CN108885214A - 检测癌症干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用识别岩藻糖α1‑2半乳糖单元的凝集素作为标记结肠直肠癌干细胞的工具用于所述结肠直肠癌干细胞的检测和/或定量，以及在诊断侵袭性、复发风险和预后价值的方法中使用所述凝集素以便修改结肠直肠癌治疗。

Description

检测癌症干细胞的方法
本发明涉及检测癌症干细胞、特别是结肠直肠癌干细胞的领域。
结肠直肠癌(CRC)是世界上第三大常见疾病。像任何癌症一样，其可以总结为健康组织，在这种情况下是结肠粘膜中的异常细胞增殖，引起肿瘤块的出现。提出解释肿瘤发展以及抗性机制和复发的理论之一在于癌症干细胞的存在。肿瘤从放射和化学疗法治疗的治疗性逃脱取决于肿瘤内这些细胞的存在。因此，肿瘤组织中这些细胞的检测构成了定义肿瘤的侵袭性水平的工具。癌症干细胞的特异性生物标志物的表征因此在癌症治疗中引起极大的诊断和预后关注。然而，当前不存在癌症干细胞(CSC)的特异性标志物允许将癌症干细胞与其它肿瘤细胞明确相区分。
归因于癌症干细胞的小数目和特异性标志物的不存在，CSC研究中的主要困难在于其分离和表征。
因此，需要一种允许在结肠直肠肿瘤中检测结肠直肠癌干细胞的方法。
本发明满足那个需要。本发明的发明者已经鉴别了在细胞的这个群体的表面上表达的特异性聚糖作为结肠直肠癌干细胞的标志物。由适当工具识别这些特异性标志物使得有可能在存在非癌症非干癌细胞、癌症非干细胞以及非癌症干细胞的结肠直肠组织内检测和定量结肠直肠癌干细胞。
在第一个方面，本发明关于用于试管内检测和/或定量结肠直肠癌干细胞(CSC)的凝集素和潜在存在的标记结肠直肠癌干细胞的第二工具的用途。
在第二个方面，本发明关于一种检测和/或定量结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞的方法。
在第三个方面，本发明涉及一种诊断结肠直肠癌的复发风险和/或侵袭性以定义预后价值以便修改结肠直肠癌治疗的方法。
在第四个方面，本发明关于一种包含凝集素和标记结肠直肠癌干细胞的第二工具的试剂盒，以及所述试剂盒用于检测和/或定量结肠直肠癌干细胞，特定地用于诊断结肠直肠癌的复发风险和/或侵袭性以定义预后价值以便修改结肠直肠癌的治疗的用途。
本发明的第一个主题因此涉及允许特异性地识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的工具，特别是识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素的用途，其用于检测和/或定量结肠直肠癌干细胞。
本发明特别涉及允许特异性地识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的工具，特别是识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素的用途，其用于试管内检测和/或定量结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞。
结肠直肠癌干细胞是能够自我更新并且对化学疗法中所用的众多物质具抗性的静止细胞的群体。其还被称为癌症肿瘤起始细胞(TIC)。已经描述了结肠直肠癌干细胞并且已经成为评论的主题，例如，在Vaiopoulos等S,《干细胞(Stem Cells)》2012(30),363-371和Ricci-Vitiani等《分子医学杂志(J.Mol.Med.)》2009,87(11),1097-1104中。
本发明还涉及使用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素作为第一标记工具以实施试管内检测和/或定量结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞的方法。
在本发明的含义内，“标记结肠直肠癌干细胞的工具”意指能够特异性地结合至在结肠直肠癌干细胞的表面上表达的标志物的物质。标记工具可以特别是针对抗原决定簇，诸如糖蛋白、蛋白质或聚糖的抗体。
根据本发明的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素有利地选自荆豆凝集素I(Ulex Europaeus Agglutinin I，UEA-I)和日本栝楼凝集素II(Trichosanthes JaponicaAgglutinin II，TJA-II)。优选地选自荆豆凝集素I。
为了保证由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的细胞是结肠直肠癌干细胞，有利地是除了识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素以外还使用标记结肠直肠癌干细胞的第二工具。这种第二标记工具可以对癌症或非癌症干细胞具特异性。
结肠直肠癌干细胞标志物的实例包括CD133、CD44、CD166(ALCAM)、CD24、CD26、CD29、EpCAM、Oct-4以及Sox-2。
优选地，标记结肠直肠癌干细胞的第二工具是抗OCT4抗体(八聚体结合转录因子4，由基因POU5F1编码)。
本发明因此还涉及使用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素，有利地选自荆豆凝集素I(UEA-I)和日本栝楼凝集素II(TJA-II)用于检测和/或定量结肠直肠癌干细胞。
根据一个实施方案，结肠直肠癌干细胞可以由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素、抗OCT4抗体以及至少一种识别T抗原的凝集素标记。
识别T抗原的凝集素可以特别选自双孢蘑菇凝集素(Agaricus BisporusAgglutinin，ABA)、尾穗苋凝集素(Amaranthus Caudatus Lectin，ACA)以及木菠萝凝集素(Jacalin)。
为了标记结肠直肠癌干细胞，还可以使用识别T抗原的凝集素的混合物，特别是选自以下的两种凝集素的混合物：ABA和ACA；ABA和木菠萝凝集素；ACA和木菠萝凝集素。有利地，凝集素是UEA-1、木菠萝凝集素和ACA。
有利地，三种凝集素的混合物由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素:木菠萝凝集素:ABA或ACA组成，摩尔比是625至12500:16至320:1至20，有利地是5000至7000:50至250:5至15，特别是6250:160:10。
更有利地，识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素是UEA-1并且识别T抗原的凝集素是木菠萝凝集素和ACA，UEA-1:木菠萝凝集素:ACA的摩尔比是6250:160:10。
为了检测和定量结肠直肠癌干细胞，用于标记结肠直肠癌干细胞的工具必须能够在生物样品中可见。
标记工具因此直接或间接结合至显现工具。
在本发明的含义内，“显现工具”表示能够识别标记工具并且传输可以在组织中检测(例如，通过直接可视化或分光光度法)的信号的物质或物质的集合。
“直接结合”在本发明的含义内意味着显现工具直接结合至标记结肠直肠癌细胞的工具。显现工具可以例如是共价结合至标记工具的发色团、荧光团或能够还原发色底物的酶。
“间接结合”在本发明的含义内意味着显现工具共价结合至二级物质，所述二级物质能够特异性地识别标记工具。显现工具可以例如共价结合至抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或抗生物素抗体并且标记工具可以是生物素化的。
本发明因此还涉及使用结合至显现工具A的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素以实施检测和/或定量结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞的方法。
