CN114438216B - m6A甲基转移酶WTAP在制备用于诊断直肠癌新辅助放疗抵抗标记物中的用途 - Google Patents

m6A甲基转移酶WTAP在制备用于诊断直肠癌新辅助放疗抵抗标记物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了m6A甲基转移酶WTAP在制备用于诊断直肠癌新辅助放疗抵抗标记物中的用途。本发明还提供了检测m6A甲基转移酶WTAP的试剂在制备诊断直肠癌新辅助放疗抵抗试剂盒中的用途。本发明还提供了m6A甲基转移酶WTAP作为标记物在制备诊断直肠癌新辅助放疗抵抗试剂盒中的用途。本发明发现m6A甲基转移酶WTAP在直肠癌组织中高表达，且与直肠癌放疗抵抗呈正相关，患者总生存时间缩短，提示预后不良。

Description

m6A甲基转移酶WTAP在制备用于诊断直肠癌新辅助放疗抵抗 标记物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种生物标记物，特别来说是m6A甲基转移酶WTAP在制备用于诊断直肠癌新辅助放疗抵抗标记物中的用途。
背景技术
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的第二大原因。据世界卫生组织国际癌症研究机构最新公布的数据，2020年中国CRC新发病例55.5477万例，占全部恶性肿瘤发病的12.2%；由CRC导致的死亡病例28.6162万例，占全部恶性肿瘤死亡的9.5%。近年来直肠癌多学科综合治疗尤其是术前新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiotherapy, nCRT），因同时兼顾放疗对局部癌灶的控制，以及化疗对全身微小转移灶的杀伤，展现出一定的临床优势。然而，不同患者对nCRT的反应千差万别。约占70%患者因对放疗不敏感无法从中获益，导致肿瘤进展、延误手术时机。因此，如何精准预测直肠癌放疗敏感性，已成为肿瘤研究领域的热点和难点。
肾母细胞瘤1-结合蛋白（Wilms Tumor 1-Associating Protein, WTAP）是m6A甲基化修饰的重要甲基转移酶，且作为剪接调节因子发挥重要作用。WTAP是与肾母细胞瘤1抑癌基因（WT1）密切相关的核蛋白，有文献报道WTAP与剪接因子共定位于整个核质和核斑点，并受放线菌素D影响。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供了m6A甲基转移酶WTAP在制备用于诊断直肠癌新辅助放疗抵抗标记物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术无法预测直肠癌放疗敏感性的技术问题。
本发明提供了m6A甲基转移酶WTAP在制备用于诊断直肠癌新辅助放疗抵抗标记物中的用途。
本发明还提供了检测m6A甲基转移酶WTAP的试剂在制备诊断直肠癌新辅助放疗抵抗试剂盒中的用途。
本发明还提供了m6A甲基转移酶WTAP作为标记物在制备诊断直肠癌新辅助放疗抵抗试剂盒中的用途。
已知m6A甲基化修饰水平失调几乎参与了肿瘤发生发展的各个方面，包括细胞周期、细胞凋亡、侵袭转移、细胞自噬、放化疗敏感性、肿瘤微环境等。申请人利用前期收集的30例直肠癌患者放疗前活检组织样本，参照术后病理AJCC版肿瘤退缩分级（TumorRegression Grade, TRG）将其分成两组，TRG=（0+1）为放疗敏感组，TRG=（2+3）为放疗抵抗组，分别检测RNA甲基化含量，结果显示：放疗抵抗组m6A甲基化修饰水平显著高于放疗敏感组。
本发明研究还发现，m6A甲基化修饰水平升高主要是由甲基转移酶参与调控。通过METTL3、METTL14、WTAP等组成的核心蛋白复合体，催化mRNA上的碱基发生甲基化修饰。其中，METTL3是具有催化活性的亚基，METTL14负责识别底物，WTAP主要负责协助两者靶向定位于核斑点。我们选取GSE80606数据集利用R语言分析RNA-seq数据，结合组织样本定量检测，筛选目标m6A甲基化修饰调控因子。结果显示：甲基转移酶WTAP在mRNA水平表达上调，且与直肠癌放疗抵抗呈正相关。
我们选取200例直肠癌患者组织芯片和8例活检样本石蜡白片，分别检测WTAP蛋白表达水平。结果显示：WTAP在癌组织中高表达，且与直肠癌放疗抵抗呈正相关，患者总生存时间缩短，提示预后不良。
