CN114113616B - 一种试剂盒及其染色方法 - Google Patents

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Abstract

一种试剂盒及其染色方法，试剂盒包含如下单克隆抗体组合中的至少一种：1)抗CD20单克隆抗体、抗α‑SMA单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体；2)抗FoxP3单克隆抗体、抗CD19单克隆抗体、抗FAP单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD163单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体。该试剂盒能够有效地在同一组织上标记多种生物标志物，且多种标记之间无交叉反应。

Description

一种试剂盒及其染色方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种试剂盒及其染色方法。
背景技术
乳腺癌作为女性中最为常见的肿瘤之一，已经严重威胁到女性的身心健康。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）提供的最新的数据显示，在全球乳腺癌的新发病例的数目为220万例，超过了肺癌成为全球第一大癌症。乳腺癌目前无法根治，患者多死于肿瘤的转移和复发，迫切需要有效方法预测临床患者的治疗效果。同时乳腺癌的肿瘤微环境是一群具有较大异质性的细胞群体组成的，因此研究肿瘤微环境中细胞的组成、分布、密度及作用对于探索乳腺癌转移和复发的生理机制至关重要。大量的研究结果提示乳腺癌的肿瘤微环境与临床预后密切相关，其中免疫细胞与肿瘤细胞亚群的密度、定位和空间关系等，可以有效预测患者的治疗效果。例如，B细胞、T细胞（CD4+ T和CD8+ T）、巨噬细胞、肿瘤相关的成纤维细胞与肿瘤细胞间相互作用，能够促进或阻止肿瘤的生长和侵袭，在乳腺癌中具有预后及疗效预测价值。
对于乳腺癌，现有技术难以同时研究免疫细胞、成纤维细胞与肿瘤细胞的密度、定位和空间关系，难以探索乳腺癌患者的免疫微环境不同生物标志物组合与预后的关系。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如下单克隆抗体组合中的至少一种：
1）抗CD20单克隆抗体、抗α-SMA单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体；
2）抗FoxP3单克隆抗体、抗CD19单克隆抗体、抗FAP单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD163单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种染色方法，包括：对待测样本分别进行如下抗原组中的中任意一组的抗原进行染色，得到染色后的细胞：
A）CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68；
B）FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68。
根据第三方面，在一实施例中，提供由第二方面所述染色方法染色得到的图像。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第三方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到待测样本所属受试者的生物标记物数值。
依据上述实施例的一种试剂盒及其染色方法，该试剂盒能够有效地在同一组织上标记多种生物标志物，且多种标记之间无交叉反应。
附图说明
图1为一种实施例的实验流程图。
图2为一种实施例在不同稀释浓度的单克隆抗体组Panel 1每个抗体的免疫组化实验结果图。
图3为一种实施例单克隆抗体组Panel 1抗体匹配不同荧光染料的染色信号比较图。SNR：signal to noise ratio，信噪比。
图4为一种实施例在不同染色顺序的条件下单克隆抗体组Panel 1抗体染色信号比较图。SNR：signal to noise ratio，信噪比。MFI：Mean Fluorescence Intensity，平均荧光强度。
图5为一种实施例在不同稀释浓度的单克隆抗体组Panel 2每个抗体的免疫组化实验结果图。
图6为一种实施例单克隆抗体组Panel 2抗体匹配不同荧光染料的染色信号比较。SNR：signal to noise ratio，信噪比。
图7为一种实施例在不同染色顺序的条件下单克隆抗体组Panel 2抗体染色信号比较。SNR：signal to noise ratio，信噪比。MFI：Mean Fluorescence Intensity，平均荧光强度。
图8为一种实施例的最终方案染色处理的单克隆抗体组Panel 1染色结果图。A：多重免疫荧光多通道。单克隆抗体组Panel 1 中各抗体染色结果，其中CD20（黄色）、α-SMA（绿色）、panCK（红色）、CD4（橙色）、CD8（青色）、CD68（白色）及核染料DAPI（蓝色）。B：单克隆抗体组Panel 1 中各抗体与核染料DAPI的染色结果。
图9为另一种实施例的最终方案染色处理的单克隆抗体组Panel 2染色结果图。A：多重免疫荧光多通道。单克隆抗体组Panel 2中各抗体染色结果，其中FAP（橙色）、FoxP3（黄色）、CD8（绿色）、CD163（红色）、CD19（青色）、CD68（白色）。B：单克隆抗体组Panel 2中各抗体与核染料DAPI的染色结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接（联接）。
B细胞通过炎症因子抑制T细胞和自然杀伤T细胞的抗肿瘤功能，同时也通过分泌抗体的方式直接促进肿瘤转移，因此检测B细胞的含量可以有效帮助评估患者预后。T细胞主要包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。CD8+ T细胞可不借助抗原呈递细胞直接溶解杀伤肿瘤细胞。CD4+ T的主要功能是启动并维持细胞抗肿瘤免疫，并协同CD8+ T细胞的细胞毒性和自然杀伤细胞功能。较高CD4+ T及CD8+ T细胞对患者预后有积极作用。但是多数临床研究显示乳腺癌组织表达CD8+ FOXP3+ T细胞与预后不良相关。在乳腺癌组织中，肿瘤相关巨噬细胞浸润较为常见，通常表现为M2型巨噬细胞表型，通过阻止T细胞攻击肿瘤细胞和分泌生长因子滋养肿瘤细胞，促进肿瘤血管的生成，导致癌细胞转移扩散。肿瘤微环境中巨噬细胞越多，患者预后就越差。除此以外，肿瘤微环境中存在大量的成纤维细胞（肿瘤相关的成纤维细胞），是乳腺癌微环境中最突出的细胞类型，其丰度与恶性程度高和预后不良相关。成纤维细胞通过分泌生长促进因子，增强血管生成和重塑细胞外基质来促进肿瘤进展。
