ES2701092T5 - Procedimientos, kits y sistemas para puntuar la respuesta inmunitaria al cáncer por detección simultánea de CD3, CD8, CD20 y FOXP3 - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos, kits y sistemas para puntuar la respuesta inmunitaria al cáncer por detección simultánea de CD3, CD8, CD20 y FoxP3
Campo
Esta divulgación se refiere a procedimientos, kits y sistemas para puntuar la respuesta inmunitaria al cáncer a través del examen de linfocitos infiltrantes de tejido (TIL).
Antecedentes
Las muestras biológicas, tales como piezas de histología, se pueden examinar histopatológicamente por microscopia óptica usando iluminación de campo claro; mientras que la anatomía patológica molecular es el examen, a nivel molecular, de biomoléculas asociadas con la enfermedad. A partir de un examen histopatológico, se puede dilucidar información importante sobre el diagnóstico, pronóstico y opciones de tratamiento del paciente. Los anatomopatólogos estudian la arquitectura histopatológica, morfología tisular y/o señales asociadas con la detección de biomoléculas particulares (por ejemplo, ácido nucleico o proteínas). Varios ensayos actualmente disponibles detectan y/o cuantifican proteínas (es decir, inmunohistoquímica (IHQ)), ácidos nucleicos (es decir, hibridación in situ (ISH)), carbohidratos (es decir, histoquímica (HQ)) y enzimas (es decir, histoquímica enzimática (EHC)).
Aunque se ha establecido hace mucho tiempo la presencia de infiltrados inmunitarios de contenido variable en tumores sólidos humanos de orígenes diferentes y pacientes diferentes, el valor pronóstico de estos componentes todavía no se sabe completamente. Ha habido un cambio desde principios del siglo 21 hasta ahora en el que la inmunidad y la inflamación se consideran rasgos característicos de los cánceres. Es decir, considerando los datos publicados, es conocido que la inflamación local influye fuertemente en el desarrollo de cáncer. En un ejemplo, se ha usado la creación de una inflamación local aguda en el tratamiento adyuvante del cáncer de vejiga superficial por BCG. Este enfoque es ahora el estado de la técnica para esta neoplasia maligna. Por el contrario, se entiende que la inflamación crónica influye en la consecuencia y progresión de muchos tumores (cabeza y cuello, gástricos, colorrectales, etc.). De forma similar, las deficiencias inmunitarias se han visto como indicadores de pronóstico negativo.
Sin embargo, en vista de la técnica anterior, es deseable un sistema de análisis de imagen para el cálculo automático de una puntuación inmunológica a partir de un conjunto de imágenes de portaobjetos de IHQ múltiple o imágenes de portaobjetos con tinción fluorescente.
El documento US 2013/330325 A1 divulga la cuantificación inmunohistoquímica de células inmunitarias en una sección de tejido tumoral, en particular, por tecnología de imágenes de portaobjetos completo usando al menos un marcador biológico, lo que es indicativo de la respuesta inmunitaria de un paciente contra el cáncer. Entre otros, se divulgan procedimientos para predecir si un paciente con cáncer responde al tratamiento con quimioterapia e inmunoterapia, en los que en una muestra de tumor del paciente se determina el número de células que son positivas para CD3 y positivas para CD8 y/o positivas para granzima B. Además, se divulgan kits para evaluar la consecuencia de un tratamiento en pacientes con cáncer individuales o para la predicción de respuesta del tratamiento de un cáncer en un paciente, pero no existe divulgación de un uso de cualquiera de estos kits en un procedimiento para puntuar la respuesta inmunitaria en cáncer.
Loos (J Histochem Cytochem. 2008; 56(4):313-28) enseña procedimientos de doble tinción inmunoenzimática para diversas combinaciones de anticuerpos primarios. De acuerdo con el autor, los protocolos son adecuados para una combinación de color rojo-marrón clásica más una contratinción nuclear azul que está compuesta de actividad peroxidasa (tetraclorhidrato de diaminobencidina), actividad fosfatasa alcalina (Liquid Permanent Red) y hematoxilina.
Cimino-Mathews et al. (Human Pathology 2013; 44:2055-2063) describe la caracterización de células tumorales infiltrantes del tumor en cánceres de mama metastásicos resecados quirúrgicamente marcando inmunohistoquímicamente las células para detectar CD3, CD4, CD8, FoxP3 y CD20 en micromatrices tisulares.
Russell et al. (Head Neck Oncol. 2013; 5(3):24) divulga un estudio en el que se examinan las interacciones inmunitarias tumor-huésped en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y su relación con la infecciosidad del papilomavirus humano y la supervivencia del paciente. Se cuantifican las poblaciones de leucocitos intratumorales y que invaden los bordes (CD3, CD8, CD16, CD20, CD68, FoxP3 y HLA-DR) y se comparan con la supervivencia específica de enfermedad del paciente.
En Gannon et al. (Journal of Immunological Methods. 2009; 348:9-17) se analiza la densidad relativa de subtipos de células inmunitarias (CD3+, CD8+, CD20+, CD56+, CD68+ y FoxP3+) por inmunohistoquímica en piezas de próstata de pacientes de control y pacientes tratados con tratamiento de privación androgénica para estudiar la regulación hormonal de infiltración de células inmunitarias.
Sumario
La presente invención se define por las reivindicaciones independientes, es decir, el procedimiento de la reivindicación 1, el uso de un kit de la reivindicación 12, el sistema para puntuar de la reivindicación 13 y el procedimiento implementado por ordenador de la reivindicación 14. Las células inmunitarias que se infiltran en el microentorno tumoral (TIL) pueden limitar o promover la progresión tumoral. Pruebas crecientes demuestran que el número, tipo y localización de TIL en tumores primarios pueden tener un papel pronóstico. Estas observaciones han dado lugar al desarrollo de nuevos sistemas de puntuación potenciales derivados del contexto inmunitario en tejido y basados en la identificación y evaluación de poblaciones de linfocitos específicos. Se exploró el valor pronóstico potencial de CD3, CD8, CD20 y FOXP3 como una "inmunopuntuación" para pacientes con melanoma que utilizaría tecnología estandarizada ampliamente accesible.
El papel de la respuesta inmunitaria adaptativa en el control del crecimiento y recidiva de tumores humanos se ha estudiado ampliamente. Se ha presentado la caracterización de células inmunitarias infiltrantes de tumor en cánceres por identificación de expresión génica y tinción inmunohistoquímica in situ. Sin embargo, conjuntamente, se descubrió que los datos inmunológicos (el tipo, densidad y localización de células inmunitarias dentro de las muestras tumorales) eran un mejor factor predisponente de la supervivencia del paciente que los procedimientos histopatológicos usados actualmente para estadificar, por ejemplo, el cáncer colorrectal. Los resultados se validaron en dos poblaciones de pacientes adicionales. Estos datos apoyan la hipótesis de que la respuesta inmunitaria adaptativa influye en el comportamiento de los tumores humanos. Por lo tanto, el análisis in situ de células inmunitarias infiltrantes de tumor puede ser una herramienta de pronóstico valiosa en el tratamiento de cáncer colorrectal y posiblemente otras neoplasias malignas.
La evolución natural de un tumor incluye las fases de crecimiento "in situ", invasión, extravasación y metástasis. Durante estas fases, las células tumorales interactúan con su microentorno y se ven influenciadas por señales que vienen de células estromales, endoteliales, inflamatorias e inmunitarias. De hecho, a menudo los tumores se infiltran por diversas cantidades de linfocitos, macrófagos o mastocitos. En general, se cree que los últimos producen factores que mantienen la inflamación crónica y promueven el crecimiento tumoral, mientras que los linfocitos pueden controlar la consecuencia del cáncer, como se prueba en modelos de ratón. En este estudio, se analizan los datos de grandes cohortes de tumores humanos, que establecen claramente que la infiltración del tumor primario por linfocitos T de memoria, en particular de los tipos Th1 y citotóxicos, es el factor pronóstico más fuerte en términos de ausencia de enfermedad y supervivencia global en todos los estadios de la enfermedad clínica. Se revisan los datos que sugieren que las estructuras linfáticas terciarias adyacentes a los tumores y compuestas de células dendríticas maduras (linfocitos T y B organizados como centros germinales) pueden ser el sitio de una reacción antitumoral. Se propone una puntuación inmunológica basada en el tipo, densidad y localización de infiltrados de linfocitos como factor pronóstico novedoso, además de la estadificación de metástasis ganglionares tumorales, para predecir la supervivencia sin enfermedad y para ayudar en las decisiones relacionadas con tratamientos adyuvantes en cánceres humanos en estadio temprano.
La necesidad médica no cubierta es la capacidad de determinar qué pacientes con melanoma con infiltración ganglionar progresan a metástasis y cuáles no se basan en una medida de la respuesta inmunitaria del paciente. La práctica estándar actual es observar y seguir a estos pacientes o bien tratarlos con un tratamiento riguroso con interferón.
