CN110073218A - 用于对肿瘤样品中的细胞外基质生物标志物评分的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
通过评价具有乙酰透明质酸染色的肿瘤相关细胞外基质(ECM)的面积与样品的相关部分的整个表面积相比较，对乙酰透明质酸染色的组织样品进行评分的方法和系统。本公开的方法和系统可以用于例如选择患者用于接收特定治疗。
Description
相关申请的交叉引用
本申请在此要求2016年9月23日提交的美国临时专利申请号US 62/398,787的权益，其内容以其整体通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于对组织样品中的细胞外基质(ECM)生物标志物(诸如乙酰透明质酸)进行评分的方法和系统，以及它们在诊断和/或预后疾病和/或预测疾病对ECM指导的疗法的反应中的用途。
发明背景
许多ECM组分已经牵涉于疾病发病机理。参见Jarvelainen等人, Pharmacol Rev.,Vol. 61, Issue 2, pp.198-223 (2009)。一个实例是乙酰透明质酸(HA)。HA由于其在排卵、胚胎发育、伤口愈合和炎性疾病中的不同作用而成为有趣的事(Meyer和Palmer, 1934,J Biol Chem 107:629-34; Dicker等人, 2014, Acta Biomater 10(4):1558-1570)。最近，已经在肿瘤微环境中鉴定了HA，这使其成为癌症疗法中的有吸引力的靶标(Kultti等人, 2012, Cancers 4(3):873-903)。HA在许多实体肿瘤中积累，并与其结合分子(透明质酸粘素，由细胞外基质(ECM)蛋白聚糖和糖蛋白(例如多功能蛋白聚糖)组成，和细胞表面受体(例如CD44、RHAMM))积极相互作用(Tammi等人, Semin Cancer Biol 18:288-295;Itano和Kimata, 2008, Semin Cancer Biol 18:268-274; Simpson和Lokeshwar, 2008,Front Biosci 13:5664-5680; Toole和Slomiany, 2008, Drug Resist Updat 11:110-121; Maxwell等人, J Cell Sci 121:925-932)。这些复杂的相互作用在肿瘤细胞粘附、运动、增殖和侵袭中起作用(Toole, 2004, Nat Rev Cancer 4:528-539)。进一步，越来越多的证据证明肿瘤中异常的HA积累阻碍了标准癌症治疗的治疗效果。
有趣的是，HA的酶促耗竭可以诱导肿瘤微环境的重组，其可以显著影响肿瘤行为。多篇出版物描述了临床前研究，其中静脉内施用聚乙二醇化透明质酸酶PH20 (PEGPH20)已经与降低的组织间质液压(tIFP)、肿瘤血管扩张、增加的化疗药物的递送、肿瘤生长抑制和改善的存活相关(Toole, 2009, Clin Cancer Res 15:7462-7468; Jiang等人, 2012,Anticancer Res 32:1203-1212)。因此，一些表现出异常HA积累的癌症(例如，一些胰腺腺癌)可能受益于HA耗竭。
使用HA作为预后因素，先前在确定肿瘤中的HA含量方面的尝试未能够可重复且准确地鉴定可能受益于HA耗竭的具有肿瘤的患者。
例如，其他人已使用染色剂来评价HA，所述HA通常是异质的，不是非常特异性的和/或缺乏纯度(参见Jadin等人, 2014, Journal of Histochemistry & Cytochemistry62(9):672-83; Tengblad A, 1979, Biochim Biophys Acta 578:281-289; Tammi等人,1988, J Invest Dermatol 90:412-414; Wells等人, 1991, Acta Derm Venereol 71:232- 238; Lindqvist等人, 1992, Clin Chem 38:127-132; Lin等人, 1997, JHistochem Cytochem 45:1157-1163; Kobayashi等人, 1999, Cell Tissue Res 296:587-597; Sakai S等人, 2000, J Invest Dermatol 114:1184-1187; Baier等人, 2007,Matrix Biol 26:348-358; Clark等人, 2011, Invest Ophthalmol Vis Sci 52:6511-6521)。其他靶向与其合成(HAS1、2和3)或裂解酶(HYAL1-5和PH20)和/或其最常见受体(CD44和RHAMM)相关的HA(参见Provenzano等人, 2012, Cancer Cell 21:418–429; Jiang等人 2012, Anticancer Res. 32:1203–1212; Jacobson等人, 2003, Biochem.Biophys. Res. Commun. 305:1017–1023; Wilkinson等人, 2006, J. Cell. Physiol.2006; Kim等人, 2004, Cancer Res. 64:4569–4576; Udabage等人, 2005, Exp. CellRes. 310:205–217)。
其他HA评价的方法没有明确定义，并且主要是定性的。一些作者已经引用“HA高”vs“HA低”肿瘤，没有明确的评分或令人信服的组织病理学成像。HA染色强度用作分类为1+(低HA)至(3+高HA)的参数。没有出版物已引用2+中间HA (参见Provenzano等人, 2012,Cancer Cell 21:418–429; Kultti等人, 2014, Biomed Res Int. Article ID 817613;Hautmann等人, 2001, Journal of Urology 165:2068-2074; Whatcott等人, 2015,Clin Cancer Res 21(5) 3561-3568; de la Motte和Drazba, 2011, J Histochem andCytochem 59(3):252-257)。
定量评分方法主要通过显微照相和数字图像分析完成，这使得HA的评价更复杂。尽管病理学家对染色的载片进行注释，但难以依靠计算机化系统来区分非肿瘤相关HA表达与肿瘤相关HA表达(参见Tool, 2009, Clin Cancer Res 15:7492-7468; Provenzano等人, 2012, Cancer Cell 21:418–429; Lokeshwar等人, 2005, Cancer Res. 65:7782–7789; Kultti等人, 2014, Biomed Res Int. Article ID 817613; 还参见美国专利号8,846,034; 美国专利申请号2014/0348817)。证明那些方法不仅与临床结果数据不一致，而且不能通过病理学家对染色组织样品的常规载玻片检查进行再现。
发明概述
发明人已经令人惊讶地发现一种用于评价肿瘤样品中的HA含量的方法。该方法的特征在于评价细胞外基质(ECM)中相对于整个肿瘤表面的HA含量。注意，前面提及的参考文献的方法似乎都与总HA染色相关。所引用的参考文献无一提出依赖于ECM中的HA含量。
不希望将本发明限制于任何理论或机制，据信本发明的方法评价肿瘤中最相关的HA作用区域中的HA含量。实际上，HA通过在其ECM中积累和通过与其他基质蛋白交联而对肿瘤发挥其最有害的作用(参见Jadin等人, 2014, Journal of Histochemistry &Cytochemistry 62(9):672-83; Kultti等人, 2012, Cancers 4(3), 873-903)。
本发明的特征还在于用于帮助鉴定可能受益于特定疗法、例如HA疗法(例如，PEGPH20，参见Lokeshwar等人, 2005, Cancer Res.65:7782–7789)与护理标准疗法的组合的具有特定肿瘤类型(例如，胰腺导管腺癌(PDA)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)等)的患者的伴随诊断法。本发明的伴随诊断法利用前面提及的基于ECM的评分方法来评价HA含量。注意，由于PEGPH20对肿瘤细胞区室没有证实的直接作用，所以据信肿瘤细胞中的HA染色的不一致表达如果添加至肿瘤中的基于ECM的HA评分方法中则可能是错误选择(就预测PEGPH20作用而论)。因此，本发明的方法在HA的基于PEGPH20的酶促耗竭的最相关作用区域中评价HA。
临床结果数据支持本发明的基于ECM的HA评分方法。与HA低的患者相比，基于本发明的评分算法鉴定的HA高的患者已经表明来自HA靶向的疗法的治疗益处大于单独的护理标准。
进一步，已经证明，通过读者精确研究和多个读者训练测试，本发明的基于ECM的HA评分方法是可重复的，可训练的，并且可转移至一般病理学实践。
本发明的范围内包括本文描述的任何特征或特征组合，条件是以任何这种组合包括的特征不是相互不一致的，如从上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识将显而易见。在下面的详述和权利要求中，本发明的额外优点和方面是显而易见的。
附图简述
