CN110283909A

CN110283909A - Zbtb20蛋白或其特异性抗体在贲门癌检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN110283909A
Application number: CN201910482628.2A
Authority: CN
Inventors: 王立东; 雷玲玲; 宋昕; 赵学科; 韩文莉; 韩雪娜; 张延瑞
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2019-06-04
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2039-06-04
Also published as: CN110283909B

Abstract

本发明涉及一种贲门癌血清标志物，具体来说，该标志物为ZBTB20。应用ZBTB20特异性抗体制备免疫组化试剂盒，利用免疫组化法筛查诊断贲门癌，其检测结果与病理活检诊断结果完全一致，表明该试剂盒具有极高的特异性和敏感性。相应的，将ZBTB20蛋白作为抗原包被于ELISA检测试剂盒中，利用该ELISA试剂盒检测人体血清中的自身抗体含量来检测贲门癌，具有特异性好、灵敏度高、操作方便等优点。本发明为有效判断贲门癌提供了新的科学依据，有望实现贲门癌的早发现及早治疗，应用前景广阔。

Description

ZBTB20蛋白或其特异性抗体在贲门癌检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医学和分子生物学技术领域，涉及ZBTB20作为贲门癌血清标志物的用途。

背景技术

贲门癌是我国北方最常见的上消化道恶性肿瘤之一，其定义为食管胃交界线下约2cm范围内的腺癌，又称食管-胃交界腺癌。历史上，我国曾把贲门癌纳入食管癌，上世纪八十年代以后，按照病理分类又把贲门癌划分到胃癌，但贲门癌有相对独立的病因、临床表现和病理，应该当做一种独立的肿瘤用于临床和研究。

癌症的发病是多种因素参与、涉及多次病变的过程，贲门癌也不例外。研究显示，贲门癌的发生主要与环境和遗传因素有关。癌症的分子生物学研究目前已经取得很大的进步，癌基因和抑癌基因的发现成为攻克癌症道路上的重要成果，研究发现各种因素导致癌基因、抑癌基因和细胞凋亡基因的表达改变，破坏了贲门粘膜上皮细胞增殖和凋亡的动态平衡，导致了贲门癌的发生。早期发现肿瘤是治疗肿瘤、提高肿瘤术后生存率的重要途径之一，早期贲门癌患者术后年生存率可达90%，而中期和晚期患者预后相对较差。所以，贲门癌患者预后的决定性因素就是早期发现、早期诊断、早期治疗。现代医学科学的进步和先进的医疗手段对于早期阶段的肿瘤，特别是原位肿瘤的治疗具有显著的疗效。因此，现代医学已经把重点聚焦于肿瘤的早期发现，使肿瘤在发展到晚期之前得到有效地治疗。人们期望探索和建立一种敏感性高、特异性强的贲门癌早期诊断指标以及贲门癌预后预测指标，并利用这些指标作为指导治疗和判断预后的依据。

随着医学科技的高速发展，越来越多的先进医疗器械被用于贲门癌的检查。目前临床贲门癌的检测方法主要有临床检查、胃镜检查、影像学检查、病理学检查和血清学检查。胃镜检查和病理学检查有创；影像学检查的灵敏度有限，且价格贵；血清学检查方法简便，价格低，患者容易接受，因此寻找贲门癌相关血清标志物十分重要。血清标志物是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。理想的血清标志物应有以下特征：(1)灵敏度高；(2)特异性好；(3)能对肿瘤进行定位；(4) 与病情严重程度、肿瘤大小或分期有关；(5)能监测对肿瘤治疗的效果；(6) 监测肿瘤的复发；(7)预测肿瘤的预后。

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。这个概念最早是在1994年，是由Marc Wikins首先提出的新名词。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些"疾病特异性的蛋白质分子"，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。

锌指蛋白ZBTB20是ZBTB锌指蛋白亚家族的新成员，与已知的BCL6和PLZF同源。通过基因打靶小鼠和疾病人群研究，学者们发现ZBTB20在肝脏、胰岛、神经系统和免疫系统等多个器官与系统中具有重要生理学功能，是个体发育、学习记忆、痛觉感受、糖脂代谢等正常生理过程所必需的调节分子。ZBTB20表达或功能异常可导致个体发育障碍，与智障、肿瘤和代谢性疾病等多种重大疾病的病理生理过程密切相关。作为甲胎蛋白基因的主要转录抑制因子，ZBTB20在出生后肝脏甲胎蛋白基因的表达失活中发挥了关键性作用，且与肝癌预后密切相关，但其在贲门癌中发挥的生物学功能鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供贲门癌相关血清标志物ZBTB20蛋白在在制备贲门癌检测试剂盒中的应用，相应的，还提供了能够特异性检测ZBTB20表达水平的分子在制备贲门癌检测试剂盒中的应用。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

