CN105209641A - 用于前列腺癌和其他疾病的诊断和预后生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及VPS28和/或VPS13A作为生物标记物用于诊断前列腺癌、前列腺上皮内瘤变(PIN)或非典型小腺泡增殖(ASAP)的应用以及VPS13A、VPS28和/或NAALADL2作为生物标记物用于预测前列腺癌的预后的应用。本发明还涉及VPS13A、VPS28和/或NAALADL2作为生物标记用于确定前列腺癌的等级或病理阶段以及监测前列腺癌的进展的应用。此外，本发明涉及NAALADL2作为生物标记物用于诊断结肠癌、胰腺癌或乳癌的应用。还提供了基于应用这些生物标记物的测定、系统和存储介质。

Description

用于前列腺癌和其他疾病的诊断和预后生物标记物
技术领域
本发明涉及VPS28和/或VPS13A作为生物标记物用于诊断前列腺癌、前列腺上皮内瘤变(前列腺上皮内肿瘤形成，PIN)或非典型小腺泡增殖(不典型小腺泡增生，ASAP)的应用，并涉及VPS13A、VPS28和/或NAALADL2作为生物标记物用于预测前列腺癌的预后的应用。本发明还涉及VPS13A、VPS28和/或NAALADL2作为生物标记用于确定前列腺癌的等级(分级、评分，grade)或病理阶段(pathologicalstage)以及监测前列腺癌的进展的应用。此外，本发明涉及NAALADL2作为生物标记物用于诊断结肠癌、胰腺癌或乳癌(乳腺癌，breastcancer)的应用。还提供了基于使用这些生物标记物的测定(assay)、系统和存储介质。
背景技术
前列腺癌是英国男性中最常见的癌症，发病率为每100,000男性中有135例(来源：CR-UK网站)，并且是北美男性中诊断的除皮肤癌外的最常见癌症。据估计，在2012年，在美国大约241,740例新病例和28,170例前列腺癌相关的死亡将会出现(来源：美国国家癌症研究所(NationalCancerInsitute)网站)。前列腺特异性抗原(PSA)测试的引入带来前列腺癌发病率的增加(来源：美国国家癌症研究所网站)。然而，死亡率保持且仅边缘性下降。年龄、疾病阶段、格利森等级(格利森分级、格利森评分，Gleasongrade)和血清PSA用于风险分级(来源：CR-UK网站)，但是PSA仍是在前列腺癌中关于诊断和预后的最有用的生物标记物。
然而，PSA不是用于前列腺癌的理想生物标记物，因为PSA可以因多种良性病症，包括良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎而升高(Farley，2010)。如果使用4ng/mL的截止值(cut-off)，那么灵敏度是21％而特异性为91％(Wolf等，2012)。因此，将有大量患者将不必要地经历前列腺组织活检用于检测前列腺癌。
生物标记物前列腺癌基因3(PCA3)正越来越多地用于诊断前列腺癌(Salagierski和Schalken，2012)。其灵敏度为约65％，而特异性为约60％。然而，目前的测定利用在前列腺按摩(prostaticmassage)后的尿中PCA3mRNA定量，使得其成为更具侵袭性的操作。
利用循环核酸作为生物标记物比蛋白有优势，例如它们能够以高灵敏度和特异性进行扩增和检测(Schwarzenbach等，2011)。表达阵列和实时-PCR允许在单一试验中定量许多基因。Leon等30多年前表明与健康对照相比，在癌症患者中的循环DNA水平增加(见Leon等，1977)。目前技术进步已致使将循环RNA用于发现和开发生物标记物。在外周血样品中RNA表达是潜在生物标记物的新来源(Papadopoulou等，2006)，并且血液中的RNA很可能反映癌症发展的早期事件。PAXgene系统用于从2.5mL外周血中存储和纯化RNA(Rainen等，2002)。其提供在-20℃存储血液样品50个月。其应用允许在患有和不患有癌症的患者样品中研究RNA表达水平之间的差异。PAXgene系统已经用于探究血液学和风湿疾病中的外周RNA水平的研究中(Batliwalla等，2005；Lewis等，2011)。从肿瘤的角度来看，已经有人利用PAXgene系统在乳腺和甲状腺癌中研究外周RNA水平(Li等，2004；Yang等，2011)。
PIN由已存在的前列腺导管和由细胞学上非典型细胞作为内层(linedby)的腺泡组成。PIN的分布反映前列腺癌的区域偏好频率。在针吸活组织检查系列(needlebiopsyseries)中高等级的PIN频率的范围为5到16％。在根治性前列腺切除术样本中高等级的PIN的患病率较高；其存在于85-100％的样本中，反映该病变与前列腺癌之间的强关联(Ayala和Ro，2007)。有流行病学的、形态学的和分子的证据表明PIN是一些前列腺癌的前期病变(Montironi等，2011)。识别PIN的临床重要性是根据其与PCa的关联。PIN可以在低的放大率下由三种重要特征识别：(i)导管结构的较暗内层(lining)；(ii)比周围正常导管和腺泡厚的内层，以及(iii)复杂的管腔内生长图案(模式，pattern)(Montironi等，2011)。然而，PIN的诊断可以是有挑战性的，因为中心区腺体结构上比腺前列腺的外周和过渡区更为复杂，并呈现出可以解释为PIN的一定程度的核层理(stratification)(Montironi等，2011)。此外，与中央血管核心形成桥接乳突，以及聚焦的(集中的，focal)管状或筛状图案可以出现在正常前列腺中(Montironi等，2011)。在来自前列腺底部的核活组织检查中经常发现中心区，使得PIN诊断变得困难(Montironi等，2011)。也已报道过最常见形式的前列腺癌侵袭性导管癌模拟微乳突和筛状高等级PIN，使得诊断具挑战性(Montironi等，2011)。
