplo comparativo 3
Se realizo un experimento usando celulas madre mesenquimatosas de rata. Se cultivaron celulas de medula osea recogidas de dos huesos de muslo de rata en el mismo medio que en el ejemplo 1 complementado con heparina 1 U/ml, 10 U/ml, 100 U/ml o 1000 U/ml. Se realizo el cultivo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 excepto porque se uso FBS en vez de suero derivado de sangre periferica humana. Los resultados se muestran en la figura 4. Estos resultados mostraron que una concentracion mayor de heparina en un medio tiene mayores efectos inhibidores sobre el crecimiento.
Ejemplo comparativo 4
Se realizo un experimento usando celulas mesenquimatosas de rata tal como sigue: para un primer grupo, se extrajo un fluido de medula osea de un hueso de muslo de rata usando 4 ml de DMEM para preparar una muestra de algo mas de 4 ml en total. Se anadio esta muestra a 36 ml de DMEM complementado con 160 U de heparina, y se inicio el cultivo. La concentracion de heparina en el medio fue de 4 U/ml. Para un segundo grupo, se extrajo un fluido de medula osea de un hueso de muslo de rata usando 4 ml de DMEM complementado con 160 U de heparina para preparar una muestra de algo mas de 4 ml en total. Se dejo esta muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos en este estado en el que se expuso a la alta concentracion de heparina. A continuacion, se anadieron 36 ml de
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DMEM a la misma y se inicio el cultivo. La concentracion de heparina en el medio fue de 4 U/ml. Los cambios en el numero de celulas para estos dos grupos se muestran en la figura 5. Se observo que el primer grupo tema una tasa de crecimiento mucho mas baja que la del segundo grupo. Estos resultados sugieren que la adicion de heparina a una muestra celular durante la recogida de la muestra (o antes de cambiar a cultivo) produce una eficacia de crecimiento celular menor que la obtenida por la adicion de heparina a un medio en el momento del cultivo.
Ejemplo 2
Se realizo el cultivo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 excepto porque se uso un medio aMEM en vez de DMEM como medio convencional. Los resultados se muestran en la figura 6. Estos resultados demostraron que cuando se uso un medio aMEM, el uso de suero humano produce un crecimiento mas rapido que el obtenido con FBS, reduciendo tambien la cantidad de heparina.
Ejemplo comparativo 5
Se realizo el cultivo durante 7 dfas de la misma manera que en el ejemplo 1 excepto porque el medio estaba libre de glutamina. La comparacion en la tasa de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas basandose en la medicion del numero de celulas se muestra en la figura 7. El uso de glutamina produjo una tasa de crecimiento de aproximadamente 1,6 veces mayor tras 1 semana en cultivo que la obtenida en ausencia de glutamina. Estos resultados muestran que se requiere la adicion de glutamina para el crecimiento rapido de celulas madre mesenquimatosas.
Ejemplo 3
[Metodo]
Se recogieron tres huesos de muslo de rata, y se lavaron las celulas de medula osea de cada hueso de muslo usando DMEM (5 ml) y complementado con los siguientes agentes para preparar tres grupos de muestras:
(i) DMEM (5 ml)
(ii) DMEM (5 ml) +heparina (2 |il)
(iii) DMEM (5 ml) +heparina (2 |il) +protamina (2 |il)
Se lavo cada muestra con DMEM y se colocaron en 10 ml de una disolucion de cultivo (DMEM+FBS al 10 %+penicilina/estreptomicina al 1 %+L-glutamina 2 mM), que se sembro despues en una placa de 10 cm y se cultivo durante 14 dfas. Se inicio el subcultivo en el momento en que la densidad celular excedfa 5.500 celulas/cm2.
[Resultados]
Tal como se muestra en la figura 8, las celulas no tratadas con heparina teman una cantidad inicial mayor y tambien una tasa de crecimiento mayor que las celulas tratadas con heparina, y esto fue obvio en los dfas de cultivo 8 a 11. Ademas, las celulas complementadas con protamina, una sustancia que inhibe la actividad de la heparina, tuvieron tambien una cantidad inicial baja y una tasa de crecimiento baja, como en las celulas tratadas con heparina.
Ejemplo 4
En condiciones en las que se cultivaron celulas sin contacto sustancial con heparina, es decir, en condiciones que implican una concentracion de heparina baja, se compararon celulas madre mesenquimatosas cultivadas en autosuero con celulas madre mesenquimatosas cultivadas en FBS.
