CN104062437A - Erbb2蛋白在制备检测嗜铬细胞瘤转移试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，特别涉及ERBB2蛋白在制备检测嗜铬细胞瘤转移试剂中的应用，本发明选取经过手术并经病理证实为嗜铬细胞瘤的患者262例，这些患者在入院时均未发现嗜铬细胞瘤的转移。收集患者的基本临床资料，包括性别、年龄、临床表现、生化检验结果、病理结果、影像学资料和病理学结果。实验结果显示，嗜铬细胞瘤转移病例中ERBB2蛋白高表达，说明ERBB2蛋白和嗜铬细胞瘤转移的发生具有密切的关系。本发明验证了嗜铬细胞瘤转移与ERBB2蛋白表达有着密切的关系，通过ERBB2的检测，快速、准确地对嗜铬细胞瘤转移确诊。本发明为临床上ERBB2蛋白在检测嗜铬细胞瘤转移的应用提供了实验数据和理论基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及ERBB2蛋白在制备检测嗜铬细胞瘤转移试剂中的应用。
背景技术
嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma，PCC)是起源于肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤，嗜铬细胞瘤可以合成，储存，代谢同时分泌儿茶酚胺激素，在临床上可引起阵发性高血压和典型的―头痛、心悸、出汗三联症状。
恶性嗜铬细胞瘤的发生率约在10％，单纯从患者的临床表现来看，恶性嗜铬细胞瘤患者与良性患者之间没有特别明显的差异。根据定义是远隔脏器的非嗜铬组织发生嗜铬的转移灶，而不包括邻近的侵犯为恶性嗜铬细胞瘤。该定义明确了转移必须发生在嗜铬组织不存在的地方如肺，骨骼或者肝脏等。尽管如此，一些研究者仍将侵袭限于局部的肾上腺嗜铬细胞瘤，也划作恶性或分类为具有恶性潜能。这种分类上的差异造成了关于良恶性嗜铬细胞瘤的研究存在很多争议。临床实践确已证明，应用传统的恶性肿瘤病理诊断标准，无法鉴别诊断嗜铬细胞瘤的良、恶性质。一些在其他肿瘤中的明显恶性病理特征，如肿瘤侵犯周围组织及局灶性的血管淋巴管浸润，却不一定代表嗜铬细胞瘤将来会复发和转移，嗜铬细胞瘤的病理学特征和生物学行为并不保持一致。部分嗜铬细胞瘤，按传统的恶性肿瘤病理诊断标准，应属于良性肿瘤，却在手术后几个月甚至很多年后出现复发和转移。
上述这些是嗜铬细胞瘤不同于其他肿瘤的显著特征，正因如此，恶性嗜铬细胞瘤的早期诊断和与良性嗜铬细胞瘤的鉴别是嗜铬研究领域的热点。现有技术中，通过采用影像学技术发现嗜铬细胞瘤的转移灶，对于患者而言，延误了最佳治疗的时机。同时影像学技术手段相比较生化手段更为繁琐，一些新的技术，普及性也远远不够，难以很好的推广于临床。如果能依靠生化检测手段对于恶性嗜铬细胞瘤预测和诊断，对于临床医生的随访以及对患者情况进行监测，显然具有更大的实用价值。
目前，研究者们试图借助肿瘤的分子生物学特点，根据肿瘤发生的信号通路，寻找分子生物学标记物，从而形成新的诊断途径，对嗜铬细胞瘤转移进行诊断。但肿瘤的发生和发展是一个多因素、多阶段的过程，单一的分子标记物，在理论上是难以胜任对良性和恶性嗜铬细胞瘤的鉴别诊断的。在其它恶性肿瘤的研究中亦发现，某一分子标志物的表达与否不能完全对于转移进行预测。
因此，如果能对嗜铬细胞瘤转移进行检测和预测，对病人的及时治疗有着至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的是研究ERBB2蛋白在嗜铬细胞瘤转移发生中所起的作用，为临床上治疗和检测在嗜铬细胞瘤的转移中提供理论依据和实验数据。
本发明涉及ERBB2蛋白在制备检测嗜铬细胞瘤转移试剂中的应用。
人ERBB2原癌基因，也被称作人类表皮生长因子受体-2(HER2)，定位于染色体17q21，编码分子质量为185kd的跨膜糖蛋白P185，与EGF受体(ERBB-1)基因产物有很高的同源性，属于表皮生长因子受体家族。
本发明应用MLPA技术对43例嗜铬细胞瘤标本进行了癌症相关基因位点在染色体水平上面的变异分析。结果显示嗜铬细胞瘤在Chromosome1p,3p,6p,11q,12q,17q和19q都发生了不同程度的变异，特别是ERBB2基因所在的Chr.17q21区域恶性嗜铬细胞瘤对比良性嗜铬细胞瘤有明显的增加，免疫组化分析进一步证实了ERBB2蛋白在良恶嗜铬细胞瘤表达上的有着明显的差异。随后，本发明又选取了18例经上海交通大学医学院附属瑞金医院确诊的嗜铬细胞瘤病人，且根据ERBB2在mRNA和蛋白水平的表达情况分为两组，即ERBB+组和ERBB2-组9例，采用基因表达谱芯片技术分析比较两组间的差异基因，结合芯片数据分析结果，发现ERBB2表达阳性和ERBB2表达阴性的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤在mRNA水平有着显著的表达差异。Focaladhesion信号通路的激活可能参与在ERBB2表达阳性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤的发生。
选取2002年至2012年上海交通大学医学院附属瑞金医院手术并经病理证实为嗜铬细胞瘤的患者262例，这些患者在入院时均未发现嗜铬细胞瘤的转移。收集患者的基本临床资料，包括性别、年龄、临床表现、生化检验结果、病理结果、影像学资料和病理学结果。实验结果显示，嗜铬细胞瘤转移病例中ERBB2蛋白高表达，说明ERBB2蛋白和嗜铬细胞瘤转移的发生具有密切的关系。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明验证了嗜铬细胞瘤转移与ERBB2蛋白表达有着密切的关系，通过ERBB2的检测，快速、准确地对嗜铬细胞瘤转移确诊。2、本发明为临床上ERBB2蛋白在检测嗜铬细胞瘤转移的应用提供了实验数据和理论基础。