能够特异性检测ZBTB20表达水平的分子在制备贲门癌检测试剂盒中的应用。

上述应用中，所述分子为核酸或蛋白质。

上述应用中，所述蛋白质为抗体。

上述应用中，所述检测是指通过免疫组织化学法进行的检测。

上述应用中，所述检测是指通过在蛋白质免疫印迹法（Western Blot）进行的检测。

作为另一个请求保护的主题，ZBTB20蛋白在制备贲门癌检测试剂盒中的应用。

将ZBTB20蛋白用于制备贲门癌检测试剂盒，所述检测是指通过酶联免疫吸附法（ELISA）进行的检测。

作为另一个请求保护的主题，一种用于贲门癌检测的ELISA试剂盒，包括固相载体和被包被于固相载体上的肿瘤相关抗原ZBTB20蛋白。

所述ELISA试剂盒还包括阴性对照血清、样本稀释液、酶标第二抗体、第二抗体稀释液、显色液、终止液以及洗涤液。阴性对照A值用于计算临界值，据此作出阴性或阳性判断。

所述ELISA试剂盒还包括阳性对照血清。阳性对照用于质控，阳性对照A值无法得出阳性为真的结论，则说明试验无效。试剂变质和操作不当均会产生“试验无效”的后果。

锌指蛋白ZBTB20是ZBTB锌指蛋白亚家族的新成员，与已知的BCL6和PLZF同源。基因打靶小鼠和疾病人群研究结果显示，ZBTB20在肝脏、胰岛、神经系统和免疫系统等多个器官与系统中具有重要生理学功能，是个体发育、学习记忆、痛觉感受、糖脂代谢等正常生理过程所必需的调节分子。ZBTB20表达或功能异常可导致个体发育障碍，与智障、肿瘤和代谢性疾病等多种重大疾病的病理生理过程密切相关。

本专利申请发明人通过整理大量贲门癌临床诊疗、病理和随访信息库，发现ZBTB20与贲门癌密切相关。实验证实，应用ZBTB20特异性抗体制备免疫组化试剂盒，利用免疫组化法筛查诊断贲门癌，其检测结果与病理活检诊断结果完全一致，表明该试剂盒具有极高的特异性和敏感性。

上述检测是将ZBTB20蛋白作为检测目标，然而，相应的自身抗体同样有望作为贲门癌早期发现、诊断、治疗和预后判断的一个检测指标。由于自身抗体是在患者血清中产生的，与贲门癌生物标志物ZBTB20蛋白的丰度成正比，因此，较高浓度的自身抗体指示ZBTB20的较高表达。基于此，本发明将ZBTB20蛋白作为抗原包被于ELISA检测试剂盒中，利用该ELISA试剂盒检测人体血清中的自身抗体含量来检测贲门癌，检测灵敏度高达88.1%，特异度高达90.8%，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中癌组织经免疫组化染色后的典型光显微镜照片；

图2是实施例1中正常组织经免疫组化染色后的典型光显微镜照片；

图3是贲门癌组织和贲门癌癌旁组织的Western Blot典型条带图；

图4是贲门癌患者术前和健康人血清中ZBTB20抗体的表达水平分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐释。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径买到。

实施例1：ZBTB20特异性抗体在免疫组化试剂盒中的应用

以ZBTB20特异性抗体（Novus公司购买）及免疫组化试剂盒组成本实施例的诊断试剂盒。

一、实验样本

通过规范整理50万例食管癌和贲门癌临床诊疗、病理和随访信息库，最终选取60例贲门癌样本，纳入标准：①接受贲门癌根治性手术治疗；②术后病理诊断为贲门癌；③随访资料完整；④有存档的手术石蜡包埋组织标本。60例贲门癌样本中，所有患者诊断时间为2017年1月至2017年12月，男性30例，女性30例，平均诊断年龄61.2±2.3岁，年龄范围60-70岁。20例对照组正常人群，纳入标准：①通过病理活检诊断为健康的门诊病人；②有存档的活检石蜡包埋组织标本。20例贲门组织样本中，诊断时间为2017年1月至2017年12月，男性10例，女性10例，平均诊断年龄58.7±4.1岁，年龄范围54-67岁。