[Smtesis y purificacion de ADNc]
Celulas madre mesenquimatosas cultivadas en un medio que contema autosuero segun el metodo del ejemplo 1 y celulas madre mesenquimatosas cultivadas en un medio que contema FBS segun el metodo del ejemplo comparativo 2 se ajustaron por separado a 1x107 celulas/muestra. Se extrajo de cada muestra el ARN total usando el kit RNeasy Protect Min (QIAGEN, n.° de catalogo 74124). Para la rotura de celulas, se uso una trituradora QIA (QIAGEN, n.° de catalogo 79654). Se ajusto la disolucion de ARN obtenida a 0,5 mg/ml, y se comprobo la calidad del ARN usando el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.).
Se sintetizo ADNc de primera hebra usando el kit de control de ARN poli-A eucariota GeneChip (AFFYMETRIX, Inc., P/N900433) y el kit mejorado con biotina MessageAmp II (Ambion, Inc., n.° de catalogo 1791). Espedficamente, se anadio una disolucion de reaccion (II) a una disolucion de reaccion (I), se hicieron reaccionar a 70 °C durante 10 minutos, y se hicieron reaccionar 20 |il en total del sistema de reaccion a 42 °C durante 2 horas.
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[Formula 1]
Disolucion de reaccion (I)
- ARN total (0,5 ig/il)
- 2 il
- Controles de ARN poli-A diluido
- 2 il
- Cebador de T7-oligo(dT), 50iM
- 1 il
- Agua libre de ARNasa
- 7 il
- Total
- 12 il
[Formula 2]
Disolucion de reaccion (II)
- 10xTampon de primera hebra
- 2 il
- Mezcla de dNTP
- 4 il
- Inhibidor de ARNasa
- 1 il
- ArrayScript
- 1 il
- Total
- 8 il
Posteriormente, se sintetizo ADNc de segunda hebra y se purifico usando el kit mejorado con biotina MessageAmp II (Ambion, Inc., n.° de catalogo 1791). Espedficamente, se anadio una disolucion de reaccion (III) a la disolucion de reaccion (II) asf hecha reaccionar, y se hicieron reaccionar 100 il en total del sistema de reaccion a 16 °C durante 2 horas. Para la purificacion de ADNc, se uso el cartucho de filtro de ADNc incluido en el kit y finalmente se anadieron 24 il de agua libre de nucleasa en dos partes al filtro para la elucion.
[Formula 3]
Disolucion de reaccion (III)
Agua libre de nucleasa 10xTampon de segunda hebra Mezcla d dNTP ADN polimerasa
ARNasa H______________1_il
Total
63 |il 10 |il 4 |il 2 il
80 il
[Reaccion IVT]
Se realizaron la reaccion IVT y la purificacion de ARNa usando el kit mejorado con biotina MessageAmp II (Ambion, Inc., n.° de catalogo 1791). Espedficamente, se hizo reaccionar una disolucion de reaccion (IV) a 37 °C durante 14 horas. A continuacion, se termino la reaccion mediante la adicion de 60 il de agua libre de nucleasa. Para la purificacion de ARNa, se uso el cartucho de filtro de ARNa incluido en el kit y finalmente se anadieron 100 il de agua libre de nucleasa al filtro para la elucion. Se ajusto la disolucion de ARN obtenida a 20 ig/32 il, y se comprobo la calidad del ARN usando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.)
[Formula 4]
Disolucion de reaccion IV
- ADNc bicatenario
- 20 il
- Mezcla de NTP-Biotina
- 12 il
- 10xTampon de reaccion de T7
- 4 il
- Mezcla de enzimas de T7
- 4 il
- Total
- 40 il
[Preparacion del coctel de hibridacion]
Se fragmento el ARNa usando el kit mejorado con biotina MessageAmp II (Ambion, Inc., n.° de catalogo 1791) para
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preparar el coctel de hibridacion. Espedficamente, se hizo reaccionar una disolucion de reaccion (V) a 94 °C durante 35 minutes. A continuacion, se preparo el coctel de hibridacion usando el kit de control de hibridacion con reactivos de amplificacion en 3' GeneChip Expresion (AFFYMETRIX, Inc., P/N900454) y se hizo reaccionar a 99 °C durante 5 minutes y despues a 45 °C durante 5 minutos.
