CN115407068B - Oma1蛋白作为胶质瘤标记物的应用及其试剂盒 - Google Patents

Oma1蛋白作为胶质瘤标记物的应用及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了OMA1蛋白作为胶质瘤标记物的应用及其试剂盒，具体提出OMA1蛋白作为胶质瘤标记物，可对组织样本进行特异性检测获得胶质瘤分类，并用于胶质瘤各阶段、恢复期的监测或评估，推进胶质瘤的临床研究和治疗。

Description

OMA1蛋白作为胶质瘤标记物的应用及其试剂盒
技术领域
本发明涉及胶质瘤标记物技术领域，具体涉及OMA1作为胶质瘤标记物的应用及其试剂盒。
背景技术
胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的和侵袭性最高的恶性脑肿瘤，它是由于大脑和脊髓的胶质细胞发生癌变后产生的，预后极差。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类，胶质瘤分为WHOI-IV级，其中I、II为低级别胶质瘤，III和IV级为高级别胶质瘤。胶质母细胞瘤(Glioblastomas，GBM)约占原发性恶性脑肿瘤的75％，总的发病年龄高峰在30-40岁，胶质瘤复发率比较高，5年的生存率较低。现在对于脑胶质瘤的治疗采取标准化治疗，包括手术、放疗和化疗，虽然采取了多模式治疗方案，有的地方甚至增加了磁场治疗，但是恶性胶质瘤患者在确诊后平均生存时间仅为12-15个月。
因此，迫切需要新的分子生物标记物应用于胶质瘤临床分类诊断，并用于胶质瘤急性期、恢复期的监测或评估，推进胶质瘤的临床研究和治疗。
发明内容
本发明旨在提出OMA1蛋白作为胶质瘤标记物的应用及其试剂盒，将OMA1蛋白作为新的分子生物标记物应用于胶质瘤临床分类，并用于胶质瘤急性期、恢复期的监测或评估，推进临床应用。
具体地，本发明的方案如下：
本发明的第一个目的在于，提供OMA1蛋白作为生物标记物在非诊断为目的检测胶质瘤中的应用。
本发明的第二个目的在于，提出检测样本中OMA1蛋白含量或表达量的试剂在制备检测胶质瘤的试剂盒中的应用。
在本发明的实施例中，所述检测方法为免疫组化法或蛋白质印迹法。
在本发明的实施例中，所述样本为组织切片。
在本发明的实施例中，所述检测胶质瘤的试剂盒包括针对OMA1蛋白的组合的第一抗体、添加与酶或同位素结合的第二抗体，和用于获得识别所述OMA1蛋白的显色反应或荧光的底物。
本发明的第三个目的在于，提出检测样本中OMA1蛋白含量或表达量的试剂在制备监测或评估胶质瘤急性期和/或恢复期的试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的在于，提出检测样本中OMA1蛋白含量或表达量的试剂在制备评估胶质瘤治疗方案试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的在于，提出一种非疾病诊断为目的的胶质瘤检测方法，其特征在于，对待检测样本中的OMA1蛋白含量进行检测。
相比现有技术，本发明的有益效果为：
1.本发明提出OMA1蛋白作为胶质瘤标记物，可对组织样本进行特异性检测获得胶质瘤分类，并用于胶质瘤急性期、恢复期的监测或评估，推进胶质瘤的临床研究和治疗。
2.本发明所述检测胶质瘤相关的生物标记物OMA1蛋白的试剂盒具有取材方便、操作便捷、特异性强、快速准确等优点，对于临床快速诊断具有较高的价值，为进一步研制出胶质瘤的快速诊断试剂盒提供了方向。
说明书附图
图1为实施例1高通量测序不同类型肿瘤及正常脑组织中OMA1蛋白的表达结果。
图2为实施例1免疫组化法检测LGG和HGG中OMA1蛋白的表达结果。
图3为实施例1蛋白质印迹法检测LGG和HGG中OMA1蛋白的表达结果。
图4为OMA1在公共肿瘤数据库中的表达情况。
图5为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中O MA1蛋白过表达效率(5A)及敲除效率(5B)情况。
图6为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中O MA1蛋白过表达(6A)及敲低(6B)后采用CCK-8检测细胞的增殖能力结果。
图7为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中O MA1蛋白过表达(7A)及敲低(7B)后克隆形成实验检测细胞的增殖能力结果。
图8为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中O MA1蛋白过表达(8A)及敲低(8B)后原位成瘤小鼠实验检测增殖能力结果。
