KR20190026772A

KR20190026772A - 장기 섬유증의 예방 또는 치료제

Info

Publication number: KR20190026772A
Application number: KR1020197001824A
Authority: KR
Inventors: 마리 데자와; 미치아키 우노; 토시히로 야마모토; 야스히로 신도; 히로토 하라; 나오야 마스토미
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 도호쿠다이가쿠; 가부시키가이샤 세이메이카가쿠 인스티튜트
Priority date: 2016-07-01
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-03-13
Also published as: AU2017287529B2; US20190201455A1; EP3479833B1; AU2017287529A1; CN109689073A; CA3029505A1; KR102513507B1; WO2018003997A1; JPWO2018003997A1; EP3479833A1; EP3479833A4; SG11201811806TA; JP2023001294A

Abstract

본 발명은 안전하고 조제가 용이한 간 섬유증 등의 장기 섬유증의 예방 및/또는 치료를 위한 세포 제제를 제공하는 것을 과제로 하며, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포(Muse 세포)를 포함하는, 간 섬유증 등의 장기 섬유증을 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제를 제공한다.

Description

장기 섬유증의 예방 또는 치료제

본 발명은 재생 의료에 있어서의 세포 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 섬유화가 발생한 장기의 수복 및 재생에 유효한 다능성 줄기세포를 함유하는 세포 제제에 관한 것이다.

장기 섬유증은 미생물, 화학 물질, 면역 반응 등 생체 내의 반응, 식습관, 환경, 유전적 배경 등 여러 가지 원인(원인 불명 또한 포함)에 의해 발생하는 감염, 염증, 지방 등 생체 내 물질의 축적, 조직·세포의 변성 등에 의해 장기에 상해·괴사 등을 받은 후, 충분히 재생되지 못하고 결합 조직이 증가하여 섬유화됨으로써 발생하는 질환이며, 간장, 폐, 심장, 신장, 뇌신경계 등의 각종 장기 외에 근육, 뼈나 피부 등 많은 장기나 조직에 발생한다는 것이 알려져 있다.

간장에 생기는 섬유증인 간경변은 여러 가지 원인에 의한 간장 질환이 만성적으로 진행된 끝에 최종적으로 도달하는 병태이며, 기능적 간세포의 감소와 섬유 조직의 증생에 의한 간 기능의 현저한 저하를 초래한다. 간경변 환자 수는 일본에서는 약 30만 명, 세계적으로는 약 2000만 명이 있다고 여겨지고 있으나, 간경변에 의한 심각한 간부전에 대한 유효한 내과적 치료법은 확립되어 있지 않다. 현 상황에서는, 여러 가지 대증요법에 의해 만성 간질환으로부터 간경변으로의 진행을 얼마나 늦출 수 있는지가 주요한 치료법이다.

폐섬유증에는 간질성 폐렴 등의 폐렴에 따른 폐 손상에 기인하는 섬유증 외에 원인 불명의 특발성 폐섬유증이 있으며, 기침, 흉통, 호흡곤란 등을 발증시키는 예후 불량의 질환이다. 심근 섬유증은 관순환 부전이나 감염·면역 반응 등에 의한 심근증 및 판막증 등을 원 질환으로 하여 심근이나 심장 판막의 조직이 섬유화되는 것으로, 진행되면 심부전 상태에 이른다.

신장에서는 만성 신장병의 진행에 따라 신장 조직 내에 섬유화가 초래되면 신장 기능이 급격하게 악화되어 회복이 불가능한 상태에 이른다. 이와 같이, 여러 가지 장기, 조직에 있어서 원 질환의 진행에 따라 장기·조직의 섬유화가 발생한다는 것이 알려져 있으나, 그 어느 질환에서도 섬유화의 진전은 당해 장기, 조직 기능의 불가역적인 악화를 초래하는 극히 예후가 불량한, 현재의 의학으로는 치료 곤란한 병태이다.

간경변에서는 유일하게 유효한 치료법으로서 간장 이식이 있으나, 여기에는 장기 제공자의 부족, 비싼 의료 비용, 생체 간이식의 경우에는 제공자에 대한 리스크 등 많은 문제를 안고 있다. 또한, 간이식을 필요로 하는 간이식 대기자가 해마다 증가하는데도 불구하고, 장기 제공자가 부족하기 때문에 이식을 기다리는 동안에 사망하는 이식 대기 중 사망자의 증가 또한 큰 과제이다.

최근, 병태 장기의 이식 치료를 대신할 수 있는 치료법으로서 줄기세포 이식이 주목받고 있다. 예를 들어, 간엽계 줄기세포(MSC)는 만성 간질환에 있어서의 간 섬유화 및 염증을 억제하는 것이 보고되어 있다(예를 들어, 비특허문헌 1). 그러나, MSC는 상해를 받은 간조직에 대한 생착 및 신규 간세포 형성의 빈도가 낮으며, 섬유화 억제나 염증 저감 효과의 대부분은 MSC에 따른 항염증 작용, 섬유화 억제 인자나 보호 인자 생산에 기인하는 것이었다(예를 들어, 비특허문헌 2). 또한, 배아줄기세포(ES세포)나 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포)로부터 간 전구세포를 유도하여 간 내에 이식하는 연구도 진행되고 있으나, 혼재하는 미분화 세포의 존재나 게놈의 불안정성에 의한 암화 등 극복해야 할 중요한 과제가 남아 있다. 따라서, 기능적 간세포의 보충을 할 수 있는 효율적인 줄기세포 요법에 의해 근본적인 해결책이 제공될 것이 요망되고 있다.

본 발명자들 중 한 명인 데자와의 연구에 의해, 간엽계 세포 획분에 존재하며 유전자 도입이나 사이토카인 등에 의한 유도조작 없이 얻어지는, 발생단계-특이적 배아성 항원-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3, SSEA-3)을 표면 항원으로서 발현하고 있는 다능성 줄기세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse 세포)가 간엽계 세포 획분이 갖는 다능성을 담당하고 있어, 조직 재생을 목표로 한 질환 치료에 응용할 수 있는 가능성이 있음을 알게 되었다(특허문헌 1; 비특허문헌 3 ~ 5). 그러나, 섬유증의 예방 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여 기대되는 치료 효과를 얻을 수 있음을 밝힌 예는 없다.

: 일본특허 제5185443호 명세서

: Transplantation 2004 ; 78: 83-88 : The Journal of surgical research 2014 ; 186 : 408-416 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010 ; 107 : 8639-8643 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011 ; 108 : 9875-9880 : Nat. Protc., 2013; 8: 1391-1415

본 발명은 장기 섬유증의 예방 및/또는 치료를 위한 세포 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 인간 세포를 거부하지 않는 면역 부전 마우스의 간 섬유증 모델에 있어서, 인간 Muse 세포를 혈관 내로 투여함으로써 Muse 세포가 상해를 입은 간장에 집적·생착하여 상해를 입은 간장을 재건 및 수복하고, 간 기능의개선 또는 회복을 가져오는 것을 발견하였으며, 이를 통해 Muse 세포가 간 섬유증을 비롯한 장기 섬유증의 치료나 예방에 알맞게 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포를 포함하는, 장기 섬유증을 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제.

[2] 장기 섬유증이 소화기, 호흡기, 순환기, 비뇨생식기, 운동기, 뇌신경계, 내분비기관 혹은 피부에 생기는 섬유증인, [1]에 기재된 세포 제제.

[3] 장기 섬유증이 소화기에 생기는 섬유증인, [2]에 기재된 세포 제제.

[4] 장기 섬유증이 간 섬유증인, [3]에 기재된 세포 제제.

[5] 상기 다능성 줄기세포가 간아세포 또는 간세포 마커를 발현하는 세포로 분화하는 능력을 갖는, [4]에 기재된 세포 제제.