显现工具A可以是发色团、荧光团、直接或间接结合至荧光团或发色团的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的抗体、或能够还原发色底物B的酶。
有利地，显现工具A是能够还原发色底物B的酶。
在一个实施方案中，识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素是生物素化的并且显现工具A结合至抗生蛋白链菌素。有利地，显现工具A是能够还原发色底物的酶，特别是辣根过氧化酶。所述能够还原发色底物B的酶可以合并至信号放大系统中。这类信号放大系统在市场上可得，例如，得自Leica或Thermofisher Scientific公司。
发色底物B取决于所使用的酶的种类。在辣根过氧化酶的情况下，其可以例如是选自由以下组成的群组的发色底物：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、10-乙酰基-10H-吩恶嗪-3,7-二醇高香草酸、鲁米诺(luminal)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)以及2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)。
有利地，发色底物B是3,3'-二氨基联苯胺(DAB)。
第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体，结合至显现工具C，有利地选自发色团、荧光团或能够还原发色底物D的酶。
所述显现工具C可以直接或间接结合至结肠直肠癌干细胞的标记工具。
有利地，显现工具C结合至识别第二标记工具的二级抗体。举例来说，标记工具可以是在第一动物物种中产生的抗体并且显现工具C所结合的抗体是在另一动物物种中产生的抗体，其识别对用作标记工具的抗体的动物物种具特异性、对免疫球蛋白链的序列具特异性的表位。或者，显现工具C可以结合至识别二级抗体的三级抗体，所述二级抗体识别第二标记工具，特别是抗OCT4抗体。
在一个实施方案中，第二结肠直肠癌干细胞标记工具是抗OCT4抗体并且显现工具C结合至识别抗OCT4抗体的抗体。有利地，所述显现工具C是能够还原发色底物D的酶，特别是碱性磷酸酶。所述能够还原发色底物D的酶可以特异性地合并至信号放大系统中。这类信号放大系统在市场上可得，例如，得自Leica或Thermofisher Scientific公司。在特定实施方案中，抗OCT4抗体是在兔中产生的抗体并且显现工具结合至兔抗免疫球蛋白抗体，例如小鼠的。
发色底物D取决于所使用的酶的种类。在碱性磷酸酶的情况下，其可以例如是选自由以下组成的群组的发色底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)、硝基四氮唑蓝(Nitro-Blue tetrazolium，NBT)、BCIP/NBT混合物、磷酸4-硝基苯酯(p-NPP)、3-吲羟磷酸盐、7-溴-N-(2-甲氧基苯基)-3-(膦酰氧基)-2-萘甲酰胺以及3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺(Fast)。
有利地，发色底物是3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺(Fast)或BCIP/NBT混合物。
有利地，发色底物B和发色底物D得以形成不同颜色的发色团，允许由第一标记工具标记的细胞和由第二标记工具标记的细胞区分开。
本发明因此还涉及使用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和抗OCT4抗体、抗生蛋白链菌素辣根过氧化酶偶联物以及识别结合至碱性磷酸酶的抗OCT4抗体的抗体以实施检测和/或定量结肠直肠癌干细胞的方法。有利地，发色底物B是DAB并且发色底物D是Fast或BCIP/NBT。
能够还原发色底物B的酶用作显现工具A并且能够还原发色底物D的酶用作显现工具C在免疫组织化学方法中特别有利，特别是用于组织学切片上。
在特定实施方案中，本发明涉及在免疫组织化学检测方法中使用如上文所定义的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素。
在这个特定实施方案中，生物样品是结肠直肠生物样品的组织学切片，特别是肿瘤切除或结肠直肠活检的组织学切片。
在这个特定实施方案中，显现工具A可以共价结合至识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素。显现工具A还可以结合至抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或抗生物素抗体并且识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素是生物素化的。
在这个特定实施方案中，显现工具C可以共价结合至第二标记工具。显现工具C还可以共价结合至识别二级抗体的三级抗体，所述二级抗体识别第二标记工具。优选地，第二标记工具是抗OCT4抗体并且显现工具C共价结合至抗OCT4抗体或共价结合至识别抗OCT4抗体的二级抗体。显现工具C还可以共价结合至识别二级抗体的三级抗体，所述二级抗体识别抗OCT4抗体。
在这个特定实施方案中，本发明优选地涉及识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素、结合至抗生蛋白链菌素的能够还原发色底物B的酶、抗OCT4抗体、结合至识别抗OCT4抗体的二级抗体的能够还原发色底物D的酶的用途，其用于检测和/或定量结肠直肠组织的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞。
在所有当中最优选地，识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素是UEA-1，第二标记工具是抗OCT4抗体，显现工具A是辣根过氧化酶，发色底物B是二氨基联苯胺，显现工具C是结合至二级抗体的碱性磷酸酶，并且发色底物D是3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺(Fast)。
本发明的第二个主题涉及一种试管内检测和/或定量结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的结肠直肠生物样品中的所述凝集素的显现步骤。
“显现步骤”在本发明的含义内意指旨在将识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素置于与生物样品接触之后，通过光谱法或分光光度法视觉上检测结合至结肠直肠癌干细胞的所述凝集素的步骤。
更特别地，本发明涉及如上文所定义的试管内检测和/或定量的方法，其包括以下步骤：
(a)在所述生物样品中用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述生物样品中标记的结肠直肠癌干细胞，
(b)显现结肠直肠生物样品中的所述凝集素，
(c)检测和/或定量所述生物组织中由所述凝集素标记的结肠直肠癌干细胞。
标记步骤之前有预期用于制备生物样品的常规步骤，诸如使用设计用于暴露抗原的缓冲液(在双标记的情况下，pH有利地是6)洗涤组织。
标记步骤有利地在具有饱和能力并且能够防止非特异性结合的稀释剂(例如，PBS-BSA稀释剂)中进行。
标记步骤在介于10与30℃之间的温度下实施，有利地持续范围介于10与30分钟之间的孵育时间。
本发明因此有利地涉及一种检测和/或定量结肠直肠组织的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括以下步骤：