二、实验方法

（1）脱蜡：组织切片65℃烤片30min，二甲苯Ⅰ脱蜡15min，二甲苯Ⅱ脱蜡15min，无水乙醇Ⅰ 15min，无水乙醇Ⅱ 15min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，蒸馏水洗。

（2）抗原修复：EDTA（pH9.0）高压修复（电磁炉加热沸腾后，放入标本，置于高压锅继续加热，喷气阀喷气后计时2分钟，停止加热，自然冷却至室温）。

（3）血清封闭：切片放入PBS缓冲液(pH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5min。3%H₂O₂，室温避光孵育25min，切片放入PBS缓冲液(pH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5min。

（4）加入一抗：切片稍甩干后，圈内加ZBTB20抗体（1:800稀释）置入试盒中4℃过夜。第二天取出试盒恢复至室温，切片放入PBS缓冲液(pH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5min。

（5）加入二抗：切片稍甩干后，圈内加与一抗相应种属的二抗（HRP标记），室温孵育50min，切片放入PBS缓冲液(pH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5min；

（6）切片稍甩干后加二氨基联苯胺（DAB）溶液镜下显色，自来水冲洗切片终止显色，苏木素复染3min，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入75%乙醇5min、85%乙醇5min、100%乙醇Ⅰ脱水5min，100%乙醇Ⅱ脱水5min，二甲苯Ⅰ透明5min。

（7）封片：二甲苯Ⅱ透明5min，从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片，显微镜下观察。

三、结果判定

对组织化学染色图片进行分析。染色评分标准如下：随机选取至少10个高倍镜视野，计数1000个细胞，以积分法计算结果，即根据每张切片的染色强度和阳性细胞比例计分。染色强度计分原则为无色0分;浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。着色细胞比例计分原则为无着色0分；＜30%为1分； 30%-60%为2分；≥60%为3分，着色强度和着色细胞比例所得积分相加，0-2分为表达阴性，3分以上为表达阳性。

按照上述方法对存档的石蜡包埋组织标本进行组织化学染色分析，包含60例贲门癌组织，20例正常贲门组织。

四、实验结果

60例贲门癌患者组织中ZBTB20表达全部阳性，25例对照组正常贲门组织中ZBTB20表达全部阴性，组织化学染色图片如图1和图2所示，其中是图1是癌组织经免疫组化染色后的典型光显微镜照片，为阳性表达；图2是正常组织经免疫组化染色后的典型光显微镜照片，为阴性表达。

五、结论

ZBTB20在正常贲门组织中阴性表达，而在贲门癌组织中呈阳性表达，将ZBTB20特异性抗体应用于免疫组化试剂盒中，利用免疫组化法筛查诊断贲门癌，其特异性和敏感性都非常高。

实施例2：ZBTB20特异性抗体在Western Blot检测试剂盒中的应用

一、收集蛋白样品

通过规范整理50万例食管癌和贲门癌临床诊疗、病理和随访信息库，最终选取42例贲门癌样本，纳入标准：①接受贲门癌根治性手术治疗；②术后病理诊断为贲门癌；③随访资料完整④有手术病理组织及癌旁组织。42例贲门癌样本中，所有患者诊断时间为2017年1月至2017年12月，男性21例，女性21例，平均诊断年龄61.5±3.1岁，年龄范围60-70岁。

将贲门癌组织和贲门癌癌旁组织分别剪成细小的碎片，按每20mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12000g离心15分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。

二、蛋白定量

（1）标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：

（2）根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；

（3）各孔加入160μL BCA工作液；

（4）把酶标板放在振荡器上振荡30 sec，37℃放置30分钟，然后在562 nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度（μg/μL）为纵坐标，绘出标准曲线；

（5）在酶标板中加入2μL待测蛋白和18μL PBS（稀释10倍），加入160μL BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30 sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度；

（6）根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度（μg/μL），乘以样品稀释倍数（10）即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。

三、SDS-PAGE胶的制备

根据目的蛋白的分子量制备12%的胶。待下层胶凝固后进行上层浓缩胶的配制，根据需要配制5%浓缩胶，并插好梳子。

四、上样及电泳

（1）上样：根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，每孔上样量为8μg蛋白，沸水浴10 min使蛋白变性后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内。