[6] 대상에 투여했을 때에, 비투여 대조와 비교하여 혈청 총 빌리루빈 및/또는 혈청 알부민치를개선시키는, [4] 또는 [5]에 기재된 세포 제제.

[7] 장기 섬유증이 피부에 생기는 섬유증인, [2]에 기재된 세포 제제.

[8] 장기 섬유증이 폐에 생기는 섬유증인, [2]에 기재된 세포 제제.

[9] 상기 다능성 줄기세포가 이하의 성질 전부를 갖는 다능성 줄기세포인, 상기 [1] ~ [8] 중 어느 하나에 기재된 세포 제제;

(ⅰ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다;

(ⅱ) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화되는 능력을 갖는다;

(ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다; 및

(ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다.

[10] 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포를 포함하는, 조직 섬유화의 억제 및/또는 섬유화 조직의 용해를 위한, 세포 제제.

본 발명에서는 섬유증을 앓고 있는 대상에 대해 Muse 세포를 혈관 등으로 투여 혹은 대상 장기 및 그 주변에 직접 투여함으로써, 섬유화 상해 장기에 집적한 Muse 세포가 섬유화의 진전을 억제 혹은 형성되어 있는 섬유 조직을 용해함과 동시에, 해당 장기를 구성하는 세포로 스스로 분화한다는 재생 메커니즘에 의해, 섬유증에 있어서의 섬유 조직을 소실시켜 장기의 기능을 개선시킬 수 있다.

Muse 세포는 상해를 입은 간장 등의 장기에 효율적으로 유주(遊走)하여 생착할 수 있고, 생착한 부위에서 간세포 등의 간 구성 세포로 자발적으로 분화하므로, 이식에 앞서 치료 대상 세포로의 분화 유도가 불필요하다. 또한, 비종양 형성성이며 안전성도 뛰어나다. 게다가 Muse 세포는 면역거부를 받지 않는다는 점에서, 기증자로부터 제조된 타가(他家) 제제에 의한 치료도 가능하다. 따라서, 상기에 나타내는 우수한 성능을 갖는 Muse 세포에 의해, 장기 섬유증 환자의 치료에 대한 용이하게 실행 가능한 수단을 제공할 수 있다.

도 1은 Muse 세포의 특성분석(characterization). (A) 인간 BM-MSC로부터 선별된 SSEA-3(+)-Muse 세포(게이트 P3) 및 SSEA-3(-)-비Muse 세포(게이트 P6). 상단은 염색하지 않음, 중단은 2차 항체만, 하단은 SSEA-3 항체. (B) M 클러스터, Muse 세포, 비Muse 세포에서의 OCT4, SOX2 및 Nanog에 대한 Q－PCR의 결과를 나타낸다. *：P<0.05, **:P<0.01,***:P<0.001.(C) 젤라틴 코팅 디쉬 상의 단일 M 클러스터로부터 증식한 세포의 현미경 사진. (D) 젤라틴 코팅 배양 디쉬 상의 단일 M 클러스터로부터 증식한 세포의 면역 염색 결과를 나타내는 현미경 사진. DLK, α-태아단백질(α-fetoprotein), 사이토케라틴 19 및 사이토케라틴 18의 각 마커로 염색하였다. 스케일 바 : 50 ㎛.
도 2는 시험관 내(in vitro)에서, Muse 세포의 사염화탄소(CCl₄) 투여 전(intact), 투여 1, 24, 48시간 후의 동물로부터 얻은 혈청 및 간으로의 유주에 대한 결과를 나타낸다. 비Muse 세포에서 관찰되는 유주에 비해, Muse 세포는 (A) 혈청 및 (B) 간조직에 높은 효율로 유주하였다. ***:P<0.001.
도 3은 24시간-CCl₄ 처리 간 상해 모델에 있어서의 Muse 세포 및 비Muse 세포의 생체 내(in vivo) 동태에 대한 결과를 나타낸다. (A) CCl₄ 처리한 군 및 비상해군에 대해, 인간 Muse 세포 또는 비Muse 세포를 정맥 주사한 지 2주일 후의 간 내에 존재하는 인간 게놈 특이적 Alu 서열의 정량 결과를 나타낸다. (B) 세포 주입 후 30일째의 시점에서의 간의 인간 골지(human golgi, H－Golgi) 면역 염색(인간 세포의 골지체를 표지하기 위해, 마우스 간 내에 생착한 인간 Muse 세포의 국재를 반영함)의 결과를 나타내는 현미경 사진. (C) 간 절편에서의 1 mm² 당 총 세포수에 대한 H-Golgi(+) 세포의 수를 나타낸다. ***:P<0.001.(D, E) H-Golgi/인간 미토콘드리아 및 간세포 마커 HepPar-1에 대한 이중 염색의 결과를 나타내는 현미경 사진. 스케일 바 : 50 ㎛.
도 4는 간 섬유증 모델에서의 기능적 및 조직학적 평가를 나타낸다. (A) CCl₄ 처리에 의한 간 섬유증 모델 마우스의 제작 순서와 Muse 세포 투여 순서를 나타낸다. (B, C) CCl₄ 처리개시 후 8주째의 Muse군, 용매군 및 비Muse군에 있어서의 혈청 총 빌리루빈(B) 및 혈청 알부민(C) 농도를 나타낸다. (D, E) 시리우스 레드 염색(D) 및 메이슨 트리크롬(Masson trichrome) 염색(E)에 의한, 간 섬유화 면적의 평가를 나타내는 현미경 사진. 그래프는 면적을 수치화한 결과를 나타낸다. **:P<0.01, ***:P<0.001.스케일 바 : 50 ㎛.
도 5는 CCl₄ 처리에 의한 간 섬유증 모델에서의 인간 Muse 세포의 간 조직으로의 분화에 대한 결과를 나타낸다. (A) CCl₄ 처리개시 후 8주째의 시점에서의 간 내에 존재하는 H-Golgi(+) 세포의 수를 나타낸다. Muse군에서는 상당수의 H-Golgi(+) 세포가 간장 내의 혈관 주변에서 관찰되었다. 한편, 비Muse군에서는 이들 세포는 거의 관찰할 수 없었다. (B) 간 절편에서의 1 mm² 당 총 세포수에 대한 H-Golgi(+) 세포의 수를 나타낸다. ***:P<0.001.(C) H-Golgi(+) 세포에 있어서의 HepPar-1(간세포 마커)의 발현을 나타내는 면역 염색 결과(현미경 사진)를 나타낸다. (D) H-Golgi(+) 세포에 있어서의 인간 알부민의 발현을 나타내는 면역 염색 결과(현미경 사진)를 나타낸다. (E) 인간 미토콘드리아(+) 세포(인간 세포임을 나타냄)에 있어서의 인간 항트립신(간세포 마커)의 발현을 나타내는 면역 염색 결과(현미경 사진)를 나타낸다. 스케일 바 : 50 ㎛.
도 6은 CCl₄ 처리개시 후 8주째의 Muse군의 FISH 및 기능 분석의 결과를 나타낸다. (A) 상단에는 FISH의 결과를 나타내고, 하단에는 인접하는 절편에 있어서의 H-Golgi/HepPar-1의 면역 염색 결과(현미경 사진)를 나타낸다. FISH에 있어서, 마우스 염색체는 녹색으로 구분되어 있고, 인간 염색체는 적색으로 구분되어 있다. 결과에서, *1의 세포는 마우스의 세포라고 생각되고, *2 및 *3은 마우스의 세포와 융합되지 않은 인간 세포이고, *4는 인간 - 마우스 융합 세포이다. 절편은 8 ~ 10㎛의 두께로 제작되었기 때문에, 인접하는 절편끼리 핵소체의 위치나 세포질의 형태는 엄밀하게는 일치하지 않는다. 그러나 FISH의 *1, *2 및 *3의 세포는 면역 염색에 있어서의 대응하는 세포에 투영 가능하다. *4의 세포는 면역 염색에 있어서 투영되지 않았다. *1의 세포는 H-Golgi에 대해 음성이다. *2 및 *3의 세포는 H-Golgi(+) 및 HepPar-1에 대해 이중 양성이며, H-Golgi(+)-인간 Muse 세포가 간세포 마커 HepPar-1(+) 세포에 마우스 간세포와 융합하는 일 없이 분화된 것이 시사된다. 스케일 바 : 25㎛. (B) 인간 특이적-알부민, -CYP1A2, -Glc-6-Pase, 그리고 인간 및 마우스 베타 액틴에 대한 RT-PCR의 결과를 나타낸다(사진). 인간 간장을 양성 대조로서 사용하고, 용매군의 간장을 음성 대조로서 사용하였다.
도 7은 대조군, 블레오마이신(BLM) 28일 + Muse 세포 투여군, BLM 28일 + 매체 투여군에서의 피부 콜라겐량을 나타내는 도면이다.
도 8은 대조군, BLM 28일 + Muse 세포 투여군, BLM 28일 + 매체 투여군에서의 진피층 두께를 나타내는 도면이다.
도 9는 대조군, BLM 28일 + Muse 세포 투여군, BLM 28일 + 매체 투여군의 피부 절편의 헤마톡실린·에오신 염색의 결과를 나타내는 도면(현미경 사진, 100배)이다. 양방향 화살표는 피부의 두께를 나타낸다.
도 10은 대조군과 Muse 세포 투여군의 폐좌엽 및 전엽에 있어서의 섬유화 스코어를 나타내는 도면이다.
도 11은 대조군과 Muse 세포 투여군의 폐 절편의 헤마톡실린·에오신 염색의 결과를 나타내는 도면이다(현미경 사진).
도 12는 대조군과 Muse 세포 투여군의 호흡 촉박 빈도의 시간 경과 변화를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 SSEA - 3 양성의 다능성 줄기세포(Muse 세포)를 포함하는, 장기 섬유증을 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.