上述多种免疫细胞、巨噬细胞、肿瘤相关的成纤维细胞与肿瘤细胞通过表面蛋白B细胞的表面表达CD19或CD20，T细胞则依据其表达CD4或者CD8而被分为CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，其中表达FOXP3+ T细胞被称为调节T细胞。CD68是巨噬细胞的典型的表面标志蛋白，M2型巨噬细胞表达CD163。肿瘤相关的成纤维细胞则表达成纤维细胞活化蛋白FAP及α-平滑肌肌动蛋白α-SMA。panCK则是乳腺癌肿瘤细胞经典的表面标志蛋白。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如下单克隆抗体组合中的至少一种：
1）抗CD20单克隆抗体、抗α-SMA单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体；
2）抗FoxP3单克隆抗体、抗CD19单克隆抗体、抗FAP单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD163单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体。该抗体组合可以实现对乳腺癌肿瘤组织切片的免疫细胞标志物及免疫相关分子的多重标记。各抗体可以从市场上购买得到。
在一实施例中，由于多克隆抗体可能会存在假阳性，因此，优选使用单克隆抗体进行免疫染色检测。
在一实施例中，单克隆抗体组合中的每种单克隆抗体独立分装于不同的容器中，形成套装试剂盒。
在一实施例中，所述试剂盒包含用于免疫染色检测CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68、FAP、FoxP3、CD163、CD19阳性免疫细胞的试剂。
在一实施例中，所述试剂盒用于对乳腺癌肿瘤组织免疫细胞进行染色。
在一实施例中，所述试剂盒还包含染色剂。
在一实施例中，所述染色剂包含如下偶联酪胺的荧光染料中的至少一种：OpalPolaris 480、Opal 520、Opal 570、Opal 620、Opal 690、Opal Polaris 780。前述荧光染料名称为试剂盒生厂商Akoya Biosciences提供的名称。
在一实施例中，所述染色剂包含如下偶联酪胺的荧光染料中的全部：OpalPolaris 480、Opal 520、Opal 570、Opal 620、Opal 690、Opal Polaris 780。各荧光染料可以从市场上购买得到，具体可以是购自生厂商Akoya Biosciences的试剂盒Opal Polaris7 Color Automation IHC Detection Kit中的荧光染料。
在一实施例中，组合1）中的单克隆抗体与染色剂按如下方式配对染色：
抗CD20单克隆抗体配对Opal-570，抗α-SMA单克隆抗体配对Opal 520，抗panCK单克隆抗体配对Opal 690，抗CD4单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对OpalPolaris 480，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780，各染色剂用于对抗原-一抗-二抗复合物进行荧光染色，所述一抗即为可与抗原特异性结合的单克隆抗体。
在一实施例中，组合2）中的单克隆抗体与染色剂按如下方式配对染色：
抗FoxP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD19单克隆抗体配对Opal Polaris 480，抗FAP单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对Opal 520，抗CD163单克隆抗体配对Opal 690，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780。
在一实施例中，所述染色剂还包含偶联酪胺的荧光染料Opal TSA-DIG。
在一实施例中，所述Opal TSA-DIG用于对结合有CD68的抗原-一抗-二抗复合物进行染色。
在一实施例中，所述染色剂还包含核染色剂。
在一实施例中，所述核染色剂包括但不限于DAPI（即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，CAS登录号：47165-04-8）。
在一实施例中，所述试剂盒还包含抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种染色方法，包括：对待测样本分别进行如下抗原组中的中任意一组的抗原进行染色，得到染色后的细胞：
1）CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68；
2）FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68。
在一实施例中，对待测样本分别按照如下抗原组中的中任意一组的抗原顺序依次进行染色，得到染色后的细胞：
A）CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68；
B）FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68。
在一实施例中，所述组合A）中的抗原对应的单克隆抗体与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗CD20单克隆抗体配对Opal-570，抗α-SMA单克隆抗体配对Opal 520，抗panCK单克隆抗体配对Opal 690，抗CD4单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对OpalPolaris 480，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780，各染色剂用于对抗原-一抗-二抗复合物进行荧光染色，所述一抗即为可与抗原特异性结合的单克隆抗体。