（2）电泳：当染料到达胶底部时即可终止电泳，本实验电泳80V 40min，进行下一步转膜。

五、转膜

本实验选用湿转。湿转转膜中，三明治的排列为：滤纸/胶/膜/滤纸，用电转缓冲液浸湿后，置于转膜用的夹子中，将夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面，胶于负极而膜置于正极。电转移时会产热，在槽的一边放冰块来降温。一般90V转膜50 min即可。转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡5 min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中2 min。

六、膜的封闭及抗体孵育

（1）封闭：5 %脱脂奶粉室温封闭2h或4℃过夜。

（2）一抗：1:1100稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育1h或4 ℃孵育过夜。

（3）二抗：孵育一抗的膜用PBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:10000稀释HRP标记的二抗，与膜室温孵育1h或4 ℃孵育过夜。用PBST洗涤3次，每次5min。

七、显色

ECL化学发光检测：将膜放置在暗室中，根据用量取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面与之充分接触。然后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测。通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

八、实验结果

结果显示：与贲门癌癌旁组织比较，ZBTB20在贲门癌组织中表达上调。图3是贲门癌组织和贲门癌癌旁组织的Western Blot典型条带图。

九、结论

ZBTB20蛋白在贲门癌组织中的表达高于贲门癌癌旁组织，所以可将ZBTB20特异性抗体应用于Western Blot试剂盒中，利用Western Blot法筛查诊断贲门癌。

实施例3：ZBTB20蛋白在ELISA检测试剂盒中的应用

为验证ZBTB20表达产物在贲门癌和癌旁血清中的表达差异，本实施例采用ELISA法检测42例贲门癌患者及98例正常人血清中ZBTB20的表达水平。通过规范整理50万例食管癌和贲门癌临床诊疗、病理和随访信息库，最终选取42例贲门癌样本，纳入标准：①接受贲门癌根治性手术治疗。②术后病理诊断为贲门癌。③随访资料完整。④有外周血血清标本，血清采于手术前1周，冰冻于-80度。42例贲门癌样本中，所有患者诊断时间为2017年6月至2017年12月，男性21例，女性21例，平均诊断年龄62.3±3.5岁，年龄范围59-68岁。98例对照组正常人群，纳入标准：①通过病理活检诊断为健康的门诊病人。②有外周血血清标本，冰冻于-80度。98例贲门组织样本中，诊断时间为2017年6月至2017年12月，男性49例，女性49例，平均诊断年龄58.8±5.4岁，年龄范围51-67岁。

间接酶联免疫法的原理是将抗原（ZBTB20蛋白）链接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原受检复合物，再用酶标二抗与固相抗原受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原受检抗体酶标二抗复合物，然后测定加显色剂后的显色程度，确定待测抗体含量。本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种用于检测贲门癌相关血清标志物的ELISA试剂盒。

一、试剂和材料

1. 制备贲门癌相关蛋白ZBTB20

（1）使用基因克隆技术构建贲门癌相关蛋白ZBTB20的重组原核表达质粒；

（2）将构建的重组原核表达质粒分别转化到大肠杆菌B121（DE3）中，使用IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导目的蛋白表达；

（3）根据目的蛋白所携带的标签，采用传统的相应的纯化方案对目的蛋白进行纯化；

（4）使用Bradford法测定蛋白浓度，使用Western Blot的方法对纯化蛋白的免疫学活性进行鉴定。

2. 抗原包被液：碳酸盐缓冲液，pH=9.6；

3. 封闭液：含2%（W/V）BSA的PBST缓冲液；

4. 酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白；

5. 96孔酶标板：购自Abcam公司；

6. 显色液A：0.02%（W/V）TMB，配制：取甲基联苯胺（TMB）0.005g，溶解于25ml去离子水中；

7. 显色液B：0.006%（W/V）过氧化脲，配制：取柠檬酸4.665g、Na2HPO418.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75%过氧化氢脲3.2ml，调整pH值至5.0～5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