为进一步验证双向干预m6A甲基转移酶WTAP的表达水平，可相应逆转直肠癌细胞的放疗敏感性。申请人利用结直肠癌放疗抵抗细胞模型（HCT116-R、RKO-R）（（上述两株细胞为已有技术，在此不再赘述，可在《Frontiers in Oncology》11 Janauar 2021 Volume 10Article 582239公开发表的文章 “Downregulation of miR-423-5p Contributes to theRadioresistance in Colorectal Cancer Cells”中查到相关使用记载），分别检测WTAP的mRNA及蛋白表达水平。结果显示：WTAP在放疗抵抗细胞中表达水平升高。
我们利用慢病毒感染筛选构建WTAP干扰及过表达稳转株，给予6Gy辐照剂量处理后，结果显示：干扰WTAP表达水平的放疗抵抗细胞株，增殖能力减弱、细胞凋亡增多、克隆形成减少；再将稳定干扰WTAP表达水平的放疗抵抗细胞株接种至裸鼠皮下，构建辐照动物模型，结果显示：干扰表达WTAP辐照组瘤体体积明显缩小，放疗敏感性增强。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明发现m6A甲基转移酶WTAP可以用来预测直肠癌放疗抵抗，帮助患者及时地调整治疗策略。
附图说明：
图1显示了直肠癌放疗抵抗组（TRG=2+3）m6A甲基化修饰水平显著高于放疗敏感组。
图2A-B显示 m6A regulators随着TRG评分升高呈现趋势性表达失调。
图3显示m6A甲基转移酶WTAP在mRNA水平表达上调且与直肠癌放疗抵抗呈正相关。
图4显示m6A甲基转移酶WTAP蛋白水平表达上调且与直肠癌放疗抵抗呈正相关。
图5A-B显示m6A甲基转移酶WTAP在癌组织中高表达总生存时间缩短提示预后不良。
图6显示放疗抵抗细胞模型（HCT116-R、RKO-R）SF2值升高获得辐照抗性。
图7A-D显示WTAP在放疗抵抗细胞（HCT116-R、RKO-R）mRNA、蛋白表达水平升高。
图8A-D显示：与HCT116-R细胞-GL401NC相比，HCT116-R细胞-Y17838组WTAP基因表达量为50.32%；与RKO-R细胞-GL401NC相比，RKO-R细胞-Y17838组WTAP基因表达量为29.58%；与HCT116细胞GL119相比，HCT116细胞H23211组WTAP基因表达量为1133.88%；与RKO细胞GL119相比，RKO细胞H23211组WTAP基因表达量为2155.39%。
图9A-F显示WTAP干扰表达放疗抵抗HCT116、RKO-R稳转株细胞增殖能力减弱，细胞凋亡增多，克隆形成减少。
图10A-F显示WTAP过表达亲代HCT116、RKO稳转株细胞增殖能力提高，细胞凋亡减少，克隆形成增多。
图11A-B显示干扰表达WTAP（RKO-R-Y17838）辐照组放疗敏感性增强。
具体实施方式
实施例1 检测m6A甲基化修饰水平与直肠癌放疗抵抗的关系
收集上海市东方医院（同济大学附属东方医院）肛肠外科30例局部进展期直肠癌患者放疗前后配对新鲜组织样本，参照术后病理AJCC版肿瘤退缩分级（Tumor RegressionGrade, TRG），将放疗前肠镜活检样本分成两组，TRG=（0+1）为放疗敏感组共15例，TRG=（2+3）为放疗抵抗组共15例。
用EpiquikTM m6A RNA Methylation Quantification Kit (Colorimetric)试剂盒，检测从30例局部进展期直肠癌患者放疗前活检组织样本中提取的总RNA。在甲基化测定过程中，总RNA被结合到RNA溶液孔底，使用捕获和检测抗体技术测定m6A甲基化水平。
然后通过读取微孔板分光光度计中的吸光度进行比色定量，m6A定量与测得的OD强度成正比。要准确计算m6A绝对量，首先以OD值与每个浓度点的PC量绘制标准曲线。再使用线性回归确定标准曲线斜率 (OD/ng)，使用标准曲线的最线性部分（包括至少4个浓度点）进行最佳斜率计算。
最后使用以下公式计算总RNA中m6A的量和百分比：m6A (ng)= (Sample OD–NCOD)/ Slope；m6A % =m6A Amount (ng)/ S x 100%（S是样品RNA的ng数）。
实验结果如图1显示：放疗抵抗组m6A甲基化修饰水平高于放疗敏感组。
实施例2 m6A甲基化修饰调控因子在直肠癌放疗抵抗组呈趋势性表达失调
利用GEO数据库选择GSE80606数据集，作为分析判断与直肠癌放疗抵抗有关的m6A甲基化修饰调控因子。依据AJCC 版肿瘤退缩TRG分级，将数据集分成放疗完全敏感组（TRG=0）和放疗不完全敏感组（TRG=1+2+3）。