在一实施例中，所述组合B）中的抗原对应的单克隆抗体与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗FoxP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD19单克隆抗体配对Opal Polaris 480，抗FAP单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对Opal 520，抗CD163单克隆抗体配对Opal 690，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780。
在一实施例中，染色方法包括如下步骤：
1）将待测样本与单克隆抗体组中的任意一种单克隆抗体混合，得到抗原-一抗复合物；
2）将抗原-一抗复合物与辣根过氧化物酶标记的二抗混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗-二抗复合物；
3）将抗原-一抗-二抗复合物、任意一种偶联酪胺的荧光染料进行荧光染色，孵育，洗涤，得到第一荧光标记复合物；
4）将第一荧光标记复合物与抗原修复液混合，洗涤，得到第二荧光标记复合物；
5）以第二荧光标记复合物作为待测样本，重复步骤1）～4），重复至所述单克隆抗体组中的各单克隆抗体全部与待测样本结合过一次为止，得到多重标记复合物。
在一实施例中，按组合1）进行染色时，各单克隆抗体与抗体稀释液的体积比如下：
抗CD20单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~150）；
抗α-SMA单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（500~4000）；
抗panCK单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（200~400）；
抗CD4单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（500~2000）；
抗CD8单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（2000~8000）；
抗CD68单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~200）。
在一实施例中，按组合2）进行染色时，各单克隆抗体与抗体稀释液的体积比如下：
抗FoxP3单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~250）；
抗CD19单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~150）；
抗FAP单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（100~200）；
抗CD8单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（2000~8000）；
抗CD163单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（250~1000）；
抗CD68单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~200）。
在一实施例中，还包括步骤6），向步骤5）所得的多重标记复合物中添加核染色剂，孵育，洗涤，封片。
在一实施例中，还包括步骤7），对核染色剂染色后的多重标记复合物进行连续光谱成像、检测。
在一实施例中，步骤1）中，所述单克隆抗体组为组合A）、B）中抗原对应的单克隆抗体组中的任意一组。
在一实施例中，所述待测样本包括但不限于乳腺癌组织切片、扁桃体组织切片中的至少一种。
根据第三方面，在一实施例中，提供由第二方面所述染色方法染色得到的图像。该图像可以是通过对多重标记复合物进行连续光谱成像得到。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第三方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到待测样本所属受试者的生物标记物数值。
为了解决现有技术存在的问题，在一实施例中，本发明在乳腺癌患者的组织切片中，使用多重免疫组织化学染色/免疫荧光染色技术（multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence，mIHC/IF），在同一张切片上同时标记多种免疫细胞、成纤维细胞及肿瘤细胞的检测方法。mIHC/IF检测作为病理检测的一种重要手段，用于分析多种特定的细胞类型，整合肿瘤不同部位的免疫细胞之间的关系，对乳腺癌肿瘤免疫微环境深入分析，有助于准确地选择能够从治疗中获益的患者。尤其在临床样本珍贵且稀少的情况下，mIHC/IF检测可以作为新的检测方法，有望成为临床上有力的检测及预测工具。
mIHC/IF技术的实验原理如下：一抗识别抗原后，带有辣根过氧化物酶的二抗结合一抗，随后在含有H2O2的反应中，偶联酪胺的荧光染料在辣根过氧化物酶催化下形成含有共价键结合位点酶促产物，与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光信号。用相同种属来源的不同一抗，以顺次单标的方式将带有不同波长荧光染料的酪胺盐共价结合到目标抗原上。每个抗原标记循环结束后，使用微波法去除上一轮的一抗、二抗。微波法对标记在抗原上的酪胺盐荧光信号影响甚小，所以在保证上一轮标记信号不丢失的前提下，彻底去除上一轮抗体，而不会对下一轮标记造成干扰。清除上一轮抗体后即可使用新的抗体继续染色，实现多重免疫组化，无需担心交叉反应。mIHC/IF技术的优势在于，能够在FFPE组织切片上进行多个生物标志物检测，获得关于细胞组成和空间排列的多种信息，配合定量分析软件，自动区分肿瘤和非肿瘤组织，客观地分析多个生物标志物以及细胞组成、功能状态和细胞-细胞相互作用，对免疫微环境进行高维分析。具有高重复性、高效率和高成本效益的优点。
多重免疫组化标记之后，多光谱成像需特定的分析仪器达到多重免疫组化分析的目的。多光谱成像依赖于光谱数据采集和光谱拆分计算两个过程。运用Akoya公司的VectraPolaris系统(液晶可调滤波器，LCTF)过滤采集特定波段的光谱信号。LCTF由液晶材料组成，通过调整附加的电压改变光线在晶体中的光程，选择性输出特定波长的光信号，实现分光的目的。CCD曝光配合LCTF的连续滤波，就可以准确记录不同波长段的图像信号。运用Akoya公司的InForm系统进行光谱拆分：光谱图像的每个像素点信号都是不同染料和样本自发信号的叠加，以每种染料的光谱特征曲线为标准，通过数学方法对光谱图像中叠加的信号进行还原运算，从而获得单通道图像的过程称为光谱拆分计算。光谱拆分计算是整个光谱成像不可缺少的重要环节，直接影响数据结果的准确性。因此，上述光谱采集及拆分方法能够为多重免疫组化分析提供保证。
