CN113238052B - MG7-Ag、hTERT及TFF2表达分析在肠上皮化生风险分层及胃癌预警中的应用 - Google Patents

MG7-Ag、hTERT及TFF2表达分析在肠上皮化生风险分层及胃癌预警中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了MG7‑Ag、hTERT及TFF2表达分析在肠上皮化生风险分层及胃癌预警中的应用：采用免疫组织化学染色对结局不同的胃肠上皮化生患者内镜活检组织标本中的MG7‑Ag、hTERT及TFF2进行表达水平检测，利用建模队列三种分子的表达水平半定量结果进行Logistic回归模型构建，并在建模队列和验证队列中进行模型内部验证和外部验证，利用所构建的模型进行胃肠上皮化生风险分层及胃癌预警。本发明可以规避个体及人群的异质性，更便于临床应用，为基于胃肠上皮化生干预的胃癌预防提供新思路。

Description

MG7-Ag、hTERT及TFF2表达分析在肠上皮化生风险分层及胃癌 预警中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤医学领域，涉及基于MG7-Ag、hTERT与TFF2的表达水平的联合预测模型，具体涉及利用免疫组织化学染色方法(IHC法)对胃粘膜肠上皮化生样本中的MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达进行检测，并构建用于对胃肠上皮化生进行风险分层和胃癌预警的模型。
背景技术
胃癌是常见的恶性肿瘤之一，在全球各地区其患病率和死亡率仍居高不下，在东亚地区情况更加严重。Correa模型揭示了胃癌，特别是肠型胃癌发生发展的规律。研究已证实，无论是否存在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染，胃黏膜肠上皮化生(Intestinal metaplasia，IM)都是胃癌重要的危险因素。
目前针对胃癌癌前病变进行风险分层的方法包括可操作的与胃癌风险联系的胃炎评估(Operative link for gastritis assessment,OLGA)和可操作的与胃癌风险联系的肠上皮化生评估(Operative link for gastric intestinal metaplasia assessment,OLGIM)分期系统、不完全型IM表型和血清胃蛋白酶原(Pepsinogen,PG)等血清学标志物分析。但这些方法所识别的“高危”癌前病变患者的年癌变率仅为2％左右。故目前对于胃肠上皮化生患者的胃癌预防主要以长期观察为主。
胃癌相关抗原MG7-Ag和人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase,hTERT)在正常胃黏膜和癌前状态组织中不表达或呈弱阳性表达，而在胃肠上皮化生等癌前病变组织中表达升高。在胃癌组织，MG7-Ag和hTERT分子表达水平显著升高，呈现强阳性表达。在胃肠上皮化生组织中hTERT的表达水平与细胞的增殖状态正相关。三叶因子2(Trefoil factor family 2,TFF2)与MG7-Ag和hTERT分子相反，在胃肠上皮化生组织中表达水平较正常胃黏膜显著降低，在胃癌组织呈相对低表达。
已有研究发现，高危胃肠上皮化生组织与低危胃肠上皮化生组织的基因表达水平、分子表达水平均存在明显差异。例如，MG7-Ag与环氧化酶(Cyclooxygenase-2,Cox-2)表达双阳性的胃癌癌前病变患者(包括肠上皮化生及异型增生)进展为胃癌的比例是表达双阴性的胃癌癌前病变患者的22倍。但这些研究并未能够在众多的胃肠上皮化生患者中准确预测最终演变结局为胃癌的高危胃肠上皮化生患者。
发明内容
本发明的目的在于提供MG7-Ag、hTERT及TFF2表达分析在肠上皮化生风险分层及胃癌预警中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种基于多分子联合预测模型的胃肠上皮化生组织分析方法，包括以下步骤：