[Formula 5]
Disolucion de reaccion V
ARNa (20 |ig/|il) 32 |il
5x Tampon de fragmentacion de alineamiento 8 |il Total 40 |il
[Formula 6]
(Coctel de hibridacion)
ARNc fragmentado 30 |il
Oligonucleotido de control B2 5 |il
20xControles de hibridacion eucariotas 15 |il ADN de esperma de arenque (10 mg/ml) 3 |il BSA (50 mg/ml) 3 |il
2xTampon de hibridacion* 150 |il
DMSO 30 |il
H2O_________________64jil__________________
Total 300 il
*Tampon de hibridacion (Ixconc.: MES100 mM, [Na+] 0,1 M, EDTA 20 mM, Tween-20 al 0,01 %)
[Hibridacion]
Se relleno el alineamiento U133 Plus 2.0 de genoma humano de GeneChip (AFFYMETRIX, Inc., P/N900466) con 1xtampon de hibridacion, seguido por prehibridacion a 60 rpm a 45 °C durante 10 minutos. A continuacion, se retiro el 1xtampon de hibridacion, y se relleno el alineamiento con el coctel de hibridacion preparado, seguido por hibridacion durante la noche a 60 rpm a 45 °C.
[Lavado y tincion]
Se cargaron tampon de lavado A (6xSSPE, Tween-20 al 0,01 %), tampon de lavado B (MES 100 mM, [Na+] 0,1 M, Tween-20 al 0,05 %) y agua en el aparato Fluidics Station y se realizo el cebado segun el programa de GCOS (software de funcionamiento de GeneChip). Posteriormente, se retiro el coctel de hibridacion y se relleno el alineamiento con tampon de lavado A. Se cargaron este alineamiento, la mezcla de disolucion SAPE (1xtampon de tincion, BSA 2 mg/ml, SAPE 10 ig/ml) y una mezcla de disolucion de anticuerpo (1xtampon de tincion, BSA 2 mg/ml, disolucion madre de IgG de cabra 0,1 mg/ml, anticuerpo biotinilado 3 mg/ml) en el aparato Fluidics Station. A continuacion, se realizaron el lavado y la tincion segun el programa de GCOS.
[Barrido]
Se cargo el escaner de alineamiento de genes en el alineamiento y se realizaron el barrido y el analisis. Los resultados del analisis se muestran en las tablas 1 a 5.
[Tabla 1]
- Expresion de antigenos de superficie celular (antigenos CD)
- Positiva
- Negative
- CD9
- CD1 CD72
- CD29
- CD4 CD74
- CM44
- CD5 CD79
- CD47
- CD6 CD84
- CD58
- CD7 CD86
- CD59
- CD8 CD93
- CD63
- CD14 CD96
- CD73
- CD19 CD117
- CD81
- CD22 CD133
- CD97
- CD21 CD163
- CD99
- CD28 CD177
- CD105
- CD33 CD180
- CD109
- CD34 CD207
- CD151
- CD37 CD209
- CD157
- CD38 CD226
- CD164
- CD45 CD244
- CD166
- CD48 CD247
- CD200
- CD53 CD274
- CD248
- CD68 CD300
- CD69
[Tabla 2]
- Expresion de factores relacionados con el factor de crecimiento A. Grupo de genes con expresion aumentada (SFB =>autosuero)
- Titulo del gen
- Simbolo del gen
- de tipo sinaptotagmina 4 (granufilina a)
- SYTL4
- regulador de la senalizacion de la proteina G 10
- RGS10
- regulador de la senalizacion de la proteina g 2, 24 kDa
- RGS2
- B. Grupo de genes con epxresion disminuida (SFB =>autosuero)
- Titulo del gen
- Simbolo del gen
- receptor activado por proliferadores de peroxisomas delta
- PPARD
- protocadherina beta 14
- PCDHB14
- protocadherina beta 2
- PCDHB2
- molecula de adhesion de la union 3
- JAM 3
- molecula de adhesion de la union 3
- JAM 3
- familia de dominio a asociacion RAS (RalGDS/AF-6)
- RASSF8
- proteina de union PPAR
- PPARBP
- protocadherina beta 10
- PCDHB10
- ribonucleotido reductasa M2 B (TP53 inducible)
- RRM2B
- factor de crecimiento derivado de plaquetas
- PDGFD
- de tipo activador de proteinas RAS 2
- RASAL2
- efector de apoptosis PERP. TP53
- PERP
- homologo de dickkopi 3 (Xenopus laevis)
- DKK3
- molecula de adhesion de la union 3
- JAM3
- homologo de flightless 1 (Drossophila)
- FL11
- sinaptotagmina XI
- SYT11
- inhibidor de la union a ADN 3, proteina helice-bucle-helice negativa dominante
- ID3
- factor de crecim. transf.. receptor beta 1 (cinasa de activina A tipo ll-tipo cinasa, 53 kDa)
- TGFBR1
- cadherina 6, tipo 2, cadherina K (rinon fetal)
- CDH6
- proteina asociada al tumor d Wilms 1
- WTAP
- proteina de union a MYC 2
- MYCBP2
- molecula de adhesion celular a leucocitos activada
- ALCAM
- molecula de adhesion celular a leucocitos activada