在一实施例中，可以使用HALO软件分析系统，将同一组织两张连续切片的图像，基于核染料DAPI的空间分布特征进行整合，实现在同一组织标记10种生物标志物。
在一实施例中，本发明提供一种乳腺癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用，涉及多重免疫组化技术领域，本发明所述多重免疫组化分析试剂盒，其中限定了单克隆抗体组panel 1为CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68，单克隆抗体组panel 2为FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68。本发明所述多重免疫组化分析试剂盒给予科研工作者及临床工作者提供实验方法，研究肿瘤微环境中细胞的组成、分布、密度及作用对于探索乳腺癌转移和复发的生理机制。
在一实施例中，本发明提供了一种所述多重免疫组化分析试剂盒，能够有效地在同一组织上标记10种生物标志物，且多种标记之间无交叉反应。
在一实施例中，本发明提供了一种乳腺癌的多重免疫组化分析试剂盒，包括单克隆抗体组、抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢、核染色剂和偶联酪胺的荧光染料，所述偶联酪胺的荧光染料中种类数量与单克隆抗体组中单克隆抗体种类的数量一致。
在一实施例中，所述单克隆抗体组包括单克隆抗体组单克隆抗体组panel 1为CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68，panel 2为FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68，孵育温度为20-25℃，孵育时间为60 min。除此以外，使用的试剂还包括Opal 7色荧光染色试剂盒内封闭液、清洗缓冲液。核染色剂为DAPI染色剂。所述偶联酪胺的荧光染料包括Opal Polaris480、Opal 520、Opal 570、Opal 620、Opal 690和Opal Polaris 780。
在一实施例中，如图1所示，本发明还提供了一种上述方案所述乳腺癌的多重免疫组化分析试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)将待测样品与所述单克隆抗体组中的任意一种单克隆抗体混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗复合物；
(2)将抗原-一抗复合物与辣根过氧化物酶标记的二抗混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗-二抗复合物；
(3)将抗原-一抗-二抗复合物、任意一种偶联酪胺的荧光染料进行荧光染色，孵育，洗涤，得到第一荧光标记复合物；
(4)将第一荧光标记复合物与抗原修复液混合，微波处理，洗涤，得到第二荧光标记复合物；
(5)以第二荧光标记复合物作为待测样品重复步骤(1)～(4)，重复至所述单克隆抗体组中的各单克隆抗体全部与待测样品结合过一次为止，得到多重标记复合物；
其中，步骤(1)中第一次和每次重复采用的单克隆抗体互不相同，步骤(3)中第一次和每次重复采用的偶联酪胺的荧光染料互不相同；
(6)向步骤(5)所得的多重标记复合物中添加核染色剂，孵育，洗涤，封片，用于连续光谱成像、检测。
在一实施例中，步骤(1)中，当孵育的单克隆抗体组单克隆抗体组panel 1为CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68，panel 2为FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68，孵育温度为20-25℃，孵育时间为60 min。
在一实施例中，所述步骤(1)中单克隆抗体使用时稀释倍数为50～4000倍；所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶标记的二抗的用量为150 μL/样品。
在一实施例中，本发明提供了一种乳腺癌的多重免疫组化分析试剂盒，本发明提供的多重免疫组化分析试剂盒以人离体乳腺组织石蜡切片作为样本进行检测，可在同一组织样品中同时标记多个免疫细胞标志物、肿瘤细胞标志物以及免疫相关分子，其中限定了单克隆抗体组panel 1为CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68，panel 2为FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68。采用本发明提供的使用方法能够实现在同一待测样品上标记多个分子，并且消除了前一轮多克隆抗体的干扰，检测的准确度高、效率高。
在一实施例中，本发明能够运用全自动染色仪器实现对FFPE样本的多重免疫组化实验，运用InForm、HALO系统对显微全景图的目标区域进行半自动化的荧光靶标生物标记物分析，识别肿瘤浸润淋巴细胞，对肿瘤免疫微环境进行分类。后期可以根据用户需求，设置比较对象。
在一实施例中，本发明满足在临床病理工作以及科学研究中对免疫组化多重标记的实验需求，减少病理医生和科研人员进行手动实验及人工计算分析的繁杂工作，高效辅助医生和科研人员完成免疫组化多重标记后的各项肿瘤微环境指标的分析。
以下实施例中，室温是指20~25℃。
以下实施例中，抗体稀释液是抗体生产商附带的稀释液，亦称工作液，各个抗体的生产商及克隆号如下：
组合1）中，抗CD20单克隆抗体：克隆号EP459Y，生产商Abcam。
抗α-SMA单克隆抗体：克隆号EPR5368，生产商Abcam。
抗panCK单克隆抗体：克隆号KRT/1877R，生产商Abcam。
抗CD4单克隆抗体：克隆号EPR6855，生产商Abcam。
抗CD8单克隆抗体：克隆号EP1150Y，生产商Abcam。
抗CD68单克隆抗体：克隆号KP1，生产商为北京中杉金桥生物技术有限公司。
组合2）中，抗FoxP3单克隆抗体：克隆号EPR22102-37，生产商Abcam。
抗CD19单克隆抗体：克隆号OTI3G7，生产商为北京中杉金桥生物技术有限公司。
抗FAP单克隆抗体：克隆号EPR20021，生产商Abcam。