依据mRNA测序数据结果，对迄今为止已报道的m6A regulators（去甲基化酶erasers：FTO ALKBH5；甲基转移酶writers：METTL3 METTL14 METTL16 WTAP KIAA1429RBM15 RBM15B ZC3H13 VIRMA ZCCHC4；甲基结合蛋白readers：YTHDC1 YTHDF2 YTHDF1YTHDF3 YTHDC2 Mrb1 FMR1 IGF2BP2 IGF2BP3 EIF3A ELAVL1 HNRNPA2B1 LRPPRC RBMXZNF217）在上述两组中进行比较并绘制mRNA表达谱。再按照TRG分级进一步细分判定，放疗抵抗与m6A regulators的mRNA表达相互关系。
选取GEO数据库GSE80606数据集用R语言分析RNA-seq数据，实验结果显示：与放疗完全敏感组（TRG=0）相比，放疗不完全敏感组（TRG=1+2+3）m6A regulators存在显著表达失调（如图2A）。且随着TRG评分升高，辐照抗性增加，m6A regulators也呈现趋势性变化（如图2B）。
实施例3 甲基转移酶WTAP在mRNA水平表达上调且与直肠癌放疗抵抗呈正相关
选取30例局部进展期直肠癌患者放疗前活检组织样本，参照术后病理AJCC版肿瘤退缩分级（Tumor Regression Grade, TRG）依次分成四组，（TRG=0）为完全敏感组，（TRG=1）为部分敏感组，（TRG=2）为部分抵抗组，（TRG=3）为完全抵抗组，Real-time PCR定量检测筛选目标m6A甲基化修饰调控因子，将组织样本离心去上清，每孔加入1000 µl Trizol。每个样品中加入200 µl氯仿，加入等体积异丙醇，混匀后去上清加入至少1 ml 4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。加入30~40 µl RNase-free水至完全溶解，紫外分析测定RNA的浓度与吸光值。冰上配制miRNA反转录混合液。（miRNA反转录及检测试剂盒(QP016)购自GeneCopoeiaTM公司）将上述混合液混匀后离心获得反转录产物（cDNA）可立即用于qPCR检测。
实验结果如图3显示：m6A甲基转移酶WTAP在mRNA水平表达上调，且与直肠癌放疗抵抗呈显著正相关。
实施例4 甲基转移酶WTAP蛋白水平表达上调且与直肠癌放疗抵抗呈正相关
选取8例局部进展期直肠癌患者活检组织石蜡白片，参照术后病理AJCC版肿瘤退缩分级（Tumor Regression Grade, TRG）依次分成四组，（TRG=0）为完全敏感组，（TRG=1）为部分敏感组，（TRG=2）为部分抵抗组，（TRG=3）为完全抵抗组，用免疫组化方法通过脱蜡与水化，细胞通透与封闭抗原修复，血清封闭孵育一抗、二抗，切片显色复染及封片过程，检测m6A甲基转移酶WTAP蛋白表达水平。石蜡切片免疫组化实验操作过程如下：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min、二甲苯Ⅱ 15min、二甲苯III 15min、无水乙醇Ⅰ 5min、无水乙醇Ⅱ 5min、85%酒精 5min、75%酒精 5min、蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火 8min至沸，停火 8min保温再转中低火 7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入（质量百分比浓度）3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、血清封闭:在组化圈内滴加（质量百分比浓度）3% BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗山羊来源用兔血清封闭，其他来源用BSA封闭）。
5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按1:2000比例配好的一抗(WTAP60188-1-ig)；切片平放于湿盒内，4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 。
6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（1:200 HRP标记山羊抗小鼠二抗GB23301）覆盖组织，室温孵育50min。
7、DAB 显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