1)构建建模队列，所述建模队列由回顾性研究中进展为胃癌的胃肠上皮化生患者和未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者构成；
2)对建模队列中各患者诊断为胃肠上皮化生的组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测；
3)根据步骤2)检测得到的组织样本中MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达水平建立联合预测模型；
4)将来自演变情况未知患者的胃肠上皮化生组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测(检测流程可参照步骤2))，并将检测得到的该组织样本中MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达水平输入步骤3)建立的联合预测模型，根据联合预测模型的输出推断所述患者的胃肠上皮化生演变情况。
优选的，所述步骤2)中，对组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测具体包括以下步骤：采用免疫组织化学染色处理组织样本，根据阳性染色结果计算组织样本的免疫组织化学染色评分，其中，MG7-Ag、hTERT或TFF2的免疫组织化学染色评分根据各自阳性细胞数量评分与阳性强度评分的乘积确定。
优选的，所述免疫组织化学染色中，同一患者的组织样本采用连续切片，并应用于不同抗体(MG7-Ag、hTERT或TFF2的抗体)的处理(一抗孵育)中；不同抗体染色时长不同，同一抗体不同组织样本染色时长保持一致。
优选的，所述联合预测模型是通过Logistic回归分析完成构建。
优选的，所述联合预测模型表示为：
y＝ln[P/(1-P)]＝a+b×SMG7-Ag+c×ShTERT–d×STFF2
其中，y为联合预测模型输出；P为胃肠上皮化生患者进展为胃癌的概率，SMG7-Ag、ShTERT、STFF2分别表示组织样本中MG7-Ag、hTERT、TFF2的免疫组织化学染色评分；a、b、c、d为拟合得到的模型参数。
优选的，所述步骤3)还包括以下步骤：构建验证队列，所述验证队列由回顾性研究中进展为胃癌的胃肠上皮化生患者和未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者构成，验证队列中患者的确诊胃癌时间与建模队列不同，对验证队列中各患者诊断为胃肠上皮化生的组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测(检测流程可参照步骤2)，分别利用建模队列和验证队列各自检测得到的组织样本中MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达水平对联合预测模型进行内部验证和外部验证，根据验证结果对利用联合预测模型进行胃肠上皮化生风险分层及胃癌预警的效果进行评价。
优选的，所述胃肠上皮化生风险分层及胃癌预警的依据为根据联合预测模型的输出计算得到的胃肠上皮化生患者进展为胃癌的概率。
优选的，所述建模队列及验证队列中，患者诊断为胃肠上皮化生的组织样本(研究对象)均采用胃镜组织活检的蜡块标本。
优选的，所述建模队列及验证队列中，进展为胃癌的胃肠上皮化生患者的数量分别为6例以上。
优选的，所述建模队列及验证队列分别由30例以上患者(进展为胃癌的胃肠上皮化生患者和未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者)构成。
优选的，所述建模队列及验证队列中，未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者按照年龄、性别以及胃肠上皮化生确诊时间，与进展为胃癌的胃肠上皮化生患者进行匹配。
一种胃肠上皮化生风险分层及胃癌预警系统，包括上述联合预测模型。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过免疫组织化学技术对结局不同的胃肠上皮化生组织进行MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达检测，并构建基于多分子表达水平的联合预测模型，可以用于临床对胃肠上皮化生患者进行组织样本分析，并获得用于患者胃肠上皮化生风险分层以及胃癌预警的信息，体现了较好的预测价值。