抗CD8单克隆抗体：克隆号EP1150Y，生产商Abcam。
抗CD163单克隆抗体：克隆号EPR19518，生产商Abcam。
抗CD68单克隆抗体：克隆号KP1，生产商为北京中杉金桥生物技术有限公司。
以下实施例中，使用的荧光染料Opal Polaris 480、Opal 520、Opal 570、Opal620、Opal 690、Opal Polaris 780、Opal TSA-DIG为购自生厂商Akoya Biosciences的试剂盒Opal Polaris 7 Color Automation IHC Detection Kit中的染料。
实施例1
本实施例提供多重标记染色实验条件设计方法。
Panel 1的制备方法如下：
1.确定一抗最适实验条件，包括抗体浓度、孵育实验、抗原修复条件等，具体如下：
参考抗体说明书的建议染色浓度，对抗体进行多个浓度梯度的稀释，使用Bond Rx对标准片进行染色（DAB），染色结果用Inform分析信噪比，确定该抗体在Bond Rx明场最佳稀释比。根据抗原的亚细胞定位（膜定位/胞浆/胞核/胞外）和组织定位情况的文献报道情况与病理医生确认染色的结果，确定抗体最适浓度。
已知CD20表达在B细胞膜/浆，集中分布于生发中心，如图2A所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：50，热修复20分钟时，生发中心呈现高强度胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
已知α-SMA表达在成纤维细胞膜/浆，如图2B所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：2000，热修复20分钟时，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合成纤维细胞呈梭形的形态特征。
已知panCK表达在上皮细胞膜/浆，如图2C所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：400，热修复40分钟时，上皮细胞呈现高强度胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合上皮细胞呈复层扁平的形态特征。
已知CD4表达在T细胞膜/浆，在生发中心周围高表达，如图2D所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：1000，热修复20分钟时，生发中心周围呈现高强度胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
CD8表达在T细胞膜/浆，在生发中心周围高表达，如图2E所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：4000，热修复20分钟时，生发中心周围呈现高强度胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
已知CD68表达在巨噬细胞膜/浆，散落分布于生发中心，如图2F所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：100，热修复20分钟时，巨噬细胞呈现弱到中等强度的胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
2.通过抗体与不同染料搭配使用的染色结果确定抗体染料配对。
需要对抗体进行荧光染料和抗体配对实验，基于“强配弱，弱配强”的原则，平衡不同靶点峰度的信号强度，依据信噪比≥10来选择合适搭档。如图3所示，抗CD20单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体、抗α-SMA单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体与不同染料信噪比均大于10，单克隆抗体CD4不适合与Opal 690搭配使用，单克隆抗体CD8不适合与Opal 690搭配使用。
基于以上结果，结合“强配弱，弱配强”的原则，单克隆抗体组 Panel 1的抗体染料配对推荐方案为：抗CD20单克隆抗体配对Opal-570，抗α-SMA单克隆抗体配对Opal 520，抗panCK单克隆抗体配对Opal 690，抗CD4单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对Opal Polaris 480，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780。
3.通过抗原修复次数实验优化染色顺序。
使用偶联酪胺的荧光染料作为检测系统的mIHC/IF（多重免疫组化/免疫荧光）技术，需要按顺序对不同抗原进行孵育，其中重复步骤包括：一抗、二抗孵育，荧光团沉积和热修复以去除结合的抗体，直到所有靶标均检测。组织连续暴露于热诱导表位修复可能导致表位的降解或增强，无法预测热修复循环对抗原表位及染料的影响。因此，需要依据不同修复次数的染色结果确定抗体的最适染色顺序。
如图4所示，具体分析如下：
抗CD20单克隆抗体染色顺序为第一位时，荧光信号与信噪比高于第三位，但差异不明显，综合考虑将该抗体染色顺序排在第一位。
抗α-SMA单克隆抗体染色顺序为第三位时，信噪比低于第一位，但荧光强度无明显变化，结合其他抗体-染料配对结果，综合考虑将该抗体染色顺序排在第二位。
抗panCK单克隆抗体荧光信号染色顺序为第五位和第三位时，信噪比高于第一位，同时荧光强度在第三位时最高，综合考虑将该抗体染色顺序排在第三位。
抗CD4单克隆抗体染色顺序为第三位时的荧光信号强，信噪比大，因此将单克隆抗体CD4染色顺序排在第四位。
抗CD8单克隆抗体的染色顺序为第五位时的荧光信号最强，信噪比最大，因此将抗CD8单克隆抗体染色顺序排在第五位。
抗CD68单克隆抗体的染色顺序为第三位和第五位时信噪比较高，但在第五位时荧光信号强，因此染色顺序应该靠后，综合考虑将该抗体染色顺序排在第六位。
总结以上内容，单克隆抗体组Panel 1抗体-染料配对，染色顺序依次为：CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68。
Panel 2的制备方法如下：
1.确定一抗最适实验条件，包括抗体浓度、孵育实验、抗原修复条件等，具体如下：
参考抗体说明书的建议染色浓度，对抗体进行多个浓度梯度的稀释，使用Bond Rx对标准片进行染色（DAB），染色结果用Inform分析信噪比，确定该抗体在Bond Rx明场最佳稀释比。根据抗原的亚细胞定位（膜定位/胞浆/胞核/胞外）和组织定位情况的文献报道情况与病理医生确认染色的结果，确定抗体最适浓度。