(a2)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素标记组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中标记的结肠直肠癌干细胞，
(b2)将步骤(a2)获得的组织学切片置于与结合至抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体的显现工具A接触，
(c2)显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素，
(d2)检测和/或定量组织学切片中由所述凝集素标记的结肠直肠癌干细胞。
有利地，上文所描述的方法可以在步骤(a)中用以下实施：识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和至少一种识别T抗原的凝集素，有利地选自ACA、ABA和木菠萝凝集素，更有利地是识别T抗原的凝集素的混合物，选自ABA和ACA的混合物、ABA和木菠萝凝集素的混合物以及ACA和木菠萝凝集素的混合物，有利地是ACA和木菠萝凝集素。
有利地，凝集素的混合物由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素:木菠萝凝集素:ABA或ACA组成，摩尔比是625至12500:16至320:1至20，有利地是5000至7000:50至250:5至15，特别是6250:160:10。
特别有利地，步骤(a)用UEA-1、ACA和木菠萝凝集素的混合物实施，优选地以6250:160:10的UEA-1:木菠萝凝集素:ACA比率。
上文所描述的方法可以之前有如上文所定义的用标记癌症干细胞的第二工具标记的步骤。特别地，上文所描述的方法可以之前有由抗OCT4抗体标记的步骤。
本发明因此关于一种方法，其在由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的步骤(a)或(a2)之前包括以下步骤：
(a'1)用第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体标记所述结肠直肠生物样品的结肠直肠癌干细胞，以获得所述生物样品中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞，
(a'2)显现第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体。
标记步骤之前有设计用于制备生物样品的常规步骤，诸如使用设计用于暴露抗原的缓冲液(在双标记的情况下，pH有利地是6)洗涤组织。
标记步骤有利地在具有饱和能力并且能够防止非特异性附着的稀释剂(例如，PBS-BSA稀释剂)中进行。
标记步骤在介于10与30℃之间的温度下实施，有利地持续范围是10至30分钟的孵育时间。
本发明因此还涉及如上文所描述的方法，其包括以下步骤：
(a3)在结肠直肠组织的组织学切片中用结肠直肠癌干细胞的第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学样品中由所述第二标记工具标记的结肠直肠癌干细胞，
(b3)将步骤(a3)获得的组织学切片置于与结合至显现工具C的识别第二标记工具的二级抗体，优选地是抗OCT4抗体接触，
(c3)显现第二标记工具，
(d3)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记步骤(c3)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记并且可能由至少一种识别T抗原的凝集素标记的癌症干细胞，
(e3)将步骤(d3)获得的组织学切片置于与结合至抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体的显现工具A接触，
(f3)显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素，
(g3)检测和/或定量组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞。
在特定实施方案中，本发明涉及一种检测和/或定量结肠直肠组织学切片中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括以下步骤：
(a4)在结肠直肠组织的组织学切片中用抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠干细胞，
(b4)将步骤(a4)中获得的组织学切片置于与结合至能够还原发色底物的酶的识别抗OCT4抗体的二级抗体接触，
(c4)用发色底物显现抗OCT4抗体，
(d4)用识别T抗原的生物素化凝集素标记步骤(c4)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e4)将步骤(d4)获得的组织学切片置于与结合至能够还原发色底物的酶的抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体接触，
(f4)用发色底物显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素，
(g4)检测和/或定量组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素、可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素以及抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种检测和/或定量结肠直肠组织学切片中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括以下步骤：
(a5)在结肠直肠组织的组织学切片中用抗OCT4抗体标识结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠干细胞，
(b5)将步骤(a5)中获得的组织学切片置于与结合至碱性磷酸酶的识别抗OCT4抗体的二级抗体接触，
(c5)用或BCIP/NBT混合物显现抗OCT4抗体，
(d5)用生物素化UEA-1和可能存在的生物素化ACA和生物素化木菠萝凝集素以6250:160:10的UEA-1:木菠萝凝集素:ACA比率标记步骤(c5)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得由UEA-1和可能存在的ACA和木菠萝凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e5)将步骤(d5)获得的组织学切片置于与结合至辣根过氧化酶的抗生蛋白链菌素接触，
(f5)用DAB显现UEA-1和可能存在的ACA和木菠萝凝集素，
(g5)检测和/或定量组织学切片中由UEA-1和抗OCT4抗体以及可能存在的ACA和木菠萝凝集素标记的结肠直肠癌干细胞。
在另一个实施方案中，本申请中所描述的一般方法可以通过使用流式细胞术来实施以检测和/或定量结肠直肠癌干细胞。在一个实施方案中，癌症干细胞可以通过流式细胞术检测和/或定量。这种方法还能够通过使用适当的设备分离结肠直肠癌干细胞。
生物样品可以是结肠直肠肿瘤组织的活检体，其中细胞已经预先相互解离，例如，借助于由Roche Diagnostic公司出售的产品LiberaseTM，其能够使组织解离而不影响表面聚糖。
为了通过流式细胞术检测和/或定量细胞，识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素直接或间接结合至荧光团E。第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体，直接或间接结合至荧光团F，例如结合至识别抗OCT4抗体的二级抗体。有利地，荧光团E和F互不相同。优选地，荧光团E是结合至抗生蛋白链菌素的Alexa 488，并且识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素是生物素化的，并且荧光团F是直接结合至抗OCT4抗体的Alexa 633。