进一步的，本发明的联合预测模型的构建采用Logistic回归分析，通过进行内部及外部验证，不仅具有对高危胃肠上皮化生的识别能力(通过对单分子，例如MG7-Ag表达水平的分析无法获得该识别能力)，而且与基于单分子(例如，hTERT或TFF2)表达水平的预测方法(例如，设定截断值)相比，在识别进展为胃癌的高危肠上皮化生患者中具有更高的预测效能。
进一步的，本发明的建模队列和验证队列中组织样本采用了严格匹配的对照，规避个体和人群的异质性，适用于临床常见的内镜胃粘膜病理活检石蜡标本。
附图说明
图1为MG7-Ag、hTERT和TFF2分子在回顾性病例对照研究不同胃黏膜组织中的染色评分统计。
图2为MG7-Ag、hTERT和TFF2分子在回顾性病例对照研究不同胃黏膜组织中的表达差异；其中，A：MG7-Ag；B：hTERT；C：TFF2。
图3为MG7-Ag、hTERT和TFF2分子在回顾性病例对照研究不同程度(轻度、中度、重度；程度划分参考Tytgat GN.The Sydney system:endoscopic division.End oscopicappearances in gastritis duodenitis.Gastroenterol Hepatol,1991,6(3):223-234.)胃肠上皮化生组织中的表达差异；其中，A：MG7-Ag；B：hTERT；C：TFF2。
图4为胃肠上皮化生进展为胃癌的单因素Logistic回归分析。
图5为单因素识别高危胃肠上皮化生患者效果的ROC曲线图。
图6为MG7-Ag、hTERT和TFF2分子在验证队列不同结局胃肠上皮化生组织中的染色评分统计。
图7为MG7-Ag、hTERT和TFF2分子在验证队列不同结局胃肠上皮化生组织中的表达差异；其中，A：MG7-Ag；B：hTERT；C：TFF2。
图8为MG7-Ag、hTERT和TFF2分子在验证队列不同程度胃肠上皮化生组织中的表达差异；其中，A：MG7-Ag；B：hTERT；C：TFF2。
图9为联合预测模型内部验证和外部验证的ROC曲线图。
图10为联合预测模型内部验证和外部验证的校准度散点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
本发明通过文献回顾和分析，筛选出了胃癌相关抗原MG7-Ag、人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、三叶因子2(Trefoil factorfamily 2,TFF2)作为对胃肠上皮化生进展为胃癌具有预测价值的分子。本发明通过胃肠上皮化生患者队列的跟踪随访，对结局不同的胃肠上皮化生标本中MG7-Ag、hTERT、TFF2的表达水平进行检测，经分析发现表达MG7-Ag和hTERT且低表达或不表达TFF2的胃肠上皮化生组织进展为胃癌的可能性最大。本发明对基于MG7-Ag、hTERT及TFF2表达水平的联合预测模型在胃肠上皮化生风险分层和胃癌预警中的效果进行了评价，验证了本发明可以弥补目前高效识别高危胃肠上皮化生患者并进行胃癌预警方法的缺失。
(一)基于MG7-Ag、hTERT及TFF2表达水平的高危胃肠上皮化生识别及胃癌预测模型的构建
1.实验设计
1.1研究方法
回顾性病例对照研究
1.2研究对象
1)高危胃肠上皮化生病例组(进展为胃癌的胃肠上皮化生组，简称IM-GC组)：
筛选2009年7月1日至2019年9月30日期间于西京医院行上消化道内镜下组织病理活检，且活检病理诊断(初次诊断)为胃肠上皮化生，后病情进展为胃癌并于西京医院行手术切除、病理确诊的患者；这类患者初次诊断为胃肠上皮化生的组织蜡块标本即为病例组样本。
2)对照组(共3组)：
a)自身前后对照(由病例组进展的胃癌组，简称GC组)：病例组患者进展为胃癌后内镜下或者外科手术切除的胃癌组织蜡块标本，与病例组1:1匹配。