已知FAP表达在成纤维细胞膜/浆，在平滑肌细胞丰富的组织中高表达，如图5A所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：100，热修复40分钟时，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合成纤维细胞梭形的形态特征。
已知FoxP3是Treg细胞特异性的转录因子，存在于细胞核。如图5B所示，抗体与抗体稀释液体积比例为1：50，热修复20分钟时，现高强度核染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
已知CD19表达在B细胞膜/浆，集中分布于生发中心，如图5C所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：150，热修复20分钟时，生发中心呈现高强度胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
已知CD163表达在巨噬细胞膜/浆，如图5D所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：1000，热修复20分钟时，巨噬细胞呈现弱到中等强度的胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
已知CD8表达在T细胞膜/浆，在生发中心周围高表达，如图5E所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：4000，热修复20分钟时，生发中心周围呈现高强度胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
已知CD68表达在巨噬细胞膜/浆，散落分布于生发中心，如图5F所示，抗体与抗体稀释液的体积比为1：100，热修复20分钟时，巨噬细胞呈现弱到中等强度的胞膜染色，无非特异性结合，着色均一，无明显背景噪音，定位准确且符合圆形的形态特征。
2.通过抗体与不同染料搭配使用的染色结果确定抗体染料配对。
需要对抗体进行荧光染料和抗体配对实验，基于“强配弱，弱配强”的原则，平衡不同靶点峰度的信号强度，依据信噪比≥10来选择合适搭档。
如图6所示，抗FAP单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体与不同染料信噪比均大于10，抗CD8单克隆抗体不适合与Opal 690搭配使用，抗CD163单克隆抗体不适合与Opal 520搭配使用，抗CD19单克隆抗体不适合与Opal Polaris 480搭配使用。Treg细胞较少，所以其特异性转录因子FoxP3在组织的表达丰度低，基于“弱配强”的原则，抗FoxP3单克隆抗体与Opal570搭配使用，信噪比大于10。
基于以上结果，结合“强配弱，弱配强”的原则，单克隆抗体组 Panel 2的抗体染料配对推荐方案为：抗FoxP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD19单克隆抗体配对Opal Polaris480， 抗FAP单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对Opal 520，抗CD163单克隆抗体配对Opal 690，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780。
3.通过抗原修复次数实验优化染色顺序。
使用偶联酪胺的荧光染料作为检测系统的mIHC/IF（多重免疫组化/免疫荧光）技术，需要按顺序对不同抗原进行孵育，其中重复步骤包括：一抗、二抗孵育，荧光团沉积和热修复以去除结合的抗体，直到所有靶标均检测。组织连续暴露于热修复中，可能导致抗原表位的降解或增强，无法预测热修复循环对抗原表位及染料的影响。因此，除去第一个和最后一个顺序的染料，需要依据不同修复次数的染色结果确定该抗体的最适染色顺序。
如图7所示，具体分析如下：
抗FoxP3单克隆抗体的染色顺序为第三位时，信噪比大，但荧光信号较低，综合考虑将单克隆抗体FoxP3染色顺序排在第一位。
抗CD19单克隆抗体的染色顺序为第一位时信噪比和荧光信号强，因此染色顺序应该靠前，综合考虑将该抗体染色顺序排在第二位。
抗FAP单克隆抗体的染色顺序为第五位时，信噪比最大，但第三位时荧光信号最强，第一位时的信噪比大于10，结合其他抗体-染料配对结果，综合考虑将该抗体染色顺序排在第三位。
抗CD8单克隆抗体的染色顺序为第五位时的荧光信号最强，信噪比最大，因此染色顺序应该靠后，结合其他抗体-染料配对结果，综合考虑将单克隆抗体CD8染色顺序排在第四位。
抗CD163单克隆抗体荧光信号染色顺序为第五位时，信噪比和荧光强度高，综合考虑将该抗体染色顺序排在第五位。
抗CD68单克隆抗体的染色顺序为第三位和第五位时信噪比较高，但在第五位时荧光信号强，因此染色顺序应该靠后，综合考虑将该抗体染色顺序排在第六位。
总结以上内容，单克隆抗体组Panel 2抗体-染料配对，染色顺序依次为：FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68。
实施例2 多重标记染色试剂盒使用方法
Panel 1的使用方法如下：
1.将石蜡切片放置在65℃恒温箱中烘烤2h。
2.脱蜡复水：脱蜡液（30 min），乙醇清洗3次。用Opal 7色荧光染色试剂盒(OpalPolaris 7 Color Automation IHC Detection Kit，Akoya Biosciences）清洗液洗涤。
3.封闭：用Opal 7色荧光染色试剂盒(Opal 7-color Manual IHC Kit，AkoyaBiosciences)封闭液(商品名Antibody Diluent/Block)，孵育5 min。
4.抗原修复：用Opal 7色荧光染色试剂盒内抗原修复液微波修复，95℃修复20min，然后使用清洗液洗涤。
5.一抗孵育：滴加一抗 (抗CD20单克隆抗体) 工作液，孵育条件为室温孵育1 h；清洗液洗涤。
6.二抗孵育：滴加试剂盒Opal Polymer HRP二抗，室温孵育10 min；清洗液洗涤。
7.信号放大：滴加稀释150倍的荧光染料Opal-570，室温10 min；清洗液洗涤。
8.去除抗体：panCK抗体的抗原修复条件：98℃，孵育20 min，重复一次；其他抗体的抗原修复条件：95℃，孵育20 min；清洗液洗涤。
