CN113652491A - m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老检测试剂盒中的应用 - Google Patents

m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老检测试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老检测试剂盒中的应用。本发明的衰老检测试剂盒通过检测m6A RNA甲基化含量、RNA甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429，m6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5以及m6A RNA甲基化结合蛋白YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2蛋白表达量判断细胞衰老；而RNA甲基化酶METTL3高表达还是低表达用于鉴定细胞早衰还是正常的复制性衰老。本发明可用于早衰、复制性衰老以及衰老相关疾患的评估，具有广阔的应用前景。

Description

m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老 检测试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老检测试剂盒中的应用。
背景技术
细胞衰老，即复制性衰老，是一个复杂的生物学过程，细胞生理功能渐进性失调，增殖衰退，细胞周期永久性阻滞。细胞衰老与许多年龄相关疾患的发生发展密切相关，如动脉粥样硬化、骨关节炎、阿尔茨海默病、老年性黄斑变性、2型糖尿病和癌症等等，细胞呈现一种慢性及低度的非细菌性炎症状态。外源性环境因素，如紫外线、化疗等可加速细胞衰老的进程，引起急性衰老现象发生，即为早衰。早衰的发生，更早的使人体伴随着机体器官功能下降，使年龄相关疾病的风险增加，降低人们的生活质量。
目前，在细胞衰老研究中涉及的检测指标包括衰老相关的β-半乳糖苷酶、端粒和端粒酶、衰老相关的异染色质灶、衰老相关的分泌表型、活性氧簇以及肿瘤抑制基因p53和p16等。这些检测指标在衰老研究中被广泛应用，各具特点。然而，关于细胞早衰的检测和鉴定，目前尚无相关专利报道。
细胞早衰与复制性衰老虽具有许多类似的表型特征，但内在调控机制存在差异。在早衰的细胞中，存在核基因组DNA甲基化和整体组蛋白修饰的规律性变化，核及线粒体表观基因组微环境不稳定，衰老相关特异基因的表观遗传学修饰的变化。其中，RNA甲基化修饰是表观遗传学崭新的研究领域，m6A RNA 甲基化是RNA表观转录组学新的调控机制，在机体正常生理功能维持中起重要作用，参与调控癌症、糖尿病、心功能和免疫功能改变等年龄相关疾患。
经查询，在衰老诊断领域，有四项专利相关，分别是“指征健康衰老关键通路的血清蛋白质标志物及应用(申请公布号：CN111366736A)”、“健康衰老血清蛋白标志物及应用(申请公布号：CN111337688A)”、“健康衰老诊断circRNA 标志物及应用(申请公布号：CN111424079A)”、“指示健康衰老关键通路的 circRNA小分子标志物及应用(申请公布号：CN111363802A)”。以上发明专利涉及健康衰老的诊断领域，以circRNA和血清标志物为主。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老检测试剂盒中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种衰老检测试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老检测试剂盒中的应用。
所述衰老包括复制性衰老(即正常衰老过程)和氧化应激诱导的早衰。
所述细胞是随年龄增加而逐渐衰老的细胞；优选为人胚肺成纤维细胞。
所述衰老检测试剂盒是通过检测m6A RNA甲基化含量、RNA甲基化相关酶及结合蛋白的蛋白表达量，将其作为标志物判断细胞衰老。
所述RNA甲基化相关酶包括RNA甲基化酶和RNA去甲基化酶。
所述RNA甲基化酶为METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429。
所述RNA去甲基化酶为FTO和ALKBH5。
所述RNA甲基化结合蛋白为YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2。