1. 적용 질환

본 발명은 SSEA - 3 양성의 다능성 줄기세포(Muse 세포)를 포함하는 세포 제제를 사용하여 장기 섬유증의 예방 및/또는 치료를 한다. 여기서, "장기 섬유증"이란 미생물, 화학 물질, 면역 반응 등 생체 내의 반응, 식습관, 환경, 유전적 배경 등 여러 가지 원인(원인 불명 또한 포함)에 의해 발생하는 감염, 염증, 지방 등 생체 내 물질의 축적, 조직·세포의 변성 등 여러 가지 원인에 의해 장기·조직 내에 섬유화가 생겨 그 장기·조직의 기능이 상해를 입는 질환이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 간장(간 섬유증), 췌장(췌 섬유증), 대장 등의 소화기에 생기는 섬유증 외에 폐(폐 섬유증) 등의 호흡기에 생기는 섬유증, 심장(심근 섬유증), 골수(골수 섬유증), 비장 등의 순환기에 생기는 섬유증, 신장(신장 섬유증) 등의 비뇨생식기에 생기는 섬유증, 근육 등의 운동기에 생기는 섬유증, 뇌신경계, 내분비 기관, 피부 등에 생기는 각종 섬유증 등을 들 수 있다.

2. 세포 제제

(1) 다능성 줄기세포(Muse 세포)

본 발명의 세포 제제에 사용되는 다능성 줄기세포는 본 발명자들 중 한 사람인 데자와가 인간 생체 내에서 그 존재를 발견하여 "Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포"라고 명명한 세포이다. Muse 세포는 골수액, 지방조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(Epub)(published on Jan 17, 2014))이나 피부의 진피 결합 조직 등으로부터 얻을 수 있는 것 외에, 널리 조직이나 장기에도 존재하는 것이 알려져 있다. 또한, 이 세포는 다능성 줄기세포와 간엽계 줄기세포 양쪽 모두의 성질을 갖는 세포이며, 예를 들어 세포 표면 마커인 "SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)" 양성 세포, 바람직하게는 SSEA-3 양성이며 CD-105 양성의 이중 양성 세포로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 예를 들어, SSEA-3 단독 또는 SSEA-3과 CD-105의 발현을 지표로 하여 생체 조직으로부터 분리할 수 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법 및 특징 등의 상세한 사항은 국제공개 제WO2011/007900호에개시되어 있다. 또한, Muse 세포가 여러 가지 외적 스트레스에 대한 내성이 높다는 점을 이용하여 단백질 분해효소 처리나 저산소 조건, 저인산 조건, 저혈청 농도, 저영양 조건, 열 충격(heat shock)에 대한 노출, 유해 물질 존재 하, 활성 산소 존재 하, 기계적 자극 하, 압력 처리 하 등 각종 외적 스트레스 조건 하에서의 배양에 의해 Muse 세포를 선택적으로 농축할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 섬유증을 치료하기 위한 세포 제제로서 SSEA-3을 지표로서 사용하여 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 조직으로부터 조제된 다능성 줄기세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 단순히 "SSEA-3 양성 세포"로 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, "비Muse 세포"란 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 조직에 포함되는 세포로서, "SSEA-3 양성 세포" 이외의 세포를 지칭하는 경우가 있다.

Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 세포 표면 마커인 SSEA-3 또는 SSEA-3과 CD-105를 지표로 하여 생체 조직(예를 들어, 간엽계 조직)으로부터 조제할 수 있다. 여기서, "생체"란 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는 수정란이나 포배기보다 발생 단계가 앞인 배는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생 단계의 배는 포함된다. 포유동물에는, 이에 한정되지 않지만, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 랫트, 토끼, 모르모트 등의 설치류, 고양이,개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페럿 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 생체의 조직으로부터 직접 마커를 가지고 분리되는 점에서, 배성줄기세포(ES세포)나 iPS 세포와 명확하게 구별된다. 또한, "간엽계 조직"이란 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄(腱), 치수(齒髓), 제대, 제대혈, 양막 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는 골수나 피부, 지방조직, 혈액, 치수, 제대, 제대혈, 양막 등에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 조제하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 조제 수단을 이용하여 섬유아세포나 골수 간엽계 줄기세포 등의 배양 간엽계 세포로부터 Muse 세포를 조제해도 된다.

또한, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에 외적 스트레스 자극을 줌으로써, 그 외적 스트레스에 내성의 세포를 선택적으로 증식시켜 그 존재 비율을 높인 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해서도 조제할 수 있다.

상기 외적 스트레스는 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열 충격에 대한 노출하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결 처리, 유해 물질 존재하에서의 배양, 활성 산소 존재하에서의 배양, 기계적 자극하에서의 배양, 진탕 처리하에서의 배양, 압력 처리하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 하나 또는 복수의 조합이어도 된다.

상기 프로테아제에 의한 처리 시간은 세포에 외적 스트레스를 주기 위해 합계 0.5 ~ 36시간 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는 배양 용기에 접착된 세포를 떼어낼 때, 세포덩어리를 단일 세포로 뿔뿔이 흩어지게 할 때, 또는 조직으로부터 단일 세포를 회수할 때에 사용되는 농도면 된다.

상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 N말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 상기 프로테아제는 트립신, 콜라게나아제 또는 디스파아제인 것이 더 바람직하다.

또한, 본 발명의 세포 제제에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는 세포 이식을 받는 수용자(recipient)에 대해 자가여도 되고, 또는 타가여도 된다.