8、复染细胞核：苏木素复染3min左右自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
9、脱水封片：将切片依次放入75%酒精 5min、85%酒精 5min 、无水乙醇Ⅰ 5min 、无水乙醇Ⅱ 5min、正丁醇 5min、二甲苯Ⅰ 5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
10、显微镜镜检，图像采集分析。石蜡切片免疫组化结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。
如图4所示，HE染色结果显示（20×）：甲基转移酶WTAP蛋白水平表达上调且与直肠癌放疗抵抗呈正相关。
实施例5 m6A甲基转移酶WTAP在癌组织中高表达且提示患者预后不良
收集上海市东方医院（同济大学附属东方医院）病理科200例直肠癌患者组织蜡块，依据AJCC第八版TNM分期筛选出I~IV期患者，并选取癌和癌旁组织制作组织芯片。
选取200例直肠癌组织芯片，依据AJCC第八版TNM分期筛选出I~IV期患者，购买WTAP抗体（Catalog number: 60188-1-ig购自proteintechTM公司），分别检测癌和癌旁组织m6A甲基转移酶WTAP的表达水平。
根据组织点的制备要求选取相应规格的组织芯片取样器和受体蜡块，根据HE定位用取样器对目的部位的组织点进行取样得到供体的组织柱。按照芯片矩阵要求，将所取的供体组织柱点按既定的顺序依次注入到相应受体蜡块孔内。利用组织芯片融合仪对供体组织柱点和受体蜡块进行多次反复融合，使二者完全融合制作成组织芯片蜡块。
将修整好的组织芯片蜡块置于石蜡切片机上切片厚度4μm，切片漂浮于摊片40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用，石蜡切片脱蜡至抗原修复，阻断内源性过氧化物酶血清封闭加一抗、二抗，DAB显色复染细胞核脱水封片，显微镜镜检图像采集分析。具体操作过程如下：
一、组织芯片制作
1、根据组织点的制备要求选取相应规格的组织芯片取样器和受体蜡块；
2、根据HE定位用取样器对目的部位的组织点进行取样，得到供体的组织柱。按照芯片矩阵要求，将所取的供体组织柱点按既定的顺序依次注入到相应受体蜡块孔内；
3、利用组织芯片融合仪对供体组织柱点和受体蜡块进行多次反复融合，使二者完全融合制作成组织芯片蜡块。
二、组织芯片切片
1、将修整好的组织芯片蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
三、石蜡切片免疫组化实验步骤
1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入脱蜡液Ⅰ 15min、脱蜡液Ⅱ 15min、脱蜡液III 15min、无水乙醇Ⅰ 5min、无水乙醇Ⅱ 5min、85%酒精5min、75%酒精5min、蒸馏水洗。
2、 抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、 阻断内源性过氧化物酶：切片放入质量百分比浓度3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、 血清封闭:在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗山羊来源用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭）。
5、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按1:2000比例配好的一抗(WTAP60188-1-ig)。切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（1:200 HRP标记山羊抗小鼠二抗GB23301）覆盖组织，室温孵育50min。
7、 DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
8、 复染细胞核：苏木素复染3min左右自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