- ALCAM
- lumican
- LUM
- inhibidor de la union a ADN 2, proteina helice-bucle-helice negativa dominante III inhibidor de la union a ADN 2B, proteina helice-bucle-helice negativa dominante
- ID2 III ID2B
- inhibidor de la union a ADN 2, proteina helice-bucle-helice negativa dominante
- ID2
- proteina de union a MYC 2
- MYCBP2
- catenina (porteina asociada a cadherina), beta 1, 88 kDa
- CTNNB1
[Tabla 3]
- Expresion de citocinas relacionadas A. Grupo de genes con expresion aumentada (FBS => autosuero)
- Titulo del gen
- Simbolo del gen
- proteina de union a ARNm 2, factor de crecimiento 2 de tipo insulina
- IGF2BP2
- factor de crecimiento derivado de hepatoma, proteina relacionada 3
- HDGFRP3
- factor de crecimiento derivado de hepatoma, porteina relacionada 3
- HDGFRP3
- factor de crecimiento epidermico (beta-urogastrona)
- EGF
- B. Grupo de genes con expresion disminuida (FBS => autosuero)
- Titulo del gen
- Simbolo del gen
- factor de crecimiento de tipo EGF de union a heparina
- HBEGF
- meteorina, de tipo regulador de diferenciacion de celulas gliales III similar a meteorina, de tipo regulador de diferenciacion de celulas gliales
- LOC653506 III METRNL
- factor derivado de celulas estromales 4
- SDF4
- receptor de quimiocina 7 (motivo C-X-C)
- CXCR7
- proteina de union 3 a factor de crecimiento de tipo insulina
- IGFBP3
- proteina de union 5 a factor de crecimiento de tipo insulina
- IGFBP5
- proteina de union 5 a factor de crecimiento de tipo insulina
- IGFBP5
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 (factor de crecimiento de queratinocitos)
- FGF7
- factor de crecimiento de tipo EGF de union a heparina
- HBEGF
- proteina de union 5 a factor de crecimiento de tipo insulina
- IGFBP5
- familia de portador de soluto 1 (transportador de glutamato de alta afinidad glial), miembro 3
- SLCIA3
- factor de crecimiento de tipo insulina 2 (somatomedina A)
- IGF2
- proteina de union 4 a factor de crecimiento de tipo insulina
- IGFBP4
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 (factor de crecimiento de queratinocitos)/// proteina 1 de tipo factor de crecimiento de queratinocitos///proteina 2 de tipo factor de crecimiento de queratinocitos
- FGF7 III KGFLP1 III KGFLP2
[Tabla 4]
- Grupo de genes cuyo nivel de expresion difirio dos veces o mas A. Grupo de genes con expresion aumentada (FBS=>autosuero)
- Titulo del gen
- Simbolo del gen
- de tipo mastermind 3 (Drosophila)
- MAML3
- proteina de union a FK506 5
- FKBP5
- proteina de union a FK506 5
- FKBP5
- 1 ligado a X, expresado en el cerebro
- BEX1
- dominio de metalopeptidasa ADAM 19 (meltrina beta)
- ADAM 19
- factor de crecimiento epidermico (beta urogastrona)
- EGF
- fibrilina 2 (aracnodactilia contractural congenita)
- FBN2
- B. Grupo de genes con expresion disminuida (FBS=> autosuero)
- Titulo del gen
- Simbolo del gen
- locus transcrrto, fuertemente similar a la proteina hipotetica XP_001142613.1 [Pan troglodytes]
- --
- gremlina 2, superfamilia del nudo de cisteina, homologa (Xenopus laevis)
- GREM2
- metalopeptidasa ADAM con trombospondina de tipo 1 motivo 5 (agrecanasa 2)
- ADAMTS5
- metalopeptidasa ADAM con trombospondina de tipo 1 motivo 5 (agrecanasa 2)
- ADAMTS5
- 1 que contiene dominio de fibronectina tipo III
- FNDC1
- gremlina 2, superfamilia del nudo de cisteina, homologa (Xenopus laevis)
- GREM2
- filagrina
- FLG
- proteina asociada microfibrilar 5
- MFAP5
- receptor de quimiocina 7 (motivo C-X-C)
- CXCR7
- proteina hipotetica
- DKFZP686A01247
- proteina hipotetica
- DKFZP686A01247
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- queratina 17
- KRT17
- acido fosfatidico fosfatasa tipo 2B
- PPAP2B
- protefna de union 5 a factor de crecimiento de tipo insulina 5
- IGFBP5
- proteina de union 5 a factor de crecimiento de tipo insulina 5
- IGFBP5
- prostaglandina E sintasa
- PTGES
- acido fosfatidico fosfatasa tipo 2B
- PPAP2B