상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 예를 들어, SSEA-3 양성 또는 SSEA-3과 CD-105의 이중 양성을 지표로 하여 생체 조직으로부터 조제할 수 있으나, 인간 성인 피부는 여러 가지 타입의 줄기세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 그러나 Muse 세포는 이들 세포와 동일하지 않다. 이와 같은 줄기세포 및 전구세포에는 피부 유래 전구세포(SKP), 신경관 줄기세포(NCSC), 멜라닌모세포(Melanoblast, MB), 혈관 주위 세포(PC), 내피 전구세포(EP), 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 들 수 있다. 이들 세포에 고유 마커의 "비발현"을 지표로 하여 Muse 세포를 조제할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는 CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c－kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF인자(폰빌레브란트병 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커) 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 조제할 수 있고, 또한 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 조제할 수 있으며, 나아가 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 조제할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 상기 특징을 갖는 Muse 세포는, 이하 :

(ⅰ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다;

(ⅱ) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 갖는다;

(ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다; 및

(ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다

는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 성질을 가져도 된다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 상기 성질을 전부 갖는다. 여기서, 상기 (ⅰ)에 대해, "텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다"란 예를 들어, TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 사용하여 텔로머라아제 활성을 검출한 경우, 낮거나 또는 검출할 수 없음을 말한다. 텔로머라아제 활성이 "낮다"란 예를 들어, 체세포인 인간 섬유아세포와 동일한 정도의 텔로머라아제 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela 세포에 비해 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머라아제 활성을 가지고 있음을 말한다. 상기 (ⅱ)에 대해, Muse 세포는 시험관 내 및 생체 내에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지며, 예를 들어 시험관 내에서 유도 배양함으로써 간세포(간아세포 또는 간세포 마커를 발현하는 세포를 포함함), 신경세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화될 수 있다. 또한, 생체 내에서 정소에 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화되는 능력을 나타내는 경우가 있다. 게다가, 정맥 주사에 의해 생체에 이식함으로써 상해를 입은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주 및 생착되어, 조직에 따른 세포로 분화되는 능력을 갖는다. 상기 (ⅲ)에 대해, Muse 세포는 부유 배양에서는 증식 속도 약 1.3일로 증식하지만, 부유 배양에서는 1 세포로부터 증식되고, 배양체(胚樣體)형 세포덩어리를 만들어 14일간 정도에서 증식이 멈춘다는 성질을 갖는데, 이들 배양체형 세포덩어리를 접착 배양으로 가져가면, 다시 세포 증식이 개시되어 세포덩어리로부터 증식된 세포가 퍼져간다. 또 정소에 이식한 경우, 적어도 반년 간은 암화되지 않는다는 성질을 갖는다. 또한, 상기 (ⅳ)에 대해, Muse 세포는 셀프 리뉴얼(자기 복제) 능을 갖는다. 여기서, "셀프 리뉴얼"이란 1개의 Muse 세포로부터 부유 배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체형 세포덩어리에 포함되는 세포로부터 삼배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있음과 동시에, 배양체형 세포덩어리의 세포를 다시 1 세포에서 부유 배양으로 가져감으로써, 다음 세대의 배양체형 세포덩어리를 형성시키고, 거기에서 다시 삼배엽성의 분화와 부유 배양에서의 배양체형 세포덩어리를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프 리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 된다.

(2) 세포 제제의 조제 및 사용

본 발명의 세포 제제는, 한정되지 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 생리 식염수나 적절한 완충액(예를 들어, 인산 완충 생리 식염수)에 현탁시킴으로써 얻어진다. 이 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리된 Muse 세포수가 적은 경우에는, 세포 이식 전에 세포를 배양하여 소정의 세포수가 얻어질 때까지 증식시켜도 된다. 아울러, 이미 보고되어 있는 바와 같이(국제공개 제WO2011/007900호 팜플렛), Muse 세포는 종양화되지 않기 때문에, 생체 조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 채 포함되어 있어도 암화의 가능성이 낮아 안전하다. 또한, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상적인 증식 배지(예를 들어, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α- 최소 필수 배지(α- MEM) 등)에서 실시할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 국제공개 제WO2011/007900호 팜플렛을 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물(예를 들어, 항생 물질, 혈청) 등을 선택하여 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 인간 대상에게 본 발명의 세포 제제를 투여하는 경우에는, 인간의 장골로부터 골수액을 채취하고, 예를 들어 골수액으로부터의 접착 세포로서 골수 간엽계 줄기세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포를 얻을 수 있는 세포량에 이를 때까지 증식시킨 후, Muse 세포를 SSEA-3의 항원 마커를 지표로 하여 분리하고, 자가 또는 타가 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다. 혹은, 예를 들어, 골수액으로부터 얻어진 골수 간엽계 줄기세포를 외적 스트레스 조건하에서 배양하여 유효한 치료량에 이를 때까지 Muse 세포를 증식, 농축한 후, 자가 또는 타가 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다.

또한, Muse 세포의 세포 제제로의 사용에 있어서는, 그 세포를 보호하기 위해 디메틸설폭시드(DMSO)나 혈청 알부민 등을 세균의 혼입 및 증식을 방지하기 위해 항생 물질 등을 세포 제제에 함유시켜도 된다. 또한, 제제상 허용되는 다른 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등)이나 간엽계 줄기세포에 포함되는 Muse 세포 이외의 세포 또는 성분을 세포 제제에 함유시켜도 된다. 당업자는 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포 제제에 첨가할 수 있다. 이와 같이, Muse 세포는 각종 첨가물을 포함하는 의약 조성물로서 사용할 수도 있다.

상기에서 조제되는 세포 제제 중에 함유되는 Muse 세포수는 섬유증의 치료 에 있어서 원하는 효과(예를 들어, 간 섬유증의 경우, 혈청 총 빌리루빈 및 알부민의 회복 및 섬유화의 감소 등)가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부 상태, 사용할 세포의 상태 등을 고려하여 적절히 조정할 수 있다. 또한, 대상으로 하는 개체는 인간을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 세포 제제는 원하는 치료 효과가 얻어질 때까지 복수 회(예를 들어, 2 ~ 10회), 적절히 간격(예를 들어, 1일에 2회, 1일에 1회, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회)을 두고 투여되어도 된다. 따라서, 대상의 상태에 따라 다르기도 하지만, 치료상 유효량으로는 예를 들어, 한 개체당 1회에 대해 1 × 10³세포 ~ 1 × 10⁸세포로 1 ~ 10회의 투여량이 바람직하다. 한 개체에 있어서의 투여 총량으로는 이에 한정되지 않지만, 1 × 10³세포 ~ 1 × 10⁸세포, 1 × 10⁴세포 ~ 5 × 10⁷세포, 2 × 10⁴세포 ~ 2 × 10⁷세포, 5 × 10⁴세포 ~ 5 × 10⁶세포, 1 × 10⁵세포 ~ 1 × 10⁹세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 상해를 입은 장기로 유주하여 생착하는 성질을 갖는다. 따라서, 세포 제제의 투여에 있어서, 세포 제제의 투여 부위, 투여되는 혈관의 종류(정맥 및 동맥)는 한정되지 않는다.

본 발명의 세포 제제는 섬유증 환자의 상해 장기의 기능을 개선 또는 정상(또는 정상치)으로 회복시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용할 때, 장기 기능의 "개선"이란 섬유증에 수반되는 각종 증상의 완화 및 진행의 억제를 의미하며, 바람직하게는 일상생활에 지장이 없을 정도로까지 증상을 완화시키는 것을 의미한다. 또한, 장기 기능을 "정상으로 회복한다"라는 것은 섬유증에 기인한 모든 증상이 장기 상해 이전의 상태로 돌아가는 것을 의미한다.

예를 들어, 간 섬유증의 경우, 본 발명의 세포 제제를 투여한 후의 간 기능의 평가는 혈청 총 빌리루빈 값이나 알부민 값 또는 간 마커 유전자의 발현을 측정하거나 함으로써 실시할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것이 아니다.