通过考虑结合附图呈现的以下详述，本公开的特征和优点将变得显而易见，其中：
图1显示过表达乙酰透明质酸(HA)的实体瘤的实例。
图2显示特定样本的HA染色工作流程的示意图。
图3A显示了显示高HA含量的可接受的HA染色的实例。
图3B显示了显示低HA含量的可接受的HA染色的实例。
图4A显示低HA状态。
图4B显示高HA状态。
图5说明如本文所公开的示例性HA评分系统。
图6A说明在如本文所公开的图像分析系统上执行的示例性工作流程，其中在实施ROI生成器功能之前在整个图像上实施对象鉴定功能。
图6B说明在如本文所公开的图像分析系统上执行的示例性工作流程，其中在实施ROI生成器功能之后仅对ROI实施对象鉴定功能。
图7说明可以形成如本文所公开的HA评分系统的一部分的示例性计算系统。
发明详述
本公开的特征在于用于评价或评分组织样品(例如肿瘤样品)中ECM相关分子的含量的方法和系统。
I. 定义
本文中的术语“抗体”以最广泛意义使用，且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指获得自基本上均质的抗体群体的抗体，即构成群体的单独抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生产期间产生，此类变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上均质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本公开使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示法、和利用含有人免疫球蛋白基因座的所有或部分的转基因动物的方法或其组合。
如本文所用，术语“生物标志物”应指在生物样品中发现的任何分子或分子组，其可用于表征生物样品或获得生物样品的受试者。例如，生物标志物可以是分子或分子组，其存在、不存在或相对丰度是：特定疾病状态的特征；指示疾病的严重程度或疾病进展或消退的可能性；和/或预测特定疾病状态将对特定治疗反应。
作为另一个实例，生物标志物可以是感染剂(诸如细菌、真菌、病毒或其他微生物)或其取代分子或分子组。
如本文所用，术语“样品”和“生物样品”应指从含有或怀疑含有生物标志物的受试者获得的任何组合物。该术语包括细胞、组织或血液的纯化或分离的组分，例如DNA、RNA、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。样品可以是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品，例如来自肿瘤或转移性病变，例如原发性肿瘤或转移性肿瘤。样品也可以来自先前冷冻或新鲜的组织，或来自液体样品，例如血液或血液组分(血浆或血清)，尿液，精液，唾液，痰液，粘液，精液，泪液，淋巴液，脑脊髓液，从拭子洗涤的材料等。样品还可以包括从个体获得的细胞的体外培养物的成分和组分，包括细胞系。样品也可以从直接获得自个体的样品部分加工，例如细胞裂解物或耗竭红细胞的血液。
如本文所用，术语“细胞样品”是指含有完整细胞的任何生物样品，诸如细胞培养物、体液样品或用于病理学、组织学或细胞学解释的手术样本。
如本文所用，术语“组织样品”应指细胞样品，其保留细胞之间的空间关系，因为它们存在于获得样品的受试者内。“组织样品”应当涵盖初始组织样品(即受试者产生的细胞和组织)和异种移植物(即植入受试者的外来细胞样品)两者。
如本文所用，“组织化学检测”是指涉及以允许在组织样品的结构之间的空间关系的背景下检测生物标志物或其他结构的方式用检测试剂标记组织样品中的生物标志物或其他结构的方法。实例包括亲和组织化学(AHC)、免疫组织化学(IHC)、显色原位杂交(CISH)、荧光原位杂交(FISH)、银原位杂交(SISH)和福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片的苏木精和伊红(H&E)染色。
如本文所用，术语“切片”应指适合于显微镜分析的组织样品的薄切片，其通常使用超薄切片机(microtome)切割。作为一个实例，切片可以是4至5微米厚。本公开不限于4至5微米。
如本文所用，术语“连续切片”应指从组织样品依次切割的一系列切片中的任一个。对于被认为是彼此的“连续切片”的两个切片，它们不一定需要是来自组织的连续切片，但是它们通常应当含有相同横截面关系的相同组织结构，使得结构可以在组织学染色后与彼此匹配。
如本文所用，短语“特异性结合”、“特异性地结合”或“对于…特异性”是指靶标和生物标志物特异性试剂之间的可测量和可再现的相互作用，诸如结合，其决定在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况下靶标的存在。例如，特异性结合靶标的结合实体是以比其结合其他靶标更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该靶标的抗体。在一个实施方案中，结合实体与无关靶标的结合程度小于抗体与靶标结合的约10%，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量。在某些实施方案中，特异性结合靶标的结合实体具有≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM或≤0.1 nM的解离常数(Kd)。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括，但不需要排他性结合。
如本文所用，术语“生物标志物特异性试剂”应指以允许特异性检测样品中的生物标志物的方式结合生物标志物或该生物标志物内的特定结构的任何化合物或组合物。实例包括：抗体及其抗原结合片段；和工程改造的特异性结合结构，包括ADNECTIN(基于第10FN3纤连蛋白的支架；Bristol-Myers-Squibb Co.)，AFFIBODY(基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域的支架；Affibody AB, Solna, Sweden)，AVIMER(基于结构域A/LDL受体的支架；Amgen, Thousand Oaks, CA)，dAb(基于VH或VL抗体结构域的支架；GlaxoSmithKlinePLC, Cambridge, UK)，DARPin(基于锚蛋白重复蛋白的支架；Molecular Partners AG, Zürich, CH)，ANTICALIN(基于脂质运载蛋白的支架；Pieris AG, Freising, DE)，NANOBODY(基于VHH(骆驼科动物Ig)的支架；Ablynx N/V, Ghent, BE)，TRANS-BODY(基于转铁蛋白的支架；Pfizer Inc., New York, NY)，SMIP (Emergent Biosolutions, Inc., Rockville,MD)和TETRANECTIN(基于C型凝集素结构域(CTLD)的支架，四连接素；Borean Pharma A/S,Aarhus, DK)(此类工程改造的特异性结合结构的描述由Wurch等人, Development ofNovel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging andTherapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, CurrentPharmaceutical Biotechnology, Vol. 9, pp. 502-509 (2008)综述，其内容通过引用并入本文)；和融合蛋白，至少包括能够特异性结合生物标志物的第一结构域(例如抗体的抗原结合片段或蛋白的靶标结合部分，其结合生物标志物)和适于促进检测试剂与融合蛋白的结合的第二部分(例如，生物素标记物、表位标签、Ig片段等)。
当与组织化学测定(包括免疫组织化学和亲和组织化学)结合使用时，“检测试剂”是用于在与细胞样品中的生物标志物结合的生物标志物特异性试剂附近沉积染色剂的任何试剂。非限制性实例包括能够结合生物标志物特异性抗体的二抗；与此类二抗连接的酶；和与此类酶反应以实现荧光或显色染色剂的沉积的化学品；等。
当用作名词时，术语“染色剂”应指可用于使细胞样品中的特定分子或结构可视化以用于显微镜分析(包括明场显微镜、荧光显微镜、电子显微镜等)的任何物质。当用作动词时，术语“染色”应指导致染色剂在细胞样品(例如，组织样品、细胞学样品等)上沉积的任何过程。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。个体可以是诊断前，诊断后但疗法前，经历疗法，或疗法后。在本公开的上下文中，个人通常寻求医疗护理。
术语“从个体获得样品”意味着提供来自个体的生物样品用于测试。获得可以直接来自个体，或来自直接从个体获得样品的第三方。
术语“为个体提供疗法”意味着可对个体开处方、推荐或进行疗法。该疗法实际上可以由第三方(例如，住院患者注射)或由个体自己施用于个体。