b)低危胃肠上皮化生同期对照(未进展为胃癌的胃肠上皮化生组，简称IM-NoGC组)：与病例组患者年龄相近、性别相同，内镜活检时间相近并且病理确诊为胃肠上皮化生，但后续随访中未进展为胃癌患者的胃肠上皮化生组织蜡块标本(在初次诊断时采集)，与病例组1:1匹配。
c)低危慢性胃炎同期对照(未进展为胃癌的低危慢性胃炎组，简称CG-NoGC组)：与病例组患者年龄相近、性别相同，内镜活检时间相近并且病理确诊为慢性胃炎，但后续随访中未进展为胃癌患者的慢性胃炎标本(在初次诊断时采集)，与病例组1:1匹配。
以上病例组及自身前后对照组从西京医院住院病历系统数据库中筛选确定；各同期对照组从西京医院内镜中心系统数据库中筛选后通过随访确定；实验组织样本由病理科获得。
1.3纳入标准
病例组
1)病例确诊IM时，年龄18～75岁，性别不限；
2)组织活检病理先后分别确诊为胃肠上皮化生及胃癌至少各一次；
3)IM与胃癌病理确诊时间间隔≥6个月；
4)病理诊断以最高级别病变为准。
对照组
1)同期对照组患者与病例组患者确诊(初次诊断)时年龄差≤1岁；
2)同期对照组患者与病例组患者病理活检时间相差≤3个月；
3)同期对照组患者与病例组患者性别一致；
4)同期对照组患者截止至随访结束时仍未进展为胃癌；
5)同期对照组(CG-NoGC组)慢性胃炎病理诊断包含胃黏膜慢性炎症和慢性萎缩性胃炎；
6)病理诊断以最高级别病变为准。
1.4排除标准
1)病例组及对照组患者病理组织蜡块标本无法获得或无法进行实验；
2)病例组及同期对照组患者确诊胃肠上皮化生及慢性胃炎时存在其他消化道恶性肿瘤；
3)IM病理诊断时同时存在腺体异型增生或上皮内瘤变；
4)慢性胃炎病理诊断时同时存在腺体异型增生、上皮内瘤变或胃肠上皮化生；
5)残胃癌。
1.5随访及资料收集
利用电话随访，获取患者近期疾病相关检查结果，电话随访中对近期未有检查结果同时存在胃部不适症状(如恶心、呕吐、反酸、嗳气、腹痛，腹胀等症状)和体征(如体重明显下降，上腹部压痛或触及上腹部包块等体征)加重患者推荐再次复查胃镜，暂不予入组。收集所有入组病例的年龄、性别、H.pylori感染(病理)资料；收集胃癌患者初次诊断肠上皮化生至进展为胃癌的时间、胃癌发病部位，病理AJCC分期资料；收集胃肠上皮化生及慢性胃炎患者病理组织资料。
以上研究对象中的IM-NoGC组和IM-GC组患者构成建模队列。建模队列涉及患者34例，其中17例为进展为胃癌的胃肠上皮化生患者，17例为未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者。
2.试剂和仪器
1.1主要试剂
MG7-Ag抗体(樊代明等.抗低分化胃癌细胞系MKN-46-9单克隆抗体的制备及免疫组化鉴定.解放军医学杂志,1988,13(1):12-15.)，TFF2抗体(购自Proteintech公司)，hTERT抗体(购自Affinity公司)，免疫组化油蜡笔、DAB显色试剂盒、EDTA(均购自中杉金桥公司)，柠檬酸钠(购自Solarbio公司)，甲醇、无水乙醇、二甲苯(均购自天津市富宇精细化工有限公司)，正常山羊血清、通用型免疫组化二抗(均购自武汉博士德生物工程有限公司)。
1.2主要仪器
3.免疫组织化学染色
1)切片：根据组织编号在标签处对空白载玻片进行标记；选择切片厚度为5μm，进行连续切片，每个组织蜡块切片各3张；将连续切片的蜡带平铺于温水(45℃左右)中，利用镊子将蜡带离断，形成单个蜡片，避免出现气泡或组织受热不均的情况影响组织贴片；用载玻片在水中进行平铺、贴附，后将蜡片贴附成功的切片平放于恒温烤片机上，烘干(72℃)多余水分。
2)切片及磷酸盐缓冲液(PBS)准备：在标签处及实验记录中标注本次实验所用抗体的名称及浓度。将PBS粉剂(干粉可配2L)与2000mL的双蒸水(dd H2O)混合，搅拌至完全溶解后备用。将切片垂直置于塑料片架(24片/个)，放入60℃烤箱中进行烤片，时间为4到6个小时。
3)脱蜡和水化：将烤片结束的切片立刻在通风橱内进行过缸，使切片在不同溶液中浸泡，顺序依次为二甲苯I、二甲苯II、无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、85％乙醇，各浓度梯度乙醇由无水乙醇和双蒸水配制而成。过缸时间为两个二甲苯缸各15分钟，4个乙醇缸各5分钟，随着乙醇浓度梯度下降，脱去被溶解的石蜡和二甲苯。过缸完成后立刻将片架浸没在装有PBS缓冲液的白盒中清洗3次，摇床转速为70r/min，每次清洗5分钟。