Como portaobjetos de IHQ múltiple, tiene las ventajas potenciales de identificar simultáneamente múltiples biomarcadores en una sección tisular a diferencia del marcaje de un único biomarcador en múltiples portaobjetos. Para apoyar al anatomopatólogo en el procedimiento de interpretación de portaobjetos de los portaobjetos de IHQ múltiple, la anatomía patológica digital puede servir para separar visualmente y puntuar cuantitativamente los biomarcadores para las células inmunitarias, tales como los diferentes tipos de linfocitos T y linfocitos B. Las siguientes referencias divulgan procedimientos para evaluar y/o puntuar tejido, pero no son adecuados para portaobjetos múltiples: Evaluación manual de microentorno tumoral con c D3, CD8, CD45R0 y FoxP3: Paolo Ascierto, "The Medical Need for an Immune Scoring/Profiling for Melanoma and Other Cancer Patients," Invited talk, Tucson Symposium, Mar 12-13, Tucson, AZ, 2013; recuento de CD3/CD8 manual/semiautomático: Galon J Costes A Sanchez-Cabo F Kirilovsky A Mlecnik B Lagorce-Pages C Tosolini M Camus M Berger A Wind P Zinzindohoue F Bruneval P Cugnenc PH Trajanoski Z Fridman WH Pages F "Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome," Science 29;313(5795):1960-4, 2006; recuento de citometría de flujo de CD8 y FoxP3: F. Stephen Hodi, "Recent Advances in Combinatorial Therapies," Invited talk, Tucson Symposium, Mar 12-13, Tucson, AZ, 2013; puntuación inmunológica de H&E: Sherene Loi, Nicolas Sirtaine, Fanny Piette, Roberto Salgado, Giuseppe Viale, Franpoise Van Eenoo, Ghizlane Rouas, Prudence Francis, John P.A. Crown, Erika Hitre, Evandro de Azambuja, Emmanuel Quinaux, Angelo Di Leo, Stefan Michiels, Martine J. Piccart y Christos Sotiriou, "Prognostic and Predictive Value of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in a Phase III Randomized Adjuvant Breast Cancer Trial in Node-Positive Breast Cancer Comparing = the Addition of Docetaxel to Doxorubicin With Doxorubicin-Based Chemotherapy: BIG 02-98," Journal of Clinical Oncology 31(7), pág. 860-867, 2013.
El obstáculo técnico ha sido cuantificar la respuesta de células inmunitarias en un portaobjetos e incorporar los marcadores inmunitarios necesarios. Para comprender totalmente el contexto de la respuesta inmunitaria actual del paciente al cáncer, se deben ver conjuntamente todas las poblaciones de marcadores tumorales, linfocitos B, linfocitos T totales, linfocitos T citotóxicos y linfocitos T reguladores, y se debe automatizar la puntuación e interpretación y debe ser escalable para funcionar de manera realista como concepto clínico.
Aunque existen procedimientos para combinar varios marcadores, hasta donde se sabe, no se ha presentado ningún ensayo en el espacio de investigación o comercial que haya incorporado estos 5 marcadores en un ensayo, aborde esta necesidad médica específica e incluya un algoritmo digital.
Se desarrolló un ensayo combinado de prototipo de investigación y el correspondiente algoritmo de puntuación digital basado en entradas clínicas, biológicas y estadísticas. Este ensayo incluye un marcador tumoral, así como 4 marcadores inmunitarios.
En consecuencia, se proporciona un procedimiento de puntuación de la respuesta inmunitaria en cáncer usando linfocitos infiltrantes de tejido como se engloba por la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una muestra con todos los restos de unión específica de CD3, CD8, CD20 y FoxP3, retirar los restos de unión específica en exceso de la muestra, detectar todos los restos de unión específica, evaluar una presencia y una distribución para todos los restos de unión específica dentro de la muestra, y puntuar el cáncer usando linfocitos infiltrantes de tejido analizando la presencia y la distribución de los restos de unión específica. Los modos de realización del procedimiento de puntuar la respuesta inmunitaria en cáncer usando linfocitos infiltrantes de tejido se engloban por las reivindicaciones 2 a 11.
También se proporciona el uso de un kit en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, para puntuar la respuesta inmunitaria en cáncer como se engloba por la reivindicación 12, comprendiendo el kit un resto de unión específica a CD3 y un reactivo de detección de CD3, un resto de unión específica a CD8 y un reactivo de detección de CD8, un resto de unión específica a CD20 y un reactivo de detección de CD20, un resto de unión específica a FoxP3 y un reactivo de detección de FoxP3 contenido en una pluralidad de recipientes, e instrucciones para la puntuación que describen la detección de CD3, CD8, CD20 y FoxP3 dentro de una muestra de tejido y la puntuación basada en una presencia y una distribución de los reactivos de detección en el tejido.
Además, se proporciona un sistema para puntuar cáncer por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, examinando una muestra de tejido dispuesta sobre un portaobjetos de vidrio como se engloba por la reivindicación 13, comprendiendo el sistema reactivos que comprenden un resto de unión específica a CD3, un reactivo de detección de CD3, un resto de unión específica a CD8, un reactivo de detección de CD8, un resto de unión específica a CD20, un reactivo de detección de CD20, un resto de unión específica a FoxP3 y un reactivo de detección de FoxP3, un aparato de tinción automatizado y un aparato de obtención de imágenes; en el que el aparato de tinción automatizado se configura para repartir los reactivos sobre el portaobjetos de manera tal que se determina específicamente una presencia y distribución de CD3, CD8, CD20 y FoxP3 y el aparato de obtención de imágenes se configura de modo que la presencia y distribución de CD3, CD8, CD20 y FoxP3 se pueden usar para generar una puntuación.
Además, se proporciona un procedimiento implementado por ordenador para contar varios tipos de células en una única pieza de tejido que se ha teñido con un ensayo múltiple de acuerdo con la reivindicación 1, como se engloba por la reivindicación 14, comprendiendo el procedimiento obtener imágenes de la única pieza de tejido que se ha teñido con el ensayo múltiple que incluye los marcadores de linfocitos CD3, CD8, CD20, FoxP3 y marcadores de detección tumoral, separar la imagen de la única pieza de tejido que se ha teñido con un ensayo múltiple en canales de imagen separados para cada marcador del ensayo múltiple, identificar regiones de interés en cada canal de imagen basándose en la información de intensidad en cada canal, en el que se retiran las regiones de baja intensidad en cada canal, y las regiones de alta intensidad representan señales celulares, generar una única imagen sustituida, en el que la imagen sustituida es una combinación de la información del canal de imagen de todos los marcadores de linfocitos, aplicar un algoritmo de detección celular, en el que el algoritmo de detección celular es un algoritmo de búsqueda de membrana o un algoritmo de búsqueda de núcleo, identificar las características de los linfocitos y combinaciones de linfocitos en cada canal de imagen o en cada imagen de canales combinados, o en una imagen transformada tal como una imagen de escala de grises o de absorbancia, o en una imagen sustituida, entrenar un algoritmo de clasificación basándose en las características de linfocitos y combinaciones de linfocitos conocidos, aplicar el algoritmo entrenado a las características de los linfocitos y combinaciones de linfocitos en cada canal de imagen o en cada imagen de canales combinados, o en una imagen transformada tal como una imagen de escala de grises o de absorbancia, o en una imagen sustituida, que se identificaron para clasificar las células detectadas como al menos una de las células positivas falsas, linfocitos T solo CD3, linfocitos T CD3 y CD8, linfocitos T FP3; y linfocitos B CD20, contar un número de cada tipo diferente de célula clasificada, y generar una puntuación de la pieza de tejido, en el que la puntuación se basa en el número de cada tipo de célula contada.
Conjuntamente, se descubrió que los datos inmunológicos (el tipo, densidad y localización de células inmunitarias dentro de las muestras tumorales) eran un mejor factor predisponente de la supervivencia del paciente que los procedimientos histopatológicos usados actualmente para estadificar el cáncer. En el cáncer colorrectal, se validaron los resultados en dos poblaciones de pacientes. Estos datos apoyan la hipótesis de que la respuesta inmunitaria adaptativa influye en el comportamiento de los tumores humanos. Por lo tanto, el análisis in situ de células inmunitarias infiltrantes de tumor puede ser una herramienta de pronóstico valiosa en el tratamiento de cáncer colorrectal y otras neoplasias malignas.
Se ha desarrollado un algoritmo y/o sistema de análisis de imagen que calcula automáticamente una puntuación inmunológica de un conjunto de imágenes de portaobjetos de IHQ múltiple y/o portaobjetos con tinción fluorescente. El algoritmo de análisis de imagen implica un procedimiento implementado por ordenador para contar varios tipos de células en una única pieza de tejido que se ha teñido con un ensayo múltiple, que comprende: obtener imágenes de la única pieza de tejido que se ha teñido con el ensayo múltiple que incluye los marcadores de linfocitos CD3, CD8, CD20, FoxP3 y marcadores de detección tumoral; separar la imagen de la única pieza de tejido que se ha teñido con un ensayo múltiple en canales de imagen separados para cada marcador del ensayo múltiple; identificar regiones de interés en cada canal de imagen basándose en la información de intensidad en cada canal, en el que se retiran las regiones de baja intensidad en cada canal, y las regiones de alta intensidad representan señales celulares; generar una única imagen sustituida, en el que la imagen sustituida es una combinación de la información del canal de imagen de todos los marcadores de linfocitos; aplicar un algoritmo de detección celular, en el que el algoritmo de detección celular es un algoritmo de búsqueda de membrana o un algoritmo de búsqueda de núcleo; identificar las características de los linfocitos y combinaciones de linfocitos en cada canal de imagen o en cada imagen de canales combinados, o en una imagen transformada tal como una imagen de escala de grises o de absorbancia, o en una imagen sustituida; entrenar un algoritmo de clasificación basándose en las características de linfocitos y combinaciones de linfocitos conocidos; aplicar el algoritmo entrenado a las características de los linfocitos y combinaciones de linfocitos en cada canal de imagen o en cada imagen de canales combinados, o en una imagen transformada tal como una imagen de escala de grises o de absorbancia, o en una imagen sustituida, que se identificaron para clasificar las células detectadas como al menos una de las células positivas falsas, linfocitos T solo CD3, linfocitos T CD3 y CD8, linfocitos T FP3; y linfocitos B CD20; contar un número de cada tipo diferente de célula clasificada; generar una puntuación de la pieza de tejido, en el que la puntuación se basa en el número de cada tipo de célula contada.