图9为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中O MA1蛋白过表达(9A)及敲低(9B)后Ki-67检测增殖能力结果。
图10为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1蛋白过表达(10A)及敲低(10B)后克隆、原位成瘤小鼠实验及Ki-67检测增殖能力定量比对结果。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明的实施例中提出一种标记物蛋白在检测胶质瘤中的应用，标记物蛋白为OMA1蛋白，通过检测样本中OMA1蛋白的表达量确定样本是否为胶质瘤，以及确定胶质瘤的分类级别。
在本实施例中，“检测”是指确认其存在，但在“检测”中也包括确认其不存在。
在本发明的实施例中，我们发现了不同级别的胶质瘤中OMA1蛋白的表达量存在差异，级别越高的胶质瘤中OMA1蛋白的表达量越高；并且胶质瘤相对于正常脑组织OMA1蛋白的表达量也存在差异，胶质瘤中OMA1蛋白的表达量相比正常脑组织明显要高。并通过利用胶质瘤细胞注入小鼠颅内的模型中验证了这一趋势，此外，我们又收集了更多胶质瘤患者的临床样本，发现OMA1蛋白在急性期表达显著升高，在恢复期表达明显降低。因此，我们认为OMA1蛋白具有诊断胶质瘤的潜力，可以作为诊断胶质瘤的生物标记物。
OMA1蛋白生物标记物及其OMA1蛋白检测方法通过应用抗OMA1蛋白抗体，制备成基于抗原抗体结合反应的免疫学检测方法的检测试剂，可用于胶质瘤样本检测。
本领域的技术人员，可以根据本发明公开的OMA1蛋白生物标记物，按照常规技术，制备相应出相应的检测胶质瘤的试剂盒，该试剂盒包括检测样本中OMA1蛋白含量或表达量的试剂，例如包括针对OMA1蛋白的组合的第一抗体、添加与酶或同位素结合的第二抗体，和用于获得识别所述OMA1蛋白的显色反应或荧光的底物。如第一抗体选择anti-OMA1ab154949(Abcam,Cambridge,USA)，第二抗体选择羊抗小鼠/兔二抗试剂PR30009(Proteintech,Wuhan,China)。可采用免疫组化法或蛋白印迹法对样本中OMA1蛋白含量或表达量进行检测。
实施例1.高通量测序不同类型肿瘤及正常脑组织中OMA1的表达
1.1高通量测序：从2020年11月至2021年10月在武汉协和医院住院的患者身上获得的3份人正常脑组织，3份低级别胶质瘤，3份高级别胶质瘤，用于转录组测序。所有参与者都提供了书面知情同意，该研究得到了武汉协和医院医院科学研究伦理委员会的批准。
通过高通量测序，正常脑组织(NBT，Normal Brain Tissue)、低级别胶质瘤组织(LGG，Low Grade Glioma)、高级别胶质瘤组织(HGG，High Grade Glioma)中OMA1、FAM72A、YBX1、SKP2、TRIM62、IGF2BP2、PGC-1α、FIS1及USP28等蛋白的表达情况如图1所示，NBT、LGG和HGG中存在明显差异，OMA1在HGG中表达量最高，并且在NBT、LGG和HGG中，OMA1差异最大。
1.2免疫组化：
①取LGG和HGG石蜡切片，将石蜡切片置于65℃烤箱中烘烤60min，有助于抗原修复；②切片常规脱蜡及水化：二甲苯3次各5min，100％乙醇3次各5min，95％乙醇1次5min，90％乙醇1次5min，85％乙醇1次5min，75％乙醇1次5min，双蒸水2次各5min；③将切片浸润在柠檬酸钠的抗原修复液中，微波高中档各加热10min进行修复，待自然冷却，ddH2O快速冲洗1次，甩干多余水分；④用将切片置于3％的H2O2中室温孵育10min，便于灭活内源性过氧化物酶活性；⑤切片置于0.3％PBST中渗透组织5min，0.025％PBST洗涤2次，各5min。甩干多余液体，用滤纸或者纸巾擦干切片周围的水渍，并用免疫组化笔在组织周边画圈；⑥用5％的BSA室温封闭60min后，倾去，甩干勿洗；切片平放在湿盒中，滴加稀释好的一抗置于4℃冰箱过夜，一般是14-16h；⑦次日，取出湿盒，室温下放置30min复温，然后用0.025％PBST洗涤3次，每次5min。甩干后，滴加二抗，室温孵育30min后用0.025％PBST洗3次，每次5min；⑧滴加显色剂DAB，然后计时，在光学显微镜下观察切片颜色，一般1-3min，待有阳性着色后水洗终止反应；⑨滴加苏木素，一般5-10s后用自来水冲洗干净，1PBS返蓝30s，ddH2O2次各30sec，然后在等梯度酒精中脱水(75％、85％、95％、100％酒精中各30sec)，再在二甲苯I和II液中浸泡30sec，二甲苯III中浸泡5min，用于透明切片；⑩进行树胶封片后利用光学显微镜进行拍照，统计分析。在不同级别的胶质瘤组织中采用免疫组化(IHC)检测OMA1的表达结果如图2所示，不难看出，HGG中OMA1的表达量明显高于LGG。