9、 脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min、85%酒精5min 、无水乙醇Ⅰ 5min 、无水乙醇Ⅱ 5min、正丁醇5min、二甲苯Ⅰ 5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片胶封片。
10、显微镜镜检，图像采集分析。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。
实验结果显示：甲基转移酶WTAP在癌组织中高表达，癌旁组织中低表达（如图5A）。其表达水平升高患者总生存时间缩短，提示预后不良（如图5B）。
实施例6 构建大肠癌细胞m6A甲基转移酶WTAP干扰及过表达稳转株
将购自ATCC网站结直肠癌细胞株HCT116（CCL-247TM）、RKO（CRL-2577TM）进行小剂量（4Gy/f）梯度辐照，直至总剂量达到40Gy，获得放疗抵抗细胞模型（HCT116-R、RKO-R）。利用放射生物学参数（SF2值、D0、Dq）检测其与亲代细胞（HCT116、RKO）之间的差异，明确已获得辐照抗性；
利用qPCR和Western blot方法，检测结直肠癌放疗抵抗细胞（HCT116-R、RKO-R）及亲代细胞（HCT116、RKO），m6A甲基转移酶WTAP的mRNA及蛋白表达水平。
利用慢病毒GL401NC（pLenti-U6-shRNA（NC）-CMV-Puro-WPRE）和Y17838（pLenti-U6-shRNA1（WTAP）-CMV-Puro-WPRE）感染HCT116-R、RKO-R细胞；慢病毒GL119（pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE）和H23211（pSLenti-CMV- WTAP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE）感染HCT116、RKO细胞。抗性筛选构建结直肠癌放疗抵抗细胞（HCT116-R、RKO-R）WTAP干扰表达稳转株，以及亲代细胞（HCT116、RKO）WTAP过表达稳转株，分别qPCR检测转染效率。
在放疗抵抗细胞（HCT116-R、RKO-R）与亲代细胞（HCT116、RKO）之间，检测放射生物学参数差异（SF2值、D0、Dq），实验结果如图6显示：放疗抵抗细胞模型（HCT116-R、RKO-R）已获得辐照抗性。
实施例7 WTAP在放疗抵抗细胞（HCT116-R、RKO-R）mRNA/蛋白水平表达上调
利用qPCR方法，检测放疗抵抗细胞（HCT116-R、RKO-R）及亲代细胞（HCT116、RKO），甲基转移酶WTAP的mRNA表达水平。
将细胞样本离心去上清，每孔加入1000 µl Trizol。每个样品中加入200 µl氯仿，加入等体积异丙醇，混匀后去上清加入至少1 ml 4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。加入30~40 µl RNase-free水至完全溶解，紫外分析测定RNA的浓度与吸光值。冰上配制miRNA反转录混合液。（miRNA反转录及检测试剂盒(QP016)购自GeneCopoeiaTM公司）将上述混合液混匀后离心获得反转录产物（cDNA）可用于qPCR检测。
实验结果显示：WTAP在HCT116-R细胞中mRNA表达水平升高（如图7A）；WTAP在RKO-R细胞中mRNA表达水平升高（如图7B）；WTAP在HCT116-R和RKO-R细胞中WB检测蛋白表达水平升高（如图7C）；WTAP在HCT116-R和RKO-R细胞中灰度分析表达水平升高（如图7D）。
实施例8 慢病毒感染构建肠癌细胞m6A甲基转移酶WTAP干扰及过表达稳转株
利用慢病毒GL401NC（pLenti-U6-shRNA（NC）-CMV-Puro-WPRE）和Y17838（pLenti-U6-shRNA1（WTAP）-CMV-Puro-WPRE）感染HCT116-R、RKO-R细胞；慢病毒GL119（pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE）和H23211（pSLenti-CMV- WTAP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE）感染HCT116、RKO细胞。抗性筛选构建大肠癌放疗抵抗（HCT116-R、RKO-R）WTAP干扰表达稳转细胞株，以及亲代（HCT116、RKO）WTAP过表达稳转细胞株，分别利用qPCR法检测转染效率。