Breve descripción de los dibujos
Las FIG. 1(A) -(B) son microfotografías de un tejido de melanoma primario (A) y (B) tomadas con (A) un objetivo 20x y (B) un objetivo 40x que muestra una tinción 5-ple que detecta FoxP3 en marrón oscuro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DB" en la FIG. 1(B)), detecta CD8 en gris oscuro/negro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DGB" en la FIG. 1(B)), detecta CD3 en azul (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "B" en la FIG. 1(B)), detecta CD20 en rojo/fucsia (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "RM" en la FIG. 1(B)) y detecta S100 en verde (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "G" en la FIG. 1(A)), en las que (B) se centra en las células linfocíticas que se pueden ver a la izquierda del tumor primario.
Las FIG. 2(A) -(B) son microfotografías de un tejido de carcinoma de colon (A) y (B) tomadas con (A) un objetivo 20x y (B) un objetivo 40x que muestra una tinción 5-ple que detecta FoxP3 en marrón oscuro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DB" en la FIG. 2(B)), detecta CD8 en gris oscuro/negro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DGB" en la FIG. 2(B)), detecta CD3 en azul (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "B" en la FIG. 2(B)), detecta CD20 en rojo/fucsia (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "RM" en la FIG. 2(B)) y detecta citoqueratina (OSCAR) en verde (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "G" en la FIG. 2(B)).
La FIG. 3 es una microfotografía de un tejido de carcinoma de lengua que muestra una tinción 5-ple que detecta FoxP3 en marrón oscuro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DB"), detecta CD8 en gris oscuro/negro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DGB"), detecta CD3 en azul (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "B"), detecta CD20 en rojo/fucsia (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "RM") y detecta citoqueratina (OSCAR) en verde (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "G").
La FIG. 4 es una microfotografía de un tejido de adenocarcinoma tomada con un objetivo 20x que muestra una tinción 5-ple que detecta FoxP3 en marrón oscuro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DB"), detecta CD8 en gris oscuro/negro (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "DGB"), detecta CD3 en azul (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "B"), detecta CD20 en rojo/fucsia (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "RM") y detecta citoqueratina (OSCAR) en verde (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "G").
La FIG. 5 es una microfotografía (objetivo 20x) de un tejido de adenocarcinoma ovárico teñido (5-ple) con anticuerpos para un marcador tumoral de citoqueratina (amarillo) (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "Y") y para linfocitos T citotóxicos CD8+ infiltrantes (verde) (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "G"), que muestra además cómo se han infiltrado los linfocitos CD8 en todo el tumor.
La FIG. 6 es una microfotografía de tejido de amígdala normal teñido con anticuerpos para detectar el marcador de proliferación Ki-67 (verde) (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "G"), linfocitos T CD8+ (violeta) (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "P") y linfocitos T CD3+ (amarillo) (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "Y"). Esta imagen confirma la localización de células Ki-67+ en centros germinales con linfocitos CD8 y CD3, detectándose FoxP3 en marrón oscuro y CD8 detectado en la zona del manto circundante. Aumento x200.
La FIG. 7 es una microfotografía (objetivo 20x) de tejido de cáncer de mama que muestra un tumor en violeta (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "P"), linfocitos CD8+ infiltrantes en verde (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con una "G") y macrófagos CD68+ en azul (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "B"), y CD20 detectado en rojo (indicado de forma ejemplar por una flecha indicada con "R"). La FIG. 8(A) -(D) es (A) una microfotografía similar a la FIG. 7, separada en sus colores componentes (B) y (D); y reensamblada y seudocoloreada en (C).
La FIG. 9 es un esquema que ilustra una secuencia de trabajo del algoritmo de puntuación de acuerdo con la presente divulgación.
La FIG. 10 es un esquema que ilustra una implementación de ejemplo del algoritmo de puntuación.
La FIG. 11 (A) -(B) es un esquema que ilustra un banco de filtros (A) y un detector de anillo (B).
Descripción detallada
La presente invención se define por las reivindicaciones independientes, es decir, el procedimiento de la reivindicación 1, el uso de un kit de la reivindicación 12, el sistema para puntuar de la reivindicación 13 y el procedimiento implementado por ordenador de la reivindicación 14. Existe una necesidad médica no cubierta de desarrollar la capacidad de determinar qué pacientes con melanoma con infiltración ganglionar progresan a metástasis y cuáles no se basan en una medida de la respuesta inmunitaria del paciente. La práctica estándar actual es observar y seguir a estos pacientes o tratarlos con un tratamiento riguroso con interferón.
El obstáculo técnico ha sido cuantificar una respuesta inmunitaria que se podría ver en un portaobjetos y que incorpora los marcadores inmunitarios necesarios. Para comprender totalmente el contexto de la respuesta inmunitaria actual del paciente al cáncer, se deben ver conjuntamente las poblaciones de marcadores tumorales, linfocitos B, linfocitos T totales, linfocitos T citotóxicos y linfocitos T reguladores, y se debe automatizar la puntuación e interpretación y debe ser escalable para funcionar de manera realista como concepto clínico.
Aunque existen procedimientos para combinar varios marcadores, hasta donde se sabe, no se ha presentado ningún ensayo en el espacio de investigación o comercial que incorpore estos 5 marcadores en un ensayo, aborde esta necesidad médica específica e incluya un algoritmo digital. Este ensayo incluye un marcador tumoral, así como 4 marcadores inmunitarios.
El ensayo múltiple, junto con los algoritmos de análisis de imagen, proporcionan potencialmente un kit de herramientas para el cálculo de la puntuación inmunológica de cáncer de mama y/o melanoma. Se puede usar el informe final generado por el ordenador para apoyar el análisis clínico de la respuesta inmunitaria personal del paciente y ayudar a guiar otro tratamiento, pero se necesitan estudios adicionales para verificar esta hipótesis. TIL
Las células inmunitarias que se infiltran en el microentorno tumoral (TIL) pueden limitar o promover la progresión tumoral. Pruebas crecientes demuestran que el número, tipo y localización de TIL en tumores primarios pueden tener un papel pronóstico. Estas observaciones han dado lugar al desarrollo de nuevos sistemas de puntuación potenciales derivados del contexto inmunitario en tejido y basados en la identificación y evaluación de poblaciones de linfocitos específicos. Se exploró el valor pronóstico potencial de células positivas para una combinación de CD3, CD8, CD20 y FOXP3 como una "inmunopuntuación" para pacientes con melanoma que utilizaría tecnología estandarizada ampliamente accesible.
Se desarrolló un ensayo combinado de prototipo de investigación y el correspondiente algoritmo de puntuación digital basado en entradas clínicas, biológicas y estadísticas.
Un portaobjetos de IHQ múltiple tiene la ventaja potencial de identificar simultáneamente múltiples biomarcadores en una única sección de tejido a diferencia del marcaje de un único biomarcador en múltiples portaobjetos, lo que demuestra de este modo mucha más información dentro de una pequeña porción de tejido. Con este propósito en mente, se ha desarrollado un ensayo múltiple para proporcionar una puntuación inmunológica para pacientes con cáncer de mama y melanoma, junto con otros tipos de tumores. Para apoyar a los anatomopatólogos con el procedimiento de interpretación de portaobjetos, la anatomía patológica digital puede servir para separar visualmente y puntuar cuantitativamente los biomarcadores para las células inmunitarias, tales como los diferentes tipos de TIL.
CD3
CD3 es el "marcador universal" para linfocitos T en general. Se debe realizar otro análisis (tinción) para identificar el tipo de linfocito T, por ejemplo, linfocito T regulador o citotóxico. Un análisis de las cantidades de linfocitos T CD3+ es un buen indicio de la respuesta inmunitaria.
CD8
CD8 es un marcador específico para linfocitos T citotóxicos. Estas son las células efectoras que realmente "destruyen" células tumorales. Actúan por contacto directo para introducir la enzima digestiva granzima B en el citoplasma de células tumorales, matándolas de este modo. Por lo tanto, no solo es importante conocer sus cantidades globales sino también su localización con relación al tumor en sí. Solo las células en contacto directo con células tumorales serán eficaces en la destrucción celular.
CD20
CD20 es un marcador para linfocitos B productores de anticuerpos. Como tal, es un indicio de una respuesta inmunitaria más completamente desarrollada (madura). Las cantidades totales y la localización de estas células efectoras productoras de anticuerpos pueden ser de importancia.
FoxP3
FoxP3 es un factor de transcripción nuclear que es el marcador más específico para los linfocitos T reguladores (llamados Treg). Los Treg funcionan moderando la respuesta inmunitaria. Presumiblemente, la presencia de Treg indicaría una respuesta inmunitaria inhibidora a un tumor.
Marcadores tumorales
En tumores epiteliales (carcinomas), la tinción con citoqueratina identifica células tumorales, así como el epitelio normal. Esta información, conjuntamente con el hecho de que las células tumorales sobreexpresan de forma anómala las citoqueratinas en comparación con células epiteliales normales, permite identificar el tumor frente al tejido normal. Para tejido de melanoma de origen neuroectodérmico, el biomarcador S100 cumple un propósito similar.
Tinción primaria/azulado/contratinción
El procedimiento puede incluir aplicar un reactivo cromógeno de modo que la muestra se tiña específicamente. En particular, teñir específicamente incluye la aplicación de una tinción primaria que tiñe selectivamente porciones de la muestra a través de la adhesión asociada con hidrofobia, intercalación u otras asociaciones sin reconocimiento. Por ejemplo, la tinción con hematoxilina y eosina (tinción H&E) es bien conocida en la técnica. Se hace referencia a la solicitud de patente publicada de EE. UU. 2008/0227143 para la divulgación relacionada con tinción con hematoxilina y primaria. Se usa la tinción H&E para la evaluación de la morfología celular y es la herramienta primaria para diagnosticar patológicamente el cáncer.