非典型小腺泡增殖(ASAP)是包括从良性、癌组织学上非典型模拟、到少量取样的癌症的连续范围的诊断(Bostwick和Meiers，2006，Montironi等，2006)。病理学家也可将ASAP称为具有癌症的高度暗示性特征但非诊断性特征的通常性小腺泡的增殖(Bostwick和Meiers，2006；Montironi等，2006)。显示ASAP聚焦的前列腺核活检可以怀疑为但不能诊断为癌症(Bostwick和Meiers，2006；Montironi等2006)。ASAP焦点存在于大约2％-5％的前列腺针吸活组织检查样本中并最常见位于前列腺的外周区域；它们很少位于过渡区。在前列腺核活检之后所发现的疑似恶性肿瘤的ASAP，基于重复活检可高度预测后续的前列腺癌，其中有17-60％病例的报告范围(Bostwick和Meiers，2006；Montironi等，2006)。Schlesinger等(2005)在后续的活组织检查中在先前单独诊断PIN后的23％的病例中和在单独诊断ASAP后的37％中发现前列腺癌。
BPH是前列腺增大(prostateglandenlargement)，其可以引起泌尿和其他症状。未治疗的前列腺增生可阻断尿从膀胱中流出，并可以引起膀胱、泌尿道或肾的问题。前列腺增生在小于40岁的男性中很少引起体征和症状。到55岁，四位男性中约有一位有一些体征和症状，并到75，约一半男性报告一些症状(来源：MayoClinic网站)。有血缘关系例如父亲或兄弟有前列腺问题，发展BPH的风险增加并且前列腺增生在美国和澳大利亚男性中更常见(来源：MayoClinic网站)。最经常使用直肠指检(digitalrectalexamination，ORE)和前列腺特异性抗原(PSA)测定来诊断BPH(来源：国家肾脏和泌尿疾病信息交换所(NKUDIC)网站)。PSA是由前列腺细胞产生的以液化精液的蛋白并经常在患有前列腺癌和BPH的男性血液中以升高的水平存在(来源：国家肾脏和泌尿疾病信息交换所(NKUDIC)网站)。美国食品药品管理局(FDA)已批准PSA检验用于与直肠指检结合以帮助在年龄50或更年老的男性中检测前列腺癌并监测患有前列腺癌的治疗后的男性。然而，PSA检验以区分癌与BPH的能力，以及在发现PSA升高后的最佳操作过程，是受限制的(来源：美国国家癌症研究所网站)。
VPS13A最近与胃和结肠直肠癌以及慢性阻塞性肺病关联(Alexandre等，2012；An等，2012)。VPS13A中的突变已与舞蹈病棘形红细胞增多症(choreaacanthocytosis)，特征为学习困难、肌无力和肌肉抽搐的神经变性疾病关联。病理上，舞蹈病棘形红细胞增多症以针尖状突起(spikey)的红细胞为特征，提示在具有VPS13A突变的个体中肌动蛋白聚合可能发生改变而这与在神经元细胞中的发现一致(Foller等，2012；Hayashi等，2012)。
VPS28形成大的多蛋白ESCRT复合物的一部分，该复合物是高度保守的内体分选复合物(endosomalsortingcomplex)(PinedaMolina等，2006；Rusten等，2012)。内体负责协调在反面高尔基网(trans-Golginetwork)、血浆膜和溶酶体之间的膜泡运输(vesiculartransport)。膜受体的胞吞作用产生分层为再循环内体的早期内体，其中受体返回到细胞表面，或晚期内体和溶酶体，其中蛋白被下调(例如EGFR)。ESCRT复合物由多种已知与TSG101相关的蛋白(VPS28、VPS23和VPS37)、已知雄激素受体调节器和辅助调节因子(Burgdorf等，2004；Sun等，1999)组成。WO2009/118205在可能的癌生物学标记物列表中包括VPS28，所有均衍生于c-myc活性指标。然而，该文献的重点是肺癌，而不是前列腺癌。
N-乙酰化、α-连接的酸性二肽酶样-2(NAALADL2)是均具有谷氨酸羧肽酶活性的N-乙酰化的、α-连接的酸性二肽酶(NAALADase)蛋白家族的新型蛋白成员(Stauch等，1989)。NAALAD家族也类似于前列腺特异性膜抗原(PSMA)，是在研究用于在前列腺癌中成像和药物靶向的已知的前列腺生物标记物(Liu等，2012；Osbourne等，2012)。在NAALADL2中的rsl7531088风险等位基因之前已与影响血管并能导致死亡的川崎病(Kawasakidisease)关联(Burgner等，2009)。NAALADL2基因也被识别为导致科尼利亚迪兰吉综合征(Corneliadelangesyndrome)的断点(breakpoint)位点，科尼利亚迪兰吉综合征是以心智障碍、生长迟缓、独特的面部特征和肢体缩小缺陷为特征的罕见的发育畸形综合症(Tonkin等，2004)。WO2009/028521涉及利用NAALADL2用于前列腺癌的诊断，尤其是激素难治性疾病，和治疗。然而，在WO2009/028521中，未对前列腺癌预后、疾病分级，或监测疾病进展中的NAALRDL2的应用进行例证、要求或描述，但却支持本申请的一些方面。
本发明旨在利用循环RNA通过表达阵列分析、qPCR验证，并且与来自Taylor-Sawyers数据集的前列腺组织中的表达阵列分析关联，来识别用于前列腺癌和PIN的诊断性和预后性靶基因组(Osbourne等，2012)。他们还研究了在循环RNA水平和在前列腺组织中基因表达是否与前列腺组织中的相应蛋白表达存在关联。这利用核活检样本的免疫组织化学和组织微阵列(TMA)来评估。