실시예

재료와 방법

인간 Muse 세포의 조제

인간 Muse 세포의 조제는 국제공개 제WO2011/007900호에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 보다 구체적으로는, 실시예 1에서 사용한 Muse 세포는 인간 골수액으로부터의 접착성을 갖는 간엽계 세포를 배양하고, 증식을 거쳐 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 SSEA-3 양성 세포로서 FACS로 분리하여 얻었다. 실시예 2 ~ 4에서 사용한 Muse 세포는 간엽계 줄기세포를 스트레스 조건하에서 배양함으로써 확대부화 배양하여 얻었다. 또한, 비Muse 세포는 상기 간엽계 세포 중 SSEA-3 음성의 세포군이며, 대조로서 사용하였다. 그 후, 인산 완충 생리 식염수 또는 배양액을 사용하여, 세포를 소정 농도로 조정하고 이하의 실험에 사용하였다.

<실시예 1>

간 섬유증 모델 마우스에 대한 인간 Muse 세포의 이식

CB17/Icr-Prkdc<scid>/CrlCrlj(SCID) 마우스를 모든 연구에 사용하였다. 모든 동물 실험은 토호쿠 대학(센다이, 일본)의 실험동물의 인도적 관리와 사용을 위한 기준에 따라 실시하였다. 간 섬유증 모델 제작의 실험 순서는 문헌[International Journal of Molecular Science 2012; 13: 3598-3617 및 Journal of Biochemistry 2003; 134: 551-558]을 참조하였다. 구체적으로는, SCID 마우스의 간 섬유증 모델을 CCl₄(0.5 ml/kg)의 복강 내 주사를 실시함으로써 제작하였다.

인간 Muse 세포 또는 비Muse 세포(5 × 10⁴세포)를 간 섬유증 모델 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다.

통계 분석

2군 사이의 유의차는 Student의 t검정을 사용하여 평가하였다. 3군 이상 사이에서의 통계적인 유의차는 본페로니의 다중 비교 검정에 의한 일원 배치 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 평가하였다. P 값이 <0.05(도면에서, *로 나타냄)인 경우에 유의하다고 판정하고, <0.01(**) 또는 <0.001(***)인 경우에 고도로 유의하다고 판정하였다.

결과

< Muse 세포의 특성분석 >

SSEA-3 양성의 인간 Muse 세포(인간 BM－MSC의 약 2%) 및 SSEA-3 음성의 비Muse 세포(대조군)를 FACS에 의해 분리하였다(도 1A). 이들에 대해 단세포 부유 배양을 수행한 결과, Muse 세포만이 부유 배양시에 형성되는 ES 세포 유래 배엽체와 유사한 단일 세포 유래 클러스터(M 클러스터)를 생성하였고, 한편 비Muse 세포는 이와 같은 클러스터를 전혀 형성하지 않았다(데이터 미도시). 접착 배양 Muse 세포, 접착 배양 비Muse 세포 및 M 클러스터에 있어서의 다능성 마커의 유전자 발현을 조사한 결과, 접착 배양 Muse 세포는 접착 배양 비Muse 세포와 비교하여 다능성 마커인 OCT4, SOX2 및 Nanog가 높은 유전자 발현을 나타내는 것을 알게 되었다. 게다가, 접착 배양 비Muse 세포의 SOX2 및 Nanog에 대해서는 검출 임계치 미만이었다. 특히, M 클러스터에 있어서의 OCT4, SOX2 및 Nanog의 발현량에 대해서는, 접착 배양 Muse 세포의 것과 비교하여 각각 약 9배, 약 54배 및 약 35배 높았고, 통계적 유의차를 나타냈다(도 1B). Muse 세포가 1 세포에서 삼배엽 계열 세포(triploblastic lineage cells)로 분화하는 능력이 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: 8639-8643]에 기재된 것과 동일하게 확인되었다. Muse 세포는 이미, 간세포 증식 인자(HGF) 및 섬유아세포 증식 인자 4(FGF-4)에 의한 유도로 알파 태아단백질/알부민 양성 세포로 분화되는 것이 보고되어 있다(Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 9875-9880). 그래서, 젤라틴 코팅 배양 디쉬 상에서 1 세포로부터 부유 배양으로 형성된 M 클러스터로부터 증식된 세포(도 1C)가 자발적으로 간아세포·간세포 마커를 발현하는 세포로 분화되는지의 여부를 확인한 결과, 이들 세포는 DLK(1.5±0.6%), 알파 태아단백질(3.0±0.8%), 사이토케라틴 19(1.7±0.4%) 및 사이토케라틴 18(2.0±0.9%)에 대해 양성의 세포를 포함하고 있었다(도 1D). 비Muse 세포는 단세포 부유 배양에 있어서 클러스터를 형성하지 않기 때문에, 그것들을 단리 후 곧바로 젤라틴 코팅 배양 디쉬에 직접 파종하고, M 클러스터와 동일한 길이의 시간 동안 배양하였다. 그러나 비Muse 세포는 아무런 간아세포·간세포 계열 마커의 발현도 나타내지 않았다(데이터 미도시). 따라서, Muse 세포는 간아세포·간세포 계열 세포에 대한 높은 분화능을 가지고 있으나 비Muse 세포에는 그러한 능력이 없다고 생각된다.

< Muse 세포는 상해를 입은 간에 효율적으로 유주하고 생착함 >

다음으로, 인간 Muse 세포가 간 상해 모델의 혈청 및 간조직으로 유주하는 능력을 시험관 내에서 시험하였다. 이를 위해, 사염화탄소(CCl₄)의 단회 복강 내 투여를 인간 세포를 거부하지 않는 면역 부전 마우스(SCID 마우스)에서 실시하고, 혈청 및 상해 간 조직을 1, 24 및 48시간 후의 시점에서 채취하였다. 대조로서 사염화탄소(CCl₄) 비투여의 SCID 마우스의 혈청 및 간 조직을 채취하였다. 유주능의 평가에는 보이덴 챔버(Boyden chamger)법을 사용하였다. 인서트의 하측에 채취한 혈청 또는 조직, 상측에 인간 Muse 세포 또는 비Muse 세포를 첨가하여 인서트를 통과한 인간 Muse 세포수 또는 비Muse 세포수를 계측하였다. 그 결과, 비상해 마우스의 혈청에 있어서는 Muse 및 비Muse 세포의 유주는 매우 적어 양자 사이에 통계적 차이는 없었다(도 2A). CCl₄ 주사 후 1시간의 혈청(1시간-CCl₄)에서는, Muse 세포 및 비Muse 세포 양자에서 유주가 조금 증가했지만, Muse 세포 및 비Muse 세포의 양자에 있어서 비상해의 경우와 1시간-CCl₄와의 사이에 통계적 차이는 없었다. 그러나 24시간-CCl₄의 혈청에서는 유주한 Muse 세포의 수가 대폭 증가하였고, 비상해 및 1시간-CCl₄에 대해 통계적 유의차가 존재하였다(양자 모두 p<0.001). 또한, 24시간의 시점에서 유주한 세포 수의 증가는 Muse 세포의 1시간-CCl₄에서보다도 약 12배 컸다. 한편, 비Muse 세포에 있어서는 그러한 극적인 변화는 관찰되지 않았다. 24시간의 시점에서 Muse 세포 쪽이 비Muse 세포보다 3 ~ 4배 높은 유주율을 보였고, 양자 사이에 통계적 유의차가 관찰되었다(p<0.001). 48시간-CCl₄의 혈청에서는, 24시간-CCl₄에서 볼 수 있었을 정도의 수준은 아니었지만, 여전히 Muse 세포와 비Muse 세포와의 사이에 통계적 차이가 관찰되었다(P<0.01)(도 2A).