本发明还涉及一种检测和/或定量结肠直肠生物样品中的如上文所描述的结肠直肠癌干细胞的方法，其中检测步骤通过流式细胞术来实施，用荧光团作为显现工具。
因为根据本发明的方法能够检测和定量结肠直肠癌干细胞，所以其特别适合于结肠直肠癌的诊断，特别是借助于病理解剖学或组织病理学检查。
癌症干细胞不同于构成肿瘤的其它细胞。其能够自我更新并且对常规化学疗法和放射疗法治疗具抗性。癌症干细胞因此将在虽然能够消除肿瘤的常规化学疗法/放射疗法之后引起肿瘤复发。肿瘤组织中这些细胞的检测因此在评估通过化学疗法或放射疗法治疗的患者的复发风险中引起主要关注。癌症干细胞的定量对于确定癌症的侵袭性也是至关重要的。此外，肿瘤组织中癌症干细胞的检测允许在治疗期间建立预后，由此提供改变治疗的可能性以更有效地靶向这些细胞并且因此降低肿瘤侵袭性和复发风险。
本发明因此涉及识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的抗OCT4抗体的用途，其用于结肠直肠癌的复发风险和/或结肠直肠癌的侵袭性的试管内诊断以定义预后价值以便修改结肠直肠癌的治疗。
在一个实施方案中，使用以下来达成标记：识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素，有利地是UEA-1；抗OCT4抗体；以及至少一种识别T抗原的凝集素，有利地选自ACA、ABA和木菠萝凝集素，或识别T抗原的凝集素的混合物，选自AVA和ACA混合物以及ABA和木菠萝凝集素混合物以及ACA和木菠萝凝集素混合物，有利地是ACA和木菠萝凝集素。有利地，UEA-1:木菠萝凝集素:ACA比率是6250:160:10。
本发明更特别地涉及结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值的试管内诊断方法，其包括以下步骤：
(a)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞，以获得所述生物样品中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(b)显现结肠直肠组织中的结肠直肠癌干细胞，
(c)检测和/或定量由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的癌症干细胞，
(d)以结肠直肠癌干细胞的数量为基础推断结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值。
有利地，本发明通过使用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和标记结肠直肠癌细胞的第二工具，优选地是抗OCT4抗体来实施。
本发明者实际上已经显示，双标记已经促成最佳灵敏度和特异性，由此大幅降低可能由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记癌症非干细胞或非癌症干细胞所致的假阳性的风险。
本发明因此还涉及复发风险和/或侵袭性的试管内诊断方法以定义预后价值用于结肠直肠癌的治疗性修改，其包括以下步骤：
(a6)在结肠直肠组织的组织学切片中用第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中标记的结肠直肠癌细胞，
(b6)将步骤(a6)中获得的组织学切片置于与结合至显现工具C的识别第二标记工具的二级抗体接触，
(c6)显现第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体，
(d6)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记步骤(c6)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e6)将步骤(d6)中获得的组织学切片置于与结合至显现工具A的抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体接触，
(f6)显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素，
(g6)检测和/或定量步骤(f6)获得的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞，
(h6)以结肠直肠癌干细胞的存在和/或数目为基础推断治疗结肠直肠癌的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值。
在优选的实施方案中，本发明关于结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值的试管内诊断方法，其包括以下步骤：
(a7)在结肠直肠组织的组织学切片中用抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞，
(b7)将步骤(a7)获得的组织学切片置于与结合至显现工具C，优选地是能够还原发色底物的酶，特别是碱性磷酸酶的识别抗OCT4抗体的二级抗体接触，
(c7)优选地用Fast或BCIP/NBT混合物显现抗OCT4抗体，
(d7)用生物素化UEA-1或6250:160:10摩尔比的UEA-1:木菠萝凝集素:ACA的混合物标记步骤(c7)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e7)将步骤(d7)获得的组织学切片置于与结合至显现工具A，优选地是能够还原发色底物的酶的抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体接触，
(f7)优选地用DAB显现UEA-1或UEA-1、木菠萝凝集素和ACA，
(g7)检测和/或定量步骤(f7)获得的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞，
(h7)以结肠直肠癌干细胞的存在和/或数目为基础推断结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值。
本发明的第五个主题关于一种特别设计用于检测和/或定量结肠直肠癌干细胞的试剂盒，其包含：
·识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素，
·结合至有利地合并入信号放大系统中的辣根过氧化酶的抗生蛋白链菌素，
·抗OCT4抗体，
·结合至有利地合并入放大系统中的能够还原发色底物的碱性磷酸酶的识别抗OCT4抗体的二级抗体。
根据本发明的试剂盒除了上文所描述的部分以外还可以含有能够由辣根过氧化酶还原的发色底物和能够由碱性磷酸酶还原的发色底物。
根据本发明的试剂盒还可以含有缓冲溶液、洗涤溶液、稀释剂以及说明书。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种特别设计用于检测和/或定量结肠直肠癌干细胞的试剂盒，其包含：
·生物素化UEA-1和可能存在的生物素化ACA和生物素化木菠萝凝集素，
·抗OCT4抗体，
·结合至碱性磷酸酶的识别抗OCT4抗体的二级抗体，
·结合至辣根过氧化酶的抗生蛋白链菌素，
·可能存在的DAB，
·可能存在的Fast或BCIP/NBT混合物，
·可能存在的洗涤溶液，
·可能存在的稀释剂，
·可能存在的缓冲溶液。
本发明还关于使用如上文所定义的试剂盒用于实施检测和/或定量结肠直肠组织的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞的试管内方法。
本发明还关于使用如上文所定义的试剂盒以实施结肠直肠癌的复发风险和/或侵袭性的试管内诊断方法以定义预后价值以便修改结肠直肠癌的治疗。