如本文所用，“肿瘤表面”应指组织切片的一部分，其特征在于基本上完全由侵入性肿瘤细胞和相关基质构成的一个或多个连续区域。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。参见，例如，Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier (第4版 2007); Sambrook等人, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”意指“一个/种或多个/种”。术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”，当在叙述步骤或要素之前时，旨在意味着进一步步骤或要素的添加是任选的并且不排除。
II. 组织化学标记和检测方法
在一个实施方案中，本文公开的评分方法在对HA进行组织化学染色的细胞样品上进行。
组织化学染色是依赖于可检测试剂在目标生物标志物附近沉积、使得可检测试剂的检测允许评估生物标志物在整个组织切片中的分布的技术。细胞化学染色是相似的，除了使用细胞学样品。此后，当使用术语“组织化学”时，应当理解“组织化学”和“细胞化学”都是意欲的，除非从上下文中清楚地看到仅意欲“组织化学”。
在一个实施方案中，使用亲和组织化学技术对样品针对HA进行组织化学染色。在亲和组织化学中，经由在促进生物标志物特异性试剂和生物标志物之间的特异性结合的条件下生物标志物特异性试剂与样品中的生物标志物的结合，将可检测试剂定位至生物标志物。由于组成身体的不同类型的组织学组织的固有性质以及靶标生物标志物的复杂性，在亲和组织化学中没有通用的“一体适用(one-size-fits-all)”染色方案。相反，全部考虑靶标生物标志物、样品类型、检测试剂和检测方案，并且修改基础组织化学方案以适应实验需求。通常，组织化学染色的工作流程如下：
a. 抗原修复(如果需要)：固定组织的过程可以导致生物标志物的“掩蔽”(即，使得所使用的检测试剂不能接近生物标志物)。为此，经常对样品进行“抗原修复方法”，其允许检测先前掩蔽的生物标志物。许多抗原修复方法是本领域已知的，并且多种抗原修复方法经常可用于相同的生物标志物。参见Shi等人, J. Histochemistry & Cytochemistry, Vol.49, Issue 8, pp. 931–37 (2001); Tacha & Teixeira, J. Histotechnology, Vol.25, Issue 4, pp. 237–42 (2002); O’Leary等人, Biotechnic & Histochemistry,Vol. 84, Issue 5, pp. 217–21 (2009)；
b. 封闭：组织切片用试剂处理以封闭非特异性染色的内源性来源，诸如酶、内源性过氧化物酶、游离醛基、免疫球蛋白和可以模拟特异性染色的其他无关分子；
c. 透化(如果需要)：将组织切片与透化缓冲液一起孵育，以促进抗体和其他染色试剂渗透至组织中；
d. 与生物标志物特异性试剂一起孵育；
e. 如果使用间接方法，则与检测试剂一起孵育。
除了这些步骤以外，可以在这些步骤各自之间进行洗涤步骤，以除去残留的试剂并防止来自一个步骤的未使用试剂与来自后续步骤的试剂相互作用的反应性。
在一个实施方案中，HA特异性试剂是基于TNF刺激的基因6 (TSG-6)的探针。TSG-6是由肿瘤坏死因子刺激的基因6编码的~30 kDa分泌的HA结合糖蛋白，其响应于各种各样细胞因子和生长因子在许多不同类型的细胞和组织中表达(Milner和Day 2003)。TSG-6在炎症和炎症样过程期间经由HA交联在富含HA的细胞外基质的形成和重塑中起关键作用(Fulop等人 2003; Milner等人 2006; Selbi等人 2006; Simpson等人 2009)。TSG-6由100个氨基酸长的N-末端HA-结合连接模块和结合纤连蛋白的C-末端CUB(补体C1r/C1s,Uegf, Bmp1)模块构成(Lee等人 1992; Kohda等人 1996; Kuznetsova等人 2008)。TSG-6HA结合连接模块对HA的高亲和力(Kahmann等人2000; Lesley等人2002)使其成为工程改造用于检测HA的同源和特异性试剂的起点。如本文所用，“基于TSG-6的探针”应指任何多肽，其：(1)含有足够部分的TSG-6蛋白以促进与人组织切片中的HA的特异性结合；和(2)含有至少一种可以促进检测试剂在组织样品上沉积的结构。
在一些实施方案中，可检测部分直接与HA特异性试剂缀合，且因此在HA特异性试剂与其靶标结合后沉积在样品上(通常被称为直接标记方法)。直接标记方法经常是更直接可定量的，但经常缺乏灵敏度。在其他实施方案中，通过使用与HA特异性试剂相关的检测试剂实现可检测部分的沉积(通常被称为间接标记方法)。间接标记方法增加可以在HA特异性试剂附近沉积的可检测部分的数目，且因此经常比直接标记方法更灵敏，特别是当与染料组合使用时。
亲和组织化学的检测方案通常分为“直接”和“间接”方法。直接检测是最快和最短的IHC方案，其需要组织切片仅与缀合至所选荧光团的一抗孵育。直接检测可能更好地适合于检测强烈、高度表达的组织抗原。例如，当由于一抗的宿主物种和组织的组织学性质而使用二级检测抗体可能引起强烈的非特异性染色时，直接检测可以是所选的技术。间接检测通常比直接检测更灵敏。间接检测的更高灵敏度是用荧光团标记的两种二抗与结合至其组织靶标的一抗的单一分子相互作用的可能性的结果。间接检测允许选择二抗与不同颜色、斯托克斯位移、量子产率和抗褪色性的荧光团的能力。
在一个实施方案中，基于TSG-6的探针是具有抗体的Fc区(诸如山羊Fc、兔Fc、小鼠Fc或大鼠Fc)的融合蛋白。用作HA特异性检测试剂的示例性TSG6融合体公开于Jadin等人,J. Histological Cytochem., Vol. 62, Issue 9, pp.672–83 (2014)，其内容以其整体通过引用并入本文。Fc区允许传统的二抗用作检测试剂以促进染料的沉积。在一个具体实施方案中，HA特异性检测试剂是TSG6-兔Fc融合体。当TSG6-Fc融合体与组织切片中的HA结合时，TSG6-Fc融合体通过介导可检测部分沉积在TSG6-Fc融合体紧密附近来促进HA的检测。
在一些实施方案中，间接方法与TSG6-Fc融合体一起使用，其中当与组织切片结合时，可检测部分经由定位于TSG6-Fc融合体的酶促反应而沉积。用于此类反应的合适的酶是众所周知的，并且包括但不限于氧化还原酶、水解酶和过氧化物酶。明确包括的特定酶是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶和β-内酰胺酶。所述酶可以直接与基于TSG6的HA特异性试剂缀合，或者可以经由标记缀合物与基于TSG6的HA特异性试剂间接结合。如本文所用，“标记缀合物”包括：
(a) 特异性检测试剂；和
(b) 与特异性检测试剂缀合的酶，其中所述酶在适当的反应条件下与显色底物、信号传导缀合物或酶反应性染料反应，以实现染料的原位生成和/或染料在组织样品上的沉积。
在非限制性实例中，标记缀合物的特异性检测试剂可以是二级检测试剂(诸如能够特异性结合TSG6-Fc融合体的Fc区的物种特异性二抗)，三级检测试剂(诸如对于与TSG6-Fc融合体结合的二抗特异性的物种特异性三级抗体，对于与TSG6-Fc融合体结合的半抗原缀合的二抗特异性的抗半抗原抗体，或能够结合与TSG6-Fc融合体结合的生物素化的二抗的生物素结合蛋白)或其他此类排列。因此定位于样品结合的TSG6-Fc融合体的酶则可以以多种方案用于沉积可检测部分。
在一些情况下，所述酶与显色化合物/底物反应。显色化合物/底物的具体非限制性实例包括4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、坚牢红、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑鎓(NBT)、BCIP/NBT、坚牢红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四唑鎓(INT)、四唑鎓蓝或四唑鎓紫。
在一些实施方案中，所述酶可用于金相检测方案中。金相检测方法包括使用酶诸如碱性磷酸酶与水溶性金属离子和酶的氧化还原无活性底物的组合。在一些实施方案中，通过所述酶将底物转化为氧化还原活性剂，并且氧化还原活性剂还原金属离子，使其形成可检测的沉淀物(参见，例如，2004年12月20日提交的美国专利申请号11/015,646，PCT公开号2005/003777和美国专利申请公开号2004/0265922；其各自以其整体通过引用并入本文)。金相检测方法包括使用氧化-还原酶(诸如辣根过氧化物酶)以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂，再次形成可检测的沉淀物。(参见，例如，美国专利号6,670,113，其以其整体通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，酶促作用发生在酶和染料本身之间，其中反应将染料从非结合物质转化为沉积在样品上的物质。例如，DAB与过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶)的反应氧化DAB，使其沉淀。