혈청의 경우와 같이, 24시간-CCl₄의 간 조직에서는 Muse 세포의 유주수가 최대가 되었고, 비Muse 세포와의 비교에 있어서(p<0.001), 또는 비상해, 1시간-CCl₄, 혹은 48시간-CCl₄의 간 조직 Muse 세포와의 비교에 있어서, 통계적 유의차를 나타내었다(각각 p<0.001). 24시간-CCl₄의 간으로 유주한 Muse 세포의 수는 1시간-CCl₄의 Muse 세포에 있어서의 경우의 약 7배이며, 24시간-CCl₄의 비Muse 세포에 있어서의 경우의 약 4배였다. 비Muse 세포에서는 현저한 유주가 검출되지 않았다(도 2B). 이들 결과로부터, 비Muse 세포와는 상이하며, Muse 세포가 CCl₄-간 상해 모델의 혈청이나 간에 대해 강력한 유주 활성을 갖는다는 것이 나타났다.

꼬리 정맥 주사된 인간 Muse 세포 및 비Muse 세포의 생체 내 동태를 분석하였다. SCID 마우스를 사용하여, 비상해의 마우스와 사염화탄소(CCl₄)의 단회 복강 내 투여를 실시한 24시간 후의 마우스(24시간-CCl₄-간 상해 마우스)를 준비하고, 인간 Muse 세포 또는 비Muse 세포를 꼬리 정맥에 주입하였다. Muse 세포 투여 후 2주째의 비상해 및 24시간-CCl₄-간 상해 마우스의 각 장기에 대해 인간 특이적 Alu 서열의 Q-PCR을 실시하여 인간 Muse 세포 및 비Muse 세포의 분포를 조사하였다. 비상해 마우스에서는, Muse 세포 주사 마우스 및 비Muse 세포 주사 마우스의 양자에 있어서, Alu 서열의 낮은 시그널이 폐에서 검출되었고, 다른 장기에서의 시그널은 검출 한계 미만이었다(도 3A). Muse 세포 주사를 실시한 24시간-CCl₄-간 상해 모델의 경우, 시그널은 간에서 최대이며, 폐에서는 더욱 낮고, 다른 장기에서는 검출 한계 미만이었다. 한편, 비Muse 세포를 주사한 마우스에서는 간에 있어서도, 폐 이외의 다른 장기에 있어서도, 시그널은 검출 임계치 미만이 되었다(도 3A).

다음으로, 간 상해 모델(24시간-CCl₄-간 상해 마우스)의 세포 투여 후 30일째에 있어서의 인간 Muse 세포의 생착과 분화를, 항인간 골지 복합체(H-Golgi) 항체 또는 항인간 미토콘드리아 항체를 사용하여 인간 세포의 생착과 분화를 검증하였다. 상해를 입은 간장의 조직상은 극히 불균질하기 때문에, 상해를 입은 영역과 정상으로 보이는 영역의 양자로부터 상이한 10개의 영역을 임의로 선택하여 그들 모두에 대해 측정을 실시하였다. Muse군에서 검출된 H-Golgi(+) 세포의 수(1 mm²의 간 절편 중에 있어서 전체 세포의 1.89±0.65%)는 비Muse 군에 있어서의 수(0.04±0.08%)의 약 48배이며, 높은 통계적 유의차(p<0.001)를 나타내었다(도 3B, C). 조직학적 분석에 의하면, H-Golgi(+) 세포는 Muse 군에서 주로 간 내의 혈관 주변에 분포하고 있으며, 정맥 주사된 Muse 세포가 혈관에서 간으로 생착한 것이 시사되었다(도 3B). 인간 Muse 세포가 상해를 입은 간 내에 생착한 것은 인간 특이적 미토콘드리아의 검출에 의해서도 확인되었다(도 3D). H-Golgi/인간 미토콘드리아 및 간세포 마커에 대한 이중 염색에 의해 인간 미토콘드리아(+) 세포의 49.8±1.9%가 인간 특이적 알부민에 대해 양성이며, H-Golgi(+)의 80.4±3.2%가 인간 전구/성숙 간세포 마커 HepPar-1(도 3D, E)에 대해 양성임이 나타났다.

이들 결과는 모두, Muse 세포가 시험관 내 및 생체 내에서 상해를 입은 간으로 유주하여 집적되고, 또한 생체 내에서 인간 특이적 알부민 및 HepPar-1 양성 세포로 분화하는 극히 높은 능력을 갖고 있는 한편, 비Muse 세포는 이러한 능력을 나타내지 않았음을 보여준다.

< Muse 세포는 간 섬유증 모델에 있어서 기능을 개선시키고, 섬유화를 감소시킨다 >

간 섬유증 모델 제작의 실험 순서, 그리고 주사를 실시하는 세포수 및 타이밍을 도 4A에 나타내었다. 구체적으로는, SCID 마우스의 간 섬유증 모델을 CCl₄(0.5 ml/kg)의 복강 내 주사를 매주 2회씩, 8주까지 실시함으로써 제작하였다.

5 ×10⁴ 세포의 인간 Muse 세포(Muse군, n=8) 또는 비Muse 세포(비Muse군, n=8), 혹은 등량의 인산 완충 식염수(PBS)(매체군; n=8)를 2, 4 및 6주의 시점에서 간 섬유증 모델 마우스의 꼬리 정맥에 주입하고, 데이터를 8주의 시점에서 수집하였다.

Muse, 비Muse 및 용매군에 있어서, 8주까지 종양 형성은 관찰되지 않았다(데이터 미도시). 8주째에는 혈청 총 빌리루빈이 Muse군(0.74±0.05 mg/dl)에 있어서, 용매군(0.74±0.05 mg/dl, p<0.001) 및 비Muse군(0.48±12 mg/dl, p<0.001)과 비교하여 유의하게 낮아졌고, Muse군에서는 용매군과 비교하여 약 2.8배 낮은 것으로 나타났다. Muse군만큼은 아니지만, 비Muse군의 총 빌리루빈은 용매군의 1.5배 낮았고, 통계적 유의차(p<0.001)가 존재하였다. 이것은 중간 정도의 회복을 시사하고 있다(도 4B). Muse군의 혈청 알부민 농도는 3군 중에서 가장 높았고(2.99±0.11 g/dl), 용매군(2.65±0.08 g/dl, p<0.001) 및 비Muse군(2.81±0.06 g/dl, p<0.01)과 비교하여 고도의 통계적 유의차가 존재하였다. Muse 군만큼은 아니지만, 비Muse 군은 용매군과 비교하여 혈청 알부민의 중간 정도의 회복을 나타내었다(p<0.01)(도 4C).

주로 I/III형 콜라겐으로 이루어지는 섬유화 정도를 시리우스 레드 염색 및 메이슨 트리크롬 염색에 의해 평가하였다. 8주에 있어서, 전형적인 결절성 격벽(internodular septum)을 수반하는 섬유화 영역의 확대가 용매군에 있어서 관찰되었다. 한편, 섬유화 면적은 Muse군에 있어서 최소였다. 시리우스 레드 염색에 의하면, Muse군(절편당 총면적의 0.75±0.15%)은 용매군(2.91±0.35%) 및 비Muse군(1.86±0.13%)과 비교하여 최소의 섬유화 면적을 나타내며, 쌍방에 대해 통계적 유의차(p<0.001)가 존재하였다. 이것은 용매군에 대해 섬유화가 75% 개선된 것에 상당한다(도 4D). 비Muse군과 용매군과의 사이에는 통계적 차이가 관찰되고(p<0.001), 비Muse군에서는 용매군에 대해 36% 상당의 섬유화 개선이 보였다. 이것은 비Muse군에 있어서 중간 정도의 효과를 시사하고 있다(도 4D). 동일한 결과가 메이슨 트리크롬 염색에 의해서도 관찰되었다. Muse군은 3군 중에서 최소의 섬유화 면적(0.73±0.15%)을 나타내었고, 용매군(1.90±0.12%, p<0.001) 및 비Muse군(1.11±0.15%, p<0.01)과 비교하여 고도의 통계적 유의차가 존재하였다. 이것은 용매군에 대해서 섬유화가 62% 개선된 것에 상당한다(도 4E). Muse군만큼은 아니지만, 비Muse군도 용매군에 대해 통계적 차이(p<0.001)를 나타내었고, 용매군에 대해 42%의 개선에 상당하였다(도 4E).

