KR102306231B1

KR102306231B1 - 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 분화방법

Info

Publication number: KR102306231B1
Application number: KR1020150081369A
Authority: KR
Inventors: 신상진; 김향
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2021-09-28
Also published as: KR20160144780A

Abstract

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 분화방법 및 이를 이용한 건 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 분화 방법은 건 세포로의 높은 분화능을 보여 다량의 건 세포의 확보가 가능하며, 본 발명에 따라 분화된 세포는 버려지는 자가 조직을 사용함으로써 조직적합성이 높으며 건 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로써 우수한 이용가능성을 보인다.

Description

편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 분화방법 {A METHOD FOR DIFFERENTIATION OF TONSIL-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELL INTO TENOCYTE}

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 분화방법 및 이를 이용한 세포 치료제에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되고, 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있는 특성이 있으며, 분화 자극에 따라 상이한 세포로도 분화될 수 있는 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포이며, 일부 줄기세포는 다분화능 또는 단분화능의 잠재력을 지닌다.

상기 줄기세포들이 가지는 분화능을 기초로 세포 치료제로 이용 가능성이 있어 이와 관련된 연구 개발이 활발히 진행중이다. 하지만, 배아 줄기세포를 이용한 세포 치료제의 경우 윤리적 문제나 조직 적합성 불일치 문제가 제기되고 있으며, 역분화 줄기세포를 세포 치료제로 사용할 경우 종양 발생 가능성의 문제가 있다.

이에 따라, 분화능이 낮은 것으로 알려져 있지만 상대적으로 안전한 중간엽 줄기세포를 이용한 연구가 많이 진행되고 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSCs)는 성체 골수 등에 있는 multi-potential non-hematopoietic progenitor cell로서 지방, 연골, 뼈, 근육, 피부 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 이러한 중간엽 줄기세포를 이용하여 다양한 조직 재생을 위한 임상 연구가 진행되고 있으며, 장기이식 분야에도 적용가능성을 보이고 있다.

그러나, 중간엽 줄기세포 중에서도 몇몇 줄기세포는 그 이용에 있어서 세포를 얻는데 큰 제한이 있기 때문에 그 이용이 어렵다. 예를 들어, 가장 비침습적인 방법을 이용해 얻을 수 있는 세포는 골수채취를 통한 중간엽 줄기세포이다. 하지만 가장 비침습적인 방법인 골수채취는 마취가 필요하고 고통을 유발하여, 그 이용에 제한이 있다. 이에 대한 대안으로 환자 맞춤형 줄기세포를 분리하기 위해 말초혈액을 이용한 세포획득법 등이 요구되고 있으나 말초혈액만으로는 성인에서 분리할 수 있는 중간엽 줄기세포의 수가 너무 적고 분리방법이 경제적이지 못하며, 분리해낸다고 해도 세포치료에 사용가능한 양만큼 증식이 원활하지 않은 경우가 대부분이기에 좀 더 실용성을 높일 수 있는 대체 방안이 필요하다.

또한, 고령인 환자에서 얻는 성체 줄기세포는 낮은 연령에게서 얻는 세포들에 비해 증식능력이 현저히 떨어지며 각종 인자들의 분비 및 줄기세포의 병변으로 이동 능력 등이 떨어지기 때문에, 저연령의 환자로부터 자연스럽게 분리될 수 있거나 버려지는 조직으로부터 세포를 얻을 필요성이 있다.

한편, 건은 보통 근육을 골에 연결시켜 주는 섬유성 결합 조직인 질긴 띠이다. 건의 탄력적인 특성이 운동시 힘을 조절하며 안정화를 시켜주고, 에너지를 보관하고 고효율로 회복시킨다. 건은 고도로 분화된 초미세구조를 가지며 이의 혈관화 수준은 낮고 콜라겐 전환이 느리기 때문에, 손상될 경우 치유 속도는 매우 느리고 원래의 강도로 회복되기는 매우 어렵다. 이에 따라, 건의 손상 부위에서 다시 손상이 재발하는 것은 흔한 일이다.

건 질환은 과용 또는 노화로 인해 점차적으로 건에 마모가 일어나고, 인열이 일어남으로써 그로 인한 이화 대사 반응과 동화 대사 반응 사이의 불균형이 원인인 것으로 보여지는 건의 만성 장애 또는 손상이다. 이와 같은 불균형의 결과는 건 변성, 쇠약, 인열, 및 동통이다. 대조적으로, 급성 건 손상, 예를 들어, 건 파열 또는 골로부터의 분리는 매우 갑작스럽게 일어나는 것으로, 보통 파열을 수복시키거나, 건을 골에 재부착시키기 위해서는 수술이 이루어져야 한다.