在还有其他实施方案中，经由包含潜在反应性部分的信号传导缀合物沉积可检测部分，所述潜在反应性部分被配置为与所述酶反应以形成可以结合样品或其他检测组分的反应性物质。这些反应性物质能够与其生成附近(即靠近酶)的样品反应，但迅速转化为非反应性物质，使得信号传导缀合物不会沉积在远离沉积酶的位点的位点处。潜在反应性部分的实例包括：醌甲基化物(QM)类似物，诸如WO2015124703A1中描述的那些，和酪酰胺缀合物，诸如WO2012003476A2中描述的那些，其各自以其整体通过引用并入本文。在一些实例中，潜在反应性部分直接与染料缀合，所述染料诸如N,N’-双羧基戊基-5,5’-二磺酸根-吲哚-二羰花菁(Cy5)、4-(二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、四甲基罗丹明(DISCO紫)和罗丹明110(罗丹明)。在其他实例中，所述潜在反应性部分与特异性结合对的一个成员缀合，并且染料与特异性结合对的另一个成员连接。在其他实例中，所述潜在反应性部分与特异性结合对的一个成员连接，并且酶与特异性结合对的另一个成员连接，其中所述酶(a)与显色底物反应以实现染料的生成，或(b)与染料反应以实现染料(诸如DAB)的沉积。特异性结合对的实例包括：
(1) 与潜在反应性部分连接的生物素或生物素衍生物(诸如脱硫生物素)，和与染料或与显色底物反应或与染料反应的酶(例如，当染料是DAB时与生物素结合蛋白连接的过氧化物酶)连接的生物素结合实体(诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、去糖基化的抗生物素蛋白(诸如NEUTRAVIDIN)或在其生物素结合位点处具有硝化酪氨酸的生物素结合蛋白(诸如CAPTAVIDIN)；
(2) 与潜在反应性部分连接的半抗原，和与染料或与显色底物反应或与染料反应的酶(例如，当染料是DAB时与生物素结合蛋白连接的过氧化物酶)连接的抗半抗原抗体。
特别包括表1中列出的TSG6-Fc融合体和检测试剂组合的非限制性实例。
在一个具体实施方案中，表1中列出的2°Fc-特异性检测试剂是抗体。在另一个实施方案中，所述TSG6-Fc融合体是TSG6-兔Fc融合体，且所述2° Fc-特异性检测试剂是抗兔Ig抗体。
适合于与本方法一起使用的商业可得的检测试剂或包含检测试剂的试剂盒的非限制性实例包括：VENTANA ultraView检测系统(与酶(包括HRP和AP)缀合的二抗)；VENTANAiVIEW检测系统(生物素化的抗物种二抗和链霉抗生物素蛋白缀合的酶)；VENTANAOptiView检测系统(OptiView)(与半抗原缀合的抗物种二抗和与酶多聚体缀合的抗半抗原三抗)；VENTANA扩增试剂盒(未缀合的二抗，其可以与任何上述VENTANA检测系统一起使用，以扩增在一抗结合位点处沉积的酶的数目)；VENTANA OptiView扩增系统(与半抗原缀合的抗物种二抗，与酶多聚体缀合的抗半抗原三抗，以及与相同半抗原缀合的酪酰胺。在使用中，使二抗与样品接触以实现与一抗的结合。然后将样品与抗半抗原抗体一起孵育以实现酶与二抗的结合。然后将样品与酪酰胺一起孵育以实现额外的半抗原分子的沉积。然后将样品再次与抗半抗原抗体一起孵育以实现额外的酶分子的沉积。然后将样品与可检测部分一起孵育以实现染料沉积)；VENTANA DISCOVERY, DISCOVERY OmniMap, DISCOVERYUltraMap抗半抗原抗体，二抗，色原，荧光团和染料试剂盒，其各自都可得自VentanaMedical Systems, Inc. (Tucson, Arizona)；PowerVision和PowerVision+ IHC检测系统(二抗与HRP或AP直接聚合成携带高比率的酶与抗体的紧密聚合物)；和DAKO EnVision™+系统(与二抗缀合的酶标记的聚合物)。
III. 评分方法
评分系统的基本特征由Crissman等人提出，且包括以下：(1)评分系统应当是可定义的，(2)其应当是可重复的，并且(3)其应当产生有意义的结果。Gibson-Corley等人还描述了用于适当的评分系统和数据评估的一些关键原则：“掩蔽”实验材料以减少有价值评分的主观性；对所有组织/载片进行彻底的“检查”，其中创建用于对组织病变评分的背景；指定“病变参数”，然后其可以用作评分类别；使用清楚的“评分定义”将改善对呈现的数据的理解并增加评分系统的可重复性；只要可能，使用“解释一致性”，其意味着所有样品在合理的时间段内由同一科学家评分。
半定量评分系统被广泛用于将组织病理学家对IHC-标志物表达的主观感知转换为定量数据，然后将其用于统计分析和建立结论。在没有评分系统的情况下，接收数据的描述可以仅以主观感知提供，以形容词诸如“强”、“弱”、“不存在”(其中修饰语为“更多”或“更少”)表示。每个病理学家在检查载片的同时都使用这种方法，但在没有转换成评分系统的情况下，它们仅仅是仅一个病理学家的评价的主观表达。为了减少主观性，推荐在研究中具有至少多于一个观察者。
大多数半定量评分系统通常包括多种参数，其被单独定量并最终组合在总评分中。然后可以通过统计检验来比较不同实验组的评分。参数的选择可以基于科学假设或问题以及在实验中使用的IHC标志物的表达的形态学特征。到目前为止定义标准化IHC评分中的“黄金标准”用于仅评估3种标志物：Her2/neu、雌激素(ER)和孕酮(PgR)，对其已开发了测试指南。对于许多IHC标志物，科学家设计了单独的评分系统。
本文公开的评分和染色方法可用于对ECM组分评分。在一个实施方案中，ECM组分是疾病状态的生物标志物。可用作疾病状态生物标志物的示例性ECM组分公开于Jarvelainen等人, Pharmacol Rev., Vol. 61, Issue 2, pp.198-223 (2009)，其内容以其整体通过引用并入本文。在示例性实施方案中，ECM组分用作人类疗法的预测性生物标志物，诸如伴随诊断法。在一个具体实施方案中，本公开的评分方法可用于对特定ECM组分进行评分，作为对ECM修饰疗法的反应的预测生物标志物。
在一些实施方案中，ECM-相关分子是透明质酸(HA)。据估计，所有实体瘤的近似20-30%在不同程度上过表达HA。图1显示特征在于异常HA表达的肿瘤的非限制性实例。本公开还特征在于对乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、膀胱肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤等中的HA进行评分。
在一个具体实施方案中，本公开的评分方法特征在于评价细胞外基质(ECM)中相对于整个肿瘤表面的HA含量(或其他适当的ECM生物标志物含量)。本公开的评分方法包括鉴定肿瘤表面(TS)。鉴定肿瘤表面涉及鉴定肿瘤细胞和相关基质(例如，在H&E载片上)。注意，器官囊区域和纤维化假囊区域不应包括在肿瘤表面，也不应包括坏死区域。包埋在肿瘤中的非肿瘤相关结构，诸如肌肉、胶原束、脂肪组织和神经，通常可能表达HA。它们被认为是肿瘤表面的一部分；然而，这些非肿瘤相关结构内的HA表达未评分。如本文所用，“肿瘤相关细胞外基质”或“肿瘤相关ECM”应指肿瘤表面内的ECM区域，其与包埋在肿瘤中的非肿瘤相关结构无关。该方法可以进一步包括证实阴性对照运行(例如，连续切割切片上的染色载片)不展现可能干扰HA读数的非特异性中等或强背景。本领域普通技术人员可以确定非特异性背景的水平(例如，不干扰HA解释的可接受的微弱至弱的弥漫性和非特异性背景)。该方法进一步包括估计HA染色的细胞外基质(在高于背景的任何强度水平)相对于整个肿瘤表面的百分比。
本公开的评分方法可以包括使HA在组织(例如，肿瘤)样品中可见，例如通过将组织样品针对HA染色，以及测定相对于背景具有任何强度的HA染色(例如，HA的弱(1+)染色，HA的中等(2+)染色或HA的强(3+)染色)的细胞外基质(ECM)的面积除以整个肿瘤表面的面积作为百分比以产生HA评分。公式1反映了前面提及的方法。
其中面积(ECM)是具有高于背景的任何强度的HA染色的肿瘤相关细胞外基质的面积，并且面积(TS)是肿瘤表面的总表面积。
参考下面的公式2，可以测定HA评分，其与公式1相比稍微不同。例如，在一些实施方案中，通过取如下的总和来计算HA评分：(1)作为百分比的具有HA的弱(1+)染色的肿瘤相关ECM的面积相比于肿瘤表面的面积；(2)作为百分比的具有HA的中等(2+)染色的肿瘤相关ECM的面积相比于肿瘤表面的面积；和(3)作为百分比的具有HA的强(3+)染色的肿瘤相关ECM的面积相比于肿瘤表面的面积。公式2反映了该计算。
其中：
·面积(ECM w/ 1+)是具有1+的HA染色强度的肿瘤相关细胞外基质的面积；
·面积(ECM w/ 2+)是具有2+的HA染色强度的肿瘤相关细胞外基质的面积；
·面积(ECM w/ 3+)是具有3+的HA染色强度的肿瘤相关细胞外基质的面积；且
·面积(TS)是肿瘤表面的总表面积。
当在如本文所述的系统上实施公式2时，“1+”、“2+”和“3+”类别可以被“低”、“中”和“高”HA染色强度或如用户所期望的其他染色强度的细分所替代。
尽管数学上公式1和公式2计算相同的HA评分，但个体(例如，病理学家)使用公式1和公式2对HA含量评分的过程是不同的，例如，在公式1中，病理学家寻找肿瘤相关ECM中高于背景的任何HA染色，而在公式2中，病理学家首先寻找肿瘤相关ECM中的弱HA染色，然后寻找肿瘤相关ECM中的中等HA染色，且然后寻找肿瘤相关ECM中的强HA染色(尽管不一定按该顺序)。如果通过一个公式相比于另一个公式进行评估，则这些过程中的细微差异可能引起HA评分略微不同。