이들 결과는, 혈청 총 빌리루빈 및 알부민에 의해 측정되는 간 기능의 개선 에 있어서, 그리고 8주까지의 마우스 간 섬유증 모델의 섬유화의 감소에 있어서, 인간 Muse군이 비Muse군에서도 유효함을 나타내고 있다.

< Muse 세포는 간 섬유증 모델에 있어서 자발적 생체 내 분화에 의해 새로운 간세포를 제공한다 >

8주의 시점에서, 인간 Muse 세포는 혈관 주위의 영역에서 다수 검출되었지만, 비Muse 세포는 극히 몇 안 되는 수밖에 검출되지 않았다(도 5A). 1 mm² 절편 내의 총 세포수에 있어서의 H-Golgi(+)세포의 수는 Muse군에 있어서 높았다(5.78±2.39%)가, 비Muse군에 있어서 극히 낮고(0.27±0.12%), 통계적 유의차가 존재하였다(p<0.001). Muse군에 있어서의 비율은 약 21배였다(도 5A, B).

Muse군에 있어서 면역 염색을 더 실시하였다. H-Golgi 및 인간 미토콘드리아에 대해 양성의 Muse 세포가 간에서 검출되어, HepPar-1(H-Golgi(+) 세포의 71.1±15.2%)(도 5C), 인간 알부민(H-Golgi(+) 세포의 54.3±8.2%)(도 5D) 및 인간 항트립신(인간 미토콘드리아(+) 세포의 47.9±4.6%)(도 5E)의 발현을 보였다. 따라서, 생착된 인간 Muse 세포는 그 후 간세포 마커 양성 세포로 자발적으로 분화한다는 것이 시사된다.

지금까지의 연구에 의해, 상해를 입은 간에 있어서 골수 유래의 간세포가 세포 융합에 의해 형성되는 경우가 있다는 것이 밝혀지고 있다. 그래서, 본 연구에 있어서의 전술한 분화가 세포 융합의 결과에 의한 것인지의 여부를 조사하기 위해, 형광 현장(in situ) 혼성화(FISH) 분석을 실시하여 숙주 간세포(마우스 기원, 녹색으로 구분)와 주입한 Muse 세포(인간 기원, 적색으로 구분)와의 사이에 세포 융합이 존재하는지 조사하였다(도 6A). 각 FISH 시료에 인접하는 절편에 대해 H-Golgi 및 HepPar-1의 이중 염색을 실시하여 분화된 인간 Muse 세포로부터 FISH 시그널이 얻어지는지 여부를 추측하였다. 그 결과, FISH에 있어서의 세포와 거의 일치하는 H-Golgi(+)/HepPar-1(+)-인간 Muse 세포 중, 불과 2.6±0.25%가 세포 융합에 의해 생성된 것이 시사되었다. 반대로 말하면, 이에 의해 마우스 간 조직에 도입된 인간 Muse 세포의 약 97%가 세포 융합에 의하지 않고 간세포 마커 양성 세포로 분화된 것이 시사된다.

인간 특이적 알부민, 약물 대사에 관여하는 효소인 인간 사이토크롬 P450 1 A2(CYP1A2) 및 유리 글루코오스 형성과 관련된 효소인 인간 글루코오스-6-포스파타아제(Glc-6-Pase) 등의 인간 특이적인 성숙한 기능적 간세포의 마커의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과, Muse군의 간에서 높은 발현을 보였다. 한편, 비Muse군 및 용매군에 있어서, 이들 마커는 발현되지 않았다. 주목해야 할 점으로는, 인간 베타 액틴의 시그널은 비Muse 이식 간에 있어서 검출 한계 미만이며(도 6B), 이 점은 도 5A 및 B에 있어서의 비Muse군의 조직학적 데이터와 일치한다.

또한, 섬유화 개선 메커니즘의 하나로서 메탈로 프로테아제 등의 프로테아제가 콜라겐 등의 섬유를 용해한다는 것을 생각할 수 있다.

이상으로부터, Muse 세포는 간아세포·간세포 계열로 시험관 내에서 분화하는 능력을 나타내었다. Muse 세포는 시험관 내에서 CCl₄ 처리된 마우스의 혈청 및 간쪽으로 유주하는 높은 능력을 보여주었고, 또한, 상해를 입은 간으로 생체 내에서 특이적으로 집적하는 한편, 다른 장기에는 특이적 집적을 보이지 않았다. Muse 세포는 간에 생착한 후, 숙주 간세포와 융합하는 일 없이, HepPar-1(71.1±15.2%), 인간 알부민(54.3±8.2%) 및 항트립신(47.9±4.6%) 양성 세포로 생체 내에서 자발적으로 분화하고, 8주의 시점에서 CYP1A2나 Glc-6-Pase 등의 성숙한 기능적 인간 마커를 발현하였다. 게다가 혈청 총 빌리루빈 및 알부민의 상당한 회복 및 섬유화의 감소가 관찰되었다.

이들 결과는, Muse 세포가 간 섬유증의 예방이나 치료에 유효함을 시사하고 있고, 나아가서는 다른 섬유증의 예방이나 치료에도 유효함을 시사하고 있다.

<실시예 2>

Muse 세포의 피부 섬유화 모델에서의 평가

문헌[Sci Rep. 2015 Aug 20;5:12466. doi: 10.1038/srep12466.]에 기재된 방법에 따라 BLM 유발 피부 섬유화 모델 마우스를 제작하였다. 마우스는 C57BL/6J, 암컷(일본 에스에르시(주))을 사용하였다. 또한, 대조군에서는 BLM 대신에 생리 식염수를 투여하였다.

BLM 투여로부터 14일째에 꼬리 정맥으로 1×10⁶/체중(kg)의 Muse 세포를 투여하였다. 한편, 매체 투여군은 14일째에 꼬리 정맥으로 매체를 투여하였다.

BLM 투여로부터 28일째에 피부 조직을 단리하여, 콜라겐 정량, 헤마톡실린·에오신(HE) 염색 및 진피층 두께의 해석을 실시하였다.

피부 콜라겐 해석은 이하와 같이 실시하였다.

피부편을 0.5 M 아세트산/펩신 용액을 사용하여 균질화시키고, 4℃에서 하룻밤 교반하였다. 얻어진 추출물을 사용하여, 피부 콜라겐 농도에 대해 Sircol collagen assay kit (Biocolor 사, Cat No. : S1000)를 사용하여 측정하였다.

HE 염색 및 진피층 두께의 해석은 먼저, 피부의 절편(4 ㎛)을 제작하고, HE 염색을 실시하고, 광학 현미경을 사용하여 100배의 시야에서 1 절편당 5 시야의 사진을 촬영하였다. 표피층 바로 아래로부터 피하지방까지의 거리를 진피층 두께로 하여 ImageJ를 사용하여 계측하였다.

혈장 히알루론산 해석

마우스로부터 얻어진 혈장을 사용하여, ELISA법(Quantikine Hyaluronan ELISA Kit, R&D systems, Inc.)에 의해 혈장 속의 히알루론산 농도에 대해 측정하였다.

결과

1. 피부 콜라겐량

피부 콜라겐량의 해석 결과를 도 7에 나타낸다. BLM 28일 + 매체 투여군에서는 BLM을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 피부 콜라겐량의 유의한 증가가 관찰되었다. 또한, BLM 28일 + Muse 세포 투여군에서는 BLM 28일 + 매체 투여군과 비교하여 피부 콜라겐량의 유의한 감소가 관찰되었다.