当检测到细胞中m6A RNA甲基化含量降低，和/或m6A RNA甲基化酶 METTL14、WTAP和KIAA1429，m6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5以及 m6A RNA甲基化结合蛋白YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2中的一种或至少两种低表达，和/或RNA甲基化酶METTL3高表达或低表达，表明细胞进入衰老状态。
当检测到细胞中所述RNA甲基化酶METTL3低表达时，表明细胞复制性衰老；当检测到细胞中所述RNA甲基化酶METTL3高表达时，表明细胞早衰。
所述蛋白表达量采用相对定量分析法统计，通过蛋白条带的灰度分析，获得不同细胞表达条带的灰度值，以22PDL年轻细胞组为对照，设为1，其他细胞表达水平与22PDL年轻细胞组灰度值相比较；蛋白和内参表达量通过Western blot 检测获得。
所述22PDL年轻细胞组的定义为：继代培养细胞最终的群体倍增水平(PDL) 为22的细胞，PDL的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，其中N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。
一种衰老检测试剂盒，包括细胞中m6A RNA甲基化定量检测试剂、和/或检测甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、去甲基化酶FTO和ALKBH5 以及m6A RNA甲基化结合蛋白中至少一种的蛋白表达量检测试剂。
所述的蛋白表达量检测试剂为Western blot半定量检测试剂。
上述衰老检测试剂盒在非治疗诊断检测衰老中的应用。
所述应用包括取待测细胞，提取总RNA，采用上述衰老检测试剂盒进行m6A RNA甲基化含量检测的步骤，和/或将待测细胞提取总蛋白，采用上述衰老检测试剂盒进行蛋白半定量的步骤。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明将m6A RNA含量、RNA甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP 和KIAA1429，m6ARNA去甲基化酶FTO和ALKBH5，以及m6A RNA甲基化结合蛋白YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2作为细胞衰老新的标志物，可用于早衰和复制性衰老以及衰老相关疾患的评估，具有广阔的应用前景。
2、本发明区别于已有的，以circRNA为检测指标，检测对象为血清蛋白的健康衰老检测专利。本发明是以m6A RNA甲基化含量、RNA甲基化相关酶及结合蛋白为检测对象，检测样本不局限于血清，对于氧化应激引起的组织细胞早衰和复制性衰老均可以准确检测。
附图说明
图1是衰老相关的β-半乳糖苷酶染色结果图；其中，A为照片图(×20，标尺：200μm)；B为染色后蓝染细胞的比率统计结果；均数±标准差，n＝3，*P<0.05， ns为差异无统计学意义(P>0.05)，与22PDL或49PDL相比。
图2是各组细胞整体m6A RNA甲基化含量变化统计图；其中，A为各组细胞200ng总RNA中发生m6A修饰的mRNA所占的比例；B为各组细胞中相对 m6A含量；与22PDL或49PDL相比，均数±标准差，n＝4，*P<0.05，ns为差异无统计学意义。
图3是各组细胞m6A RNA甲基化酶蛋白表达及相对定量统计图；其中，A 为WesternBlot检测METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429在细胞衰老中表达结果；B为METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429各个蛋白条带灰度密度值在复制性衰老和H2O2诱导细胞早衰中的表达差异；均数±标准差，n＝3， *P<0.05，ns为差异无统计学意义，与22PDL或49PDL相比。
图4是各组细胞m6A RNA去甲基化酶蛋白表达及相对定量统计图；其中， A为Western Blot检测FTO和ALKBH5细胞衰老中表达结果；B为FTO和ALKBH5各个蛋白条带灰度密度值在复制性衰老及H2O2诱导细胞早衰中表达差异；均数±标准差，n＝3，*P<0.05，ns为差异无统计学意义，与22PDL或49PDL 相比。