어느 누구에서나 건 질환이 발병될 수 있지만, 직업상, 운동시, 또는 규칙적인 일상 활동에서 같은 동작을 반복해서 하는 경향이 있는 사람인 경우에 상기 질환이 발병될 가능성은 더 크다. 예컨대, 어깨 관절이 경우 커다란 운동 영역을 가지고 있는 반면 매우 안정적이지 못한 특성을 가지고, 어깨 사용에 따라 마손으로 인해 퇴화가 빠르게 일어난다. 더욱이, 회전 근개 기능 단위는 혈액 순환이 약해서 손상에 민감하고 완전 파열이 흔하게 일어나는 곳이다.

이와 관련된 치료는 전통적으로 비스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 스테로이드 주사, 및 물리적 요법을 이용하는 치료법을 비롯한, 소염적 조치에 중점을 두고 있다. 더욱 최근에는, 충격파 요법, 저수준 레이저 요법, 혈관 경화 요법, 및 다른 실험적 치료법이 시험되었다. 대개는, 일부 치료법 (예를 들어, NSAID 및 코르티손 주사)을 통해 단기간 완화되는 반면, 현 치료법들의 장기간의 이점은 여전히 불명확하다. 따라서, 현 치료 방식과 비교하여 보다 장기간에 걸쳐 이점을 제공할 수 있는 개선된 건 질환 치료 방법이 요구된다.

이러한 배경 하에, 건 세포로의 높은 분화능을 보일 수 있는 특정 줄기세포로부터 최적의 분화 방법을 확인하여 인체 적용에 적합한 건 세포를 확보하는 방안에 대한 연구 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허공보 제10-2014-0103132호 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0031300호

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 TGF-β3을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 건 세포 분화 방법에 따라 제조된 건 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 건 세포 분화 방법에 따라 제조된 건 세포를 유효성분으로 포함하는 건 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 인체 적용에 적합한 건 세포의 대량 생산 방법을 연구하던 중, 편도 유래 중배엽 줄기 세포로부터 건 세포를 단기간에 대량 생산하는 방법을 발명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포란 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직인 편도에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 건 세포(tenocyte)는 섬유의 다발 사이에 뻗고 있는 날개 같은 돌기를 가진 백색 섬유성 결합조직 속세포로써, 보통 근육을 골에 연결시켜 주는 섬유성 결합 조직인 질긴 띠를 이룰 수 있다.

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 TGF-β3을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, TGF-β3은 세포 분화의 조절에 중요한 역할을 하는 성장 인자에 해당하며, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화 인자로써 편도 유래 중간엽 줄기세포를 자극하여 건 세포 분화를 현저하게 촉진시키는 첨가제이다.

본 발명에 있어서, 세포 배양은 배양 접시에서 cm² 당 2x10⁴ 내지 5x10⁴개의 세포를 2 내지 13일, 바람직하게 3 내지 10일 동안 배양하여 수행되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, TGF-β3는 10 ng/ml 내지 70 ng/ml. 바람직하게 20ng/ml 내지 50ng/ml로 첨가되는 것이 바람직하다.

편도 유래 중간엽 줄기세포는 1 내지 3일, 바람직하게 3일 마다 TGF-β3은 10 ng/ml 내지 70 ng/ml, 바람직하게 20 ng/ml 내지 50 ng/ml가 포함된 배지를 교환함으로써 분화가 재자극될 수 있다.

상기 배양 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640), MEM(Minimum Essential Media) 또는 Ham F10 으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지이다.

본 발명의 건 세포 분화 방법은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여, 타 유래의 성체 줄기세포를 사용한 방법과 대비하여 현저한 분화능을 보이며, 이러한 효과는 특히 건 세포 분화에 전반적으로 발현되어지는 표지인자들의 높은 발현 패턴을 통해 확인가능하다. 본 발명에 따르면, 미분화된 상태의 편도유래 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따라 1형 콜라겐, Decorin, Tenomodulin 및 Scleraxis의 발현이 크게 증가된다.

본 발명은 또한 상기 분화 방법에 따라 제조된 건 세포를 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 건 세포는 편도 유래 줄기세포와 대비하여 높은 1형 콜라겐, Decorin, Tenomodulin 및 Scleraxis 발현량을 보여, 건 세포로의 우수한 특성을 가진다.