8. 阳性对照血清：灭活的ZBTB20抗体阳性人血清；

9. 阴性对照血清：灭活的ZBTB20抗体阴性人血清；

10. ZBTB20抗体标准品。

二、制备抗原包被的酶标板

（1）制备贲门癌相关抗原溶液：将ZBTB20蛋白溶解于抗原包被液中，充分混匀，配置配制成抗原溶液，其中ZBTB20蛋白的浓度为0.75μg/ml；

（2）包被酶标板：将制备好的ZBTB20抗原溶液加入到96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，设3个阳性对照孔、4个阴性对照孔，留1个空白对照孔。3个阳性对照孔和4个阴性对照孔中包被ZBTB20抗原溶液，1个空白对照孔只加包被液；4℃过夜后去除包被液；

（3）封闭：向包被后的96孔酶标板的点样孔中加入封闭液，室温孵育2小时，然后除去多余封闭液；

（4）将经过处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，4℃保存备用。

三、ELISA试剂盒的组成

（1）抗原包被的96孔酶标板；

（2）ZBTB20抗体标准品；

（3）阳性对照血清：灭活的ZBTB20抗体阳性人血清；

（4）阴性对照血清：灭活的ZBTB20抗体阴性人血清；

（5）样本稀释液：含有1％（W/V）BSA的PBST缓冲液；

（6）酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白，购自Abcam公司；

（7）第二抗体稀释液：为含有1％（W/V）BSA的PBST缓冲液；

（8）显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％（W/V）TMB，显色液B为0.006％（W/V）过氧化脲；

（9）终止液：10％的浓硫酸；

（10）洗涤液：pH7.2的0.01M的PBST（磷酸盐）缓冲液。

四、检测

（1）准备ELISA试剂盒中的试剂，并用样本稀释液10倍稀释42例贲门癌患者及98例健康人血清样本和对照血清；

（2）阳性对照孔加100微升稀释后的阳性对照血清，阴性对照孔加100微升稀释后的阴性对照血清，其余包被ZBTB20抗原的反应孔为待测样品孔，每孔添加100微升待测样品。空白对照孔不加样品，其余各步操作与待测样品孔相同。用样本稀释液和ZBTB20抗体标准品配制5个不同浓度的标准品溶液，同时设一组5个标准孔，标准孔分别加100微升一系列不同浓度的标准品，用于绘制标准曲线。加样完成后于37℃孵育2小时；

（3）去除反应孔中多余液体，洗涤液洗涤5次；

（4）于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体0.1ml，37℃孵育1小时；（5）去除反应孔中多余液体，洗涤液洗涤5次；

（6）将显色液A、显色液B 按1:1等体积混合，每反应孔中加100微升混合显色液，37℃反应30min；

（7）于各反应孔中加入90微升终止液，终止显色，立即450nm波长读取吸光度值A。

（8）结果判定：以标准品的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，得到一条呈S形的标准曲线，用于定量测定。以空白对照孔调0后测各孔吸光度值，阳性判断值应用临界值计算，临界值=阴性对照平均A值+0.160。样本A值＜临界值，为ZBTB20抗体检测阴性；样本A值≥临界值，为ZBTB20抗体检测阳性，用于定性测定。

五、实验结果

图4是42例贲门癌患者（术前）和98例健康人血清中ZBTB20抗体的表达水平分布图，图1显示：大部分贲门癌患者血清中ZBTB20抗体浓度明显高于健康人群。

应用临界值法对检测结果进行分析判定，判定结果如表1所示：42例贲门癌患者37例为阳性，5例阴性，98例对照正常人群89例为阴性，9例阳性。从以上数据可以计算出，通过ELISA法检测血清中ZBTB20抗体的表达水平来诊断贲门癌，灵敏度高达88.1%，特异度高达90.8%。

六、结论

42例贲门癌患者血清ZBTB20含量相对健康人群明显升高，即通过测定血清ZBTB20的含量可迅速、简便、快捷诊断贲门癌。

Claims

1.能够特异性检测ZBTB20表达水平的分子在制备贲门癌检测试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分子为核酸或蛋白质。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为抗体。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测是指通过免疫组织化学法进行的检测。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测是指通过在蛋白质免疫印迹法进行的检测。

6.ZBTB20蛋白在制备贲门癌检测试剂盒中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测是指通过酶联免疫吸附法进行的检测。

8.一种用于贲门癌检测的ELISA试剂盒，包括固相载体和被包被于固相载体上的肿瘤相关抗原ZBTB20蛋白。

9.如权利要求8所述用于贲门癌检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒还包括阴性对照血清、样本稀释液、酶标第二抗体、第二抗体稀释液、显色液、终止液以及洗涤液。

10.如权利要求9所述用于贲门癌检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒还包括阳性对照血清。