图5是各组细胞RNA甲基化结合蛋白表达及相对定量统计图；其中，A为 WesternBlot检测RNA甲基化结合蛋白(YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2)在细胞衰老中表达结果；B为YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2各个蛋白条带灰度密度值在复制性衰老及H2O2诱导细胞早衰中表达差异；均数±标准差，n＝3， *P<0.05，ns为差异无统计学意义，与22PDL或49PDL相比。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
(1)细胞培养
细胞人胚肺成纤维细胞(来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)置于温度37℃、相对湿度95％及CO2体积分数为5％的细胞培养箱中无菌培养。培养液为L-DMEM低糖培养基。当细胞融合度达到90％时，按实际需要进行细胞传代(1：2，1：3或1：4)，并进行细胞计数。群体倍增水平(population doubling levels，PDL)的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，其中n为继代培养细胞最终的PDL，N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X 为上代细胞的PDL。
(2)早衰细胞模型和复制性衰老细胞模型
复制性衰老细胞模型：正常人胚肺成纤维细胞在体外连续传代培养至 52PDL时，细胞停止增殖，呈现深度的复制性衰老状态。根据体外细胞培养年龄的定义：当培养细胞PDL小于或等于其寿命的50％时，获得年轻细胞；大于或等于90％时，获得衰老细胞；介于50％～90％之间时，获得中年细胞。本实验人胚肺成纤维细胞复制性衰老模型中，细胞分组为年轻细胞组22PDL，中年细胞组35PDL，复制性衰老细胞组49PDL(参考发明人发表文章，参考毒理学杂志,2009,23(01):1-4)。
早衰细胞模型：利用年轻细胞组22PDL进行H2O2染毒，将相同数目的 22PDL接种至细胞培养瓶中(1：3传代)，待细胞增长至其50％融合度时，使用终浓度400μmol/L H2O2染毒4d，每天固定时间染毒一次，每次染毒2h。连续染毒4d获得细胞早衰起始组(prematuresenescence initiation group，PSi)；连续染毒4d后，换正常培养基继续培养7d后获得细胞早衰持续组(premature senescence persistence group，PSp)。
(3)衰老细胞表型鉴定
利用β-半乳糖苷酶染色实验观察并验证步骤(2)中复制性衰老细胞和早衰细胞的衰老状态。操作步骤如下：
1)吸除6孔板中培养细胞的细胞培养液，用1×PBS洗涤1次，加入1mLβ- 半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min；
2)吸除细胞固定液，用1×PBS洗涤细胞3次，每次3min；
3)吸除1×PBS，每孔加入1mL染色工作液(β-半乳糖苷酶染色液A 10μL+β- 半乳糖苷酶染色液B10μL+β-半乳糖苷酶染色液C 930μL+X-Gal溶液50μL)；
4)用保鲜膜封住6孔板防止蒸发，置于37℃无二氧化碳培养箱中孵育过夜；
5)在普通光学显微镜下观察细胞衰老情况。每组细胞选取显微镜下三处不同的视野观察，计算每个视野中细胞总数和蓝染细胞数，最后计算蓝染细胞数占细胞总数的比率。
(4)Western blot蛋白表达水平测定
4.1细胞总蛋白的提取和蛋白定量
细胞总蛋白提取：收集细胞步骤(2)中的复制性衰老细胞和早衰细胞，每 100万细胞加入含1％(v/v)PMSF的RIPA裂解液60μL，轻轻吹打，置于冰上裂解10min，震荡，重复3次，4℃，15000rpm，离心5min，将上清液转移至新的1.5mL离心管，即得到相应蛋白样品。
按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物公司)操作说明对上述制备的蛋白样品进行定量：
蛋白标准品的准备：取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为1mg/mL；