- inhibidor de la union a ADN3, proteina helice-bucle-helice negativa dominante
- ID3
- prostaglandina E sintasa
- PTGES
- miembro de la familia SMAD 6
- SMAD6
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 (factor de crecimiento de queratinocitos)
- FGF7
- proteina de la oligomerica de cartilago
- COMP
- secretogranina II (cromogranina C)
- SCG2
- hemo oxigenasa (desciclacion) 1
- HMOX1
- proteina de union 5 a factor de crecimiento de tipo insulina 5
- IGFBP5
- factor de crecimiento de tipo insulina 2 (somatomedina A)
- IGF2
- integrina, alfa 6
- ITGA6
- inhibidor de la union a ADN 2, proteina helice-bucle-helice negativa dominante/// inhibidor de la union a ADN 2B, proteina helice-bucle-helice negativa dominante
- ID2 III ID2B
- inhibidor de la union a ADN 2, proteina helice-bucle-helice negativa dominante
- ID2
- metalopeptidasa ADAM con trombospondina tipo 1 motivo 5 (agrecanasa 2)
- ADAMTS5
[Resultados]
La tabla 1 muestra anhgenos de superficie celular que presentaban un nivel aumentado o disminuido en comun en 5 casos que implican a las celulas cultivadas en FBS y las celulas cultivadas en autosuero. La tabla 2 muestra factores relacionados con factores de crecimiento que presentaban expresion aumentada o disminuida en comun en estos 5 casos. Ademas, la tabla 3 muestra citocinas que presentaban expresion aumentada o disminuida en comun en estos 5 casos. Ademas, la tabla 4 muestra un grupo de genes cuyo nivel de expresion difirio en dos veces o mas en comun en estos 5 casos.
Tal como se muestra en la tabla 1, el marcador de diferenciacion CD24 expresado en las celulas cultivadas en FBS no se expreso en las celulas cultivadas en autosuero, demostrando que las celulas cultivadas en autosuero mantuvieron un estado mas indiferenciado. Ademas, tal como se muestra en las tablas 2 a 4, se expresaron una serie de factores de crecimiento en las celulas cultivadas en autosuero, y algunos factores de crecimiento presentaban expresion aumentada, en comparacion con las celulas cultivadas en FBS. Ademas, los resultados del presente analisis demostraron que las celulas cultivadas en autosuero tienen baja expresion del grupo de una serie de genes relacionados con el cancer y son por tanto altamente seguras.
Se confirmo por tanto que el metodo de cultivo de la presente invencion que usa autosuero puede cultivar celulas con alta eficacia de crecimiento sin usar FBS y produce celulas que tienen mayor seguridad y mayor potencia de diferenciacion.
Ejemplo 5
Un paciente (hombre de 52 anos de edad) con enfermedad neurologica isquemica (infarto cerebral: oclusion de la arteria carotida interna derecha) desarrollo paralisis en el lado izquierdo el 4 de febrero de 2007 y fue transferido al hospital universitario medico de Sapporo el 19 de febrero de ese ano. Antes de tratamiento, el paciente tuvo smtomas: estaba paralizado del lado derecho y tema paralisis severa particularmente en la extremidad superior; no podfa apretar y relajar su puno en absoluto; no podfa sujetar y soltar un objeto (bloque de construccion, etc.); no podfa levantar el brazo por encima del hombro; y no podfa flexionar y extender su muneca. Se recogieron de este paciente celulas madre mesenquimatosas y se hicieron crecer tal como se describe en el ejemplo 1. Se anadio una disolucion de crioconservacion (20,5 ml de RPMI habitual esterilizado por filtracion, 20,5 ml de autosuero recogido del paciente, 5 ml de dextrano, y 5 ml de DMSO) a la cantidad total de las mismas para producir un farmaco
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terapeutico. Se confirmo de antemano mediante examen de la sangre periferica que el fluido de medula osea del paciente no estaba infectado con VIH, ATL, HB, HC, sffilis, parvovirus humano B19 y similares. Este farmaco terapeutico se administro al paciente por via intravenosa a lo largo de 30 minutos el 19 de marzo. No se observo ningun efecto secundario.