9.复染：重复步骤3-7，依次进行抗体染色标记。
各抗体对应的染料如下：
抗α-SMA单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal 520；
抗panCK单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal 690；
抗CD4单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal 620；
抗CD8单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal Polaris 480；
抗CD68单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal TSA-DIG、Opal Polaris 780。先使用Opal TSA-DIG染色，再用Opal Polaris 780染色。TSA-DIG是信号放大剂，可以增强信号，如果不使用，会出现着色过浅的情况。
上述抗体与染料的配对关系不能更改，如果更改，会造成染色效果会变差，出现染色不均，着色过浅，串色等现象。
10.DAPI染色，室温5 min；清洗液洗涤。
11.封片：从玻片架上取出切片，去除玻片盖，使用无尘纸擦干切片上的水迹。每张切片滴加抗荧光淬灭剂50-100 μL进行封片。
12.使用Vectra Polais设备扫描切片，获取连续光谱成像。
根据以上操作步骤，完成对乳腺癌肿瘤组织切片的免疫细胞标志物及免疫相关分子的多重标记。
Panel 2的使用方法如下：
1.将石蜡切片放置在65℃恒温箱中烘烤2 h。
2.脱蜡复水：脱蜡液（30 min），乙醇清洗3次。用Opal 7色荧光染色试剂盒(Opal7-color Manual IHC Kit，Akoya Biosciences)清洗液洗涤。
3.封闭：用Opal 7色荧光染色试剂盒(Opal Polaris 7 Color Automation IHCDetection Kit，Akoya Biosciences)封闭液(商品名Antibody Diluent/Block)，室温孵育5 min。
4.抗原修复：用Opal 7色荧光染色试剂盒内抗原修复液微波修复，95℃修复20min，然后使用清洗液洗涤。
5.一抗孵育：滴加一抗 (抗FoxP3单克隆抗体) 工作液，孵育条件为室温孵育1 h；清洗液洗涤。
6.二抗孵育：滴加试剂盒Opal Polymer HRP二抗，室温孵育10 min；Bond清洗液洗涤。
7.信号放大：滴加稀释150倍的荧光染料Opal-570，室温10 min；清洗液洗涤。
8.去除抗体：FAP抗体的抗原修复条件：95℃，孵育40 min，重复一次；其他抗体的抗原修复条件：95℃，孵育20 min；清洗液洗涤。
9.复染：重复步骤3~7，依次进行抗体染色标记。
各抗体对应的染料如下：
抗CD19单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal Polaris 480；
抗FAP单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal 620；
抗CD8单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal 520；
抗CD163单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal 690；
抗CD68单克隆抗体，孵育60 min，配对染料为：Opal TSA-DIG、Opal Polaris 780。
10.DAPI染色，室温5 min；清洗液洗涤。
11.封片：从玻片架上取出切片，去除玻片盖，使用无尘纸擦干切片上的水迹。每张切片滴加抗荧光淬灭剂50~100 μL进行封片。
12.使用Vectra Polais设备扫描切片，获取连续光谱成像。
根据以上操作步骤，完成对乳腺癌肿瘤组织切片的免疫细胞标志物及免疫相关分子的多重标记。
实施例3
本实施例提供多重标记染色图像处理及数据分析方法
1.使用Vectra Polais设备获取的连续光谱成像，通过图像浏览软件（本实施例为Phenochart）对图像进行光谱拆分，评估染色效果。
（1）单克隆抗体组Panel 1的实验结果见图8，CD20（黄色）、α-SMA（绿色）、panCK（红色）、CD4（橙色）、CD8（青色）、CD68（白色）染色效果出现阳性信号，染色清晰且均一，无明显背景噪音。如图2B所示，已知CD20、CD4、CD8表达在细胞膜/浆，染色结果表明定位准确且符合淋巴细胞呈圆形的形态特征；已知CD68表达在细胞膜/浆，染色结果表明染色定位准确且符合巨噬细胞呈不规则的形态特征；已知α-SMA表达在细胞膜/浆，染色结果表明染色定位准确且符合成纤维细胞呈梭形的形态特征；已知panCK表达在细胞膜/浆，染色结果表明染色定位准确且符合肿瘤细胞呈不规则的形态特征；单独每一个细胞标志物与核染整合图表明各生物标志物之间无明显的交叉反应。
（2）单克隆抗体组Panel 2的实验结果见图9，FoxP3（黄色）、CD19（青色）、FAP（橙色）、CD8（绿色）、CD163（红色）、CD68（白色）染色效果出现阳性信号，染色清晰且均一，无明显背景噪音。如图3所示，已知CD19、CD8表达在细胞膜/浆，染色结果表明定位准确且符合淋巴细胞呈圆形的形态特征；已知FoxP3表达在细胞核，染色结果表明定位准确且符合淋巴细胞呈圆形的形态特征；已知CD68、CD163表达在细胞膜/浆，染色结果表明染色定位准确且符合巨噬细胞呈不规则的形态特征；已知FAP表达在细胞膜/浆，染色结果表明染色定位准确且符合成纤维细胞呈梭形的形态特征；单独每一个细胞标志物与核染整合图表明各生物标志物之间无明显的交叉反应。
2.使用Phenochart圈选感兴趣区域，即ROI。打开图像分析系统（Inform等），导入已圈选ROI的图像。选择荧光通道（DAPI、Opal Polaris 480、Opal 520、Opal 570、Opal620、Opal 690、Opal Polaris 780）在圈选的ROI中，依据不同组合划分不同组织形态区域。如：单克隆抗体组Panel 2，以panCK表达为主的肿瘤细胞maker的表达情况，将组织分为肿瘤区和基质区。