在第七个主题中，本发明涉及一种试管内检测和/或定量结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括显现由所述凝集素标记的结肠直肠生物样品中用显现工具修饰的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素的步骤。
本发明更特别地涉及如上文所定义的试管内检测和/或定量的方法，其包括以下步骤：
(a)在所述生物样品中用显现工具修饰的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述生物样品中标记的结肠直肠癌干细胞，
(b)显现结肠直肠生物样品中的所述凝集素，
(c)检测和/或定量所述生物组织中由所述凝集素标记的结肠直肠癌干细胞。
本发明因此有利地涉及如上文所定义的检测和/或定量结肠直肠组织的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞的方法，其中显现工具是生物素，其包括以下步骤：
(a2)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素标记组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中的结肠直肠癌干细胞，
(b2)将步骤(a2)获得的组织学切片置于与结合至抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体的显现工具A接触，
(c2)显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素，
(d2)检测和/或定量组织学切片中由所述凝集素标记的结肠直肠癌干细胞。
有利地，上文所描述的方法可以在步骤(a)中用以下实施：用显现工具修饰的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和用显现工具修饰的至少一种识别T抗原的凝集素，有利地选自ACA、ABA和木菠萝凝集素，更有利地是用显现工具修饰的识别T抗原的凝集素的混合物，选自ABA和ACA的混合物、ABA和木菠萝凝集素的混合物以及ACA和木菠萝凝集素的混合物，有利地是ACA和木菠萝凝集素。
有利地，凝集素混合物由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素:用显现工具修饰的木菠萝凝集素:用显现工具修饰的ABA或用显现工具修饰的ACA组成，摩尔比是625至12500:16至320:1至20，有利地是5000至7000:50至250:5至15，特别是6250:160:10。
特别有利地，步骤(a)用以下实施：用显现工具修饰的UEA-1混合物、用显现工具修饰的ACA以及用显现工具修饰的木菠萝凝集素，优选地以6250:160:10的UEA-1:木菠萝凝集素:ACA比率。
上文所描述的方法可以之前有如上文所定义的用癌症干细胞的第二标记工具标记的步骤。特别地，上文所描述的方法可以之前有由抗OCT4抗体标记的步骤。
本发明因此关于一种方法，其在由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的步骤(a)或(a2)之前包括以下步骤：
(a'1)用第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体标记所述结肠直肠生物样品的结肠直肠癌干细胞，以获得所述生物样品中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞，
(a'2)显现所述第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体。
本发明因此还涉及如上文所描述的方法，其包括以下步骤：
(a'3)在结肠直肠组织的组织学切片中用标记结肠直肠癌干细胞的第二工具，优选地是抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由所述第二标记工具标记的癌症干细胞，
(b3)将步骤(a3)获得的组织学切片置于与结合至显现工具C的识别第二标记工具的二级抗体，优选地是抗OCT4抗体接触，
(c3)显现第二标记工具，
(d3)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记步骤(c3)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记并且可能由至少一种识别T抗原的凝集素标记的癌症干细胞，
(e3)将步骤(d3)获得的组织学切片置于与结合至抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体的显现工具A接触，
(f3)显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素，
(g3)检测和/或定量组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞。
在特定实施方案中，本发明涉及一种检测和/或定量结肠直肠组织学切片中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括以下步骤：
(a4)在结肠直肠组织的组织学切片中用抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠干细胞，
(c4)用发色底物显现抗OCT4抗体，
(d4)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记步骤(c4)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e4)将步骤(d4)获得的组织学切片置于与结合至能够还原发色底物的酶的抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体接触，
(f4)用发色底物显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素，
(g4)检测和/或定量组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素、可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素以及抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞。
在优选的实施方案中，本发明关于一种检测和/或定量结肠直肠组织学切片中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括以下步骤：
(a5)在结肠直肠组织的组织学切片中用抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠干细胞，
(b5)将步骤(a5)获得的组织学切片置于与结合至碱性磷酸酶的识别抗OCT4抗体的二级抗体接触，
(c5)用Fast或BCIP/NBT混合物显现抗OCT4抗体，
(d5)用生物素化UEA-1和可能存在的生物素化ACA和生物素化木菠萝凝集素以6250:160:10的UEA-1:木菠萝凝集素:ACA比率标记步骤(c5)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得由UEA-1和可能存在的ACA和木菠萝凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e5)将步骤(d5)获得的组织学切片置于与结合至辣根过氧化酶的抗生蛋白链菌素接触，
(f5)用DAB显现UEA-1和可能存在的ACA和木菠萝凝集素，