Detección
El procedimiento incluye aplicar un reactivo de unión inmunohistoquímico (IHQ) o un reactivo de unión de hibridación in situ (ISH) de modo que el reactivo de unión IHQ o el reactivo de unión de ISH estén en contacto con la muestra. Se puede usar ISH para diagnosticar la presencia de una afección o anomalía genética, o una expresión excesiva o insuficiente sobre lo normal. Por ejemplo, se puede usar ISH para detectar amplificación génica, eliminación o translocación de genes de genes relacionados con una enfermedad particular. La ISH también es útil en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, ya que permite la detección de secuencias microbianas y víricas dentro de células infectadas. La IHQ incluye anticuerpos que se unen específicamente a epítopos de interés. Los epítopos, también denominados antígenos o secuencias antigénicas, son porciones de proteínas que se han establecido como marcador de interés clínico. Por ejemplo, el epítopo puede ser una forma mutada de una proteína, un sitio de unión proteína-proteína o una proteína normal que se expresa a una concentración más alta o bien más baja que la normal, tal como en una muestra de control. Se han usado la detección y/o cuantificación de epítopos en diversas muestras biológicas para un gran número de propósitos clínicos.
Tanto la IHQ como la ISH implican un acontecimiento de reconocimiento específico entre una sonda de ácido nucleico (ISH) o un anticuerpo (IHQ) y una diana dentro de la muestra. Esta interacción específica marca la diana. El marcador se puede visualizar directamente (marcaje directo) o se puede observar indirectamente usando sustancias químicas de detección adicionales. La detección cromogénica, que implica el depósito de una sustancia cromógena en la proximidad del marcador, implica etapas de detección adicionales para amplificar la intensidad de la señal para facilitar la visualización. La visualización de la señal amplificada (por ejemplo, el uso de moléculas indicadoras) permite que un observador localice dianas en la muestra.
La detección cromogénica ofrece un procedimiento de detección sencillo y rentable. Los sustratos cromógenos han funcionado tradicionalmente por precipitación cuando actúan por la enzima apropiada. Es decir, la sustancia cromógena tradicional se convierte de un reactivo soluble en un precipitado coloreado insoluble tras ponerse en contacto con la enzima. El precipitado coloreado resultante no requiere ningún equipo especial para su procesamiento o visualización. La tabla 1 es una lista no exhaustiva de sistemas cromógenos útiles dentro del alcance de la presente divulgación:
Tabla 1: Reactivos de detección cromogénica
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La tabla 1, aunque no es exhaustiva, proporciona una visión de las variedades de sustancias cromógenas disponibles en la actualidad (fdocumento WO2012/024185, Kelly et al. "Substrates for Chromogenic detection and methods of use in detection assays and kits").
Además, se hace referencia al documento US20130260379.
Puntuación automatizada; algoritmos
Se puede incluir un sistema de análisis de imagen que calcula automáticamente una puntuación, por ejemplo, una puntuación inmunológica, para un ensayo múltiple (por ejemplo, un conjunto de portaobjetos de IHQ múltiple) o portaobjetos con tinción fluorescente. El sistema de análisis de imagen incluye módulos de programas informáticos y algoritmos, que incluyen instrucciones ejecutables por ordenador que se ejecutan, por ejemplo, por un procesador, con el propósito de analizar imágenes de tejido teñido con un ensayo múltiple, y para generar una puntuación basada en el análisis. El sistema de análisis de imagen puede identificar múltiples biomarcadores en la misma biomuestra, por ejemplo, una única pieza de tejido, y es aplicable a un ensayo múltiple para cualquier tipo de tejido. Para propósitos ejemplares, el algoritmo de análisis de imagen se describe en relación con portaobjetos de tejido canceroso que se tiñen por un ensayo múltiple. Como ejemplo de implementación del algoritmo de análisis de imagen, se analizan portaobjetos de tejido de mama. Por ejemplo, los portaobjetos de tejido teñido se someten a obtención de imágenes y/o se escanean, y se generan las correspondientes imágenes de color, y se introducen en el sistema de análisis de imagen. De forma alternativa, las imágenes se obtienen a partir de una fuente.
El sistema de análisis de imagen es aplicable a imágenes de campo claro y fluorescencia, y se utiliza un sistema de microscopia (por ejemplo, un sistema de microscopia de campo claro) o un escáner para obtener imágenes o escanear los portaobjetos y obtener las imágenes de campo claro. Para generar imágenes multiespectrales, se usa un sistema de imagen multiespectral (tal como un microscopio o escáner fluorescente (por ejemplo, un escáner de portaobjetos completo) para obtener las imágenes fluorescentes multiespectrales.
Para analizar las imágenes generadas u obtenidas, el algoritmo y/o sistema de análisis de imagen incluye un algoritmo de separación de color, que se puede incluir en un módulo de separación, que identifica los tintes constituyentes individuales para los biomarcadores y las proporciones en las que aparecen en las imágenes de color. Las operaciones de separación se pueden realizar de acuerdo con el procedimiento de separación divulgado en la solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/830620, presentada el 3 de junio de 2013, y titulada SEPARACIÓN DE COLOR FISIOLÓGICAMENTE POSIBLE ADAPTABLE A IMAGEN (IMAGE ADAPTIVE PHYSIOLOGICALLY PLAUSIBLE COLOR SEPARATION). Basándose en los canales de imagen separados para cada marcador, se desarrollan algoritmos de detección para identificar automáticamente una combinación diferente de linfocitos T y B con respecto a cada uno de los marcadores IHQ diferenciadores. Por ejemplo, diferentes marcadores de linfocitos T podrían colocalizar y crear una combinación diferente de las cantidades de tinción. Adicionalmente, también se puede incluir un marcador tumoral, por ejemplo, un marcador de citoqueratina (por ejemplo, Oscar), en el ensayo para identificar el tumor, regiones intratumorales y/o peritumorales para obtener el contexto tisular (por ejemplo, para identificar los núcleos y las regiones tumorales). Por ejemplo, se realiza el análisis de imagen, después de la separación, para identificar, cuantificar y/o generar una puntuación para un biomarcador, por ejemplo, marcadores Oscar, CD3, CD8 y FoxP3. En particular, se puede informar de la puntuación para cada marcador, junto con la información del contexto tisular, como resultado.
La fig. 9 ilustra la secuencia de trabajo de un procedimiento y sistema de análisis de imagen. La fig. 9 muestra una implementación de ejemplo de un procedimiento de análisis de imagen que representa detalles asociados al procedimiento de análisis de imagen que se aplica al cálculo de puntuación inmunológica de cáncer de mama.
El procedimiento de análisis de imagen puede implicar una etapa de entrenamiento, que se puede incorporar en un módulo de etapa de entrenamiento. En la etapa de entrenamiento, en primer lugar, se puede realizar la identificación de diferentes tipos de linfocitos, así como los ejemplos de células positivas falsas, para cada marcador. Por ejemplo, en la fig. 9, se anotan manualmente los inóculos dentro de las células (por ejemplo, linfocitos T positivos verdaderos) y los inóculos fuera de las células (por ejemplo, linfocitos T positivos falsos), después de la detección automática.
A continuación, se aplican uno o más algoritmos de extracción de características, que se pueden incorporar en un módulo de extracción de características, a un parche de imagen alrededor del inóculo para obtener un conjunto de características para cada tipo de células (por ejemplo, células CD3, células CD8 y células CD20). Se extraen las características de diferentes canales de imagen, por ejemplo, los canales RGB de la imagen, el espacio de absorbancia, los canales separados y la imagen en escala de grises. Aquí se pueden usar diferentes algoritmos de extracción de características. Por ejemplo, como se muestra en la fig. 9, se pueden aplicar conocimientos de diccionario para construir un libro de códigos para los diferentes aspectos celulares.
Por ejemplo, se puede entrenar un algoritmo de clasificación, que se puede incluir en un módulo de clasificación, para clasificar diferentes tipos de células presentes en una imagen, por ejemplo, una imagen de tejido teñido con un ensayo múltiple. Se pueden aplicar diferentes algoritmos de clasificación, por ejemplo, los algoritmos SVM, Random Forest y Boosting, etc. Por ejemplo, se utiliza un algoritmo SVM en el algoritmo de clasificación, como se muestra en la fig. 9 para asociar una característica con un marcador para la característica.
En la etapa de prueba y/o etapa de implementación, donde se aplica el algoritmo de clasificación, se introduce la imagen de portaobjetos completo, o porción de la misma, en el procedimiento/sistema de análisis de imagen. Para cada región de interés en la imagen de portaobjetos completo, o porción de la misma, se aplican las siguientes etapas de separación, eliminación de ruido relacionado con tumor, generación de imagen sustituida, detección de anillos o manchas (por ejemplo, para encontrar linfocitos con marcadores de membrana), extracción de características, clasificación y recuento de tipos de células o linfocitos. En primer lugar, se puede obtener una imagen sustituida de los linfocitos (es decir, una imagen que contiene todos los linfocitos T). Al hacerlo, en primer lugar, se pueden detectar todos los linfocitos T y a continuación usar el algoritmo de clasificación para identificar los tipos de células. Para generar la imagen sustituida, se utiliza una transformada logarítmica para convertir la imagen RGB en espacio de absorbancia, y a continuación se puede utilizar el canal Oscar para eliminar el ruido (células tumorales) como se muestra en la fig. 9, ya que no se están detectando las células tumorales. Por ejemplo, se guarda la información del canal Oscar, incluyendo la información de células tumorales, en una memoria para contar las células tumorales. Se utiliza una imagen sustituida para realizar la detección, en lugar de cada canal separado, ya que los ensayos múltiples de separación, por ejemplo, los ensayos que tienen cinco o más marcadores, pueden no ser fiables debido a la gran variación de color en la imagen. En otro ejemplo, se puede utilizar una imagen combinada de algún otro tipo, por ejemplo, una imagen transformada (por ejemplo, una imagen de absorbancia o imagen en escala de grises) o una imagen que combina varios canales. A continuación, se puede separar la imagen de entrada (por ejemplo, la imagen RGB) en diferentes canales de biomarcadores, por ejemplo, los canales Oscar, FoxP3, CD3, CD8, HTX y CD20.