1.3Western blot
(1)SDS-PAGE电泳：将Western blot电泳槽、制胶器具等清洗并擦拭干净，安装好厚薄两块玻璃板，以去离子水检漏后，擦拭干玻璃板。根据目的蛋白分子量大小，依次配制好如下分离胶与积层胶，注入厚薄板夹层中，再在其上层缓慢加入去离子水使凝胶齐平，置于室温凝固。小心弃去上层去离子水，小心擦拭干玻璃板，将积层胶加入TEMED后充分均匀，立即注入厚薄板夹层中分离胶上层，插入15孔加样孔梳，置于室温凝固。将制备好的蛋白样本从-20℃取出置于冰上融化，制备好的凝胶置于电泳槽中并注意对应正负极，内槽加入足量新鲜配制的1×电泳缓冲液且不漏出，再小心拔去孔梳。将5μl预染蛋白Marker加入对应上样孔内，蛋白样本按每孔蛋白总量为200μg分别上样。外槽中加入适量电泳液，使内外存在液面差，电泳仪电源设置80v恒压进行垂直电泳，待样本电泳至分离胶层时，将电压调至100v继续恒压电泳直至条带完全分开。
(2)转膜：电泳结束后关闭电源，取出凝胶置于1×转膜缓冲液中，回收电泳液用于下次电泳的外槽液。将PVDF膜置于甲醇活化15s，转膜夹展开后按黑夹板面、海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫、白夹板面的三明治夹心法放置好，注意叠层放置时去除所有气泡。将转膜夹按黑夹板面对转膜架黑面，白夹板面对转膜架红面放置于电泳槽内，加入1×转膜缓冲液以及降温小冰袋，盖好盖子，将整个转膜装置移入事先装好冰的盆内用以降温。电泳仪电源设置350mA恒流进行转膜，120min后终止。其中1×转膜缓冲液是由100ml 10×转膜缓冲液、200ml甲醇、700ml去离子水配制。10×转膜缓冲液是由30.3g Tris-Base、144g甘氨酸溶于1L去离子水。
(3)封闭：取出PVDF膜放入5％脱脂牛奶中，置于摇床上室温封闭1h。
其中5％脱脂牛奶是由1g脱脂奶粉溶于20ml 1×TBS/T中。
(4)抗体孵育：将封闭后的PVDF膜置于1×TBS/T中洗涤，以滤纸吸去水分，加入适量以1×TBS/T稀释好的相应一抗于膜上，置于4℃孵育过夜。吸去抗体，将膜置于1×TBS/T中，置于摇床上洗涤3次，每次10min。以滤纸吸去水分，加入适量以1×TBS/T稀释好的相应二抗于膜上，置于37℃孵育1h。吸去抗体，将膜置于1×TBS/T中，置于摇床上洗涤3次，每次10min。
(5)曝光：在化学发光凝胶成像仪中，先以白光模式调整膜位置以及清晰度，再将曝光液均匀加在膜表面，根据蛋白表达量及曝光难易程度调整曝光模式和时间，拍照并保存。
在不同级别的胶质瘤组织中采用Western Blotting检测OMA1的表达水平如图3所示。图3中不难看出，在LGG和HGG中的表达量存在明显差异，OMA1在HGG中表达量相对LGG要高。
OMA1在公共肿瘤数据库The Cancer Genome Atlas(TCGA，https://cancergenome.nih.gov/)中的表达情况如图4所示，相对于正常脑组织，OMA1及在肿瘤组织中高表达(图4A)，并且表达量与病人预后(图4B、C)呈反比。
实施例2胶质瘤模型的建立以及检测OMA1蛋白的表达
2.1细胞来源与培养：U87MG细胞购买于中国上海中科院细胞库。GBM#1原代提取于患者胶质瘤细胞瘤样本。所有细胞培养基配制成含10％FBS、1×青霉素-链霉素溶液的完全培养基后使用，并将细胞置于37℃、5％CO2和饱和湿度的细胞培养箱中培养，以倒置式显微镜密切观察细胞状态。隔天以灭菌PBS缓冲液洗涤并换上新鲜完全培养基。当细胞密度到达85％左右以0.25％胰酶消化，含血清的完全培养基终止消化，以800rpm于室温离心5min，弃上清，向细胞沉淀中加入适量完全培养基，按1：3传代培养或于-80℃冻存保种。
2.2CCK-8实验：在96孔板中接种细胞悬液，培养到预定时间点后，每孔各加入10μlCCK-8溶液，将培养板放入培养箱中孵育1h，酶标仪测定450nm处的吸光值(OD)。
2.3集落形成实验：在6孔板中以2×103数量均匀接种培养。每隔2天换一次培养基，密切观察，直至出现明显的、由单个细胞形成的细胞集落终止培养。弃培养基，PBS洗涤2次后，以4％多聚甲醛室温固定30min。以5％结晶紫染色15min，PBS洗涤直至背景清晰。吸弃尽PBS，室温干燥，对克隆拍照，并计数每皿细胞集落数培养2周后，甲醇固定，结晶紫染色，观察。