본 발명은 또한 상기 분화 방법에 따라 제조된 건 세포를 유효성분으로 포함하는 건 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 즉, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로 사용되어 건 질환에 사용될 수 있다.

상기 건 질환은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염, 족저 근막염, 및 회전근개 건 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 건 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제, 분무제 등이 바람직하다. 또한, 상기 건 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체를 포함할 수 있다. 또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 투여량은 1.0×10⁵내지 1.0×10⁹세포/kg 체중, 바람직하게 1.0×10⁶내지 1.0×10⁷세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 3차원 분화 방법을 제공한다.

바람직하게 본 발명의 일실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 3차원 분화 방법으로써, (a) 하이드로젤을 포함하는 배지에 편도 유래 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양 배지에 TGF-β3을 첨가하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 3차원 분화 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 3차원 분화 방법은 (a) 단계에서, cm당 1x10⁶ 내지 2x10⁶개의 세포를 배양하는 것이 바람직하며, (b) 단계에서 TGF-β3은 10 ng/ml 내지 70 ng/ml, 바람직하게 20 ng/ml 내지 50 ng/ml가 첨가되는 것이 바람직하다. 세포의 분화 기간 및 배양 배지 교환에 따른 재자극은 건 세포 분화 방법에 관한 내용이 적절히 변형되어 적용가능하다.

본 발명에 따른 3차원 분화 방법은 하이드로젤 지지체를 통해 3차원 환경을 제공하여 이식 전 줄기세포의 분화 방향을 미리 조절하고 높은 분화율 및 세포 생존율을 보임으로써 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화에 현저한 효과를 보인다. 하이드로젤은 이에 제한되지 않으나, 알지네이트, 콜라겐 , 아가로즈 등의 천연 하이드로젤과 PEG(polyethlene glycol), PGLA(poly(lactic-co-glycolic acid)), 서모젤(thermogel) 등의 합성 하이드로젤을 포함한다. 이러한 하이드로젤은 세포 수준이 아닌 조직 수준에서 3차원 세포 배양을 통해 생리학, 병리학적 모델을 구축하거나 세포 주변 미세 환경과 cell delivery vehicles 향상시키는 등의 장점을 제공한다.

또한, 바람직하게 본 발명의 다른 일실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 3차원 분화 방법으로써, (a) 편도 유래 줄기세포를 TGF-β3이 첨가된 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 콜라겐 I 처리된 배양 플레이트 멤브레인에 상기 (a) 단계의 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 콜라겐 I 처리된 배양 플레이트 멤브레인을 통해 세포에 이축-인장(equi-biaxial) 압력을 가하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 3차원 분화 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 건 세포의 3차원 분화 방법의 (a) 단계에서 TGF-β3은 10 ng/ml 내지 70 ng/ml, 바람직하게 20 ng/ml 내지 50 ng/ml가 첨가될 수 있다. 상기 (b) 단계에서 콜라겐 I 처리된 배양 플레이트 멤브레인은 예컨대, Bioflex culture plate membrane treated with collagen I (Bioflex; BF-3001C)일 수 있으며 상기 (a) 단계의 TGF-β3 처리된 편도 유래 중간엽 줄기세포가 배양될 수 있다.

상기 (c) 단계의 이축-인장 압력을 가하는 단계는 건세포의 활성화를 위하여 기계적 자극을 제공하는 단계이다. 이축-인장 압력의 적용은 예컨대, Flexcell^® Tension System에서 Bioflex culture plate membrane treated with collagen I을 통해 멤브레인 아래쪽의 loading post에 순환적으로 압력이 전달되도록 진공을 통해 압력을 제공할 수 있다. 압력의 적용은 30 분 내지 180분, 바람직하게 약 120분 동안 0.5 내지 2 Hz, 바람직하게 1 Hz의 압력을 가하여 적용될 수 있으며, 이축-인장 압력 하의 배양은 1 내지 7일, 바람직하게 2 내지 4일 동안 수행될 수 있다. 세포의 분화 기간 및 배양 배지 교환에 따른 재자극은 건 세포 분화 방법에 관한 내용이 적절히 변형되어 적용가능하다.

본 발명의 분화 방법은 건 세포로의 높은 분화능을 보여 다량의 건 세포의 확보가 가능하며, 본 발명에 따라 분화된 세포는 버려지는 자가 조직을 사용함으로써 조직적합성이 높으며 건 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로써 우수한 이용가능성을 보인다.