图2显示特定样本的工作流程的示意图。作为一个非限制性实例，在一些实施方案中，组织样品取自患者并固定(例如，在NFB或其他适当的系统中)并包埋在石蜡中。将样品的切片封固在显微镜载片上。一个切片(或多个切片)用H&E染色。如果H&E染色是可接受的，则将一个切片针对HA进行染色，并且在相同的染色运行中对另一个切片进行染色用于阴性对照(例如，用蛋白酶阴性试剂对照染色)。如果必要，其他组织对照(例如，正常皮肤、正常肝脏等)在与患者载片相同的运行中进行染色以充当组织对照。如果组织对照是可接受的并且阴性对照是可接受的，则评估HA载片。如果HA载片是可接受的，则病理学家使用根据本公开的评分方法评估样品。
作为评估组织对照的实例，对于肝脏对照组织，可接受的染色将显示肝细胞中的无HA含量和门静脉空间中的任何HA含量(以任何强度)。在一些实施方案中，不可接受的染色将显示肝细胞中的任何HA含量和/或肝脏组织的过度非特异性背景染色。图3A显示了显示高HA含量的可接受的HA染色的实例：在上基部角质形成细胞中存在低至中等HA含量并且在皮肤真皮中存在高HA染色。图3B显示了显示低HA含量的可接受的HA染色：在门静脉空间中存在HA含量并且在肝细胞中无HA染色。
可以将样品的HA评分与特定阈值进行比较。例如，如果样品的HA评分大于(或等于)阈值，则可以将样品指定为具有高HA评分。或者，如果样品的HA评分小于(或在一些情况下等于)阈值，则可以将样品指定为具有低HA评分。可以使用适当数据诸如临床数据来确定阈值。阈值可以根据生物标志物和/或癌症类型而不同。在一些实施方案中，阈值为50%(例如，对于胰腺导管腺癌)。例如，特定肿瘤(例如，胰腺导管腺癌)中50%或更高(例如，大于或等于50%)的评分可以被指定为高HA。在一些实施方案中，特定肿瘤(例如，胰腺导管腺癌)中小于50%的评分可以被指定为低HA。本公开不限于这些阈值。例如，大于或等于25%的评分可以被指定为高HA，并且小于25%的评分可以被指定为低HA。或者，大于或等于75%的评分可以被指定为高HA，并且小于75%的评分可以被指定为低HA。进一步，这些阈值对于其他肿瘤类型可能是不同的。例如，对于肿瘤类型诸如胃癌或肺癌，25%或更高的HA评分可以被认为是高HA，而对于胰腺肿瘤，大于或等于50%的评分可以被认为是高HA。截止值或阈值可以通过对从群组获得的评分的技术评价或其他适当手段来确定。
如前所讨论，本公开的基于肿瘤相关ECM的HA评分方法由临床结果数据支持。与HA低的患者相比，基于本公开的评分算法鉴定的HA高的患者已经表明来自HA靶向的疗法的治疗益处大于来自单独的护理标准的治疗益处(参见表2)。
进一步，已经证明，通过读者精确研究和多个读者训练测试，本公开的基于ECM的HA评分方法是可重复的，可训练的，并且可转移至一般病理学实践(参见表2、表3；OPA =总体百分比一致性；APA =平均阳性一致性；ANA =平均阴性一致性；[a] 95% CI = 使用来自5,000个自举样品的百分位数自举方法计算的双侧95%置信区间)。
本公开还特征在于用于帮助鉴定可能受益于特定疗法，例如HA疗法(例如，PEGPH20)的具有特定肿瘤类型(例如，乳腺肿瘤、肺肿瘤(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤(包括胰腺导管腺癌(PDA))、胃肠道肿瘤、泌尿生殖道肿瘤等)的患者的预测诊断法。本公开的预测诊断法利用前面提及的基于ECM的评分方法来评价HA含量。高HA评分可以指示可以受益于HA疗法(例如，PEGPH20)的患者，例如可能更可能受益于抗HA疗法的患者。或者，低HA评分可以指示可能不受益于HA疗法的患者。通常，HA疗法用于改善其他抗肿瘤治疗实体(诸如化学治疗剂、放射疗法或靶向治疗剂)的效力，且因此通常与此类抗肿瘤治疗实体共同施用或在施用其他抗肿瘤治疗实体之前不久施用。
IV. HA评分系统
在一个实施方案中，对本方法进行手动评分。在另一个实施方案中，评分方法可以在评分系统上实施，所述评分系统适于从针对HA组织化学染色的组织切片的一个或多个数字图像计算HA评分。示例性HA评分系统在图5中说明。
HA评分系统包括图像分析系统100。图像分析系统100可以包括一个或多个计算设备，诸如台式计算机、膝上型计算机、平板电脑、智能电话、服务器、专用计算设备或能够执行本文描述的技术和操作的任何其他类型的电子设备。在一些实施方案中，图像分析系统100可以作为单个设备实施。在其他实施方案中，图像分析系统100可以实现为两个或更多个设备的组合，其一起实现本文所讨论的各种功能。例如，图像分析系统100可以包括一个或多个服务器计算机和一个或多个客户计算机，其经由一个或多个局域网和/或广域网诸如因特网与彼此通信地耦合。
如图5中所说明，图像分析系统100可以包括存储器115、处理器116和显示器117。存储器115可以包括任何类型的易失性或非易失性存储器的任何组合，所述存储器诸如随机存取存储器(RAM)，只读存储器，诸如电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、闪存、硬驱动器、固态驱动器、光盘等。为了简洁目的，存储器115在图5中被描绘为单个设备，但应理解，存储器115也可以分布在两个或更多个设备上。
处理器116可以包括任何类型的一个或多个处理器，诸如中央处理单元(CPU)，图形处理单元(GPU)，专用信号或图像处理器，现场可编程门阵列(FPGA)，张量处理单元(TPU)，等等。为了简洁目的，处理器116在图5中被描绘为单个设备，但应理解，处理器116也可以分布在任何数目的设备上。
显示器117可以使用任何合适的技术(诸如LCD、LED、OLED、TFT、等离子等)实施。在一些实施方式中，显示器117可以是触敏显示器(触摸屏)。
如图5中所说明，图像分析系统100还可以包括对象鉴定器110，目标区域(ROI)生成器111，用户界面模块112和评分引擎114。尽管这些模块在图5中被描绘为独立模块，对于本领域普通技术人员显而易见的是，每个模块可以替代地作为多个子模块实施，并且在一些实施方案中，任何两个或更多个模块可以组合成单个模块。此外，在一些实施方案中，系统100可以包括为了简洁起见在图5中未描绘的额外引擎和模块(例如，输入设备、联网和通信模块等)。此外，在一些实施方案中，可以禁用或省略图5中描绘的方框中的一些。如下面将更详细讨论，系统100的一些或所有模块的功能可以在硬件、软件、固件中或作为其任何组合来实施。可用于实施如本文公开的模块的示例性商业可得软件包包括VENTANAVIRTUOSO；Definiens TISSUE STUDIO，DEVELOPER XD，和IMAGE MINER；和VisopharmBIOTOPIX，ONCOTOPIX，和STEREOTOPIX软件包。
在获取图像之后，图像分析系统100可以将图像传递至对象鉴定器110，其执行一组计算机可执行指令以鉴定和标记后来将用于评分的图像内的相关对象和其他特征。对象鉴定器110可以从每个图像中提取(或生成)表征图像中的各种对象的多个图像特征以及表示生物标志物的表达的像素。提取的图像特征可以包括例如纹理特征，诸如Haralick特征、词袋特征等。多个图像特征的值可以组合成高维向量，下文中称为表征生物标志物的染色图案的“特征向量”。例如，如果对于每个对象和/或像素提取M个特征，则每个对象和/或像素可以通过M维特征向量表征。对象鉴定器110的输出有效地是图像的地图，其注释目标对象和像素的位置，并将那些对象和像素与描述对象或像素的特征向量相关联。
由对象鉴定器110提取的特征可以包括足以鉴定样品中的对象(诸如膜、核、细胞、ECM等)并且将样品的ECM分类为HA阳性、HA阴性或基于相对强度的特征或特征向量。由于HA仅在定位于肿瘤相关ECM时进行评分，所以由对象鉴定器110提取的特征可以包括与鉴定以下相关的特征：(1)与肿瘤相关ECM相关的像素；和/或(2)与肿瘤相关ECM相关的像素的HA强度。在一个示例性实施方案中，对于每个像素，由对象鉴定器110生成特征向量，所述特征向量包括：(1)该像素是否与ECM相关；和(2)HA染色通道中的像素强度是高于还是低于对应于背景强度的阈值水平。在另一个示例性实施方案中，由对象鉴定器110生成的特征向量包括：(1)该像素是否与肿瘤相关的ECM相关；和(2)HA染色通道中的像素强度是否在选自以下的预定范围内：背景强度或以下；低(或1+)强度；中等(或2+)强度；和高(或3+)强度。从图像中提取并并入特征向量中的精确特征将取决于所应用的分类函数的类型，并且对于本领域普通技术人员是众所周知的。
图像分析系统100还可以将图像传递至ROI生成器111。用户访问ROI生成器111以鉴定将从其计算ECM评分的图像的一个或多个ROI。在其中对象鉴定器110未应用于整个图像的情况下，由ROI生成器111生成的一个或多个ROI还可以用于定义在其上执行对象鉴定器110的图像的子集。在一个实施方案中，ROI发生器111的输出是ROI，其包含肿瘤表面，基本上由肿瘤表面组成或由肿瘤表面组成。
在一个实施方案中，可以通过用户界面模块112访问ROI生成器111。HA染色的样品(或HA染色的样品的形态学染色的连续切片)的图像显示在用户界面模块112的图形用户界面上，并且用户注释图像中被视为ROI的一个或多个区域。在该实例中，ROI注释可以采用多种形式。例如，用户可以手动定义ROI(以下被称为“手动ROI注释”)。在其他实例中，ROI生成器111可以帮助用户注释ROI (被称为“半自动化ROI注释”)。例如，用户可以描绘数字图像上的一个或多个区域，然后系统自动将其转换为完整的ROI。例如，如果期望的ROI是肿瘤表面，则用户描绘肿瘤表面，并且系统通过例如使用计算机视觉和机器学习来鉴定相似的形态学区域，其然后可以通过用户来接受、拒绝或修改。在其他实施方案中，ROI生成器111可以在没有来自用户的任何直接输入的情况下(例如，通过将组织分割功能应用于未注释的图像)自动建议ROI，然后用户可以选择接受、拒绝以支持手动ROI，或编辑ROI和/或附加用户认为适当的额外ROI区域。用于注释ROI的其他排列同样是可能的，并且不应将本公开的范围视为限制ROI可被注释的方式。
