CN117147844A - 肿瘤细胞亚群及其作为结直肠癌诊断标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了肿瘤细胞亚群，所述肿瘤细胞亚群包括B7H3、PTGS2和SREBP2三个标志物分子，其中B7H3蛋白表达阴性，PTGS2蛋白和SREBP2蛋白表达为阳性。本申请还公开了该肿瘤细胞亚群在制备诊断或辅助诊断结直肠癌以及预测结直肠癌预后的产品中的应用。本申请解决相关技术中单一分子预测模型存在很强的异质性的问题的技术问题。
Description
技术领域
本申请属于生物医学技术领域，具体涉及肿瘤细胞亚群及其作为结直肠癌诊断标志物的应用。
背景技术
目前，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一，每年有近200万新诊断病例。尽管诊断和治疗方法有了显著改善，但包括内镜和外科局部切除、化疗、放疗、中药治疗和免疫治疗在内的常规治疗对晚期结直肠癌患者的效果有限。近些年来不断开发对结直肠癌或者诊断和预后的预测模型，但有些患者表现出多变的临床过程，多数基于单基因靶点的模型难以得到验证。因此，鉴定和探究联合多个生物标志物或治疗靶点，对结直肠癌的临床诊疗具有重要的意义。
B7H3，也称为CD276，为B7共信号分子家族的成员。B7H3具有经典的细胞外免疫球蛋白可变(IgV)样和免疫球蛋白恒定(IgC)样结构域。许多癌症研究表明，失调的B7H3表达与癌症相关的生物学功能(如细胞生存、增殖、转移和耐药性)之间存在着密切联系。研究表明B7-H3在包括结直肠内的多种实体瘤中异常表达。前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)，又称环加氧酶2，是前列腺素生物合成中的关键酶，既是一种双加氧酶又是一种过氧化物酶。研究表明PTGS2在包括结直肠内的多种实体瘤中异常表达。此外，胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP2)是位于内质网的细胞内胆固醇敏感器，在细胞胆固醇代谢过程中发挥关键作用。SREBP2同样在多种实体瘤组织中异常表达。
针对相关技术中单一分子预测模型存在很强的异质性，且现在实行的免疫组化评分方法根据蛋白的染色强度和染色范围，往往与评价人员的主观有关，存在一定的不确定性的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
本申请的主要目的在于提供肿瘤细胞亚群及其作为结直肠癌诊断标志物的应用，以解决相关技术中单一分子预测模型存在很强的异质性的问题。本申请基于多色免疫组化染色的方法，发现在结直肠癌癌组织中存在一种显著下调的肿瘤细胞亚群，即：B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群。该亚群的比例与结直肠癌患者的预后密切相关，因此该肿瘤亚群作为结直肠癌诊断和预后的生物标志物具有重要的临床意义。
本申请基于多色免疫组化的方法，使用Image J对细胞核计数，根据荧光的有无来确定细胞亚群，进而通过特定细胞亚群的比例来作为结直肠癌患者的诊断和预后的标准，客观性更好。
为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了肿瘤细胞亚群，所述肿瘤细胞亚群包括B7H3、PTGS2和SREBP2三个标志物分子，其中B7H3蛋白表达阴性，PTGS2蛋白和SREBP2蛋白表达为阳性。
第二方面，本申请提供了检测上述的肿瘤细胞亚群的试剂在制备诊断或辅助诊断结直肠癌的产品中的应用。
作为优选方案，所述应用具体为：与癌旁正常组织相比，B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌癌组织中的比例显著下调。
第三方面，本申请提供了检测上述的肿瘤细胞亚群的试剂在制备预测结直肠癌预后的产品中的应用。
作为优选方案，所述应用具体为：B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群比例与结直肠癌预后效果正相关。
作为优选方案，所述试剂包括检测B7H3、PTGS2和SREBP2的引物、探针和抗体。
作为优选方案，所述产品包括试剂盒。
第四方面，本申请提供一种检测上述的肿瘤细胞亚群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测B7H3、PTGS2和SREBP2的引物、探针或抗体。
作为优选方案，所述试剂盒为多色免疫组化染色试剂盒。
作为优选方案，所述试剂盒包括B7H3一抗、PTGS2一抗和SREBP2一抗。
本申请通过对84例正常组织和89例结直肠癌组织样本进行多色免疫组化染色，评估B7H3、PTGS2和SREBP2在结直肠癌组织和正常组织细胞中的染色结果，统计B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群比例，发现B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌癌组织中比例显著下降，反应了B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌诊断和辅助诊断中的价值。