도 1은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화시간 및 TGF-β3 농도에 따른 건 세포 관련 유전자들의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 1형 콜라겐의 발현 변화를 면역형광법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 Tenomodulin의 발현 변화를 면역형광법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 Decorin의 발현 변화를 면역형광법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 Scleraxis의 발현 변화를 면역형광법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 1형 콜라겐의 발현 변화를 면역조직화학염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 Tenomodulin의 발현 변화를 면역조직화학염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 Decorin의 발현 변화를 면역조직화학염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포로의 분화에 따른 Scleraxis의 발현 변화를 면역조직화학염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예, 제조예를 제시한다. 하기의 실시예, 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 배양

편도 유래 중간엽 줄기 세포 (tonsil-derived mesenchymal stem cell, TMSC)는 이대목동병원 이비인후-두경부외과에서 편도 적출술을 시행하는 환자로부터 적출된 편도조직 (4-20세의 저연령층 조직, 임상윤리위원회 심의 통과: ECT 11-53-02)으로부터 얻었다.

채취한 신선한 편도 조직을 PBS(Phosphate biffered saline)로 3 번 세척 후, 멸균된 scissor를 이용하여 잘게 자르고, 210 U/mL collagenase type I (Invitrogen)와 10 ㎍/mL DNAse (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA )을 넣은 DMEM 배지에서 37℃로 30분 간 효소 처리하였다. 이를 cell strainer를 통하여 여과한 후 20 % normal human serum (PAA Laboratories GmbH, Austria)이 함유된 DMEM 배지에서 2번 세척하고, 10 % human serum 이 함유된 DMEM 배지에서 1번 세척하는 과정을 수행하였다. 그리고 나서, Ficoll-Paque (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에서 원심분리를 수행하고, 소화 편도선 조직에서 단핵 세포를 획득하였다. 이를 배양 플라스크에 150 mm 직경 당 1x10⁷ 의 농도로 10 % fetal bovine serum (FBS)와 100 ㎍/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin을 넣은 DMEM 배지에 배양하였다. 24시간 후 부착되지 않은 세포들은 제거하고, 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 ㎍ /mL streptomycin, 10% FBS를 넣은 DMEM 새로운 배지로 교체하였다. 3-5 번의 계대를 한 신선한 세포를 실험에 사용하였다.

< 실시예 2> 2차원 배양에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 (tenocyte)의 분화

상기 실시예 1에서 제조한 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 4 well slide chamber에 직경당 2x10⁴개로, 10 % fetal bovine serum (FBS)와 100㎍/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin을 넣은 DMEM 배지에서 배양하였다. TGF-β3 (Peprotech)을 넣지 않은 well과 TGFβ-3 20 ng/ml 또는 50 ng/ml의 농도로 자극한 well을 나누어 배양을 수행하였으며, 자극 날짜는 각각 1, 3, 7 day 로 진행하였다. 세포는 3일마다 재자극을 실시하였다.

< 실시예 3> RT- PCR을 통한 건 세포 분화 확인

RT-PCR을 수행하여, 건 세포로의 분화를 확인하였다. Total RNA는 Trizol (Invitrogen)을 통해 추출하였고, 희석한 RNA는 석영 cuvette에 옮겨 준 뒤 260nm에서의 흡광도 및 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. cDNA 합성은 Maxime RT premix kit(Intron viotechnology)를 사용하였으며, mRNA 발현은 FastStart SYBR Green Master (Roche Applied Science)을 이용하여 각각의 Tenocyte primer와 함께 real time PCR을 수행하여 확인하였다.

사용된 프라이머 정보는 하기 표 1과 같다.

상기 실험 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포에 TGF-β3 자극을 통하여, 건 세포 관련 유전자인 1형 콜라겐, Decorin, Tenomodulin 및 Scleraxis의 mRNA 발현량이 증가하는 것이 확인되어 건세포로의 분화가 이루어짐을 확인하였다.

< 실시예 4> 면역 형광법을 통한 건 세포 분화 확인

상기 실시예 2에서의 방법과 동일하게, TGF-β3 (Peprotech)항체 자극과 함께 배양된 세포는 20˚C 메탄올로 5분간 고정되었다. 고정된 세포는 Decorin(abcam), Collagen type I (abcam), Tenomodulin (santacruz) 또는 Scleraxis (abcam) 1차 항체로 염색된 뒤 4˚C에서 overnight 후 형광 결합된 2차 항체 647 donkey anti-rabbit IgG (Thermo) 와 DAPI(Invitrogen)로 염색이 수행되었다. 염색된 슬라이드는 Zeiss microscope (LSM 510 Meta; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 으로 분석되었다.