Resultados
Este paciente tema disfuncion motora en los cinco dedos de la mano izquierda antes de la terapia celular y, sin embargo, a la manana siguiente de la administracion de las celulas, fue capaz de mover los dedos totalmente inmoviles de la mano izquierda y de apretar y relajar el puno. Una semana mas tarde, se observo una mejora en la funcion motora y fue capaz de realizar la actividad ffsica de llevar un palo. Dos semanas mas tarde, se confirmo una reduccion evidente en el tamano del infarto cerebral mediante IRM (figura 10). Ademas, fue capaz de apretar y relajar el puno mas rapido y de sujetar y soltar un bloque de construccion. Tambien fue capaz de levantar el brazo por encima del hombro y adoptar la postura “banzai” (echar los brazos al aire). Tambien fue capaz de flexionar y extender su codo y muneca. Los cambios en el nivel de infarto cerebral de este paciente durante el periodo que se centra en la terapia celular se muestran en la figura 11 usando escalas bien conocidas la evaluacion del infarto cerebral (NIHSS: National Institutes of Health Stroke Scale (escala de accidente cerebrovascular de los institutos nacionales de salud), JSS: Japan Stroke Scale (escala de accidente cerebrovascular japonesa) y MRS: Modified Ranking Scale (escala de clasificacion modificada))
La figura 10 es una imagen de IRM del cerebro de este paciente. Se observo una reduccion en el tamano del sitio (parte blanca) danado por infarto cerebral en el hemisferio derecho del cerebro. Ademas, la figura 12 es una imagen del torrente sangumeo cerebral de este paciente, en la que se observo una recuperacion en el torrente sangumeo cerebral en el sitio de lesion tras 1 semana de tratamiento. Estos resultados, junto con la recuperacion en la funcion motora mostrada anteriormente, demostraron que la administracion de la presente preparacion presenta efectos de mejora significativos en la fase subaguda o posterior. Estos resultados, junto con la recuperacion en la funcion motora, demostraron que la administracion de la preparacion farmaceutica de la presente invencion presenta efectos de mejora significativos sobre el infarto cerebral en la fase subaguda o posterior.
Ejemplo 6
Una paciente (mujer de cincuenta y tantos anos) padecfa oclusion espontanea del cfrculo de Willis (enfermedad de Moyamoya) durante un largo periodo y de ese modo desarrollo paralisis en el lado izquierdo. Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de esta paciente y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Aproximadamente 2 meses tras el desarrollo, se administraron las celulas por via intravenosa a esta paciente. Se confirmo una mejora en el torrente sangumeo cerebral mediante examen de IRM (PWI) realizado tras la administracion.
Ejemplo 7
Un paciente (hombre de sesenta y tantos anos) desarrollo paralisis del lado izquierdo atribuida a aterotrombosis. Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de este paciente y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Cuatro meses tras el desarrollo, se administraron las celulas por via intravenosa a este paciente. Como resultado, se observo un alivio de la rigidez y el intervalo aumentado de movimiento articular desde el siguiente dfa de la administracion. Posteriormente, recupero significativamente la fuerza muscular para conseguir un nivel mensurable de potencia de agarre (4 kg). Ademas, aproximadamente 2,5 meses tras la administracion, fue capaz de andar por sf mismo y recupero la funcion de la mano izquierda hasta un nivel disponible de manera practica.
Ejemplo 8
Un paciente (hombre de cincuenta y tantos anos) desarrollo paralisis del lado izquierdo atribuida a aterotrombosis. Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de este paciente y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Seis semanas tras el desarrollo, se administraron las celulas por via intravenosa a este paciente. Como resultado, mejoro la movilidad de los dedos desde el dfa siguiente de la administracion. Posteriormente, recupero significativamente la fuerza muscular para conseguir un nivel mensurable de potencia de agarre (8 kg). Ademas, fue capaz de realizar tareas mas finas mas rapidamente y tambien recupero la suficiente fuerza de las puntas de los dedos para, por ejemplo, separar un par de palillos chinos. Por tanto, fue capaz de realizar actividades utiles en la vida diaria.
Ejemplo 9
Un paciente (hombre de sesenta y tantos anos) desarrollo paralisis del lado izquierdo atribuida a aterotrombosis. Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de este paciente y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Cinco semanas tras el desarrollo, se administraron las celulas por via intravenosa a este paciente. Como resultado, sintio una mejora principalmente en el movimiento de la extremidad inferior desde la noche del dfa de la administracion y sintio una mejora incluso en el movimiento de la mano al dfa siguiente de la administracion.
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Posteriormente, la mejora en la funcion motora continuo.