由于这些分析，发明人鉴别了用于前列腺癌、PIN和ASAP的诊断性和预后性生物标记物，其能将这些病症与良性前列腺增生(BPH)区分，这与PSA不同。这增加了利用这些生物标记物进行分析的特异性。
发明内容
在第一方面，本发明提供了用于在受试者中诊断前列腺癌、PIN或ASAP的方法，所述方法包括确定从该受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中的相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和/或编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和/或VPS28蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
在第二方面，本发明提供了用于确定受试者中前列腺癌等级的方法，所述方法包括检测从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达和/或活性水平指示在受试者中前列腺癌的等级。相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的更高的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的较高等级。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的等级。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的等级。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的等级。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的等级。
从受试者获取的测试样品以比在正常参照样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
指示受试者可能(likely)患有格利森等级至少3+3的前列腺癌。例如，受试者可能患有格利森等级3+4或4+3的前列腺癌。更可能地，受试者患有格利森等级4+3的前列腺癌。
在第三方面，本发明提供了用于确定受试者中前列腺癌的病理阶段的方法，所述方法包括检测从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的病理阶段。相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的更高的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的较高病理阶段。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的病理阶段。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的病理阶段。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的病理阶段。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与正常参照样品相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在受试者中前列腺癌的病理阶段。
从受试者获取的测试样品以比在正常参照样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
指示受试者可能患有病理阶段pT2或pT3的前列腺癌。
在第四方面，本发明提供了用于监测受试者中前列腺癌的进展的方法，所述方法包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在从所述受试者获取的先前的细胞或组织样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与所述先前样品相比，在测试样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展到更具侵袭性的形式(侵袭性更强的形式)。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在从所述受试者获取的先前样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；
其中与先前样品中相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展至更具侵袭性的形式。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在从所述受试者获取的先前样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与先前样品中相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展为更具侵袭性的形式。
该方法可以包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在从所述受试者获取的先前样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与先前样品中相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展至更具侵袭性的形式。