3.根据表达标记（marker）对mIHC病理图像的细胞进行表型识别，设置参数。各靶标荧光强度大于以上cutoff值的细胞被判断为阳性细胞，获得相应的细胞表型的数据。如：单克隆抗体组Panel 1：检测navie B或mature B细胞（CD20+）、T细胞（CD4+ T, CD8+ T）、成纤维细胞（SMA+）、肿瘤细胞（panCK+）、巨噬细胞（CD68+）在组织或肿瘤区或基质区的表达情况；单克隆抗体组Panel 2：检测B细胞（CD19+）、T细胞（CD8+ T），活化的成纤维细胞（FAP+），巨噬细胞（CD68+），免疫微环境的抑制性免疫细胞，包括：Treg（CD8+FoxP3+ T）、M2型巨噬细胞（CD68+CD163+）在组织的表达情况。使用HALO软件将Panel 1和Panel 2 的图像整合之后，增加分析的细胞群体，并且在Panel 1中依据Panel 2的panCK的表达情况，将图像分为肿瘤区和基质区。Panel 1和2整合分析后，还可以检测Treg（CD4+FoxP3+）及Panel 2的各免疫细胞在肿瘤区与基质区的的空间分布。
4.对每一受试者的病理图像目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到每一受试者的生物标记物定量性数值。可以使用统计软件（GraphPad Prism等）对数据进行分析。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (8)

1.一种非诊断目的的染色方法，其特征在于，包括：
对待测样本分别按照如下抗原组合中的任意一组合的抗原顺序依次进行染色，得到染色后的细胞：
A）CD20、α-SMA、panCK、CD4、CD8、CD68；
B）FoxP3、CD19、FAP、CD8、CD163、CD68；
所述组合A）中的抗原对应的单克隆抗体与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗CD20单克隆抗体配对Opal-570，抗α-SMA单克隆抗体配对Opal 520，抗panCK单克隆抗体配对Opal 690，抗CD4单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对Opal Polaris480，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780，各染色剂用于对抗原-一抗-二抗复合物进行荧光染色，所述一抗为与抗原特异性结合的单克隆抗体；
所述组合B）中的抗原对应的单克隆抗体与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗FoxP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD19单克隆抗体配对Opal Polaris 480，抗FAP单克隆抗体配对Opal 620，抗CD8单克隆抗体配对Opal 520，抗CD163单克隆抗体配对Opal690，抗CD68单克隆抗体配对Opal Polaris 780；
所述待测样本为乳腺癌组织切片。
2.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）按照权利要求1中所述组合A）或B）中的抗原对应的单克隆抗体与染色剂的配对染色顺序，将待测样本与单克隆抗体组中的第一种单克隆抗体混合，得到抗原-一抗复合物；
2）将抗原-一抗复合物与辣根过氧化物酶标记的二抗混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗-二抗复合物；
3）将抗原-一抗-二抗复合物、偶联酪胺的荧光染料进行荧光染色，孵育，洗涤，得到第一荧光标记复合物；
4）将第一荧光标记复合物与抗原修复液混合，洗涤，得到第二荧光标记复合物；
5）以第二荧光标记复合物作为待测样本，按照权利要求1中所述组合A）或B）中的抗原对应的单克隆抗体与染色剂的配对染色顺序，重复步骤1）～4），重复至所述单克隆抗体组中的各单克隆抗体全部与待测样本结合过一次为止，得到多重标记复合物。
3.如权利要求2所述的染色方法，其特征在于，按组合A）进行染色时，各单克隆抗体与抗体稀释液的体积比如下：
抗CD20单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~150）；
抗α-SMA单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（500~4000）；
抗panCK单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（200~400）；
抗CD4单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（500~2000）；
抗CD8单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（2000~8000）；
抗CD68单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~200）。
4.如权利要求2所述的染色方法，其特征在于，按组合B）进行染色时，各单克隆抗体与抗体稀释液的体积比如下：
抗FoxP3单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~250）；
抗CD19单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~150）；
抗FAP单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（100~200）；
抗CD8单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（2000~8000）；
抗CD163单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（250~1000）；
抗CD68单克隆抗体与抗体稀释液的体积比为1：（50~200）。
5.如权利要求2所述的染色方法，其特征在于，还包括步骤6），向步骤5）所得的多重标记复合物中添加核染色剂，孵育，洗涤，封片。
6.如权利要求5所述的染色方法，其特征在于，还包括步骤7），对核染色剂染色后的多重标记复合物进行连续光谱成像、检测。
7.由权利要求1~6任意一项所述染色方法染色得到的图像。
8.一种非诊断目的的图像分析方法，其特征在于，包括：对权利要求7所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到待测样本所属受试者的生物标记物数值。
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