Se puede incluir el algoritmo de detección celular (por ejemplo, correspondiente al detector de anillos en la fig. 10), en un módulo de detección celular y se puede aplicar a la imagen sustituida para detectar los linfocitos. En particular, la conformación de anillo del algoritmo de detección celular permite capturar marcadores de membrana de conformación de anillo (por ejemplo, todos los posibles candidatos de linfocitos T y puede incluir detecciones de positivos falsos). Se usa la imagen de absorbancia con la corrección de Oscar como imagen sustituida en la implementación (fig. 9) para detectar los marcadores de membrana con conformación de anillo. En la etapa de implementación, es deseable un algoritmo de detección celular que sea muy sensible, por ejemplo, un algoritmo que capture todas las células posibles y puede incluir las detecciones de positivos falsos. Por ejemplo, se puede aplicar un detector de anillo a la imagen sustituta para detectar los marcadores de membrana, que se utilizan para identificar células. La fig. 10 ilustra un ejemplo simple del detector de anillo. Se debe entender por un experto en la técnica que se pueden aplicar otros y diferentes tipos de algoritmos de detección celular a una imagen (sustituta o de otro modo) para detectar células.
A continuación, se puede usar un clasificador, por ejemplo, el clasificador aprendido o generado de la etapa de entrenamiento, para clasificar todos los inóculos candidatos de células entre categorías, tales como células positivas falsas, linfocitos T solo CD3, linfocitos T CD3/CD8, linfocitos T FP3 y linfocitos B.
La información de los canales CD3, CD8, FP3 y CD20, por ejemplo, la información con respecto a los colores y conformaciones de células en los respectivos canales, también se puede usar como característica para la clasificación. La fig. 9 ilustra un ejemplo de implementación del algoritmo con conocimientos de diccionario. En este ejemplo, (1) se utiliza una característica de aspecto aprendida, por ejemplo, la conformación de la célula, que se obtuvo del parche local alrededor del inóculo, para distinguir entre linfocitos positivos verdaderos y positivos falsos y (2) se utiliza la característica de cantidad de tinción para clasificar, por ejemplo, los linfocitos T solo CD3 y CD3/CD8.
En particular, para cada linfocito T positivo verdadero detectado en una imagen sustituta, se pueden obtener los píxeles CD3 y CD8 alrededor de la zona del linfocito T, de los canales separados de CD3 y CD8, y se calcula la proporción de las dos tinciones para clasificar entre (1) células positivas para CD y células positivas para CD8 y (2) células positivas solo para CD3. Por ejemplo, si (número de píxeles de CD8)/(número de píxeles de CD3) < valor umbral, se marca la célula identificada en la imagen sustituta como célula solo CD3, de lo contrario se marca como célula CD3/CD8.
Para identificar los núcleos, se evalúa el canal del marcador nuclear, por ejemplo, la imagen del canal FoxP3, ya que FoxP3 es el marcador nuclear. Se aplica el algoritmo de detección de manchas, que se puede incluir en un módulo de detección de manchas, en el canal FoxP3 para encontrar los núcleos de FoxP3. De forma alternativa, se puede utilizar un algoritmo de simetría radial, que se puede incluir en un módulo de simetría radial, para detectar núcleos. Sin embargo, se debe entender por un experto en la técnica que se pueden realizar otros procedimientos de detección de manchas utilizando, por ejemplo, una transformada circular.
Para identificar la región tumoral, se utiliza el canal Oscar. Por ejemplo, se pueden usar algoritmos de detección de regiones para identificar las regiones tumorales. En la implementación mostrada en la (fig. 11), se aplica un procedimiento de determinación de valor umbral de Otsu al canal Oscar para encontrar la región tumoral. El procedimiento de determinación de valor umbral de Otsu identifica la región tumoral por un procedimiento que encuentra el mejor valor umbral para el primer plano y el fondo. También se utiliza el canal Oscar para eliminar el ruido asociado con la región tumoral. También se utiliza el canal Oscar para eliminar los marcadores citoplásmicos tumorales de conformación de anillo. Como los marcadores citoplásmicos crean a veces un aspecto de conformación de anillo, es necesario retirar esas regiones primero antes de aplicar la detección de anillos. Se observa que el orden de las etapas de los algoritmos, procedimientos y/o sistemas de análisis de imagen puede variar.
La fig. 11(B) ilustra un detector de anillo ejemplar, que se puede utilizar para la detección de linfocitos en esta implementación. Para implementar un detector de anillo, se puede construir un banco de filtros, es decir, un conjunto de máscaras que contienen 12 direcciones, como se muestra en la fig. 11(A). La región negra indica píxeles de -1 que cubren el centro del anillo y la región gris corresponde a píxeles de 1 que cubren el límite del anillo, de modo que cuando se convoluciona esta máscara con la imagen se obtiene la diferencia de intensidad entre el límite de anillo y el centro. En este ejemplo, el ancho del filtro es de 3 píxeles, la longitud de la región negra es de 5 píxeles y la longitud de la región gris es de 10 píxeles. Los parámetros, incluyendo, por ejemplo, el número de direcciones, el ancho y la longitud del filtro son ajustables, por ejemplo, para corresponder a los diferentes tamaños celulares para los que se desea la detección. Como se muestra en la fig. 11 (B), para cada localización (x,y) en la imagen, se calcula el voto V(x,y) = V(x,y) (sum(I(A))-sum(I(B))). El voto corresponde a la diferencia de valor de intensidad de las intensidades de píxeles totales dentro de la región negra del filtro y la región gris del filtro. Este voto se acumula en (x,y) a lo largo de 12 direcciones en el centro del anillo. Cabe destacar que 12 es solo un ejemplo del número de direcciones y se puede usar un número diferente. En particular, se puede utilizar detección multiescala (es decir, diferentes tamaños del anillo) para capturar células en diferentes tamaños ajustando los parámetros del filtro.
Un sistema informático ejemplar para su uso de acuerdo con la presente divulgación puede incluir cualquier número de plataformas informáticas o múltiples tipos de plataformas informáticas, tales como estaciones de trabajo, ordenadores personales, servidores, dispositivos portátiles, sistemas multiprocesador, electrónica de consumo programable o basada en microprocesadores, PC de red, miniordenadores, ordenadores centrales o cualquier otro presente o futuro ordenador. Por ejemplo, también se puede practicar en entornos informáticos distribuidos en los que se realizan las tareas por dispositivos de procesamiento local y/o remoto que están conectados (por ejemplo, por conexiones cableadas, conexiones inalámbricas o una combinación de las mismas), en una red de comunicaciones. En un entorno informático distribuido, se pueden localizar los módulos de programa en medios de almacenamiento informáticos tanto locales como remotos incluyendo los dispositivos de almacenamiento de memoria. Sin embargo, se apreciará por un experto en la técnica que las plataformas informáticas mencionadas anteriormente como se describen en el presente documento se configuran específicamente para realizar las operaciones especializadas de acuerdo con la presente divulgación y no se consideran ordenadores de propósito general.
Típicamente los ordenadores incluyen componentes conocidos, tales como un procesador, un sistema operativo, memoria del sistema, dispositivos de almacenamiento de memoria, controladores de entrada-salida, dispositivos de entrada-salida y dispositivos de visualización. También se entenderá por los expertos en la técnica que existen muchas configuraciones y componentes posibles de un ordenador y que también pueden incluir memoria caché, una unidad de respaldo de datos y muchos otros dispositivos. Los ejemplos de dispositivos de entrada incluyen un teclado, un dispositivo de control del cursor (por ejemplo, un ratón), un micrófono, un escáner, etc. Los ejemplos de dispositivos de salida incluyen un dispositivo de visualización (por ejemplo, un monitor o proyector), altavoces, una impresora, una tarjeta de red, etc. Los dispositivos de visualización pueden incluir dispositivos de visualización que proporcionan información visual, típicamente esta información se puede organizar lógica y/o físicamente como una matriz de píxeles. También se puede incluir un controlador de interfaz que puede comprender cualquiera de una variedad de programas informáticos conocidos o futuros para proporcionar interfaces de entrada y salida. Por ejemplo, las interfaces pueden incluir lo que en general se denomina "interfaces gráficas de usuario" (a menudo denominadas GUI) que proporcionan una o más representaciones gráficas a un usuario. Típicamente, las interfaces se habilitan para aceptar entradas de usuario usando medios de selección o de entrada conocidos por los expertos en la técnica. La interfaz también puede ser un dispositivo de pantalla táctil. Por ejemplo, las aplicaciones en un ordenador pueden emplear una interfaz que incluye lo que se denomina "interfaces de línea de comando" (a menudo denominadas CLI), típicamente las CLI proporcionan una interacción basada en texto entre una aplicación y un usuario. Típicamente, las interfaces de línea de comando presentan la salida y reciben entradas como líneas de texto a través de dispositivos de visualización. Por ejemplo, algunas implementaciones pueden incluir lo que se denomina "Shell", tales como las Shells de Unix conocidas por los expertos en la técnica, o Microsoft Windows Powershell que emplea arquitecturas de programación de tipo orientadas a objetos como el marco Microsoft .NET.