BCA工作液的配制：按照50:1的体积比加入试剂A和试剂B，充分混匀；
蛋白浓度检测：将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL；加入20μL样品，每组平行设置3 个复孔；各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min；用酶标仪测定562nm 处的吸光度；根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
4.2SDS-PAGE电泳分离蛋白
1)制备SDS-PAGE电泳分离胶
2)制备SDS-PAGE电泳浓缩胶
3)将分离胶缓慢灌注于事先装配好的制胶板中，加至小玻板2/3宽处时加入无水乙醇封胶，室温静置30min，去除无水乙醇，灌注浓缩胶后迅速插入齿梳，静置30～45min，待其凝固；
4)电泳装置装配好后，在左边加入1μL marker后，依次在各上样孔加入20μg蛋白样品，最后在右边加入5μL marker作为指示蛋白；
5)设定恒定电压为80V电泳20min后，待溴酚蓝指示蛋白迁移到浓缩胶和分离胶交界处时，调节电压120V，电泳60min，直至溴酚蓝指示蛋白到达胶底后停止电泳。
4.3转膜(湿转)
1)取下胶板，根据指示蛋白准确切取目的蛋白的胶带；
2)准备与胶带面积相当的PVDF膜，PVDF膜在100％(v/v)甲醇中激活 10s，然后放进蒸馏水中漂洗3min，再转移至转膜液中平衡5min。同时将2张滤纸放入转膜液中浸泡5min；
3)制作传统“三明治”夹心结构，层层对齐，不留气泡，将转膜系统置于盛有转膜缓冲液的电泳仪中，设定恒定电压200mA，冰水浴转膜60min。
4.4免疫反应
1)湿转终止后，PVDF膜剪角以示正反，TBST漂洗2次，封闭液摇床缓慢轻摇封闭4h或4℃冰箱封闭过夜；
2)将PVDF膜取出，置于按照1:1000的比例稀释后的一抗抗体(分别为 METTL3(ab195352)、METTL14(ab220030)、WTAP(ab195380)、KIAA1429 (25712-1-AP)、FTO(ab124892)、ALKBH5(ab195377)、YTHDC1(ab220159)、 YTHDF1(ab17479-1-AP)、YTHDF2(ab24744-1-AP)，内参为β-actin(ab8226)，均为英国Abcam公司提供)中，室温下摇床缓慢轻摇孵育2h或4℃孵育过夜；
3)用TBST冲洗PVDF膜3次，每次10min；
4)根据一抗的种属来源选取相应的二抗类型，使用的二抗为anti-rabbit IgG(ab6721，英国Abcam公司)或使用该公司的anti-mouse IgG(ab6789)，将二抗按照1:5000比例稀释，室温摇床缓慢轻摇1h；
5)二抗孵育结束后，用TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min。
6)将PVDF膜放置显影板上，等量混合ECL显影液的A液和B液，均匀滴至PVDF膜表面，进行自动曝光，拍照保存；
7)利用Image-Pro Plus 6.0软件对蛋白条带进行半定量分析。
(5)m6A RNA甲基化总体水平检测(试剂盒购自美国EpiGentek公司)
5.1缓冲液及溶液配制
(1)制备1×洗涤缓冲液(WB)：在117mL蒸馏水中加入13mL WB(10×洗涤缓冲液)，最终pH7.2-7.5；
(2)稀释捕获抗体溶液(CA)：将1×洗涤缓冲液按照体积比1:1000比例稀释捕获抗体溶液；
(3)稀释检测抗体溶液(DA)：用1×洗涤缓冲液以1:2000的比例稀释检测抗体；
(4)稀释增强剂溶液(ES)：用1×洗涤缓冲液以1:5000的比例稀释增强剂溶液；
(5)构建标准曲线：用1×TE稀释PC至0.5ng/μL(1μL PC+3μL TE)，进一步制备6种不同浓度0.01，0.02，0.05，0.1，0.2和0.5ng/μL的阳性对照(PC)。
5.2RNA提取和鉴定
5.2.1RNA 提取
1)利用预冷1×PBS刮取25cm2细胞培养瓶的细胞(步骤(2)中复制性衰老细胞和早衰细胞)，2000rpm，4℃，离心5min，弃上清；
2)加入2mL trizol，吹打混匀，孵育5min；
3)加入0.2mL氯仿，上下摇动EP管15s；
4)4℃，12000×g，离心15min；
5)取400μL上清至新EP管；
6)加400μL异丙醇；
7)室温孵育10min；
8)4℃，12000×g，离心10min，弃上清；