实验结果显示：与HCT116-R细胞-GL401NC相比，HCT116-R细胞-Y17838组WTAP基因表达量为50.32%（如图8A）；与RKO-R细胞-GL401NC相比，RKO-R细胞-Y17838组WTAP基因表达量为29.58%（如图8B）。与HCT116细胞GL119相比，HCT116细胞H23211组WTAP基因表达量为1133.88%（如图8C）；与RKO细胞GL119相比，RKO细胞H23211组WTAP基因表达量为2155.39%（如图8D）。
实施例9 WTAP干扰表达放疗抵抗HCT116、RKO-R稳转细胞株放疗敏感性增强
选择m6A甲基转移酶WTAP干扰表达放疗抵抗HCT116-R、RKO-R稳转细胞株，分别给予单次剂量0Gy或6Gy辐照处理。
具体分组如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
干扰表达WTAP空白载体（HCT116、RKO-R-GL401NC），0Gy对照组
Figure 247693DEST_PATH_IMAGE002
干扰表达WTAP（HCT116、RKO-R-Y17838），0Gy对照组
Figure DEST_PATH_IMAGE003
干扰表达WTAP空白载体（HCT116、RKO-R-GL401NC），6Gy辐照组
Figure 978888DEST_PATH_IMAGE004
干扰表达WTAP（HCT116、RKO-R-Y17838），6Gy辐照组。
利用CCK-8、细胞凋亡、克隆形成实验，检测其放疗敏感性变化。将各组细胞消化后制成单细胞悬液计数，每组细胞配成一定浓度的单细胞悬液。每个样品设6个复孔，边缘孔加100μL无菌水。在每个检测时间点加入10μL的 CCK-8 于孔中无需换液，两小时后酶标仪检测450nm OD值；将细胞消化后制成单细胞悬液，每个样品准备1.0-5.0×106 cells，实验组加入195μL 1xbuffer 然后加10μL的PI 和 5μL Annexin-V-FITC 染色15min结合液重悬细胞；加入400μL 1xbuffer 稀释，用1000μL枪轻轻混匀。将细胞移到流式上机管中，做好上机检测准备；各组细胞按6孔板每孔1000个细胞进行铺板，每组细胞铺3个复孔。每隔3天换3新鲜培养基一周后随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。两周后染色液染色，数码相机拍照或者扫描仪扫描，计算克隆形成率。
结果显示：WTAP干扰表达放疗抵抗HCT116-R稳转细胞株（HCT116-R-Y17838）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（HCT116-R-GL401NC）细胞增殖能力减弱（如图9A）；WTAP干扰表达放疗抵抗RKO-R稳转细胞株（RKO-R-Y17838）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（RKO-R-GL401NC）细胞增殖能力减弱（如图9B）；WTAP干扰表达放疗抵抗HCT116-R稳转细胞株（HCT116-R-Y17838）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（HCT116-R-GL401NC）细胞凋亡增多（如图9C）；WTAP干扰表达放疗抵抗RKO-R稳转细胞株（RKO-R-Y17838）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（RKO-R-GL401NC）细胞凋亡增多（如图9D）；WTAP干扰表达放疗抵抗HCT116-R稳转细胞株（HCT116-R-Y17838）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（HCT116-R-GL401NC）克隆形成减少（如图9E）；WTAP干扰表达放疗抵抗RKO-R稳转细胞株（RKO-R-Y17838）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（RKO-R-GL401NC）克隆形成减少（如图9F）；提示放疗敏感性增强。
实施例10 WTAP过表达结直肠癌亲代HCT116、RKO稳转细胞株放疗敏感性减弱
选择m6A甲基转移酶WTAP过表达亲代细胞HCT116、RKO稳转株，分别给予单次剂量0Gy或6Gy辐照处理。
具体分组如下：
Figure 503410DEST_PATH_IMAGE001
过表达WTAP空白载体（HCT116、RKO-GL119），0Gy对照组