Los expertos en la técnica apreciarán que las interfaces pueden incluir una o más GUI, CLI o una combinación de las mismas.
Un procesador puede incluir un procesador disponible comercialmente tal como un procesador Celeron, Core o Pentium fabricados por Intel Corporation, un procesador SPARC fabricado por Sun Microsystems, un procesador Athlon, Sempron, Phenom u Opteron fabricados por AMD Corporation, o puede ser uno de otros procesadores que están o estarán disponibles. Por ejemplo, un procesador puede incluir lo que se denomina procesador multinúcleo y/o estar habilitado para emplear tecnología de procesamiento paralelo en una configuración de uno o varios núcleos. Por ejemplo, típicamente una arquitectura multinúcleo comprende dos o más "núcleos de ejecución" del procesador. En el presente ejemplo, cada núcleo de ejecución puede funcionar como un procesador independiente que permite la ejecución paralela de múltiples subprocesos. Además, los expertos en la técnica apreciarán que un procesador se puede configurar en lo que en general se denomina arquitecturas de 32 o 64 bits, u otras configuraciones de arquitecturas conocidas ahora o que se pueden desarrollar en el futuro.
Típicamente un procesador ejecuta un sistema operativo, que puede ser, por ejemplo, un sistema operativo de tipo Windows de Microsoft Corporation; el sistema operativo Mac OS X de Apple Computer Corp.; un sistema operativo de tipo Unix o Linux disponible de muchos proveedores o lo que se denomina código abierto; otro o un futuro sistema operativo; o alguna combinación de los mismos. Un sistema operativo interactúa con el soporte lógico y el soporte físico de manera bien conocida, y facilita al procesador la coordinación y ejecución de las funciones de los diversos programas informáticos que pueden estar escritos en una variedad de lenguajes de programación. Un sistema operativo, típicamente en cooperación con un procesador, coordina y ejecuta las funciones de los otros componentes de un ordenador. Un sistema operativo también proporciona programación, control de entrada-salida, administración de archivos y datos, administración de memoria y control de comunicación y servicios relacionados, todo de acuerdo con las técnicas conocidas.
La memoria del sistema puede incluir cualquiera de una variedad de dispositivos de almacenamiento de memoria conocidos o futuros que se pueden usar para almacenar la información deseada y a la que se puede tener acceso desde un ordenador. Los medios de almacenamiento legibles por ordenador pueden incluir medios volátiles y no volátiles, extraíbles y no extraíbles implementados en cualquier procedimiento o tecnología para el almacenamiento de información tales como instrucciones legibles por ordenador, estructuras de datos, módulos de programas u otros datos. Los ejemplos incluyen cualquier memoria de acceso aleatorio (RAM), memoria de solo lectura (ROM), memoria de solo lectura programable y borrable electrónicamente (EEPROM), discos versátiles digitales (DVD), medio magnético, tal como una cinta o disco duro residente, un medio óptico tal como un disco compacto de lectura y escritura u otro dispositivo de almacenamiento de memoria, comúnmente disponibles. Los dispositivos de almacenamiento en memoria pueden incluir cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos o futuros, incluyendo una unidad de disco compacto, una unidad de cinta, una unidad de disco duro extraíble, una unidad flash o USB, o una unidad de disquete. Típicamente dichos tipos de dispositivos de almacenamiento de memoria leen de y/o escriben en, un medio de almacenamiento de programas tal como, respectivamente, un disco compacto, una cinta magnética, un disco duro extraíble, una unidad flash o USB, o un disquete. Cualquiera de estos medios de almacenamiento de programas, u otros actualmente en uso o que se pueden desarrollar más adelante, se pueden considerar un producto de programa de ordenador.
Como se apreciará, típicamente estos medios de almacenamiento de programas almacenan un programa informático de ordenador y/o datos. Los programas informáticos de ordenador, también llamados lógica de control de ordenador, típicamente se almacenan en la memoria del sistema y/o el dispositivo de almacenamiento de programas usado conjuntamente con el dispositivo de almacenamiento de memoria. Por ejemplo, se describe un producto de programa de ordenador que comprende un medio usable por ordenador que tiene lógica de control (programa informático de ordenador, incluyendo el código de programa) almacenado en el mismo. La lógica de control, cuando se ejecuta por un procesador, hace que el procesador realice las funciones descritas en el presente documento. Algunas funciones se pueden implementar principalmente en el soporte físico usando, por ejemplo, una máquina de estado de soporte físico. La implementación de la máquina de estado de soporte físico para realizar las funciones descritas en el presente documento será evidente para los expertos en las técnicas relevantes. Los controladores de entrada-salida podrían incluir cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos para aceptar y procesar información de un usuario, ya sea un ser humano o una máquina, ya sea local o remoto. Dichos dispositivos incluyen, por ejemplo, tarjetas de módem, tarjetas inalámbricas, tarjetas de interfaz de red, tarjetas de sonido u otros tipos de controladores para cualquiera de una variedad de dispositivos de entrada conocidos.
Los controladores de salida podrían incluir controladores para cualquiera de una variedad de dispositivos de visualización conocidos para presentar información a un usuario, ya sea un ser humano o una máquina, ya sea local o remoto. En particular, los elementos funcionales de un ordenador se comunican entre sí por medio de un bus de sistema. De forma alternativa, un ordenador se puede comunicar con algunos elementos funcionales usando la red u otros tipos de comunicaciones remotas. Como será evidente para los expertos en la técnica, un control de instrumento y/o una aplicación de procesamiento de datos, si se implementa en un programa informático, se puede cargar y ejecutar desde la memoria del sistema y/o un dispositivo de almacenamiento de memoria.
Todas o partes de las aplicaciones de control instrumental y/o procesamiento de datos también pueden residir en una memoria de solo lectura o dispositivo similar del dispositivo de almacenamiento de memoria, que son dispositivos que no requieren que las aplicaciones de control instrumental y/o procesamiento de datos se carguen primero a través controladores de entrada-salida. Se entenderá por los expertos en la técnica que las aplicaciones de control instrumental y/o procesamiento de datos, o partes de él, se pueden cargar por un procesador, de manera conocida en la memoria del sistema, o memoria caché, o ambas, como ventajoso para su ejecución. Además, un ordenador puede incluir uno o más archivos de biblioteca, archivos de datos experimentales y un cliente de internet almacenado en la memoria del sistema. Por ejemplo, los datos experimentales podrían incluir datos relacionados con uno o más experimentos o ensayos, tales como valores de señales detectadas u otros valores asociados con uno o más experimentos o procesos de secuenciación por síntesis (SBS).
Adicionalmente, un cliente de internet puede incluir una aplicación habilitada para acceder a un servicio remoto en otro ordenador usando una red y, por ejemplo, puede comprender lo que en general se denomina "navegadores de internet". En el presente ejemplo, algunos navegadores de internet comúnmente empleados incluyen Microsoft Internet Explorer disponible de Microsoft Corporation, Mozilla Firefox de Mozilla Corporation, Safari de Apple Computer Corp., Google Chrome de Google Corporation u otro tipo de navegador de internet actualmente conocido en la técnica o que se va a desarrollar en el futuro. Además, un cliente de internet puede incluir, o podría ser un elemento de, aplicaciones informáticas especializadas habilitadas para acceder a información remota por medio de una red tales como una aplicación de procesamiento de datos para aplicaciones biológicas.
Una red puede incluir uno o más de los muchos tipos diferentes de redes bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una red puede incluir una red de área amplia o local que puede emplear lo que comúnmente se denomina conjunto de protocolos TCP/IP para comunicarse. Una red puede incluir una red que comprende un sistema mundial de redes informáticas interconectadas que comúnmente se denomina internet, o también podría incluir diversas arquitecturas de intranet. Los expertos en las técnicas relacionadas también apreciarán que algunos usuarios en entornos en red pueden preferir emplear lo que en general se denomina "cortafuegos" (también denominados a veces Packet, Filters o Border Protection Devices) para controlar el tráfico de información a y de sistemas informáticos y/o de soporte físico. Por ejemplo, los cortafuegos pueden comprender elementos informáticos o de soporte físico o alguna combinación de los mismos y típicamente están diseñados para hacer cumplir las políticas de seguridad implementadas por los usuarios, tales como, por ejemplo, administradores de red, etc.
Sistemas automatizados para tinción
Los sistemas automatizados ejemplares disponibles a través de Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, incluyen el sistema de tinción sYm PhONY®, n.° de catálogo: 900-SYM3, sistemas de preparación automatizada de portaobjetos VENTANA® BenchMark, n.° de catálogo: N750-BMKXT-FS, N750-BMKU-FS, VENTANA, y el teñidor de portaobjetos automatizado VENTANA® BenchMark Special Stains. Estos sistemas emplean un sistema controlado por microprocesador que incluye una rueda giratoria que apoya los portaobjetos colocados radialmente. Un motor de velocidad gradual hace girar la rueda disponiendo cada portaobjetos debajo de uno de una serie de distribuidores de reactivos situados sobre los portaobjetos. Los códigos de barras en los portaobjetos y distribuidores de reactivos permiten la colocación controlada por ordenador de los distribuidores y portaobjetos de modo que se puedan realizar diferentes tratamientos con reactivos para cada una de las diversas muestras de tejido por la programación apropiada del ordenador.