9)加入1mL 75％(v/v)乙醇；
10)涡旋10s，4℃，7500×g，离心5min，弃上清，自然晾干5～10min；
11)加入20μL DEPC水，混匀，利用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度；
12)分装4μL RNA样品用于完整性鉴定试验，剩余样品置于-20℃冰箱保存。
5.2.2RNA完整性鉴定
1)配制1.5％琼脂糖凝胶：将0.6g琼脂糖粉，8mL 5×TBE缓冲液和32mL 纯水加入到100mL锥形瓶中；
2)用塑料薄膜手套封住锥形瓶口，置于微波炉中加热至溶液澄清透明；
3)取出锥形瓶，待温度降至37℃左右时，加入2μL Goldview，轻轻摇晃，置于制胶板中，等待凝固；
4)将凝胶置于盛有300mL 1×TBE电泳液的水平电泳槽中，小心拔除胶梳后，点样(4μL RNA样品+1μL 5×RNA Loading buffer)；
5)电泳：120V，30min；
6)在全自动数码凝胶图像分析系统中观察RNA条带。
5.3RNA结合
(1)根据实验需要取出所需数量微孔板，其排列和加样顺序如下；
表4微孔板加样顺序
Figure BDA0002928512620000081
(2)每孔加入80μL BS(结合溶液)；
(3)将2μL NC，2μL稀释的PC和200ng的样品RNA步骤5.2提取的RNA (1-8μL)加入到以上表4所示的指定孔，轻轻倾斜微孔板或摇动板数次以混合溶液，确保溶液均匀地涂在孔底；
(4)用封口膜密封微孔板，置于37℃孵育90min；
(5)从每个孔中吸出BS(结合溶液)。用150μL稀释的WB洗涤每个孔，吸入稀释的WB到孔中，然后用移液管将其移除。重复洗涤两次，共洗涤三次。
5.4m6A RNA捕获
(1)每个孔中加入50μL稀释的CA，然后盖上盖子并在室温下孵育60min，孵育结束后弃除CA溶液；
(2)每次用150μL稀释的WB洗涤每个孔，共洗涤3次，弃洗涤液；
(3)每个孔中加入50μL稀释的DA，用封口膜密封微孔板，室温下孵育 30min，吸出稀释的DA溶液；
(4)每次用150μL稀释的WB洗涤每个孔，共洗涤4次，弃洗涤液；
(5)每个孔中加入50μL稀释的ES，用封口膜密封微孔板，室温下孵育 30min，移除稀释的ES溶液；
(6)每次用150μL稀释的WB洗涤每个孔，共洗涤5次，弃洗涤液。
5.5信号检测
(1)向每个孔中加入100μL DS并在室温下避光孵育1～10min。密切关注样品孔和对照孔中的颜色变化。当有足够的m6A存在时，DS溶液会变成蓝色；
(2)当阳性对照孔中的颜色变为中等蓝色时，向每个孔中加入100μL SS 以阻止酶促反应；
(3)添加SS后颜色变为黄色，在2～15min内置于酶标仪450nm波长处读取各微孔板的吸光度值。
5.6计算各组m6A含量
使用精确计算量化m6A的绝对量。
生成标准曲线并绘制OD值。使用线性回归方程计算标准曲线的斜率 (OD/ng)，选取拟合程度最好的标准曲线(至少包括4个阳性对照点)进行最佳斜率计算。总RNA中m6A的含量和百分比的计算公式如下：
m6A(ng)＝Sample OD-NC OD/Slope
m6A％＝m6A(ng)×100％/S(注：S是以ng为单位的输入样本RNA的量。)
5.7统计分析
所有实验数据均采用相对定量后进行分析，以均数±标准差的形式表示。使用Excel 2016和GraphPad Prism 7软件进行绘图。应用SPSS 20.0统计软件对实验结果进行统计学分析，应用单因素方差分析及Dunnett t检验进行组间差异性比较，均采用双侧检验，检验水准α＝0.05，P<0.05，差异有统计学意义。
结果
(1)细胞形态学观察及β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老的发生
从图1A可知，复制性衰老细胞49PDL和400μmol/L H2O2诱导细胞持续早衰PSp组细胞生物学性状明显改变，体积变大，扁平，有空泡，核变大，颗粒物增多，细胞间隙增宽。蓝染细胞的阳性率随增龄呈上升趋势，其中年轻细胞组22PDL为0.0％，35PDL为5.2％，而复制性衰老细胞组49PDL升高至91.9％ (P<0.05)，49PDL组细胞β-半乳糖苷酶染色后，细胞呈现蓝绿色变化；H2O2诱导的细胞早衰起始组PSi蓝染细胞比率为66.5％，而细胞持续早衰组PSp达到91.3％，均高于22PDL，差异有统计学意义(P<0.05)；PSp和49PDL间蓝染细胞比率无明显差异(P>0.05)，细胞复制性衰老与细胞早衰具有相似的形态学变化。详见图1B。