4)抗原修复：首先进行抗原修复液配制，20mL柠檬酸钠修复液(50×；本实验中MG7-Ag和hTERT的对应抗体使用的抗原修复液)或20mL EDTA修复液(50×，pH 9.0；本实验中TFF2的对应抗体使用的抗原修复液为乙二胺四乙酸)与980mL dd H2O进行充分搅拌混合；将配制得到的1L抗原修复液倒入高压修复锅中，使用电磁炉进行加热；在修复液即将沸腾前，将片架直接浸没在修复液中，扣紧锅盖；当限压阀开始规律喷气后，进行2分钟倒计时；时间到后关闭电磁炉开关，轻提限压阀放气降压；在室温下，不开盖自然冷却10分钟后开盖，利用常温自来水慢速冲淋，使其冷却至室温，注意避免水流直接接触组织；PBS缓冲液清洗3次，摇床转速为70r/min，每次清洗5分钟。
5)消除内源性过氧化物酶：每个片架需用200mL 3％过氧化氢溶液(20mL 30％过氧化氢和180mL dd H2O混合均匀)，配制完成倒入组化盒备用。将切片浸没于3％过氧化氢溶液中，室温静置15分钟后，PBS缓冲液清洗3次，摇床转速为70r/min，每次清洗5分钟。
6)山羊血清封闭：备好湿盒，加入适量自来水；切片甩干后，用免疫组化油蜡笔根据组织的大小画一封闭圆圈，包含所有组织，滴加10％山羊血清，使组织完全覆盖，将切片置于备好的湿盒中以防干片，室温下静置15分钟，非特异性染色明显时可延长封闭时间。
7)一抗孵育：根据组织大小计算所需抗体稀释液体积，内镜下组织活检标本(慢性胃炎、IM等)约需50-100μL，内镜黏膜下剥离术及外科手术所得胃癌标本约需200-250μL。将MG7-Ag抗体、hTERT抗体、TFF2抗体分别按照1:4000、1:150、1:1000稀释至工作浓度，用免疫组化一抗稀释液分别进行配制。甩干切片上山羊血清，滴加一抗使其完全覆盖组织，切片置于湿盒中，冰箱4℃过夜。
8)复温：次日，将湿盒放置室温下复温40分钟；PBS缓冲液清洗3次，摇床转速为70r/min，每次清洗5分钟。
9)二抗孵育：甩干切片，滴加二抗，使组织完全覆盖，将切片置于湿盒中，室温静置40分钟；置于摇床上，PBS缓冲液清洗3次，转速为70r/min，每次清洗5分钟。
10)二氨基联苯胺(DAB)显色：将1滴(约50μL)工作液I(浓缩液20×)与1mL工作液II(底液)充分混匀，得DAB显色液，备用；准备显微镜和滤纸，调整光源大小和物镜；将切片多余水分用滤纸吸干，滴加现配DAB显色液使组织被完全覆盖；显微镜下观察，当发现目标部位染色清楚且背景无明显着色时，立即用自来水慢速冲洗终止显色，同一抗体不同切片染色时间应一致；显色完成后将切片放置于自来水中防止干片。
11)苏木精染核：将切片多余水分用滤纸吸干，滴加苏木精使组织被完全覆盖，静置约1分钟40秒后自来水冲洗停止反应，将切片浸泡于自来水白盒中。
12)脱水、透明：将切片依次浸泡在通风橱内的不同溶液的缸中，顺序依次为85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯II、二甲苯I。过缸时间分别为乙醇溶液每缸3分钟，脱去组织水分；二甲苯溶液每缸10分钟，透明组织；完成过缸后放置于通风橱中晾干(2小时)。
13)封片：晾干后根据组织大小滴加适量中性树脂，盖玻片覆盖，防止气泡生成；室温下放置2-3天自然晾干。
4.统计分析方法
4.1免疫组化染色评分
免疫组化染色的病理切片的阅片及评分由两位主治以上病理科医生独立完成。评分方法采用半定量法，即以阳性细胞数量评分和阳性强度评分乘积为最终得分(阳性即为染色着色)。
阳性细胞数量评分根据阳性腺体(腺体中至少应存在一个阳性细胞)个数占总腺体个数的百分比或阳性肿瘤细胞面积占肿瘤总面积的百分比进行评定：0～5％记为0分，6～25％记为1分，26～50％记为2分，51～75％记为3分，76～100％记为4分。
阳性强度评分根据染色强度进行评定：不着色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，深褐色记为3分。