Ejemplo 10
Un paciente (hombre de setenta y tantos anos) desarrollo paralisis del lado izquierdo y alalia atribuida a infarto lacunar. Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de este paciente y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Ocho semanas tras el desarrollo, se administraron las celulas por via intravenosa a este paciente. Como resultado, fue capaz de mover los dedos de los pies desde la manana siguiente a la administracion, y tambien se observo mejora en el movimiento del hombro y el codo. A continuacion, 3 dfas tras la administracion, se recupero lo suficiente como para mover los dedos.
Ejemplo 11
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un paciente con diabetes mellitus cronica y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1 y se administraron por via intravenosa a este paciente. Como resultado, su glucemia, que estaba alrededor de 190 mg/dl antes de la administracion, mejoro hasta el nivel normal en aproximadamente 1 mes tras la administracion. Ademas, se observo tambien una mejora evidente en otros indices para diabetes mellitus (figura 13).
Ejemplo 12
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un paciente con hiperplasia prostatica benigna, y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1 y se administraron por via intravenosa a este paciente. Como resultado, la administracion mejoro evidentemente el valor de PSA que sirve como mdice para la hiperplasia prostatica benigna con respecto a antes de la administracion (figura 14).
Ejemplo 13
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un paciente con dano hepatico y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1 y se administraron por via intravenosa a este paciente. Como resultado, la administracion mejoro evidentemente los niveles de y-GTP, GOT y GPT que sirven como indices para dano hepatico con respecto a antes de administracion (figura 15).
Ejemplo 14
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un paciente con dano renal y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1 y se administraron por via intravenosa a este paciente. Como resultado, la administracion mejoro evidentemente el valor de p2-microglobulina que sirve como mdice para dano renal con respecto a antes de la administracion y tambien mejoro evidentemente otros indices para dano renal (valores de BUN y/o creatinina) (figura 16).
Ejemplo 15
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un paciente con hiperlipidemia y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1 y se administraron por via intravenosa a este paciente. Como resultado, la administracion mejoro evidentemente el valor de grasa neutra que sirve como mdice para hiperlipidemia con respecto a antes de la administracion y tambien mejoro evidentemente otros indices para hiperlipidemia (figura 17).
Ejemplo 16
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un paciente con disfuncion cerebral/afasia mayor y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1 y se administraron por via intravenosa a este paciente. Antes y despues de la administracion, se sometio al paciente a la prueba de lenguaje convencional de afasia (SLTA, standard language test of aphasia) y a la escala revisada de inteligencia de adultos de Wechsler (WAIS-R, Wechsler adult intelligence scale-revised). Como resultado, la administracion mejoro evidentemente los valores de SLTA y WAIS-R con respecto a antes de la administracion (figura 18).
Ejemplo 17
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un humano sano y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Las celulas madre mesenquimatosas humanas se prepararon para modelos de infarto cerebral en rata (modelos de oclusion de la arteria cerebral media). Posteriormente, los modelos de rata se dividieron en (i) un grupo sin trasplante, (ii) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas (1,0x106), (iii) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de angiopoyetina (1,0x106), (iv) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de vEgF (1,0x106) y (v) un grupo en el que se inyectaron por via intravenosa celulas transfectadas con el gen de angiopoyetina/VEGF (1,0x106), y, despues, se
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trataron y se estudiaron los efectos terapeuticos por comparacion. Como resultado de examinar los efectos terapeuticos por IRM (figura 19A), los efectos terapeuticos se observaron en los grupos (ii), (iii) y (v) con la fuerza de los efectos terapeuticos en el orden de (v) > (iii) > (ii).
Ademas, como resultado de analizar los efectos terapeuticos de los aspectos de la angiogenesis (figura 19B), los efectos terapeuticos se observaron en los grupos (ii), (iii), (iv) y (v) con la fuerza de los efectos terapeuticos en el orden de (v) > (iii) > (iv) > (ii).
Ademas, como resultado de analizar los efectos terapeuticos usando la prueba de esfuerzo de cinta rodante de los aspectos de comportamiento (figura 20), los efectos terapeuticos se observaron en los grupos (ii), (iii) y (v) con la fuerza de los efectos terapeuticos en el orden de (v)>(iii)>(ii).
Ejemplo 18
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un humano sano y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Las celulas madre mesenquimatosas humanas (1,0x106) se administraron por via intravenosa a modelos de parada cardiorrespiratoria en rata, y se determinaron los efectos terapeuticos. El tratamiento suprimio la apoptosis (redujo el numero de celulas positivas para Tunnel) (figura 21), y un gran numero de celulas neuronales sobrevivieron (figura 22). Ademas, se evaluaron las funciones superiores del cerebro segun la prueba del laberinto de agua de Morris. Como resultado, se observo una mejora en las mismas en el grupo tratado.