(2)H2O2诱导细胞早衰中整体m6A RNA甲基化改变
对于m6A含量的变化情况，从图2A可知，复制性衰老细胞22PDL、35PDL、 49PDL和H2O2诱导早衰细胞PSi和PSp中，各组的RNA中m6A含量分别占其 RNA总量的0.12％、0.07％、0.05％、0.1％和0.06％。如图2B所示，在复制性衰老过程中，与22PDL相比，35PDL和49PDL的m6A含量呈下降趋势，分别降低35.1％(P<0.05)和52.3％(P<0.05)；与22PDL相比，H2O2诱导细胞早衰中，早衰持续组PSp的m6A含量降低41.1％，差异具有统计学意义(P<0.05)；与49PDL相比，PSp的m6A含量变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，说明早衰持续组达到了49PDL细胞复制性衰老的水平，m6A RNA甲基化水平可作为细胞衰老的评估指标。
(3)H2O2诱导细胞早衰中m6A RNA甲基化酶的蛋白表达
在细胞复制性衰老中，与年轻细胞组22PDL相比，RNA甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429的蛋白表达在细胞复制性衰老组49PDL中分别降低36.2％(P<0.05)、84.4％(P<0.05)、28.3％(P>0.05)和79.0％(P<0.05)； H2O2诱导细胞早衰中，与22PDL相比，METTL3的蛋白表达在细胞早衰持续组 PSp中升高1.6倍(P<0.05)，但METTL14、WTAP和KIAA1429的蛋白表达分别降低66.8％、72.5％和35.5％(P<0.05)。与49PDL相比，H2O2诱导的早衰细胞组PSp中METTL3、METTL14和KIAA1429的蛋白表达分别升高2.5、2.1和 3.1倍，但WTAP的蛋白表达降低61.6％，差异均具有统计学意义(P<0.05)，详见图3。因此，与年轻细胞相比，无论是复制性衰老或细胞早衰，衰老的细胞均具有METTL14、WTAP和KIAA1429蛋白表达显著降低，而两种衰老降低的程度存在差异；对于METTL3，复制性衰老细胞中其表达降低，而氧化应激诱导的早衰细胞中其表达显著升高。
(4)H2O2诱导细胞早衰中m6A RNA去甲基化酶的蛋白表达
从图4可知，复制性衰老过程中，与22PDL相比，RNA去甲基化酶FTO的蛋白表达在35PDL和49PDL中分别降低63.7％和82.7％，ALKBH5的蛋白表达在35PDL和49PDL中分别降低49.5％和66.8％，均具有统计学差异(P<0.05)； H2O2诱导细胞早衰中，与22PDL相比，FTO的蛋白表达在PSi和PSp中分别降低67.2％和59.2％，差异均具有统计学意义(P<0.05)，ALKBH5的蛋白表达在PSi和PSp中分别降低20.4％(P>0.05)和91.5％(P<0.05)。相比于49PDL，FTO 的蛋白表达在PSp中升高2.4倍，ALKBH5的蛋白表达则降低74.4％，均具有统计学差异(P<0.05)。衰老的细胞均具有较低表达水平的RNA去甲基化酶。
(5)H2O2诱导细胞早衰中m6A RNA甲基化结合蛋白表达水平
从图5可知，复制性衰老过程中，与22PDL相比，m6A RNA甲基化结合蛋白YTHDC1在35PDL和49PDL中分别降低18.6％(P>0.05)和52.0％(P<0.05)， YTHDF1在35PDL和49PDL中分别降低39.9％(P<0.05)和62.9％(P<0.05)， YTHDF2在35PDL和49PDL中分别降低12.1％(P>0.05)和58.5％(P<0.05)； H2O2诱导细胞早衰过程中，与22PDL相比，YTHDC1在PSi和PSp中分别降低 66.3％和66.2％，YTHDF1在PSi和PSp中分别降低55.2％和90.1％，差异均具有统计学意义(P<0.05)，YTHDF2在PSi和PSp中分别降低29.5％(P>0.05)和 91.3％(P<0.05)。与49PDL相比，PSp中YTHDF1和YTHDF2的蛋白表达分别降低73.2％和78.9％，差异均具有统计学意义(P<0.05)，但YTHDC1的蛋白表达在49PDL和PSp之间无明显改变(P>0.05)。说明了细胞衰老的表达特征，与年轻细胞相比，YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2蛋白表达均显著降低。m6ARNA 甲基化结合蛋白有一种或者至少两种低表达可用来评估细胞衰老的发生。