附图说明
图1为ERBB2蛋白染色结果图，其中A为ERBB2高表达，+++，B为ERBB2高表达，++，C为ERBB2低表达，+，D为ERBB2低表达，-。
图2为ERBB2分组的非转移生存曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实施例1
1、研究对象
本发明选取2002年至2012年上海交通大学医学院附属瑞金医院手术并经病理证实为嗜铬细胞瘤的患者262例，这些患者在入院时均未发现嗜铬细胞瘤的转移。查阅病史资料，收集患者的基本临床资料，包括性别、年龄、临床表现、生化检验结果、病理结果、影像学资料和病理学结果。
手术标本用10％福尔马林固定，常规取材后石蜡包埋，4μm厚度做连续切片，贴附于涂有APES的载玻片上，每个组织标本各切5张，常规HE染色。
2、实验过程
1)主要试剂
所用抗体名称及工作浓度：ERBB2单克隆抗体溶液：1：200稀释，一抗DAKO Rabbit anti-human ERBB2oncoprotein，A0485)UltraSensitiveTM SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
2)实验方法与步骤：
A)切片56℃烤箱内烤片2小时。
B)二甲苯脱蜡，20min×3次，梯度酒精水化：100％酒精-95％酒精-85％酒精-75％酒精-水，蒸馏水冲洗三次。；
C)修抗原复：PH6.0柠檬酸液电饭煲中沸腾10min，切片浸入其中煮10min，保温10min，自然冷却。
D)除去PBS，切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟(3×3分钟)；
E)除去PBS，切片上滴加正常非免疫动物血清，室温下孵育10分钟；
F)除去血清，切片上滴加第一抗体，4℃过夜，PBS冲洗3×3分钟；
G)除去PBS，切片上滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟；
H)除去PBS，切片上滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟；
I)除去PBS，切片上滴加新鲜配制的DAB或AEC显色试剂显色；
J)自来水冲洗终止显色，苏木素复染，切片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
3、实验结果
1)ERBB2蛋白免疫组化染色结果
ERBB2基因产物p185表达呈黄色或棕褐色颗粒，主要定位于细胞浆内，具体如图1所示，ERBB2表达情况为，76例患者的组织标本ERBB2染色阳性:50例为+，标记为C，18例为++标记为B，8例为+++，标记为A，。++和+++的为高表达组，+和-的为低表达组。
2)患者的临床基本特点
262名患者研究中，152名为女性，110名为男性，平均年龄为46岁，共191名肾上嗜铬细胞瘤，71名肾上腺外副神经节瘤。平均肿瘤直径在6.1cm，平均随访时间为57.8月，23名(8.8％)患者证实出现转移，从术后转移发生的平均时间为57.2月。
3)、高表达组和低表达组之间的临床资料比较
根据ERBB2高表达和低表达进行分组，我们比较了患者基线资料包括性别，诊断年龄，原发肿瘤直径和位置，血尿儿茶酚胺水平以及随访中的转移情况。结果提示，ERBB2高表达组和低表达组之间未见明显临床差异：两组原发肿瘤直径和位置及血尿生化指标无统计学差别。高表达组中8名患者(30.8％)出现转移，而低表达组中15名患者(6.4％)出现转移，两组具有明显统计学差异，P＝0.000提示ERBB2高表达组与嗜铬细胞瘤的转移发生具有重要相关性。
4)、与转移相关的单因素和多因素logistic回归
将患者年龄，原发肿瘤直径和位置以及ERBB2表达情况(按高表达和低表达分组)分别做单因素和多因素的logistic回归。在单因素分析中，可见原发肿瘤直径和位置，以及ERBB2高表达均与转移的发生相关，ERBB2高表达的OR值达5.58，转移风险分别是肿瘤直径和位置的5倍和2倍。当将以上因素纳入多因素回归分析中，ERBB2高表达仍然是与转移相关的独立影响因素。
5)、ERBB2表达分组的K-M生存曲线
单因素非转移生存分析结果提示，ERBB2高表达组的非转移生存期低于ERBB2低表达组，具体如图2所示。
综上所述，ERBB2蛋白表达与嗜铬细胞瘤的转移发生具有密切的关系，在ERBB2高表达的26名患者中，8名发生了转移，将ERBB2蛋白表达与已知的转移的危险因素肿瘤直径和位置列入多元分析中，我们发现ERBB2仍然是转移的独立影响因素。在非转移生存分析中，结合随访数据，证实ERBB2表达是嗜铬细胞瘤转移的独立预后因素。通过大规模样本的验证，我们证实了ERBB2与嗜铬细胞瘤转移有着密切的的关系，嗜铬细胞瘤转移的病例中，ERBB2高表达。
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1.ERBB2蛋白在制备检测嗜铬细胞瘤转移试剂中的应用。
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