在一些实施方案中，ROI生成器111还可以包括注册功能，由此在一组连续切片的一个切片中注释的ROI被自动转移至该组连续切片的其他切片。当与HA结合分析生物标志物时，或者当H&E染色的连续切片与HA标记的切片一起提供时，该功能是特别有用的。因此，例如，基于形态学的ROI可以在H&E染色的组织切片的图像中注释，并且注释的ROI被自动注册至HA染色的连续切片。
对象鉴定器110和ROI生成器111可以以任何顺序实施。例如，对象鉴定器110可以首先应用于整个图像。当实施ROI发生器111时，可以然后存储且后来调用所鉴定的对象的位置和特征。在这样的布置中，可以在生成ROI后立即由评分引擎114生成评分。这种工作流程在图6A中说明。如从图6A可以看出，获得具有不同对象的混合物的图像(由深色椭圆和深色菱形说明)。在实施对象鉴定任务之后，鉴定图像中的所有菱形(由空心菱形说明)。当ROI附加至图像(由虚线说明)时，只有位于ROI区域中的菱形包括在ROI的度量计算中。然后计算特征向量，包括特征度量和评分函数使用的任何额外度量。或者，可以首先实施ROI发生器111。在该工作流程中，对象鉴定器110可以仅在ROI上实施(其使计算时间最小化)，或者它仍然可以在整个图像上实施(这将允许进行运行中调整，而不重新运行对象鉴定器110)。这种工作流程在图6B中说明。如从图6B可以看出，获得具有不同对象的混合物的图像(由深色椭圆和深色菱形说明)。ROI附加至图像(由虚线说明)，但尚未标记任何对象。在ROI上实施对象鉴定任务之后，ROI中的所有菱形都被鉴定(通过空心菱形说明)，并包括在ROI的特征度量计算中。然后计算特征向量，包括特征度量和评分函数使用的任何额外度量。还可能同时实施对象鉴定器110和ROI生成器111。
在已经实施对象鉴定器110和/或ROI生成器111之后，实施评分引擎114。评分引擎114计算ROI的特征度量和ROI中对象的相关度量(诸如肿瘤相关ECM内的HA阳性像素的面积，具有HA强度在多个范围(诸如“高”、“中”、“低”或“1+”、“2+”或“3+”)之一内的像素的肿瘤相关ECM的面积)。编辑ROI特征向量，包括计算的特征度量和从评分函数使用的ROI导出的任何其他变量，并且将评分函数(诸如公式1或公式2的评分函数)应用于ROI特征向量。
如图7中说明，图像分析系统可以包括用于实施各种功能的计算系统400，计算系统400包括处理资源410和非暂时性计算机可读介质420。非暂时性计算机可读介质420包括例如执行功能的指令，所述功能包括以下中的一种或多种：获得生物样本图像422；鉴定图像中的相关对象424；在图像中生成ROI426；鉴定ROI中可用于鉴定ECM空间的对象428；生成ROI的特征向量，包括一个或多个ROI度量(诸如，具有高于背景的染色强度的ROI的面积，或具有在预定强度范围(诸如与1+、2+或3+强度评分相关的数字测量的强度读数)内的染色强度的ROI的面积)430；基于特征向量计算HA评分432；和生成包括HA评分的报告434。
如图5中所描绘，在一些实施方案中，图像分析系统100可以与图像采集系统120通信地耦合。图像采集系统120可以获得样品的图像并将那些图像提供给图像分析系统100以用于分析和呈现给用户。
图像采集系统120可以包括扫描平台125，诸如可以以20x、40x或其他放大率扫描染色的载片以产生高分辨率的整个载片数字图像的载片扫描仪，包括例如载片扫描仪。在基本水平上，典型的载片扫描仪至少包括：(1)具有透镜物镜的显微镜，(2)光源(诸如卤素、发光二极管、白光和/或多光谱光源，取决于染料)，(3)在周围移动载玻片(或围绕载片移动光学元件)的机器人，(4)用于图像捕获的一个或多个数码相机，(5)控制机器人和操纵、管理和查看数字载片的计算机和相关软件。在载片上的许多不同的X-Y位置(并且在一些情况下，在多个Z平面)的数字数据由相机的电荷耦合器件(CCD)捕获，并且将图像接合在一起以形成整个扫描表面的复合图像。实现这一点的常用方法包括：
(1) 基于平铺(tile)的扫描，其中载片台或光学器件以非常小的增量移动以捕获正方形图像帧，其在较小程度上与相邻的正方形重叠。然后，捕获的正方形与彼此自动匹配以构建复合图像；和
(2) 基于行的扫描，其中载片台在采集期间在单个轴上移动以捕获多个复合图像“条带”。然后，图像条带可以与彼此匹配，以形成更大的复合图像。
各种扫描仪(荧光和明场两者)的详细概述可见于Farahani等人, Whole slide imaging in pathology:advantages, limitations, and emerging perspectives,Pathology and Laboratory Medicine Int’l, Vol. 7, p. 23–33 (June 2015)，其内容以其整体通过引用并入。商业可得的载片扫描仪的实例包括：3DHistech PANNORAMIC SCANII; DigiPath PATHSCOPE; Hamamatsu NANOZOOMER RS, HT和XR; Huron TISSUESCOPE4000, 4000XT和HS; Leica SCANSCOPE AT, AT2, CS, FL和SCN400; Mikroscan D2;Olympus VS120-SL; Omnyx VL4和VL120; PerkinElmer LAMINA; Philips ULTRA-FASTSCANNER; Sakura Finetek VISIONTEK; Unic PRECICE 500和PRECICE 600x; VENTANAISCAN COREO和ISCAN HT；和Zeiss AXIO SCAN.Z1。其他示例性系统和特征可见于例如WO2011-049608或2014年6月26日公开的美国公开专利申请号US 2014-0178169 A1，其内容以其整体通过引用并入。
由扫描平台125产生的图像可以被传输至图像分析系统100或图像分析系统100可访问的服务器或数据库。在一些实施方案中，可以经由一个或多个局域网和/或广域网自动传输图像。在一些实施方案中，图像分析系统100可以与扫描平台125和/或图像采集系统120的其他模块集成或包括在其中，在这种情况下，图像可以被传输至图像分析系统，例如，通过平台125和系统120两者都可访问的存储器。在一些实施方案中，图像采集系统120可以不与图像分析系统100通信地耦合，在这种情况下，图像可以存储在任何类型的非易失性存储介质(例如，闪存驱动器)上并且从介质下载至图像分析系统100或与其通信地耦合的服务器或数据库。在任何上述实例中，图像分析系统100可以获得生物样品的图像，其中样品可以已经附着至载片并且通过组织化学染色平台123染色，并且其中载片可以通过载片扫描仪或另一类型的扫描平台125扫描。然而，应理解，在其他实施方案中，下面描述的技术也可以应用于通过其他手段获取和/或染色的生物样品的图像。
图像采集系统120还可以包括自动化组织化学染色平台123，诸如自动化IHC/ISH载片染色机。自动化IHC/ISH载片染色机通常至少包括：染色方案中使用的各种试剂(包括生物标志物特异性试剂、检测试剂、洗涤溶液和其他辅助剂)的储器，用于将试剂分配至载片上的与储器流体连通的试剂分配单元，用于从载片除去经使用的试剂和其他废物的废物除去系统，以及协调试剂分配单元和废物除去系统的动作的控制系统。除了执行染色步骤之外，许多自动化载片染色机还可以执行辅助染色的步骤(或与执行此类辅助步骤的单独系统相容)，包括：载片烘烤(用于将样品粘附至载片)、脱蜡(也称为脱石蜡)、抗原修复、复染、脱水和清除以及盖玻片。以其整体通过引用并入本文的Prichard, Overview of Automated Immunohistochemistry, Arch Pathol Lab Med., Vol. 138, pp. 1578–1582(2014)描述了自动化IHC/ISH载片染色机及其各种特征的几个具体实例，包括intelliPATH(Biocare Medical)、WAVE (Celerus Diagnostics)、DAKO OMNIS和DAKO AUTOSTAINERLINK 48 (Agilent Technologies)、BENCHMARK (Ventana Medical Systems, Inc.)、Leica BOND和Lab Vision Autostainer (Thermo Scientific)自动化载片染色机。另外，Ventana Medical Systems, Inc.是公开用于进行自动化分析的系统和方法的许多美国专利的受让人，所述美国专利包括美国专利号5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029以及美国公开专利申请号20030211630和20040052685，其各自以其整体通过引用并入本文。