(g5)检测和/或定量组织学切片中由UEA-1和抗OCT4抗体以及可能存在的ACA和木菠萝凝集素标记的结肠直肠癌干细胞。
在另一个实施方案中，本申请中所描述的一般方法可以通过使用流式细胞术来实施用于检测和/或定量结肠直肠癌干细胞。在一个实施方案中，癌症干细胞可以通过流式细胞术检测和/或定量。这种方法还允许通过使用适当的设备分离结肠直肠癌干细胞。
生物样品可以是结肠直肠肿瘤组织的活检体，其中细胞已经预先相互解离，例如，借助于由Roche Diagnostic公司出售的产品LiberaseTM，其能够使组织解离而不影响表面聚糖。
为了通过流式细胞术检测和/或定量细胞，识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素直接或间接结合至荧光团E。第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体，直接或间接结合至荧光团F，例如结合至识别抗OCT4抗体的二级抗体。有利地，荧光团E和F互不相同。优选地，荧光团E是结合至抗生蛋白链菌素的Alexa 488，并且识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素是生物素化的，并且荧光团F是直接结合至抗OCT4抗体的Alexa 633。
本发明因此还涉及一种检测和/或定量结肠直肠生物样品中的如上文所描述的结肠直肠癌干细胞的方法，其中检测步骤通过流式细胞术来实施，用荧光团作为显现工具。
在一个实施方案中，用以下来进行标记：用显现工具修饰的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素，有利地是UEA-1，和抗OCT4抗体，以及用显现工具修饰的至少一种识别T抗原的凝集素，有利地选自ACA、ABA和木菠萝凝集素，或用显现工具修饰的识别T抗原的凝集素的混合物，选自ABA和ACA混合物、ABA和木菠萝凝集素混合物以及ACA和木菠萝凝集素混合物，有利地是ACA和木菠萝凝集素。有利地，UEA-1:木菠萝凝集素:ACA比率是6250:160:10。
本发明更特别地涉及结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值的试管内诊断方法，其包括以下步骤：
(a)用显现工具修饰的识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞，以获得所述生物样品中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(b)显现结肠直肠组织中的结肠直肠癌干细胞，
(c)检测和/或定量由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e)以结肠直肠癌干细胞的数量为基础推断结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值。
有利地，本发明用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素与显现工具和标记结肠直肠癌细胞的第二工具，优选地是抗OCT4抗体来实施。
本发明者实际上揭示，双标记促成最佳灵敏度和特异性，由此大幅降低可能由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记癌症非干细胞或非癌症干细胞所致的假阳性的风险。
本发明因此还涉及复发风险和/或侵袭性的试管内诊断方法以定义预后价值用于修改结肠直肠癌的治疗，其包括以下步骤：
(a6)在结肠直肠组织的组织学切片中用第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中标记的结肠直肠癌细胞，
(b6)将步骤(a6)获得的组织学切片置于与结合至显现工具C的识别第二标记工具的二级抗体接触，
(c6)显现第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体，
(d6)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记步骤(c6)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e6)将步骤(d6)获得的组织学切片置于与结合至显现工具A的抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体接触，
(f6)显现识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素，
(g6)检测和/或定量步骤(f6)获得的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞，
(h6)以结肠直肠癌干细胞的存在和/或数目为基础推断治疗结肠直肠癌的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值。
在优选的实施方案中，本发明关于结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值的试管内诊断方法，其包括以下步骤：
(a7)在结肠直肠组织的组织学切片中用抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由抗OCT4抗体标记的结肠直肠癌干细胞，
(b7)将步骤(a7)获得的组织学切片置于与结合至显现工具C，优选地是能够还原发色底物的酶，特别是碱性磷酸酶的识别抗OCT4抗体的二级抗体接触，
(c7)优选地用Fast或BCIP/NBT混合物显现抗OCT4抗体，
(d7)用生物素化UEA-1或6250:160:10摩尔比的UEA-1:木菠萝凝集素:ACA的混合物标记步骤(c7)获得的组织学切片的结肠直肠癌干细胞，以获得组织学切片中由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e7)将步骤(d7)获得的组织学切片置于与结合至显现工具A，优选地是能够还原发色底物的酶的抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体接触，
(f7)优选地用DAB显现UEA-1或UEA-1、木菠萝凝集素和ACA，
(g7)检测和/或定量步骤(f7)获得的组织学切片中的结肠直肠癌干细胞，
(h7)以结肠直肠癌干细胞的存在和/或数目为基础推断结肠直肠癌治疗的复发风险和/或侵袭性和/或预后价值。
附图说明
图1描绘了由UEA1标记(上图)、抗OCT4抗体标记(中图)以及由UEA-1/抗OCT4抗体双标记(下图)的一系列健康组织中的组织学切片。在健康组织中，可以观察到不存在因双标记而产生的颜色。
图2描绘了由UEA1标记(上图)、抗OCT4抗体标记(中图)以及由UEA-1/抗OCT4抗体双标记(下图)的一系列肿瘤组织中的组织学切片。在这个肿瘤组织中，可以观察到由UEA-1和抗OCT4抗体双标记而引起的显著深色染色(在实际获得的图像中是棕色)。
图3示出了由与Alexa Fluor 488偶联的UEA-1/抗生蛋白链菌素和与Alexa Fluor594偶联的抗OCT3抗体双标记的健康组织的图像。荧光的不存在指示结肠直肠癌干细胞的不存在。
图4示出了由与Alexa Fluor 488偶联的UEA-1/抗生蛋白链菌素和与Alexa Fluor594偶联的抗OCT4抗体双标记的肿瘤组织的图像。图像上的亮区归因于由与Alexa Fluor488偶联的UEA-1/抗生蛋白链菌素和抗OCT4抗体与Alexa Fluor 594对癌症干细胞的双标记。双标记揭示大量结肠直肠癌干细胞的存在。
图5示出了通过用与Alexa Fluor 488偶联的UEA-1/抗生蛋白链菌素和与AlexaFluor 594偶联的抗OCT4抗体对健康组织双标记获得的在使用z-堆叠方法之后经过调整的共焦显微图像。左上象限对应于由抗OCT4抗体标记的细胞，左下象限对应于未标记的细胞，并且右下象限对应于由UEA-1标记的细胞。右上象限对应于由UEA-1和抗OCT4抗体双标记的细胞。双标记的细胞的不存在确认组织不含结肠直肠干细胞。