本申请通过对89例结直肠癌患者预后状态进行分析，结果显示B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群比例低的患者的预后，明显比B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群比例高的患者的预后更差。本申请首次发现并证实了B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群可以作为预测结直肠癌预后的生物标志物。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为B7H3、PTGS2和SREBP2在结直肠癌组织和正常组织细胞中表达的多色免疫组化染色。
图2为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
图3为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
图4为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
图5为B7H3阴性(-)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
图6为PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
图7为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
图8为B7H3阴性(+)PTGS2阳性(-)肿瘤细胞亚群的预后图。
图9为B7H3阴性(-)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
图10为B7H3阴性(+)SREBP2阳性(-)肿瘤细胞亚群的预后图。
图11为PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
图12为PTGS2阳性(-)SREBP2阳性(-)肿瘤细胞亚群的预后图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
实施例1多色免疫组化染色结直肠癌癌组织及癌旁正常组织中B7H3、PTGS2和SREBP2的表达
选取的84例癌旁正常组织和89例结直肠癌组织标本来源于上海国家生物芯片工程中心。本研究得到了苏州大学附属第一医院伦理委员会的支持。本研究所需的生物样本在获取前均获得患者同意。89例结直肠癌组织样本的详细信息见表1。
表1结直肠癌患者的临床特征
所用多色免疫组化染色试剂盒及试剂：Opal 7-color Manual IHC试剂盒(上海起发实验试剂有限公司，货号NEL821001KT)，抗荧光淬灭封片剂(美国Vector Labs公司，货号H-1000-10)，DAPI(碧云天生物技术，货号C1002)。
所用的抗体包括：B7H3一抗(鼠抗人B7H3单克隆抗体,Proteintech，货号：66481-1-lg,稀释度1:100)、PTGS2一抗(鼠抗人PTGS2单克隆抗体,Proteintech，货号：66351-1-Ig,稀释度1:200)、SREBP2一抗(兔抗人SREBP2单克隆抗体,Proteintech，货号：28212-1-AP,稀释度1:1000)和Cytokeratin一抗(鼠抗人Cytokeratin抗体，Abcam，货号：ab7753，稀释度1:100)。
多色免疫组化染色步骤：
(1)首先将组织切片放入烘箱中，温度调至63℃，烘烤一小时。
(2)在全自动染色机中完成，脱蜡程序如下：二甲苯15min→二甲苯15min→100％无水乙醇7min→100％无水乙醇7min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min。
(3)抗原修复：将10×修复液稀释为1×工作液，微波炉调整至高火3min煮沸，随后放入玻片，微波炉功率调整至低火继续修复15-20min(整个过程确保组织浸泡于液体中)，室温自然冷却。
(4)封闭：取出玻片，TBST洗片后放置于湿盒内，滴加blocking buffer，孵育10min。
(5)一抗孵育：除去blocking buffer，放置于湿盒内，滴加一抗，室温孵育1h，TBST清洗玻片。
(6)二抗孵育：取出玻片，放置于湿盒内，滴加二抗，室温孵育10min，TBST清洗玻片。
(7)Opal染料显色：取出玻片，放置于湿盒内，滴加Opal染料稀释液(1:100稀释)，室温孵育10min，TBST清洗玻片。
(8)微波处理(去除一抗、二抗)：重复步骤(3)后TBST清洗玻片。
(9)复染后续指标，重复步骤(4)-(8)直至全部指标标记完毕。
(10)DAPI染色及封片：取出玻片，放置于湿盒内，滴加DAPI工作液，室温孵育10min，TBST清洗玻片，取出玻片，滴加荧光抗淬灭封片剂封片。
(11)全景图像采集使用TissueFAXS SPECTRA多光谱全景组织扫描定量分析系统。光谱通道分辨率进行使用TissueFAXS分析软件。用DAPI通道定位和鉴定细胞核，采用ImageJ软件计算细胞总数，并对细胞质染色阳性的细胞进行鉴定和定量分析。结果见图1。
参见图1，以Cytokeratin阳性(+)细胞标记肿瘤上皮细胞区域，检测Cytokeratin+细胞中B7H3、PTGS2和SREBP2分子荧光。无荧光信号表示蛋白表达阴性，有荧光信号表示蛋白表达阳性。每个标本随机检测5个视野，结合DAPI染色，分析B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群占肿瘤细胞的比例。
图1为B7H3、PTGS2和SREBP2在结直肠癌组织和正常组织细胞中表达的多色免疫组化染色。
实施例2