商业可得的染色单元通常以以下原理之一操作：(1)开放单独的载片染色，其中载片水平放置并且试剂作为水坑分配在含有组织样品的载片的表面上(诸如在DAKO AUTOSTAINER Link 48 (Agilent Technologies)和intelliPATH (BiocareMedical)染色机上实施)；(2)液体覆盖技术，其中试剂用沉积在样品上的惰性流体层覆盖或通过沉积在样品上的惰性流体层分配(例如在VENTANA BenchMark和DISCOVERY染色机上实施)；(3)毛细管间隙染色，其中载片表面靠近另一个表面(其可以是另一个载片或盖板)放置，以产生狭窄的间隙，毛细管力通过该间隙吸收并保持液体试剂与样品接触(诸如由DAKO TECHMATE、Leica BOND和DAKO OMNIS染色机使用的染色原理)。毛细管间隙染色的一些迭代不会混合间隙中的流体(例如在DAKO TECHMATE和Leica BOND上)。在称为动态间隙染色的毛细管间隙染色的变型中，使用毛细管力将样品应用至载片，且然后平行表面相对于彼此平移以在孵育期间搅拌试剂以实现试剂混合(诸如在DAKO OMNIS载片染色机(Agilent)上实施的染色原理)。在平移间隙染色中，可平移头部定位在载片上。头部的下表面与载片间隔开足够小的第一间隙，以允许在载片平移期间由载片上的液体形成液体的弯月面。横向尺寸小于载片宽度的混合延伸部从可平移头部的下表面延伸，以限定小于混合延伸部和载片之间的第一间隙的第二间隙。在头部平移期间，混合延伸部的横向尺寸足以在通常从第二间隙延伸至第一间隙的方向上在载片上的液体中产生横向移动。参见WO2011-139978 A1。最近已提出使用喷墨技术在载片上沉积试剂。参见WO 2016-170008 A1。该自动化组织化学染色平台的列表并非旨在是全面的，并且用于进行生物标志物特异性组织化学染色的任何完全或半自动化系统可以并入自动化组织化学染色平台123中。
图像采集系统120还可以包括自动化H&E染色平台124。用于进行H&E染色的自动化系统通常以两种染色原理之一操作：批量染色(也称为“浸染(dip ‘n dunk)”)或单独的载片染色。批量染色机通常使用试剂的大桶或浴，其中许多载片同时浸没。另一方面，单独的载片染色机将试剂直接应用至每个载片，并且没有两个载片共享相同的试剂等分试样。商业可得的H&E染色机的实例包括来自Roche的VENTANA SYMPHONY (单独载片染色机)和VENTANA HE 600 (单独载片染色机)系列H&E染色机；来自Agilent Technologies的DakoCoverStainer (批量染色机)；来自Leica Biosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020小型线性染色机(批量染色机)，Leica ST5020多重染色机(批量染色机)和Leica ST5010自动染色机XL系列(批量染色机) H&E染色机。H&E染色平台124通常用于工作流程中，其中期望生物标志物染色的切片的形态学染色的连续切片。
HA评分系统可以进一步包括实验室信息系统(LIS) 130。LIS 130通常执行选自以下的一种或多种功能：记录和跟踪对样本和载片进行的过程以及从样品导出的图像，指示HA评分系统的不同组分以对样品、载片和/或图像进行特定过程，并跟踪关于应用于样品和或载片的特定试剂的信息(诸如批号、有效期、分配的体积等)。LIS 130通常至少包含含有关于样品的信息的数据库；与样品、载片和/或图像文件相关的标记物(诸如条形码(包括1维条形码和2维条形码)，射频识别(RFID)标签，附着至样品的α数字代码等)；以及通信设备，其读取样品或载片上的标记物和/或传送关于LIS 130和HA评分系统的其他组件之间的载片的信息。因此，例如，通信设备可以放置在样品处理站、自动化组织化学染色机123、H&E染色平台124和扫描平台125中的每一个处。当样品最初被处理成切片时，可以将关于样品的信息(诸如患者ID、样品类型、待在切片上执行的处理)输入通信设备中，并且为由样品产生的每个切片产生标记物。在每个后续工作站，标记物被输入通信设备(诸如通过扫描条形码或RFID标签或通过手动输入α数字代码)，并且工作站与数据库进行电子通信，以例如指示工作站或工作站操作员在该切片上执行特定过程和/或记录在该切片上执行的过程。在扫描平台125处，扫描平台125还可以用计算机可读标记物或代码对每个图像进行编码(所述计算机可读标记物或代码与从其导出图像的切片或样品回复关联)，使得当图像被发送至图像分析系统100时，待执行的图像处理步骤可以从LIS 130的数据库发送至图像分析系统和/或由LIS 130的数据库记录由图像分析系统100对图像执行的图像处理步骤。可用于本方法和系统中的商业可得的LIS系统包括例如VENTANA Vantage Workflow系统(Roche)。
V. 实施例 - 胰腺导管腺癌(PDA)中的乙酰透明质酸测定
实施例1描述了本公开的评分测定的测试。
在测试本公开的评分方法期间，使用来自细胞系和异种移植物(PC3、BxPC3和DU145)、正常人组织以及肿瘤组织样品，例如PDA，乳腺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌的多个组织样品。使用作为生物标志物特异性试剂的TSG6-兔Fc融合蛋白(TSG6-Fclb)和VENTANA OptiView DAB IHC检测试剂盒，在VENTANA BenchMark自动化载片染色系统上染色样品。亲和组织化学测定用于选择具有包含乙酰透明质酸(HA)的胰腺导管腺癌(PDA)的患者，其可以受益于PEGPH20辅助疗法，其使用的高HA和低HA之间的截止值为50%的高于背景的任何HA强度的肿瘤相关ECM染色。
图4A显示使用本公开的方法评分的样品的实例。例如，一个样品具有10%的评分，一个具有20%的评分，且一个具有30%的评分。这些样品会具有低HA状态。图4B显示使用本公开的方法评分的样品的额外实例。例如，一个样品具有50%的评分，一个具有70%的评分，且一个具有90%的评分。这些样品会具有高HA状态。
除了本文描述的那些以外，本公开的各种改变对于本领域技术人员而言，从前面的描述是显而易见的。此类修改也意欲落入所附权利要求的范围之内。本申请中引用的每个参考文献都以其整体通过引用并入本文。
尽管已经显示并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对其进行不超出所附权利要求范围的修改。因此，本公开的范围仅受以下权利要求的限制。权利要求中记载的参考编号是示例性的，并且仅为了易于由专利局审查，并且不以任何方式进行限制。在一些实施方案中，本专利申请中呈现的附图是按比例绘制的，包括角度、尺寸比率等。在一些实施方案中，附图仅是代表性的，并且权利要求不受附图的尺寸限制。在一些实施方案中，本文使用短语“包含”描述的公开的描述包括可以被描述为“由...组成”的实施方案，并且因此满足使用短语“由...组成”来请求保护本公开的一个或多个实施方案的书面描述要求。
在以下权利要求中记载的参考编号仅仅是为了易于审查本专利申请，并且是示例性的，并且不旨在以任何方式将权利要求的范围限制为具有附图中的对应参考编号的特定特征。
Claims (50)
1.通过对来自个体的肿瘤的组织样品中的乙酰透明质酸(HA)含量进行评分来鉴定HA治疗有效的所述个体的方法，所述方法包括：
(a) 通过针对HA染色所述组织样品而使所述组织样品中的HA可见；和
(b) 测定相对于背景具有任何强度的HA染色的肿瘤相关细胞外基质(ECM)的面积除以整个肿瘤表面的面积，以获得百分比以产生HA评分，其中大于或等于阈值的HA评分被指定为高HA，并且小于阈值的HA评分被指定为低HA，其中高HA评分指示HA治疗有效的个体。
2.权利要求1的方法，其中相对于背景的任何强度的染色包括HA的弱(1+)染色，HA的中等(2+)染色，和HA的强(3+)染色。
3.权利要求1的方法，其中将相对于背景具有任何强度的HA染色的肿瘤相关ECM的面积除以整个肿瘤表面的面积测定为百分比包括
(a) 分开测定(i)作为百分比的具有HA的弱(1+)染色的肿瘤相关ECM的面积相比于整个肿瘤表面的面积；(ii)作为百分比的具有HA的中等(2+)染色的肿瘤相关ECM的面积相比于整个肿瘤表面的面积；和(iii)作为百分比的具有HA的强(3+)染色的肿瘤相关ECM的面积相比于整个肿瘤表面的面积；和
(b) 计算(i)、(ii)和(iii)的总和。
4.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是乳腺、肺、前列腺、胰腺、胃肠道或泌尿生殖道的肿瘤。
5.权利要求1的方法，其中所述肿瘤表面包含肿瘤细胞和相关基质。
6.权利要求1的方法，其中所述肿瘤表面不包含坏死区域。
7.权利要求6的方法，其中非肿瘤相关基质是囊。
8.权利要求1的方法，其中背景是指不干扰HA读数的弱或不可察觉的非特异性染色。
9.权利要求1的方法，其中所述阈值是50%。
10.权利要求1的方法，其中所述HA治疗包含PEGPH20。
11.抑制患者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括：
(a) 用高乙酰透明质酸(HA)评分鉴定具有肿瘤的患者，所述高乙酰透明质酸(HA)评分如通过如下测定：
(i) 通过针对HA染色组织样品而使所述组织样品中的HA可见；和
(ii) 测定相对于背景具有任何强度的HA染色的肿瘤相关细胞外基质(ECM)的面积除以整个肿瘤表面的面积，以获得百分比以产生HA评分，其中大于或等于阈值的HA评分被指定为高HA评分；并且