2. HE 염색 및 진피층 두께

HE 염색상을 도 9에, 진피층 두께를 도 8에 나타낸다. BLM 28일 + 매체 투여군에서는 대조군과 비교하여 진피층 두께의 유의한 증가가 관찰되었다. 또한, BLM 28일 + Muse 세포 투여군에서는 BLM 28일 + 매체 투여군과 비교하여 진피층 두께의 유의한 감소가 관찰되었다.

3.혈장 히알루론산 농도

혈장 히알루론산 농도에 있어서, 대조군과 BLM 28일 + 매체 투여군 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 한편, BLM 28일 + Muse 세포 투여군에서는 BLM 28일 + 매체 투여군과 비교하여 혈장 히알루론산 농도의 증가 경향을 나타내었다.

<실시예 3>

Muse 세포의 폐섬유화 모델에서의 평가

BLM 용액(14 ㎍/25 ㎕/폐)을 기관 내 투여하고, BLM 폐섬유증 모델 마우스를 제작하였다(의학과 약학, 62(4):661-668, 2009). 마우스는 Cr1 : CD1(ICR), 수컷(일본 찰스·리버(주))을 사용하였다. BLM 투여 21일 후에 꼬리 정맥으로 1×10⁶ 세포/체중(kg)의 Muse 세포 또는 매체를 투여하였다.

포르말린 고정한 폐를 꺼내, 메이슨 트리크롬 염색 표본을 제작하였다. 메이슨 트리크롬 염색 표본을 사용하여 폐엽마다 섬유화의 스코어화를 실시하였다.

폐섬유화 스코어에 대해서는, 하기의 폐섬유화의 평가 기준으로 정도를 분류하였다. 그 후, 각 군의 폐섬유화 스코어의 평균치에 가까운 상의 사진을 각각 촬영하였다(도 11). 또한, 섬유화 스코어의 평가는 BLM 투여 21일 및 35일 후의 폐 조직을 사용하여 실시하였다.

폐섬유화의 평가 기준(수치는 스코어)

O : 정상

1 : 폐포 혹은 기관지 벽의 경도의 섬유성 비후가 관찰됨

2 : 폐포 혹은 기관지 벽의 중등도의 섬유성 비후는 있으나, 명백한 폐의 구조적 변화는 수반하지 않음

3 : 명백한 폐의 구조적 변화와 작은 섬유화소(線維化巢)의 형성이 관찰됨

4 : 딱딱한 폐의 구조적 변화와 큰 섬유화소의 형성이 관찰됨

5 : 전체가 섬유화로 치환됨

BLM 투여 후에 출현하는 호흡 촉박에 대한 Muse 세포의 효과를 검토하기 위해, 대조군과 Muse 세포 투여군의 BLM 투여 21일 후부터 35일 후까지의 호흡 촉박의 출현수를 각각 카운팅하였다.

결과

1. 폐섬유화 스코어

폐섬유화 스코어의 결과를 도 10에 나타낸다. 그 결과, BLM 투여 21일 후에 섬유화가 형성되어 있고, 그 섬유화의 정도는 35일 후에 있어서도 변함 없었다.

한편, BLM 투여 35일 후에 있어서, Muse 세포 투여군에서는 매체 투여군과 비교하여 섬유화 스코어는 점수가 낮아지고, 추가로 폐엽마다의 섬유화 스코어를 비교한 결과 왼쪽 폐에서 억제 경향(p=0.086)이 관찰되었다.

2. 호흡 촉박 출현수

도 12에 나타낸 바와 같이, Muse 세포 투여군에서는 BLM 투여 29일 후부터 35일 후까지, 매체 투여군에 비해 호흡 촉박 출현수는 유의하게 감소하였다.

<실시예 4>

Muse 세포의 간 섬유화 모델에서의 평가

10% 사염화탄소 10 mL/kg를 마우스의 복강 내에 2회/주의 빈도로 12주간 투여하여 간 섬유화를 유발시켰다. 마우스는 BALB/c, 암컷(일본 찰스·리버(주))을 사용하였다.

사염화탄소 첫회 투여로부터 57일째에 1×10⁶ 세포/체중(kg)(저용량군) 및 1×10⁷ 세포/체중(kg)(고용량군)의 Muse 세포를 꼬리 정맥으로 투여하였다.

사염화탄소 첫회 투여로부터 84일째에, 간을 꺼내 HE 염색 및 메이슨 트리크롬 염색을 실시하였다. 광학 현미경을 사용하여 섬유화의 정도를 관찰하였다.

관찰된 변화는 등급 매기기(grading)(0, none ; 1, minimal ; 2, mild ; 3, moderate ; 4, severe)하여 평가하였다.

사염화탄소 첫회 투여로부터 84일째에 혈액을 채취하고, 드라이켐(후지 메디컬 시스템 주식회사)을 사용하여, 혈장 속의 ALT(GPT), AST(GOT), ALB(알부민), CHE(콜린에스테라아제) 및 TBIL(총 빌리루빈)을 측정하였다.

결과

1. 섬유화 레벨

섬유화의 정도를 표 1에 나타낸다. 매체 대조군의 섬유화 정도는 10개의 예 중 10개의 예로 레벨 2였다.

Muse 세포 저용량군의 섬유화 정도는 10개의 예 중 9개의 예가 레벨 1이었고, 1개의 예가 레벨 2였다.

Muse 세포 고용량군의 섬유화 정도는 10개의 예 중 7개의 예가 레벨 1이었고, 3개의 예가 레벨 2였다.

Muse 세포 투여 양군 모두 매체 대조군과 비교하여 유의한 섬유화의 개선이 관찰되었다.

2. 혈장 속의 ALT(GPT), AST(GOT), ALB, CHE 및 TBIL의 측정

매체 대조군에서는 ALT, AST/ALT비, TBIL에 있어서 간염을 나타내는 변화가 관찰되었지만, Muse 세포 투여군에서는 저용량, 고용량 모두 ALT, AST/ALT 비 및 TBIL에 있어서 유의한 개선 효과를 나타내었다. 또한, ALB, CHE에 있어서는 용매 대조군과 비교하여 약간의 개선 경향이 관찰되었다.

[산업상 이용가능성]

본 발명의 세포 제제는 섬유증 환자에게 투여함으로써 상해 부위에 있어서 조직을 재건 및 수복하고, 기능을 회복시킬 수 있으며 섬유증의 예방이나 치료에 응용할 수 있다.

Claims

생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포를 포함하는, 장기 섬유증을 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제.
제1항에 있어서,
장기 섬유증은 소화기, 호흡기, 순환기, 비뇨생식기, 운동기, 뇌신경계, 내분비 기관, 또는 피부에 생기는 섬유증인 것인 세포 제제.
제2항에 있어서,
장기 섬유증은 소화기에 생기는 섬유증인 것인 세포 제제.
제3항에 있어서,
장기 섬유증은 간 섬유증인 것인 세포 제제.
제4항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포는 간아세포 또는 간세포 마커를 발현하는 세포로 분화하는 능력을 갖는 것인 세포 제제.
제4항 또는 제5항에 있어서,
대상에 투여했을 때, 비투여 대조와 비교하여 혈청 총 빌리루빈 및/또는 혈청 알부민 값을 개선시키는 세포 제제.
제2항에 있어서,
장기 섬유증은 피부에 생기는 섬유증인 것인 세포 제제.
제2항에 있어서,
장기 섬유증은 폐에 생기는 섬유증인 것인 세포 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포가 이하의 성질 전부를 갖는 다능성 줄기세포인 세포 제제 :
(ⅰ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다;
(ⅱ) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 갖는다;
(ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다; 및
(ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다.
생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포를 포함하는, 조직 섬유화의 억제 및/또는 섬유화 조직의 용해를 위한 세포 제제.