MG7-Ag、hTERT或TFF2分子的免疫组化染色评分根据对应分子的阳性细胞数量评分与阳性强度评分两者的乘积进行综合判定：0分记为阴性(-)，1～4分记为弱阳性(+)，5～8分记为中阳性(++)，9～12记为强阳性(+++)。最终免疫组化染色评分根据两位病理科医生的评分取平均值，分值越高相应分子的组织表达水平也越高。
4.2统计分析
采用SPSS26.0软件对四组样本的组间差异和组内差异比较，胃肠上皮化生进展为胃癌的相关危险因素分析采用单因素Logistic回归分析，并进行ROC曲线分析，计算AUC值。
5.结果
5.1MG7-Ag、hTERT与TFF2分子免疫组化染色及表达水平
参见图1，MG7-Ag分子在胃癌(GC组)中显著高表达，在IM中(IM-NoGC组和IM-GC组)表达下降，在低危慢性胃炎(CG-NoGC组)中低表达；hTERT分子在胃癌(GC组)和高危IM(IM-GC组)中显著高表达，在低危IM(IM-NoGC组)和低危慢性胃炎(CG-NoGC组)中低表达；TFF2在低危慢性胃炎(CG-NoGC组)和低危IM(IM-NoGC组)中显著高表达，在胃癌(GC组)和高危IM(IM-GC组)中低表达。
5.2MG7-Ag、hTERT与TFF2免疫组化染色评分组间和组内比较
MG7-Ag、hTERT和TFF2分子免疫组化染色评分在CG-NoGC组、IM-NoGC组、IM-GC组和GC组四组组间的表达水平均不同(P<0.05)。参见图2，hTERT和TFF2在结局不同的IM组织(IM-NoGC组与IM-GC组)中表达水平不同，MG7-Ag分子染色评分在结局不同的IM组织中表达水平未见显著差异。参见图3，MG7-Ag、hTERT与TFF2分子染色评分同IM程度轻重无关。
5.3胃肠上皮化生进展为胃癌的相关因素回归分析
在Logistic回归分析中，hTERT和TFF2分子的表达水平是IM癌变的独立危险因素(图4)，而MG7-Ag不构成独立危险因素。在ROC分析中可以得出同样的结果(图5)。
6.构建基于MG7-Ag、hTERT与TFF2表达水平的联合预测模型
根据Logistic回归模型，可得联合预测模型：
y＝ln[P/(1-P)]＝5.403+0.202×SMG7-Ag+0.576×ShTERT–1.212×STFF2
其中，SMG7-Ag、ShTERT、STFF2分别表示IM患者的胃肠上皮化生组织样本(可通过内镜胃粘膜病理活检获得)中对应分子(MG7-Ag、hTERT、TFF2)的免疫组化染色评分；P表示胃肠上皮化生患者可能进展为胃癌的概率。
当某IM患者进展为胃癌的概率(根据y计算得到P的值)越接近于1，表明其属于高危胃肠上皮化生患者，并最终进展为胃癌的可能性更高；当某IM患者进展为胃癌的概率越接近于0，表明其属于高危胃肠上皮化生患者，并最终进展为胃癌的可能性更低。
(二)验证队列表达水平检测及联合预测模型验证
1.验证队列研究对象
1)高危胃肠上皮化生病例组(进展为胃癌的胃肠上皮化生组，简称IM-GC组)：
筛选2019年10月1日至2020年12月30日期间于西京医院行上消化道内镜下组织病理活检，且活检病理诊断(初次诊断)为胃肠上皮化生，随访发现于西京医院或其他医院(外院)病理确诊为胃癌患者；这类患者初次诊断胃肠上皮化生的组织蜡块标本即为病例组样本。
2)对照组(未进展为胃癌的胃肠上皮化生组，简称IM-NoGC组)：
与病例组患者年龄相近、性别相同，内镜活检时间相近并且病理确诊为胃肠上皮化生，但后续随访中未进展为胃癌患者的胃肠上皮化生组织蜡块标本(在初次诊断时采集)，以1:3左右的比例与病例组匹配。
以上病例组及对照组通过从消化内镜中心系统数据库中筛选后通过随访确定，实验组织样本由病理科获得。
2.入排标准
参照第(一)部分。
验证队列涉及患者31例，其中8例为进展为胃癌的肠上皮化生患者，23例为未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者。
3.统计分析方法
参照第(一)部分方法进行免疫组化染色及评分后，采用SPSS26.0软件完成对验证队列的组间差异和组内差异比较；对上述基于MG7-Ag、hTERT与TFF2表达水平的联合预测模型在利用建模队列完成内部验证后进行外部验证，区分度采用敏感性、特异性及AUC值，校准度采用拟合优度检验。