图6示出了通过用与Alexa Fluor 488偶联的UEA-1/抗生蛋白链菌素和与AlexaFluor 594偶联的抗OCT4抗体对肿瘤组织双标记获得的在使用z-堆叠方法之后经过调整的共焦显微图像。左上象限对应于由抗OCT4抗体标记的细胞，左下象限对应于未标记的细胞，并且右下象限对应于由UEA-1标记的细胞。右上象限对应于由UEA-1和抗OCT4抗体双标记的细胞。右上象限中细胞的存在指示16.6％结肠直肠癌干细胞的存在。
图7示出了由抗OCT4抗体和UEA-1双标记的健康组织的图像(上图)和由抗OCT4抗体和UEA-1双标记的肿瘤组织的图像，其中大量结肠直肠癌干细胞存在(下图)。健康组织没有双标记，而在肿瘤组织中标记众多细胞(在实际获得的图像中是深棕色斑点)。
图8至11示出了罹患不同发展阶段的结肠直肠癌的患者的肿瘤组织切片上的组织化学标记的结果，对应于实施例3中所描述的回顾性临床研究。
图8示出了对于已经存活的罹患I期结肠直肠癌的患者(良好病例，患者I)和并未存活的罹患I期结肠直肠癌的患者(不良病例，患者II)所获得的结果。用抗OCT4抗体(Ia和IIa)，或用抗OCT4抗体和UEA-1/ACA/木菠萝凝集素的凝集素混合物(Ib和IIb)，或用UEA-1/ACA/木菠萝凝集素的凝集素混合物(Ic和IIc)进行标记。
图9示出了对于已经存活的罹患II期结肠直肠癌的患者(良好病例，患者I)和并未存活的罹患II期结肠直肠癌的患者(不良病例，患者II)所获得的结果。用抗OCT4抗体(Ia和IIa)，或用抗OCT24抗体和UEA-1(Ib和IIb)，或用UEA-1(Ic和IIc)进行标记。
图10示出了对于已经存活的罹患III期结肠直肠癌的患者(良好病例，患者I)和并未存活的罹患III期结肠直肠癌的患者(不良病例，患者II)所获得的结果。用抗OCT4抗体(Ia和IIa)，或用抗OCT4抗体和UEA-1/ACA/木菠萝凝集素的凝集素混合物(Ib和IIb)，或用UEA-1/ACA/木菠萝凝集素的凝集素混合物(Ic和IIc)达成标记。
图11示出了对于用化学疗法治疗已经存活的罹患IV期结肠直肠癌的患者(良好病例，患者I)和并未存活的罹患IV期结肠直肠癌的患者(不良病例，患者II)所获得的结果。用抗OCT4抗体(Ia和IIa)，或用抗OCT24抗体和UEA01(Ib和IIb)，或用UEA-1(Ic和IIc)进行标记。
实施例
实施例1：组织学切片上可见的双标记
使用石蜡中的凝集素/OCT4的双标记方案：
所使用的设备：石蜡块、冰、切片机、载玻片、带有计算机的Automated Bond Max染色器(Leica Microsystems)、Leica耗材(酒精、洗涤缓冲液、ER1缓冲液、脱蜡缓冲液、标签、盖玻片、管)、5％PBS-BSA缓冲液、抗OCT4抗体(ThermoFisherScientific)、Bond Polymer Refine Red检测试剂盒(Leica)、Leica封固介质、载玻片以及显微镜。
将由编号(由病理解剖部(Pathological Anatomy Department)给予)鉴别的含有来自每个患者的CRC样品的石蜡块封装于冰中约1小时以使其冷却以有助于其切片机切片成4μm的厚度。
用于达成切片组织的最大附着的所谓的“急速冷冻”载玻片由与存在于块上的那些相同的编号鉴别。将水滴置于这些载玻片中的每一者的中心。
制造切片机切片并且置于先前沉积的水滴上。然后将载玻片置于37℃的热板上以有助于其附着并且去除过量的水。将制造的所有载玻片置于37℃的烘箱中干燥。
由连接至计算机运行软件以控制染色器的Leica Automated Bond Max染色器处理其余的操作。
在载玻片处于烘箱中的时间期间，使用染色器操作软件进行双标记操作准备，开始是核对进行操作所需要的每个产品在染色器中的水平，然后由相同的编号鉴别载玻片。产生能够进行标准化方案的标签。计算抗体的稀释度和其数量并且制备所需的各种试剂盒。注意，所使用的每个产品必须经过扫描并且在进行每个实验之前水平重置为零。
然后将标签贴附至从烘箱取出的其对应的载玻片并且将盖玻片置于每一者上以允许产品归功于接触特性而呈现于载玻片的整个表面上。
将载玻片架置于染色器中，并且在由读取器识别每个要素并且由标签上的条形码鉴别载玻片之后，开始操作。
首先，归功于Leica脱蜡产品通过加热去除石蜡，从而能够接近抗体。这个步骤以及所有其它之后继之以在先前稀释的Bond洗涤溶液10X中的三次洗涤。
这个步骤之后继之以用具有pH 6的Leica ER1缓冲液预处理5分钟，以暴露将要在这个双标记程序期间获得的抗原。
抗OCT4抗体(兔，ThermoFisher Scientific)首先以1:500施加20分钟，在5％PBS-BSA中稀释以归因于其饱和能力防止非特异性结合。
Leica Bond Polymer Refine Red检测试剂盒(具有碱性磷酸酶聚合物适配体的抗兔抗体偶联物)然后能够在红色可见光谱中归功于Fast显现这个抗体。
生物素化凝集素或生物素化凝集素的混合物，即，1:40UEA-1或由1:40UEA-1与1:400木菠萝凝集素和1:25000ACA组成的凝集素的1:3混合物，始终使用5％PBS-BSA稀释剂，施加20分钟。注意，标记的顺序对于确保操作令人满意地进行是重要的。
Bond Intense R检测试剂盒归功于起到二级抗体的作用的抗生蛋白链菌素-HRP的介入能够归因于其特性使这个或这些生物素化凝集素以棕色显现，这归功于识别生物素/抗生蛋白链菌素-HRP复合物的DAB的特性。
归功于苏木精的存在，然后进行蓝色复染步骤7分钟以确保可以鉴别整个样品。
从染色器移出载玻片。然后通过将载玻片手动浸入酒精浴中两次持续5分钟使切片复水。这个复水步骤之后继之以甲苯浴，也持续5分钟。
然后可以通过施加一滴封固介质(Leica)来封固载玻片。这种特定的介质是生物附着剂，其防止相应的标签磨损和溶解，特别是红色标签。
最后，在显微镜下观测载玻片并且在20的放大率下获取图像。
结果示于图1和2中。
由UEA-1并且由抗OCT4抗体对健康组织的双标记显示细胞双标记的不存在。因此可以推断这个组织中不存在结肠直肠癌干细胞。
数种细胞类型存在于肿瘤组织中：非干肿瘤细胞、非肿瘤干细胞、肿瘤干细胞以及非肿瘤非干细胞。用单独的UEA-1或UEA-1和抗OCT4抗体标记肿瘤组织证实凝集素UEA-1选择性地标记结肠直肠癌干细胞的能力(更深区域)。OCT4能够标记(肿瘤和非肿瘤)干细胞并且确认由UEA-1标记的细胞是结肠直肠癌干细胞。
实施例2：组织学切片上的双荧光标记
孵育一些4至6μm切片：
·在抗OCT4抗体(兔，1:200稀释)存在下在4℃下过夜，然后用PBS洗涤切片三次，并且和与Alexa Fluor 594(ThermoFisher Scientific)偶联的抗兔二级抗体一起孵育1小时；
·在生物素化UEA-1(1:200稀释)存在下在周围温度下20至30分钟，然后用PBS洗涤切片三次，并且由与Alexa Fluor 488偶联的抗生蛋白链菌素488显现30分钟；
·在抗OCT4抗体(兔，1:200稀释)存在下在4℃下过夜，然后用PBS洗涤切片三次，并且和与Alexa Fluor 594(ThermoFisher Scientific)偶联的抗兔二级抗体一起孵育1小时。然后在生物素化UEA-1(1:200稀释)存在下在周围温度下孵育切片20至30分钟，用PBS洗涤三次，并且由与Alexa Fluor 488偶联的抗生蛋白链菌素显现30分钟。
在PBS中洗涤三次之后，用DAPI(1:10000)将核染色5分钟。在水中用DAPI再洗涤3次之后，将切片封固于载玻片上并且在LSM 510META共焦显微镜(Zeiss)下使用相关联的软件检查。
结果示于图3和4中。
在健康组织(图3)中，未观测到双标记。在肿瘤组织中，对比之下，可以示出结肠直肠癌干细胞的双标记(图4，图像的亮区)。