Los sistemas de instrumentación ilustrativos se diseñan para aplicar secuencialmente reactivos a secciones de tejido montadas en portaobjetos de microscopio de vidrio de una por tres pulgadas en condiciones ambientales controladas. El instrumento debe realizar varias funciones básicas tales como la aplicación de reactivos, lavado (para retirar un reactivo aplicado previamente), drenaje con chorro (una técnica para reducir el volumen de tampón residual en un portaobjetos posterior al lavado), aplicación de un aceite fluido usado para contener reactivos y evitar la evaporación y otras funciones instrumentales. Los instrumentos de tinción ejemplares procesan los portaobjetos en una rueda giratoria. Los portaobjetos mantienen una posición estacionaria y una rueda distribuidora hace girar los reactivos por encima de los portaobjetos fijos. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar usando diversas configuraciones físicas. El procedimiento de clarificación y tinción de tejido en un portaobjetos consiste en la repetición secuencial de las funciones instrumentales básicas descritas anteriormente. Esencialmente, se aplica un reactivo al tejido, a continuación, se incuba durante un tiempo especificado a una temperatura específica. Cuando se completa el tiempo de incubación, se elimina por lavado el reactivo del portaobjetos y se aplica el siguiente reactivo, se incuba, se elimina por lavado, etc., hasta que se hayan aplicado todos los reactivos y se complete el procedimiento de tinción.
Para la divulgación relacionada, se hace referencia a Richards et al., patente de EE. UU. n.° 6296809, asignada a Ventana Medical Systems, que describe un aparato y procedimientos para teñir o tratar automáticamente múltiples muestras de tejidos montadas en portaobjetos de microscopio de modo que cada muestra pueda recibir un protocolo de tinción o tratamiento individualizado incluso cuando dichos protocolos requieran diferentes parámetros de temperatura. Más específicamente, lo que se describe es un aparato que comprende un instrumento de tinción accionado por código de barras, controlado por ordenador que aplica automáticamente reactivos químicos y biológicos a tejido o células montadas o fijadas a portaobjetos de microscopio de vidrio estándar. Una pluralidad de portaobjetos se monta en un conjunto circular sobre una rueda que gira, dirigida por el ordenador, a una localización de distribución, disponiendo cada portaobjetos debajo de uno de una serie de distribuidores de reactivos sobre una segunda rueda giratoria ubicada por encima de los portaobjetos. Cada portaobjetos recibe los reactivos seleccionados (por ejemplo, sonda de ADN) y se lava, se mezcla y/o se calienta en una secuencia óptima y durante el periodo de tiempo requerido.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas características específicas de modos de realización de trabajo y protocolos generales. El alcance de la presente invención no está limitado a las características ejemplificadas por los siguientes ejemplos.
Procedimiento IHQ
Se implementaron los siguientes protocolos en un VENTANA® BenchMark XT (VMSI n.° de catálogo VMSI: N750-BMKXT-FS) con NexES V10.6, proporcionando los intervalos variaciones de procedimiento ilustrativas representando los valores entre corchetes un valor ejemplar:
(1) se puede realizar la cocción para adherir tejido a los portaobjetos, en especial para portaobjetos recién cortados; temperaturas: 60 °C - 75 °C; tiempo de incubación: 4-32 min; para hornear en línea, configurar la temperatura 2-4 grados por encima del punto de fusión del tipo de parafina usada, [sin cocción];
(2) se realizó la desparafinación para retirar la cera para la penetración de reactivo; las opciones de desparafinación únicas incluyen estándar, extendido y extendido II; estos procedimientos permiten una mejora en la flexibilidad para permitir un mayor éxito en la optimización de tejidos difíciles; estándar es el predeterminado y reproducirá el protocolo de desparafinación clásico usando EZ Prep (n.° de catálogo VMSI: 950-102); extendido, cuando se selecciona, reproducirá la desparafinación de HER2 d DiSH (n.° de catálogo VMSI: 780-4422) (añadiendo 5 etapas de aclarado adicionales de EZ Prep al protocolo estándar; extendido II, cuando se selecciona, usará LCS (n.° de catálogo VMSI: 650-010), [Desparafinación estándar, 75 °C, 4 minutos; 3 aclarados de EZ Prep; 76 °C, 4 minutos; aclarado];
(3) pretratamiento; en portaobjetos posterior a fijación, tratamiento previo opcional, retirada de proteína en exceso (calor y enzima); reactivo fijador rellenable por el usuario; temperatura de 37 °C - 60 °C; de "FIXATIVE 1" a "FIXATIVE 10" rellenable por el usuario, tiempo de incubación de 4 - 32 min en tampón de reacción; [sin tratamiento previo];
(4) acondicionamiento celular; se usó CC1 (n.° de catálogo VMSI: 950-124), CC2 (n.° de catálogo VMSI: 950-123) o tampón de reacción (n.° de catálogo VMSI: 950-300); CC1 con un pH ligeramente alcalino usado para recuperación con calor tampón; CC2 pH de 6,0 usado para recuperación por calor tampón, tampón de reacción usado solo para recuperación con calor; 1 a 5 ciclos seleccionables; tiempos de incubación: 4 - 16 min; temperaturas: 60 °C -100 °C, [CC1 durante 32 minutos - 8 minutos a 95 °C seguido de 24 minutos a 100 °C];
(5) tratamiento con proteasas: acondicionamiento celular usando recuperación con calor reduce la fijación de la reticulación; la proteasa "perfora orificios" en la proteína; la combinación puede permitir una mejor penetración de muestra; la elección de la enzima y el tiempo de incubación se pueden determinar por el fabricante del reactivo, recomendación, experimentación, opción de enzima; distribuidores rellenables por el usuario para usar con ENZYME 1 - 10, proteasa prediluida 1 - 3 (n.° de catálogo VMSI: 760-2018, 760-2019, 760-2020); ISH-proteasa prediluida 1 - 3 (n.° de catálogo VMSI: 780-4147, 780-4148, 780-4149); tiempo de incubación de 4 - 32 min, [no se usa proteasa]; (6) inhibición previa de peroxidasa primaria e inhibición posterior de peroxidasa primaria (n.° de catálogo VMSI: 253­ 4578); permite la inhibición de la peroxidasa endógena después de que la primaria se haya unido al antígeno; algunos antígenos pueden ser sensibles al peróxido de hidrógeno; esta opción puede mejorar la tinción para esos anticuerpos, [no se usa inhibición de peroxidasa];
(7) aplicar reactivo de aclarado; tampón de reacción; aplicar LCS, [4 minutos, sin calor];
(8) procedimiento de aclaramiento [descrito en el presente documento];
(9) aplicación de anticuerpo primario; temperatura del anticuerpo primario y opción de dilución del anticuerpo primario; permite al usuario modificar la temperatura de incubación para el primario; añade 900 pl adicionales de tampón de reacción al portaobjetos antes de la aplicación del anticuerpo primario; [anti-V600E (clon VE1), incubar a 37 °C durante 16 minutos];
(10) la detección vincula una molécula "visual" a la sonda; UltraView u OptiView (n.° de catálogo VMSI: 760-500, 760-700) [OptiView]; y
(11) contratinción y contratinción posterior; añade un color de "fondo" al tejido; el usuario puede seleccionar de una lista de reactivos de contratinción, incluyendo reactivos VENTANA prediluidos así como distribuidores de contratinción rellenables por el usuario; el tiempo de incubación es seleccionable de 4 min a 32 min; [contratinción 4 minutos con hematoxilina II (n.° de catálogo VMSI: 790-2208), contratinción posterior 4 minutos con reactivo de tinción azul (n.° de catálogo VMSI: 760-2037)].
Ejemplo de cáncer de mama (ejemplo de referencia)
Se tiñeron portaobjetos de tejido de mama canceroso con un cóctel de anticuerpos primarios haptenados seguido de tinción secuencial usando anticuerpos secundarios antihapteno unidos a HRP. El depósito de cromógenos específicos de diferentes colores representó la localización de los anticuerpos primarios. Se escanearon los portaobjetos teñidos y se obtuvieron las correspondientes imágenes de color RGB. Para analizar las imágenes, se desarrolló un algoritmo de separación de colores para identificar los tintes constituyentes individuales para los biomarcadores y las proporciones en las que aparecen en las imágenes en color. Basándose en los canales de imagen separados para cada marcador, se desarrollaron algoritmos de detección para identificar automáticamente diferentes tipos de linfocitos T. Se realizó el análisis de imagen para los marcadores Oscar, CD3, CD8 y FP3. Como resultado final, se informó de la puntuación para cada marcador.
Se observaron diferentes combinaciones de las distribuciones de linfocitos T en los portaobjetos y se validó este algoritmo de análisis identificando el número y localización de cada tipo de linfocito T.
El ensayo múltiple, junto con los algoritmos de análisis de imagen, proporcionan potencialmente un kit de herramientas para el cálculo de la puntuación inmunológica de cáncer de mama. Se puede usar el informe final generado por el ordenador para apoyar el análisis clínico de la respuesta inmunitaria personal del paciente y ayudar a guiar otro tratamiento de cáncer de mama, pero se necesitan estudios adicionales para validar este enfoque. Para cada caso, se tomaron recuentos celulares manuales y anotaciones regionales. Se resumieron los datos para cada paciente como una mediana de la expresión a través de ganglios muestreados, y a continuación se compararon estos valores entre los grupos con recidiva y sin recidiva. Existieron diferencias estadísticamente significativas en la proporción peri/intra tanto para CD3 como para CD8, siendo la proporción mayor en pacientes sin recidiva en comparación con pacientes con recidiva para ambas cohortes de mama.