그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었다. 도 2는 1형 콜라겐(Collagen type I, Col-I), 도 3은 Tenomodulin(Tmnd), 도 4는 Decorin, 도 5는 Scleraxis(Scx)의 형광 염색 결과를 나타낸다.

도 2 내지 도 5에서 확인되는 바와 같이, TGF-β3 처리에 따라 건 세포에서 발현되는 유전자인 Decorin, Collagen type I, Tenomodulin 및 Scleraxis 모두 발현이 증가되어 건세포로의 분화가 이루어짐을 확인하였다.

< 실시예 5>면역 조직화학 염색법을 통한 건 세포 분화 확인

상기 실시예 2에서의 방법과 동일하게, TGFβ3(Peprotech)항체 자극과 함께 배양된 세포는 20˚C 메탄올로 5분간 고정되었다. 메탄올에 3% H₂O₂를 내생의 페록시다아제 활성화를 위해서 4˚C에서 30분간 반응시켰다. 면역 조직화학 염색에는 Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 시약을 사용하였다. 세포는 Decorin (abcam), Collagen type I (abcam), Tenomodulin (santacruz) 또는 Scleraxis (abcam) 1차 항체로 4˚C overnight 배양되었다. overnight으로 배양된 세포는 PBS 세척 후 1차 항체 관련된 biotinylation된 secondary (Rabbit)항체를 상온에서 1시간 incubation되었다. Avidin-Biotinylated HRP로 1시간 상온에서 incubation하였다. DAB Substrate를 첨가하고, 상온에서 원하는 만큼의 발색이 될 때까지 기다리고, 증류수로 세척하여 발색을 멈춘 뒤, Hematoxylin으로 핵 염색을 해준 뒤 염색된 슬라이드를 mounting하였다.

그 결과를 도 6 내지 도 9에 나타내었다. 도 6는 1형 콜라겐(Collagen type I), 도 7은 Tenomodulin, 도 8은 Decorin, 도 9는 Scleraxis의 면역 조직 화학 염색 결과를 나타낸다.

도 6 내지 도 9에서 확인되는 바와 같이, TGF-β3 처리에 따라 건 세포에서 발현되는 유전자인 Decorin, Collagen type I, Tenomodulin 및 Scleraxis 모두 발현이 증가되는 것이 확인되어 건세포로의 분화가 이루어짐을 확인하였다.

상기 결과들로부터, 본원 발명 분화 방법에 따라 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건세포로의 우수한 분화능을 확인하였다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> A METHOD FOR DIFFERENTIATION OF TONSIL-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELL INTO TENOCYTE <130> P15-077-EWHA <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type 1 forward primer <400> 1 tgacctcaag atgtgccact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type 1 reverse primer <400> 2 accagacatg cctcttgtcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type 3 forward primer <400> 3 gctggcatca aaggacatcg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type 3 reverse primer <400> 4 tgttacctcg aggccctggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNMD forward primer <400> 5 ttgaagaccc acgaagtaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNMD reverse primer <400> 6 atgacatgga gcacactttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mohawk forward primer <400> 7 tggtttgcta atgcaagacg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mohawk reverse primer <400> 8 ccttcgttca tgtgggttct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Decorin forward primer <400> 9 cgcctcatct gagggagctt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Decorin reverse primer <400> 10 tactggaccg ggttgctgaa 20

Claims

편도 유래 중간엽 줄기세포를 TGF-β3을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화 방법.
제1항에 있어서, 상기 TGF-β3의 농도는 10 ng/ml 내지 70 ng/ml인 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화 방법.
제2항에 있어서, 상기 TGF-β3는 분화 재자극을 위하여 1 내지 3일마다 재첨가되는 것인 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양은 2 일 내지 13 일 동안 수행되는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640), MEM(Minimum Essential Media) 또는 Ham's F10으로부터 선택된 어느 하나인 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포 분화 방법.
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(a) 하이드로젤을 포함하는 배지에 편도 유래 줄기세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배양 배지에 TGF-β3을 첨가하는 단계;를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 3차원 분화 방법.
(a) 편도 유래 줄기세포를 TGF-β3이 첨가된 배양 배지에서 배양하는 단계;
(b) 콜라겐 I 처리된 배양 플레이트 멤브레인에 상기 (a) 단계의 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 콜라겐 I 처리된 배양 플레이트 멤브레인을 통해 세포에 이축-인장(equi-biaxial) 압력을 가하는 단계;를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 건 세포의 3차원 분화 방법.