Figure 788898DEST_PATH_IMAGE002
过表达WTAP（HCT116、RKO-H23211），0Gy对照组
Figure 57069DEST_PATH_IMAGE003
过表达WTAP空白载体（HCT116、RKO-GL119），6Gy辐照组
Figure 111612DEST_PATH_IMAGE004
过表达WTAP（HCT116、RKO-H23211），6Gy辐照组。
利用CCK-8、细胞凋亡、克隆形成实验，检测其放疗敏感性变化。将各组细胞消化后制成单细胞悬液计数，每组细胞配成一定浓度的单细胞悬液。每个样品设6个复孔，边缘孔加100μL无菌水。在每个检测时间点加入10μL的 CCK-8 于孔中无需换液，两小时后酶标仪检测450nm OD值；将细胞消化后制成单细胞悬液，每个样品准备1.0-5.0×106 cells，实验组加入195μL 1xbuffer 然后加10μL的PI 和 5μL Annexin-V-FITC 染色15min结合液重悬细胞；加入400μL 1xbuffer 稀释，用1000μL枪轻轻混匀。将细胞移到流式上机管中，做好上机检测准备；各组细胞按6孔板每孔1000个细胞进行铺板，每组细胞铺3个复孔。每隔3天换3新鲜培养基一周后随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。两周后染色液染色，数码相机拍照或者扫描仪扫描，计算克隆形成率。
结果显示：WTAP过表达亲代细胞HCT116稳转株（HCT116-H23211）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（HCT116-GL119）细胞增殖能力提高（如图10A）；WTAP过表达亲代细胞RKO稳转株（RKO-H23211）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（RKO-GL119）细胞增殖能力提高（如图10B）；WTAP过表达亲代细胞HCT116稳转株（HCT116-H23211）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（HCT116-GL119）细胞凋亡减少（如图10C）；WTAP过表达亲代细胞RKO稳转株（RKO-H23211）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（RKO-GL119）细胞凋亡减少（如图10D）；WTAP过表达亲代细胞RKO稳转株（RKO-H23211）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（RKO-GL119）克隆形成增多（如图10E）；WTAP过表达亲代细胞RKO稳转株（RKO-H23211）在6Gy辐照条件下，较空白载体对照细胞株（RKO-GL119）克隆形成增多（如图10F）；提示放疗敏感性减弱。
实施例11 WTAP干扰表达RKO-R-Y17838辐照动物模型放疗敏感性增强
选择m6A甲基转移酶WTAP干扰表达放疗抵抗（RKO-R）稳转细胞株（RKO-R-Y17838）；空白载体对照细胞株（RKO-R-GL401NC），挑选9只BALB/c-nu雄鼠（5-6周龄，体重＞20g）皮下接种成瘤后辐照处理（如图11A）。
具体分组如下（3只/组）：
Figure 869353DEST_PATH_IMAGE001
干扰表达WTAP空白载体（RKO-R-GL401NC），2Gy*3d对照组
Figure 642137DEST_PATH_IMAGE002
干扰表达WTAP（RKO-R-Y17838），2Gy*3d实验组
Figure 182839DEST_PATH_IMAGE003
干扰表达WTAP（RKO-R-Y17838），0Gy*3d对照组。
观测瘤体体积及裸鼠体重，记录存活状态，三周后评估实验结果显示：与RKO-R-GL401NC辐照组及RKO-R-Y17838不辐照组比较，干扰表达WTAP（RKO-R-Y17838）辐照组，瘤体体积明显缩小，放疗敏感性增强（如图11B）。

Claims (1)

1.检测m6A甲基转移酶WTAP的试剂在制备诊断直肠癌新辅助放疗抵抗试剂盒中的用途，甲基转移酶WTAP在mRNA水平与直肠癌放疗抵抗呈正相关，如果WTAP在癌组织中高表达，则患者总生存时间缩短，提示预后不良。
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