(b) 将抗HA治疗施用于具有高HA评分的具有肿瘤的患者，所述抗HA治疗转化肿瘤微环境以抑制肿瘤的生长。
12.权利要求11的方法，其中所述抗HA治疗促进其他治疗进入所述肿瘤。
13.权利要求11的方法，其中所述抗HA治疗包含PEGPH20。
14.权利要求11的方法，其中所述肿瘤是乳腺、肺、前列腺、胰腺、胃肠道或泌尿生殖道的肿瘤。
15.权利要求11的方法，其中所述阈值是50%。
16.转化患者中的肿瘤的肿瘤微环境的方法，所述方法包括：
(a) 用高乙酰透明质酸(HA)评分鉴定具有肿瘤的患者，所述高乙酰透明质酸(HA)评分如通过如下测定：
(i) 通过针对HA染色所述组织样品而使所述组织样品中的HA可见；和
(ii) 测定相对于背景具有任何强度的HA染色的肿瘤相关细胞外基质(ECM)的面积除以整个肿瘤表面的面积，以获得百分比以产生HA评分，其中大于或等于阈值的HA评分被指定为高HA评分；并且
(b) 将抗HA治疗施用于具有高HA评分的具有肿瘤的患者，所述抗HA治疗通过耗竭肿瘤的ECM中的HA来转化肿瘤微环境。
17.权利要求16的方法，其中所述抗HA治疗促进其他治疗进入所述肿瘤。
18.权利要求16的方法，其中所述抗HA治疗包含PEGPH20。
19.权利要求16的方法，其中所述肿瘤是乳腺、肺、前列腺、胰腺、胃肠道或泌尿生殖道的肿瘤。
20.权利要求16的方法，其中所述阈值是50%。
21.评价肿瘤对医学治疗的可接受性的方法，所述方法包括：
(a) 通过针对ECM生物标志物染色组织样品而使肿瘤的组织样品中的细胞外基质(ECM)生物标志物可见；
(b) 测定相对于背景具有任何强度的ECM生物标志物染色的肿瘤相关ECM的面积，并将所述面积除以整个肿瘤表面的面积以获得ECM生物标志物评分；
其中大于或等于阈值的ECM生物标志物评分指示所述肿瘤是所述医学治疗可接受的，使得所述医学治疗抑制肿瘤生长，减小肿瘤大小或消除肿瘤。
22.权利要求21的方法，其中所述ECM生物标志物是乙酰透明质酸(HA)。
23.权利要求22的方法，其中所述肿瘤是乳腺、肺、前列腺、胰腺、胃肠道或泌尿生殖道的肿瘤。
24.测定肿瘤中细胞外基质(ECM)生物标志物的含量的方法，所述方法包括
(a) 通过针对ECM生物标志物染色肿瘤的组织样品而使肿瘤的组织样品中的ECM生物标志物可见；和
(b) 测定相对于背景具有任何强度的ECM生物标志物染色的肿瘤相关ECM的面积，并将所述面积除以整个肿瘤表面的面积以获得ECM生物标志物评分；
其中大于或等于阈值的ECM评分指示所述肿瘤具有高ECM生物标志物含量。
25.权利要求23的方法，其中所述ECM生物标志物是乙酰透明质酸(HA)。
26.权利要求24的方法，其中所述肿瘤是乳腺、肺、前列腺、胰腺、胃肠道或泌尿生殖道的肿瘤。
27.方法，其包括：
(a) 在针对乙酰透明质酸(HA)组织化学染色的组织切片的数字图像上注释目标区域(ROI)，其中ROI包括肿瘤表面；
(b) 在所述数字图像中检测HA的组织化学染色；和
(c) 根据公式1或公式2测定HA评分：
其中：
● 面积(ECM染色)是具有高于背景染色的HA的任何染色强度的肿瘤相关ECM的面积；
● 面积(ECM w/ 1+)是具有1+的HA染色强度的肿瘤相关ECM的面积；
● 面积(ECM w/ 2+)是具有2+的HA染色强度的肿瘤相关ECM的面积；
● 面积(ECM w/ 3+)是具有3+的HA染色强度的肿瘤相关ECM的面积；且
● 面积(TS)是ROI内肿瘤表面的总表面积。
28.权利要求27的方法，其中HA染色剂通过如下沉积：在促进TSG6-Fc1b与组织切片中的HA特异性结合的条件下使所述组织切片与TSG6和兔Fc的重组融合体(TSG6-Fc1b)接触，和在导致染料沉积在组织切片的HA附近的条件下使与组织切片结合的TSG6-Fc1b与检测试剂反应。
29.权利要求27或28的方法，其中所述组织切片是乳腺、肺、前列腺、胰腺、胃肠道或泌尿生殖道的肿瘤的切片。
30.权利要求27–29中任一项的方法，其中所述ROI由肿瘤表面组成。
31.系统，其包含：
处理器；和
存储器，其与所述处理器耦合，所述存储器用于存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令在由所述处理器执行时引起所述处理器执行操作，包括权利要求27-30中任一项的方法。
32.权利要求31的系统，其进一步包含扫描仪或显微镜，其适于捕获组织样品的数字图像并将图像传送至计算机设备。
33.权利要求31或32的系统，其进一步包含自动化载片染色机，其被编程为对组织样品的一个或多个切片针对HA进行组织化学染色。
34.权利要求31–33中任一项的系统，其进一步包含用于跟踪样品和图像工作流程的实验室信息系统(LIS)，所述LIS包含中央数据库，所述中央数据库被配置为接收和存储与所述组织样品相关的信息，所述信息包含以下中的至少一种：
● 待在组织切片上实施的处理步骤，
● 待在组织切片的数字图像上实施的处理步骤，和
● 组织切片和数字图像的处理历史。
35.非暂时性计算机可读存储介质，其用于存储由处理器实施以执行操作的计算机可执行指令，所述操作包括权利要求27-30中任一项的方法。
36.用于通过对来自个体的肿瘤的组织样品的数字图像进行评分来鉴定透明质酸(HA)指导的治疗有效的所述个体的系统，所述组织样品已经进行针对HA的亲和组织化学染色，所述系统包含：
图像分析系统，其包含处理器和与处理器耦合的存储器，所述存储器用于存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由处理器执行时，引起所述处理器执行操作，所述操作包括：
在图像内鉴定肿瘤相关细胞外基质(ECM)面积；
在图像内鉴定总肿瘤表面积；和
根据以下对图像内的像素进行分类：
像素是否在肿瘤相关ECM区域内；
像素是否具有高于第一阈值水平的强度，所述阈值水平是背景染色和HA特异性染色之间的截止值；并且
任选地，其中像素的HA染色强度下降的一组预定范围之一；并且
将一组评分规则应用于图像以计算HA评分，所述HA评分是相对于背景具有HA染色的肿瘤相关ECM的面积除以总肿瘤表面积的函数，其中高于第二阈值的HA评分可预测对HA治疗的反应。
37.权利要求36的系统，其中所述HA评分根据公式1计算：
其中：
● 面积(ECM)是具有高于背景的任何强度的HA染色的肿瘤相关细胞外基质的面积；且
● 面积(TS)是肿瘤表面的总表面积。
38.权利要求36的系统，其中一组预定HA染色强度范围包括(i)低染色强度范围，(ii)中等染色强度范围，和(iii)强染色强度范围，并且其中所述HA评分是单独除以整个肿瘤表面的面积的(i)、(ii)和(iii)各自的函数。
39.权利要求38的系统，其中所述HA评分根据公式3计算：
其中：
● 面积(ECM低)是具有低染色强度范围内的HA染色强度的肿瘤相关细胞外基质的面 积；
● 面积(ECM中)是具有中等染色强度范围内的HA染色强度的肿瘤相关细胞外基质的面积；
● 面积(ECM高)是具有强染色强度范围内的HA染色强度的肿瘤相关细胞外基质的面积；且
● 面积(TS)是总肿瘤表面积。
40.权利要求36的系统，其中所述操作进一步包括：
通过基于所述像素的HA染色强度将所述肿瘤相关ECM区域的像素转换为多种颜色之一来产生转换的图像，其中具有落在第一阈值水平之下的HA染色强度的像素具有第一颜色，并且具有落在第一阈值水平之上的HA染色强度的像素具有第二颜色，其中所述第一颜色不同于所述第二颜色。
41.权利要求36的系统，其中具有落在第一阈值水平之上的HA染色强度的像素根据其中所述像素的HA染色强度下降的一组预定范围之一进行分类，并且其中所述操作进一步包括：
通过基于所述像素的HA染色强度将所述肿瘤相关ECM区域的像素转换为多种颜色之一来产生转换的图像，其中具有落在第一阈值水平之下的HA染色强度的像素具有第一颜色，并且为每个预定范围内的像素分配与第一颜色不同并且与不同预定范围内的像素不同的颜色。
42.权利要求36–41中任一项的系统，其进一步包括与图像分析系统通信地耦合的输出设备，其中所述图像分析系统适于从所述图像分析系统发送一个或多个输出，其中所述输出包括HA评分、图像和转换的图像中的至少一种。
43.权利要求36–42中任一项的系统，其中所述系统进一步包含扫描仪，所述扫描仪适于从所述组织样品的组织切片产生数字图像，并将所述数字图像通信至所述图像分析系统或非易失性存储介质。
44.权利要求36–43中任一项的系统，其中所述系统进一步包含自动化IHC/ISH载片染色机和所述组织样品的未染色组织切片，其中所述自动化IHC/ISH载片染色机适于针对HA染色未染色的组织切片。
45.权利要求44的系统，其中所述自动化IHC/ISH载片染色机包含基于TSG-6的探针和与所述基于TSG-6的探针相容的一组特异性检测试剂。
46.权利要求45的系统，其中所述基于TSG-6的探针是TSG-6-Fc融合体。
47.权利要求46的系统，其中所述自动化IHC/ISH载片染色机包含根据表1的TSG6-Fc融合体和检测试剂的组合。
48.权利要求37或权利要求39的系统，其中所述第二阈值是50%。
49.权利要求36–48中任一项的系统，其中所述肿瘤是乳腺、肺、前列腺、胰腺、胃肠道或泌尿生殖道的肿瘤。
50.权利要求36–49中任一项的系统，其中HA指导的治疗包含PEGPH20。
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