该方法可以包括确定从受试者获取的包括细胞或组织的测试样品是否以比在从所述受试者获取的先前的细胞或组织样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因、编码VPS13A蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白、VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与先前样品中相比，在测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展至更具侵袭性的形式。
从受试者获取的包括细胞或组织的测试样品以比在从所述受试者获取的先前细胞或组织样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和/或编码VPS13A蛋白的基因；编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；编码VPS13A蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或编码VPS28蛋白的基因、编码VPS13A蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和/或VPS13A蛋白；VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；或VPS28蛋白、VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；
可指示前列腺癌已进展为至少3+3的格利森等级。例如，前列腺癌可能已进展为3+4或4+3的格利森等级。更可能地，前列腺癌已进展为4+3的格利森等级。
在第五方面，本发明提供了用于预测患有前列腺癌的受试者的预后的方法，所述方法包括检测从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与在测试样品中相比，在正常参照样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的较高水平的表达和/或活性指示不良预后。
该方法可以包括检测从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；编码VPS28蛋白和NAALADL2蛋白的基因；编码VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白的基因；或编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；VPS13A蛋白和NAALADL2蛋白；或VPS13A蛋白VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中所述细胞或组织的检测指示不良预后。
在第六方面，本发明提供了包括以下步骤的测定：
(i)在获自受试者的测试样品中测量或定量(量化)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因的表达，或VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达或活性；以及
(ii)将相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的测量的或定量的表达和/或活性与它们在正常参照样品或从受试者获取的先前的样品中的表达相比较，而如果相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达相对于它们各自在正常参照样品或先前样品中的表达和/或活性是增加的，则鉴别该受试者患有前列腺癌、PIN或ASAP，或前列腺癌的更具侵袭性的形式的可能性增加。
在第七方面，本发明提供针对怀疑患有前列腺癌的受试者用于选择治疗或进一步的测试方案的测定，该测定包括测量或定量获自受试者的测试样品中编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因的表达，或VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性，并将相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达与它们在正常参照样品或从受试者获取的先前的样品中的表达和/或活性比较，从而确定该受试者是否需要进一步的测试(例如，活组织检查)、手术(例如，根治性前列腺切除术)、放射治疗和/或化疗。
在第八方面，本发明提供用于从取自至少一位受试者的至少一种测试样品中获得数据的系统，该系统包括：
(i)测量模块，定量获自受试者的测试样品中编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2的基因的表达，或VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性；
(ii)存储模块，配置为存储从测量模块输出的数据；
(iii)比较模块，适用于将存储在存储模块上的数据与获自正常参照样品或者获自从所述受试者获取的先前样品的参照和/或对照数据相比较、并提供比较内容(comparisoncontent)；以及