Ejemplo 19
Se recogieron celulas madre mesenquimatosas de un humano sano y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Se uso un impactador NYU para las medulas espinales (Th11) de ratas sometidas a laminectoirna para preparar modelos de lesion de medula espinal. Tras 6 horas, 1 dfa, 3 dfas, 7 dfas o 14 dfas, se trasplantaron las celulas madre mesenquimatosas humanas (1,0x106) a traves de la vena la femoral a los modelos de rata, y se evaluaron sus actividades a lo largo del tiempo con la prueba de cinta rodante. Espedficamente, se diseno de antemano un conjunto de cinta rodante en movimiento a una velocidad de 20 m/min para aplicar choque electrico a las ratas que dejaban de correr y se entrenaron a las ratas para que corriesen en sesiones de 20 minutos (al dfa) dos dfas a la semana desde antes de la creacion del infarto cerebral. Se represento graficamente el grado de recuperacion dependiente del tiempo para cada grupo con el tiempo como eje de abscisas frente a la velocidad maxima como eje de ordenadas. Se observaron efectos terapeuticos marcados en los grupos que recibieron trasplante tras 6 horas o 1 dfa de la creacion de la lesion de medula espinal (figura 23).
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en el presente documento se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad.
Aplicabilidad industrial
La presente invencion consigue una rapida provision de celulas para su uso en un farmaco terapeutico que presenta efectos significativos sobre la reparacion/regeneracion de tejido. Esta rapida provision del farmaco terapeutico tiene grandes efectos particularmente en enfermedades para las que una terapia celular temprana es eficaz, por ejemplo, en la regeneracion de nervios cerebrales para un paciente que tiene un nervio cerebral danado. Ademas, alivia la escasez de donantes de celulas y reduce su carga ffsica. Una preparacion farmaceutica producida mediante el metodo de la presente memoria descriptiva tiene efectos como un farmaco terapeutico, por supuesto. Ademas, la preparacion farmaceutica mejora significativamente la QOL de pacientes debido a los efectos terapeuticos potenciados por la rapida provision y tambien reduce la carga de cuidadores y el coste del cuidado, conduciendo a una reduccion en la carga social. Por tanto, la presente invencion arroja luz sobre el envejecimiento de la sociedad.
Claims (8)
- 10
- 2.15
- 3.20 4.25
- 5.30
- 6.35 7.
- 8.40 9.
- 10.
- 11.45REIVINDICACIONESUn metodo para hacer crecer celulas en un fluido de medula osea o muestra de sangre recogida de un sujeto vivo cultivando las celulas en un medio, comprendiendo el metodo cultivar las celulas, sin contacto sustancial con un anticoagulante, en un medio que contiene suero alogenico,en el que las celulas se han recogido sin contacto sustancial con un anticoagulante del sujeto vivo,en el que el anticoagulante es heparina, un derivado de heparina o una sal de la misma, yen el que la cantidad de anticoagulante en el medio durante el cultivo es menos de 0,02 U/ml, con respecto al volumen del medio.El metodo segun la reivindicacion 1, en el que se ha determinado que el suero alogenico es negativo para un marcador tumoral serico y/o un factor infeccioso.El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el suero alogenico es autosuero del sujeto del que se recogen las celulas.El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el marcador tumoral serico es uno o mas seleccionado del grupo que consiste en ferritina, CEA, AFP, BFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CA72-4, STN, DUPAN-2, SLX, ST-439, SPAN-1, SCC, PSA, G-seminoprotema, TPA, CYFRA, PAP, NSE, peptido C, PIVKA, Pro-GRP, HCGp, elastasa, p2 microglobulina, S-NTX, un anticuerpo anti-p53 y HER2, en el que el factor infeccioso es uno o mas seleccionado del grupo que consiste en VIH, ATL, HB, HC, sffilis y parvovirus humano B19.El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cantidad de heparina, un derivado de heparina o una sal de la misma anadida a la muestra recogida es menos de 0,2 U/ml con respecto al volumen de la muestra.El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el derivado de heparina es glucosaminoglucano que puede obtenerse por desulfatacion en la posicion 6 de la D-glucosamina que constituye la heparina.El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio tiene un contenido en suero del 1 al 20 % en volumen.El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las celulas son celulas madre.El metodo segun la reivindicacion 8, en el que las celulas madre son celulas madre mesenquimatosas.El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las celulas son celulas humanas.El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las celulas se hacen crecer en un estado indiferenciado.
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