4.结果
4.1验证队列MG7-Ag、hTERT与TFF2分子免疫组化染色及表达水平
参见图6，MG7-Ag、hTERT在IM-GC组中染色阳性率高于IM-NoGC组，TFF2在IM-NoGC组中染色阳性率高于IM-GC组。
4.2验证队列MG7-Ag、hTERT与TFF2分子免疫组化染色评分组间和组内比较
组间比较中，hTERT分子在不同结局IM组织中表达水平不同，MG7-Ag、TFF2未见明显差异(图7)；组内比较中，不同程度IM之间MG7-Ag、hTERT及TFF2表达水平均无统计学差异(图8)。
4.3基于MG7-Ag、hTERT与TFF2表达水平的联合预测模型验证
4.3.1联合预测模型内部和外部验证区分度评价
在建模队列内部验证中，联合预测模型的敏感度为88.2％，特异度为100％，预测IM患者进展为胃癌的准确率(AUC)能够达到97.1％。在验证队列外部验证中，联合预测模型的敏感度为75％，特异度为87％，预测IM患者进展为胃癌的准确率能够达到87％(图9)。
4.3.2联合预测模型内部和外部验证校准度评价
在拟合优度检验中通过计算χ2发现，联合预测模型在内部验证和外部验证中均体现了较好的校准能力，从校准度散点图中也可得到相同结论(图10)。
(三)单分子与多分子的预测效能比对
1)联合预测模型的预测效果(敏感度、特异度、准确率)明显优于单分子预测模型
在基于建模队列的单分子预测模型中，hTERT评分以5.75为截断值，其识别高危肠上皮化生的敏感度为70.6％，特异度88.2％，预测IM患者进展为胃癌的准确率能够达到81.5％。TFF2评分以6.50为截断值，其识别高危肠上皮化生的敏感度为82.4％，特异度为88.2％，预测IM患者进展为胃癌的准确率能够达到91.3％。MG7-Ag无法区分高危和低危肠上皮化生。而MG7-Ag、hTERT和TFF2的联合预测模型与单分子预测模型相比，无论敏感度还是特异度都明显提高。
在基于验证队列的单分子预测模型中，hTERT单分子模型的预测结果的敏感度、特异度、准确率较低，MG7-Ag和TFF2单分子模型均不能区分高危和低危胃肠上皮化生患者，而联合预测模型的敏感度为75％，特异度为87％，预测IM患者进展为胃癌的准确率能够达到87％。
2)在回顾性病例对照研究期间(2009年至2020年约11年中)，根据联合预测模型进行计算，模型识别的高危胃肠上皮化生患者进展为胃癌的总癌变率为87.5％，年癌变率约为8％，预测结果明显优于目前报道方法的年癌变率(约2％)。
根据以上比对结果，利用本发明的联合预测模型能够尽可能多的识别出高危胃肠上皮化生患者。临床上对于IM患者，若经过预测P值接近于1，则应给予不同的干预措施，例如，缩短观察时间。
总之，本发明通过回顾性病例对照研究对结局不同的胃肠上皮化生组织进行MG7-Ag、hTERT和TFF2分子表达水平分析，发现在结局不同的胃肠上皮化生组织中分子表达水平存在差异。通过Logistic回归分析，将MG7-Ag、hTERT和TFF2分子表达水平联合，进一步构建预测模型，经建模队列和验证队列进行验证，发现与利用单分子表达水平识别高危肠上皮化生组织相比，多分子联合检测能够提高对高危胃肠上皮化生患者的识别能力，并具有胃癌预警价值，为基于胃肠上皮化生干预的胃癌预防提供新思路。

Claims (7)

1.一种基于多分子联合预测模型的胃肠上皮化生组织分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）构建建模队列，所述建模队列由回顾性研究中进展为胃癌的胃肠上皮化生患者和未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者构成；
2）对建模队列中各患者诊断为胃肠上皮化生的组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测；
3）根据步骤2）检测得到的组织样本中MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达水平建立联合预测模型；