通过共焦显微术分析和与Alexa Fluor 594偶联的抗OCT4抗体以及与AlexaFluor 488偶联的生物素化UEA-1/抗生蛋白链菌素一起孵育的细胞并且通过z-堆叠方法调整图像。
结果示于图5和6中。
在健康组织(图5)中，没有细胞加双标记，指示不存在结肠直肠癌干细胞。
在肿瘤组织中，经过调整的图像的分析能够检测由UEA-1和抗OCT4抗体双标记的细胞。这些细胞的数量代表细胞总数的16.6％。
以这些数据为基础，有可能总结出肿瘤含有能够导致复发的结肠直肠癌干细胞。证实肿瘤的侵袭性以及复发风险，因此可以总结出必须追踪并适时修改治疗。
实施例3
对罹患不同发展阶段的结肠直肠癌的100名患者的肿瘤组织进行回顾性临床研究。
这个研究的目的在于通过使用癌症干细胞的特异性凝集素进行免疫组织化学测量来验证结肠直肠癌侵袭性测试。样品有意地选自追溯到5年前的患者群以了解在研究中经过60个月的患者存活率。经过5年监测患者结果也使得有可能超出据估计是3年的化学疗法治疗的作用时间。
对于癌症的每个阶段，呈现两个实例。对于癌症干细胞标记并且对于患者在60个月后存活的阴性样品的良好病例。对于癌症干细胞标记并且对于患者未存活的阳性样品的不良病例。
对于I期结肠直肠癌的实例，患者已经去除肿瘤并且不接受化学疗法。这是用于I期结肠直肠癌治疗的常规方案。
对于II期结肠直肠癌的实例，患者已经去除肿瘤并且不接受化学疗法。这是用于呈现足够数目的外周神经节的II期结肠直肠癌治疗的常规方案。
对于III期结肠直肠癌的实例，患者已经去除肿瘤并且不接受化学疗法。这些是III期结肠直肠癌治疗的特定病例并且通常患者除了手术以外还经历化学疗法。
对于IV期结肠直肠癌的实例，患者已经去除肿瘤并且全身接受化学疗法治疗。在此处所示的不良实例中，患者在接受化学疗法治疗之前死亡。
如下进行标记：
I期结肠直肠癌
双标记：OCT4+凝集素混合物(UEA-1、木菠萝凝集素、ACA)
糖基化标记：凝集素混合物(UEA-1、木菠萝凝集素、ACA)
II期结肠直肠癌
双标记：OCT4+仅UEA-1凝集素
糖基化标记：仅UEA-1凝集素
III期结肠直肠癌
双标记：OCT4+凝集素混合物(UEA-1、木菠萝凝集素、ACA)
糖基化标记：凝集素混合物(UEA-1、木菠萝凝集素、ACA)
IV期结肠直肠癌
双标记：OCT4+仅UEA-1凝集素
糖基化标记：仅UEA-1凝集素
对于每个阶段(I、II和III)，分析能够鉴别具有阳性和阴性测试结果(呈现或不呈现癌症干细胞)的患者组。测试为从业医师提供额外的信息并且设想用于具有阳性结果的患者的特定治疗或监测。
结果示于图8至11中。

Claims (12)

1.一种识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素，有利地是UEA-1或TJA-II的用途，其作为结肠直肠癌干细胞的第一标记工具用于检测和/或定量所述结肠直肠癌干细胞。
2.根据权利要求1所述的用途，其中有识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和结肠直肠癌干细胞的至少一个第二标记工具，优选地是抗OCT4抗体。
3.根据权利要求2所述的用途，其中有识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素、抗OCT4抗体以及至少一种识别T抗原的凝集素，有利地选自ACA、ABA和木菠萝凝集素。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素的显现工具A，有利地选自发色团、荧光团以及能够还原发色底物B的酶与抗生蛋白链菌素偶联，所述识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素是生物素化的。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，其中所述抗OCT4抗体的显现工具C，有利地选自发色团、荧光团或能够还原发色底物D的酶结合至识别所述抗OCT4抗体的二级抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中结肠直肠生物样品是组织学切片。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中：
·所述生物样品是组织学切片，
·所述识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素是生物素化UEA-1，
·所述显现工具A是辣根过氧化酶，
·所述发色底物B是二氨基联苯胺，
·所述显现工具C是结合至二级抗体的碱性磷酸酶，
·所述发色底物D是3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺。
8.一种试管内检测和/或定量结肠直肠生物样品中的结肠直肠癌干细胞的方法，其包括显现由识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记的结肠直肠生物样品中的所述凝集素的步骤。
9.根据权利要求8所述的试管内检测和/或定量的方法，其包括以下步骤：
(a)在所述生物样品中用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素标记所述结肠直肠癌干细胞，以获得所述生物样品中标记的结肠直肠癌干细胞，
(b)显现所述结肠直肠生物样品中的所述凝集素，
(c)检测和/或定量所述生物组织中由所述凝集素标记的所述结肠直肠癌干细胞。
10.一种识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和可能存在的抗OCT4抗体的用途，其用于结肠直肠癌的复发风险和/或结肠直肠癌的侵袭性的试管内诊断以定义预后价值以便修改结肠直肠癌的治疗。
11.一种用于结肠直肠癌的复发风险的试管内诊断以定义预后价值以便修改结肠直肠癌的治疗的方法，其包括以下步骤：
(a3)在结肠直肠组织的组织学切片中用抗OCT4抗体标记结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学样品中的结肠直肠癌干细胞，
(b3)将步骤(a3)获得的所述组织学切片置于与结合至显现工具C的识别所述抗OCT4抗体的二级抗体接触，
(c3)显现所述抗OCT4抗体，
(d3)用识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记步骤(c3)获得的所述组织学切片的所述结肠直肠癌干细胞，以获得所述组织学切片中由所述识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和所述可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素标记的结肠直肠癌干细胞，
(e3)将步骤(d3)获得的所述组织学切片置于与结合至显现工具A的抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗生物素抗体接触，
(f3)显现所述识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的凝集素和所述可能存在的至少一种识别T抗原的凝集素，
(g3)检测和/或定量步骤(f3)获得的组织学切片中的所述结肠直肠癌干细胞，
(h3)以结肠直肠癌干细胞的存在和/或数目为基础推断结肠直肠癌的复发风险和/或侵袭性以定义预后价值以便修改结肠直肠癌的治疗。
12.一种试剂盒，其包含：
·识别岩藻糖α1-2半乳糖单元的生物素化凝集素和可能存在的至少一种识别T抗原的生物素化凝集素，有利地选自ABA、ACA和木菠萝凝集素，
·结合至辣根过氧化酶的抗生蛋白链菌素，
·抗OCT4抗体，
·结合至碱性磷酸酶的识别所述抗OCT4抗体的二级抗体。
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