2.4荧光裸鼠肿瘤模型：大量扩增稳定表达荧光素酶的胶质瘤细胞，用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液，原位注射悬液于小鼠颅内，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型，饲养一定时间后，进行小鼠胶质瘤活体成像。
2.5免疫荧光染色：将小鼠麻醉后，剪破右心耳，用注射器分别从左心室缓慢注射20ml PBS和20ml 4％的PFA。取出脑肿瘤，冰冻切片后，切片用PBS洗涤，用10％山羊血清在PBS中封闭，在含有0.01％Triton X-100和10％山羊血清的缓冲液中稀释的Ki67一抗在4℃孵育12h，第二抗体在37℃下孵育2h，封片成像。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中采用Western Blotting检测OMA1的过表达效率，结果如图5A所示。可见在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1的过表达效率存在一致性，且相比vector(不含胶质瘤空白组模型)而言更高。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1过表达OMA1后，采用CCK-8检测细胞的增殖能力，结果如图6A所示，可见二者增殖能力存在一致性。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1过表达OMA1后，采用克隆形成实验检测细胞的增殖能力，结果如图7A所示，可见相比vector组，胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1的表达量明显增大。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1过表达OMA1后，采用胶质瘤原位成瘤动物实验检测细胞的增殖能力，结果如图8-10中A所示。其中图8A为胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1蛋白过表达后原位成瘤小鼠实验检测增殖能力结果。图9A为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1蛋白过表达后Ki-67检测增殖能力结果。图10A为胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1蛋白过表达后克隆(左)、原位成瘤小鼠实验(中)及Ki-67(右)检测增殖能力定量比对结果。不难看出，胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1相比相比vector组OMA1的表达量明显增大，由此可作为胶质瘤评估模型。
2.6采用慢病毒分别转染胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1的方式对OMA1进行低表达，具体步骤如下：
2.6.1慢病毒包装
1)293T细胞分盘转染前一天，将已经长好的细胞以合适比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到80％时准备转染。
2)转染前1～2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12ml/10cm皿。注意换液时避免冲起细胞。
3)取无菌EP管，配制反应体系：无血清DMEM 1ml DNA 10μg GM easyTM LentiviralMix 10μl(10μg)HG TransgeneTM Reagent 60μl混匀后，室温放置18min～20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。
4)转染18～20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml新鲜的培养基(或无血清的DMEM)继续培养。
5)换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度或者感染目的细胞，如考虑病毒的滴度及纯度，可对上清液进行浓缩与纯化。
6)将病毒以40～50μl分装后，于-80℃保存。
2.6.2慢病毒感染细胞实验步骤
1)Day 1，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔处于对数生长期的目的细胞和平行对照293T细胞，铺板时细胞融合率为50％左右，每孔加入100μL培养基，培养箱中培养至细胞贴壁(针对贴壁细胞)，进行病毒感染时细胞的最佳融合度为70％左右。