4）将来自演变情况未知患者的胃肠上皮化生组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测，并将检测得到的该组织样本中MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达水平输入步骤3）建立的联合预测模型，根据联合预测模型的输出推断所述患者的胃肠上皮化生演变情况；
所述步骤2）及步骤4）中，组织样本采用胃镜组织活检的蜡块标本，对组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测具体包括以下步骤：采用免疫组织化学染色处理组织样本，根据阳性染色结果计算组织样本的免疫组织化学染色评分，其中，MG7-Ag、hTERT或TFF2的免疫组织化学染色评分根据各自阳性细胞数量评分与阳性强度评分的乘积确定；
所述联合预测模型表示为：
y=ln [ P /（1 - P）]= a + b × SMG7-Ag + c × ShTERT – d × STFF2
其中，y为联合预测模型输出；P为胃肠上皮化生患者进展为胃癌的概率，SMG7-Ag、ShTERT、STFF2分别表示组织样本中MG7-Ag、hTERT、TFF2的免疫组织化学染色评分；a、b、c、d为拟合得到的模型参数。
2.根据权利要求1所述一种基于多分子联合预测模型的胃肠上皮化生组织分析方法，其特征在于：所述联合预测模型是通过Logistic回归分析完成构建。
3.根据权利要求1所述一种基于多分子联合预测模型的胃肠上皮化生组织分析方法，其特征在于：所述步骤3）还包括以下步骤：构建验证队列，所述验证队列由回顾性研究中进展为胃癌的胃肠上皮化生患者和未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者构成，验证队列中患者的确诊胃癌时间与建模队列不同，对验证队列中各患者诊断为胃肠上皮化生的组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测，分别利用建模队列和验证队列各自检测得到的组织样本中MG7-Ag、hTERT及TFF2的表达水平对联合预测模型进行内部验证和外部验证。
4.根据权利要求3所述一种基于多分子联合预测模型的胃肠上皮化生组织分析方法，其特征在于：所述建模队列及验证队列中，进展为胃癌的胃肠上皮化生患者的数量分别为6例以上。
5.根据权利要求4所述一种基于多分子联合预测模型的胃肠上皮化生组织分析方法，其特征在于：所述建模队列及验证队列中，未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者按照年龄、性别以及胃肠上皮化生确诊时间，与进展为胃癌的胃肠上皮化生患者进行匹配。
6.一种胃肠上皮化生风险分层及胃癌预警系统，其特征在于：包括根据回顾性研究中进展为胃癌的胃肠上皮化生患者和未进展为胃癌的胃肠上皮化生患者的胃肠上皮化生组织样本MG7-Ag、hTERT及TFF2表达水平建立的联合预测模型，胃肠上皮化生风险分层及胃癌预警的依据为根据联合预测模型的输出计算得到的胃肠上皮化生患者进展为胃癌的概率；
对组织样本进行MG7-Ag、hTERT及TFF2表达检测具体包括以下步骤：组织样本采用胃镜组织活检的蜡块标本，采用免疫组织化学染色处理组织样本，根据阳性染色结果计算组织样本的免疫组织化学染色评分，其中，MG7-Ag、hTERT或TFF2的免疫组织化学染色评分根据各自阳性细胞数量评分与阳性强度评分的乘积确定；
所述联合预测模型表示为：
y=ln [ P /（1 - P）]= a + b × SMG7-Ag + c × ShTERT – d × STFF2
其中，y为联合预测模型输出；P为胃肠上皮化生患者进展为胃癌的概率，SMG7-Ag、ShTERT、STFF2分别表示组织样本中MG7-Ag、hTERT、TFF2的免疫组织化学染色评分；a、b、c、d为拟合得到的模型参数。
7.根据权利要求6所述一种胃肠上皮化生风险分层及胃癌预警系统，其特征在于：所述联合预测模型是通过Logistic回归分析完成构建。
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