综上所述，细胞复制性衰老及H2O2诱导早衰中m6A含量降低，而两种衰老的m6A含量无明显差异；细胞复制性衰老和H2O2诱导早衰RNA甲基化酶表达谱存在差异：与正常年轻细胞相比，H2O2诱导早衰细胞中METTL3高表达，复制性衰老细胞中METTL3低表达；METTL14、WTAP和KIAA1429及FTO和 ALKBH5在H2O2诱导早衰细胞和复制性衰老细胞中均是低表达；H2O2诱导早衰细胞和复制性衰老细胞中m6A RNA甲基化结合蛋白YTHDC1、YTHDF1和 YTHDF2低表达。METTL3可用作区分细胞正常复制性衰老与氧化应激诱导早衰的特异性指标。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.m6A RNA甲基化含量及其甲基化相关酶和结合蛋白在制备衰老检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述衰老检测试剂盒是通过检测m6A RNA甲基化含量、RNA甲基化相关酶及结合蛋白的蛋白表达量，将其作为标志物判断细胞衰老；
所述衰老包括复制性衰老和氧化应激诱导的早衰；
所述细胞是随年龄增加而逐渐衰老的细胞；
所述RNA甲基化相关酶包括RNA甲基化酶和RNA去甲基化酶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述细胞为人胚肺成纤维细胞；
所述RNA甲基化酶为METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429；
所述RNA去甲基化酶为FTO和ALKBH5；
所述RNA甲基化结合蛋白为YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当检测到细胞中m6A RNA甲基化含量降低，和/或m6A RNA甲基化酶METTL14、WTAP和KIAA1429，m6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5以及m6ARNA甲基化结合蛋白YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2中的一种或至少两种低表达，和/或RNA甲基化酶METTL3高表达或低表达，表明细胞进入衰老状态。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，当检测到细胞中所述RNA甲基化酶METTL3低表达时，表明细胞复制性衰老；当检测到细胞中所述RNA甲基化酶METTL3高表达时，表明细胞早衰。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述蛋白表达量采用相对定量分析法统计，通过蛋白条带的灰度分析，获得不同细胞表达条带的灰度值，以22PDL年轻细胞组为对照，设为1，其他细胞表达水平与22PDL年轻细胞组灰度值相比较；蛋白和内参表达量通过Western blot检测获得；
所述22PDL年轻细胞组的定义为：继代培养细胞最终的群体倍增水平PDL为22的细胞，PDL的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，其中N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。
7.一种衰老检测试剂盒，其特征在于，包括细胞中m6A RNA甲基化定量检测试剂、和/或检测甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、去甲基化酶FTO和ALKBH5以及m6A RNA甲基化结合蛋白中至少一种的蛋白表达量检测试剂。
8.根据权利要求7所述的衰老检测试剂盒，其特征在于，
所述的蛋白表达量检测试剂为Western blot半定量检测试剂。
9.权利要求7或8所述的衰老检测试剂盒在非治疗诊断检测衰老中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括取待测细胞，提取总RNA，采用上述衰老检测试剂盒进行m6A RNA甲基化含量检测的步骤，或者将待测细胞提取总蛋白，采用上述衰老检测试剂盒进行蛋白半定量的步骤。
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