2)Day 2，准备病毒：4℃保存的病毒，取出后轻轻用移液器混匀；-80℃冻存的病毒在冰上融化后使用。接着感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，观察细胞生长状态，细胞状态好时开始实验。
吸去原培养基，PBS清洗两次，更换新鲜培养基(如果细胞生长良好，没有大量漂浮细胞，培养基没有变色，则不用换液)。使用移液器吸取准确体积的病毒液加入胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中。
将病毒液和培养基混匀，放于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)孵育培养。
3)Day 3，弃去含病毒的培养液，换上新鲜完全培养液，继续在培箱中进行培养(可根据实验情况具体调整液)。
4)Day 4，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP荧光强度，对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin完全培养液(Puromycin标准终浓度范围为1-10μg/mL，不同细胞系Puromycin工作液浓度不同，可查阅文献或者预实验寻找最适Puromycin筛选浓度)，筛选出稳定表达的细胞株。转染48小时HepG2细胞GFP荧光强度。
5)稳定细胞株筛选：将Puromycin筛选后的细胞进行传代，并继续持续施加合适浓度Puromycin维持抗性，连续筛选并传3代后，冻存保存稳定表达细胞株。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中采用Western Blotting检测OMA1的敲低效率；结果如图5B所示。可见在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1的敲低效率存在一致性，且相比NC组(空白对照组)而言更低。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1敲低OMA1后，采用CCK-8检测细胞的增殖能力；结果如图6B所示，可见二者增殖能力存在一致性。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1敲低OMA1后，采用克隆形成实验检测细胞的增殖能力，结果如图7B所示，可见相比NC组，胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1的表达量明显降低。
在胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1敲低OMA1后，采用胶质瘤原位成瘤动物实验检测细胞的增殖能力，结果如图8-10中B所示。其中图8B为胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1蛋白过表达后原位成瘤小鼠实验检测增殖能力结果。图9B为本发明实施例胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1蛋白过表达后Ki-67检测增殖能力结果。图10B为胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1中OMA1蛋白过表达后克隆(左)、原位成瘤小鼠实验(中)及Ki-67(右)检测增殖能力定量比对结果。不难看出，胶质瘤细胞系U-87MG及胶质瘤原代细胞GBM#1相比相比vector组OMA1的表达量明显降低，由此可作为恢复期胶质瘤评估模型。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的示例。

Claims (4)

1.检测组织样本中OMA1蛋白含量的试剂在制备检测胶质瘤的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测方法为免疫组化法或蛋白质印迹法。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本为组织切片。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测胶质瘤的试剂盒包括针对OMA1蛋白的第一抗体、与酶或同位素结合的第二抗体，和用于获得识别所述OMA1蛋白的显色反应或荧光的底物。
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