Ejemplo de melanoma
Se han recogido linfadenectomías FFPE de 34 pacientes con melanoma, analizando un total de 150 ganglios linfáticos. Se ha caracterizado la inmunopuntuación por expresión inmunohistoquímica de CD3, CD8, CD20 y Foxp3 (todos de Ventana Medical Systems), se han cortado secciones tisulares en serie de 3-4 pm para hematoxilina/eosina (H&E) y se tiñeron con una combinación de todos los marcadores incluyendo el marcador tumoral para melanoma (S100). Se tiñeron secciones tisulares usando protocolos de tinción múltiple novedosos en un instrumento VENTANA Benchmark así como tinción de sección en serie (portaobjetos). Se llevó a cabo una evaluación inicial con un campo de microscopio de alta potencia (Olympus BX51), excluyendo las áreas hemorrágicas o necróticas. Se ha evaluado el número de células positivas contándolas en 5 campos peritumorales y 5 intratumorales no superpuestos usando un aumento de X400. La expresión de cada marcador, así como las combinaciones de marcadores se han concordado con la información clínica más importante que se correlaciona con la consecuencia clínica.
Estas diferencias de tendencia también parecieron ser evidentes tanto para FoxP3 como para CD20, aunque este tamaño de muestra limitado restringió algunas conclusiones. A continuación, se planteó la hipótesis de una puntuación de riesgo alto/bajo que ahora se planea validar en un melanoma más grande. Para cada caso, se tomaron recuentos celulares manuales y anotaciones regionales. Se resumieron los datos para cada paciente como una mediana de la expresión a través de ganglios muestreados, y a continuación se compararon estos valores entre los grupos con recidiva y sin recidiva. Existieron diferencias estadísticamente significativas en la proporción peri/intra tanto para CD3 como para CD8, siendo la proporción mayor en pacientes sin recidiva en comparación con pacientes con recidiva para ambas proteínas. Estas diferencias de tendencia también parecieron ser evidentes tanto para FoxP3 como para CD20, aunque este tamaño de muestra limitado limitó algunas conclusiones. A continuación, se planteó la hipótesis de una puntuación de riesgo alto/bajo que ahora se planea validar en una cohorte más grande.
Análisis de imagen
Se desarrolló un algoritmo de separación de colores, que se puede denominar algoritmo de separación de colores, que separa datos de imagen en contribuciones individuales de tres o más cromógenos diferentes. Se escanearon portaobjetos de tejido teñidos con el sistema de ensayo de campo claro de cromógeno múltiple recientemente desarrollado en un escáner de portaobjetos completo de campo claro estándar y se aplicó el algoritmo de separación de colores para proporcionar canales de imagen específicos de tinción individuales para su análisis posterior. Como modelo para aplicar esta tecnología, se diseñaron ensayos de identificación inmunitaria para tejido de cáncer de mama que consistieron en anticuerpos dirigidos a linfocitos T CD3+, linfocitos T citotóxicos CD8+, linfocitos Treg FoxP3+, linfocitos B CD20+, macrófagos CD68+ y células tumorales citoqueratina+.
Se observó un intervalo de respuestas inmunitarias, tanto en términos de diferentes tipos de células como en términos de número de células. Además, se localizaron células inmunitarias en diferentes regiones del tejido, tales como: solo en el estroma, en el margen invasivo del tumor y en el centro del tumor. Se observaron diversas combinaciones de distribución de células inmunitarias, y al correlacionarlos con la consecuencia clínica, estos datos pueden predecir las respuestas de los pacientes.
Sumario
La detección y caracterización de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y macrófagos en pacientes con cáncer individuales sirve para demostrar hasta qué punto el propio sistema inmunitario del paciente se activa en respuesta al tumor. A continuación, se puede usar esta información como prueba pronóstica o predictiva, o como una guía para otro tratamiento.
El sistema de detección de cromógeno múltiple es una tecnología flexible y sensible que se puede usar para detectar múltiples dianas en microscopia óptica de campo claro. Por ejemplo, se demuestra la flexibilidad por la intercambiabilidad de los cromógenos y se pueden diseñar ensayos combinados usando anticuerpos haptenados para mejorar la sensibilidad y evitar la unión no específica o "interferencia". Al usar la amplificación del hapteno, la señal generada es más fuerte y permite la detección de antígenos que se expresan débilmente.
El concepto de identificación inmunitaria ilustrado en esta presentación sirve como aplicación ideal para IHQ de campo claro de cromógeno múltiple, que proporciona valor médico al permitir análisis de microentornos de tumores de múltiples componentes y facilitar la eficacia de las pruebas por medio de tinción de portaobjetos individual.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de puntuación de la respuesta inmunitaria en cáncer usando linfocitos infiltrantes de tejido, que comprende:
- poner en contacto una muestra con todos los restos de unión específica de CD3, CD8, CD20 y FoxP3 y un resto de unión específica para un marcador tumoral, en el que la muestra está en un portaobjetos, - retirar los restos de unión específica en exceso de la muestra,
- detectar todos los restos de unión específica,
- evaluar una presencia y una distribución para todos los restos de unión específica dentro de la muestra, - puntuar el cáncer usando linfocitos infiltrantes de tejido analizando la presencia y la distribución de los restos de unión específica de CD3, CD8, CD20 y FoxP3.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el resto de unión específica para el marcador tumoral se selecciona de anticuerpos contra citoqueratina para tumores epiteliales (carcinomas) y anticuerpos contra S100 para melanomas.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el resto de unión específica para CD3 son anticuerpos monoclonales de conejo o ratón anti-CD3.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el resto de unión específica para CD8 son anticuerpos monoclonales de conejo o ratón anti-CD8.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto de unión específica para CD20 son anticuerpos monoclonales de conejo o ratón anti-CD20.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el resto de unión específica para FoxP3 son anticuerpos monoclonales de conejo o ratón anti-FoxP3.
7. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el contacto comprende poner en contacto la muestra con restos de unión específica de CD3, CD8, CD20 y FoxP3 que se seleccionan de anticuerpos monoclonales de conejo o ratón.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la detección comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo antiespecie específico para los anticuerpos monoclonales de conejo o ratón.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo antiespecie está haptenado, o el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los restos de unión específica están haptenados, y la detección del anticuerpo haptenado o los restos de unión específica comprende además poner en contacto la muestra con un anticuerpo antihapteno conjugado con una enzima.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la detección comprende además poner en contacto la muestra con un compuesto de detección.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el compuesto de detección se selecciona de un cromógeno o un fluoróforo.
12. Uso de un kit en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para puntuar la respuesta inmunitaria en cáncer, que comprende:
- un resto de unión específica a CD3 y un reactivo de detección de CD3,
- un resto de unión específica a CD8 y un reactivo de detección de CD8,
- un resto de unión específica a CD20 y un reactivo de detección de CD20,
- un resto de unión específica a FoxP3 y un reactivo de detección de FoxP3,
- contenidos en una pluralidad de recipientes, e
- instrucciones para la puntuación que describen la detección de CD3, CD8, CD20 y FoxP3 dentro de una muestra de tejido y la puntuación basada en una presencia y una distribución de los reactivos de detección en el tejido.
13. Un sistema para puntuar el cáncer por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 examinando una muestra de tejido dispuesta sobre un portaobjetos de vidrio, comprendiendo el sistema:
- reactivos que comprenden un resto de unión específica a CD3, un reactivo de detección de CD3, un resto de unión específica a CD8, un reactivo de detección de CD8, un resto de unión específica a CD20, un reactivo de detección de CD20, un resto de unión específica a FoxP3, un reactivo de detección de FoxP3, un resto de unión específica a marcador tumoral y un reactivo de detección de marcador tumoral,
- un aparato de tinción automatizado, y
- un aparato de obtención de imágenes;
en el que el aparato de tinción automatizado se configura para repartir los reactivos sobre el portaobjetos de manera tal que se determina específicamente una presencia y distribución de CD3, CD8, CD20, FoxP3 y marcador tumoral y el aparato de obtención de imágenes se configura de modo que la presencia y distribución de CD3, CD8, CD20 y FoxP3 se pueden usar para generar una puntuación.
14. Un procedimiento implementado por ordenador para contar varios tipos de células en una única pieza de tejido que se ha teñido con un ensayo múltiple de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
- obtener imágenes de la única pieza de tejido que se ha teñido con el ensayo múltiple que incluye los marcadores de linfocitos CD3, CD8, CD20, FoxP3 y marcadores de detección tumoral;
- separar la imagen de la única pieza de tejido que se ha teñido con un ensayo múltiple en canales de imagen separados para cada marcador del ensayo múltiple;
- identificar regiones de interés en cada canal de imagen basándose en la información de intensidad en cada canal, en el que se retiran las regiones de baja intensidad en cada canal, y las regiones de alta intensidad representan señales celulares;
- generar una única imagen sustituida, en el que la imagen sustituida es una combinación de la información del canal de imagen de todos los marcadores de linfocitos;
- aplicar un algoritmo de detección celular, en el que el algoritmo de detección celular es un algoritmo de búsqueda de membrana o un algoritmo de búsqueda de núcleo;
- identificar las características de los linfocitos y combinaciones de linfocitos en cada canal de imagen o en cada imagen de canales combinados, o en una imagen transformada tal como una imagen de escala de grises o de absorbancia, o en una imagen sustituida;
- entrenar un algoritmo de clasificación basándose en las características de linfocitos y combinaciones de linfocitos conocidos;
- aplicar el algoritmo entrenado a las características de los linfocitos y combinaciones de linfocitos en cada canal de imagen o en cada imagen de canales combinados, o en una imagen transformada tal como una imagen de escala de grises o de absorbancia, o en una imagen sustituida, que se identificaron para clasificar las células detectadas como al menos una de las células positivas falsas, linfocitos T solo CD3, linfocitos T CD3 y CD8, linfocitos T FoxP3; y linfocitos B CD20;
- contar un número de cada tipo diferente de célula clasificada;
- generar una puntuación de la pieza de tejido, en el que la puntuación se basa en el número de cada tipo de célula contada.
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