根据上述84例癌旁正常组织和89例结直肠癌组织标本中B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群的比例进行统计，结果见图2。
图2为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
由图2可知，与癌旁正常组织相比，B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌癌组织中的比例显著下调，表明B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌的发生过程中发挥重要作用，以及在结直肠癌的诊断中的具有重要价值。
实施例3
本申请通过在100个月随访和生存分析绘制89例结直肠癌组织标本的生存曲线，并根据B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群比例的中位数，分为高/低两组，使用log-rank(Mantel-Cox)and the Gehan–Breslow–Wilcoxon检验，评估B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群占肿瘤细胞的比例与结直肠癌患者预后的相关性，结果参见图3。
图3为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
由图3可知，B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群占肿瘤细胞比例低的患者的预后，明显比B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群占肿瘤细胞比例高的患者的预后更差。表明B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群是一种预测结直肠癌预后的生物标志物。
对比例
本申请发明人按照实施例3的方法，还将89例结直肠癌组织标本中的B7H3、PTGS2和SREBP2两两组合来评价预后，结果见图4-12。
图4为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
图5为B7H3阴性(-)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
图6为PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌组织及正常组织的表达统计图。
图7为B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
图8为B7H3阴性(+)PTGS2阳性(-)肿瘤细胞亚群的预后图。
图9为B7H3阴性(-)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
图10为B7H3阴性(+)SREBP2阳性(-)肿瘤细胞亚群的预后图。
图11为PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群的预后图。
图12为PTGS2阳性(-)SREBP2阳性(-)肿瘤细胞亚群的预后图。
由图4-6可知，B7H3、PTGS2和SREBP2两两组合在结直肠癌组织及正常组织的表达无显著性差异。
由图7-12可知，B7H3、PTGS2和SREBP2两两组合的预后评价无显著性差异。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.肿瘤细胞亚群，其特征在于，所述肿瘤细胞亚群包括B7H3、PTGS2和SREBP2三个标志物分子，其中B7H3蛋白表达阴性，PTGS2蛋白和SREBP2蛋白表达为阳性。
2.检测权利要求1所述的肿瘤细胞亚群的试剂在制备诊断或辅助诊断结直肠癌的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用具体为：与癌旁正常组织相比，B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群在结直肠癌癌组织中的比例显著下调。
4.检测权利要求1所述的肿瘤细胞亚群的试剂在制备预测结直肠癌预后的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用具体为：B7H3阴性(-)PTGS2阳性(+)SREBP2阳性(+)肿瘤细胞亚群比例与结直肠癌预后效果正相关。
6.如权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测B7H3、PTGS2和SREBP2的引物、探针和抗体。
7.如权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
8.一种检测权利要求1所述的肿瘤细胞亚群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测B7H3、PTGS2和SREBP2的引物、探针或抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为多色免疫组化染色试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括B7H3一抗、PTGS2一抗和SREBP2一抗。
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