(iv)输出模块，用于为用户显示内容比较，并且如果相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达和/或活性高于从正常参照样品或先前样品获得的参照和/或对照数据，则识别该受试者为可能患有前列腺癌、PIN或ASAP，或前列腺癌的更具侵袭性的形式。
在第九方面，本发明提供计算机执行系统，以便于在受试者中诊断前列腺癌、PIN或ASAP，和/或监测前列腺癌的进展，该系统包括：
(i)确认模块(测定模块，determinationmodule)，配置为接收和输出编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2的基因的表达，或VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性；
(ii)存储模块，配置为存储来自确认模块的输出数据；
(iii)比较模块，适用于将存储在存储模块上的数据与取自正常参照样品或取自从受试者获取的先前的样品的参照和/或对照数据比较，并提供比较内容；以及
(iv)输出模块，用于为用户显示内容比较，其中如果相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达和/或活性高于从正常参照样品或先前样品获得的参照和/或对照数据，则该受试者可能患有前列腺癌、PIN或ASAP，或前列腺癌的更具侵袭性的形式。
在第十方面，本发明提供了计算机可读的存储介质，其包括：
(i)存储数据模块，包含来自受试者的代表编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2的基因的表达，或VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性的数据；
(ii)比较模块，将存储在存储数据模块上的数据与取自正常参照样品或取自来自受试者的先前样品的参照和/或对照数据比较，并提供比较内容；以及
(iii)输出模块，用于为用户显示比较内容，其中如果相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达和/或活性高于从正常参照样品获得的参照和/或对照数据，则该受试者可能患有前列腺癌、PIN或ASAP，或前列腺癌的更具侵袭性的形式。
在第十一方面，本发明提供用于在受试者中诊断结肠癌、胰腺癌或乳癌(乳腺癌，breastcancer)的方法，所述方法包括确定从受试者获取的测试样品是否以比在正常参照样品中编码NAALADL2蛋白的基因或NAALADL2蛋白的表达更高的水平表达：
(I)编码NAALADL2蛋白的基因；或
(Ii)NAALADL2蛋白；
其中与在正常参照样品中相比，在测试样品中编码NAALADL2蛋白的基因或NAALADL2蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在该受试者中结肠癌、胰腺癌或乳癌的存在。
下面的说明适用于本发明任何以上的方面或实施方式。
在本文所披露的本发明的任何方法、测定、系统或存储介质中，受试者优选是人。
测试样品优选是全血、血浆、尿液、精液、粪便、胰腺活检、前列腺活检(例如，前列腺细针活检)、来自根治性前列腺切除术(radicalprostatectomy)的组织、囊液(cystfluid)或胆胰海绵(biliarypancreaticsponge)。
正常参照样品可以包括来自受试者的良性或正常细胞或组织。在一些实施例中，正常的参照样品可以取自与测试样品相同的组织。例如，正常参照样品可以是存在于测试样品中的内部参照。在一些实施例中，正常参照样品可以是来自健康受试者，即未患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者的相应样品类型。例如，正常参照样品可以是取自健康受试者，即未患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者的全血、血浆、尿液或精液。在用于在受试者中监测前列腺癌的进展的方法中，先前样品优选与测试样品类型相同。
确定编码VPS28蛋白、VPS13A蛋白和/或NAALADL2蛋白的基因的表达的步骤可以，例如，通过确定VPS28、VPS13A或NAALADL2mRNA的表达来进行。例如，VPS28、VPS13A或NAALADL2mRNA的表达可以通过定量RT-PCR、数字PCR(digitalPCR)、下一代测序(nextgenerationsequencing，NGS)或RNA印迹(northernblotting)来确定。
确定VPS28、VPS13A和/或NAALADL2蛋白的表达的步骤可以，例如，通过用与相关蛋白结合的抗体检测VPS28，VPS13A和/或NAALADL2蛋白来进行。例如，VPS28、VPS13A和/或NAALADL2蛋白的表达可以通过免疫组织化学、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白印迹(westernblotting)、流式细胞术、多重复用技术(multiplexing)，例如，通过多重ELISA(multiplexedELISA)，或单克隆抗体成像模态(monoclonalantibodyimagingmodalities)和相关细胞表面靶向技术(例如纳米点样)来确定。
VPS28、VPS13A和/或NAALADL2蛋白的表达可以通过确定VPS28，VPS13A和/或NAALADL2蛋白的活性来确定。例如，可以确定NAALADL2蛋白的酶活性。
本发明的每种方法、测定或系统可以包括从受试者获取测试样品的步骤。每种方法、测定或系统还可以包括处理测试样品以获取DNA、cDNA、mRNA和/或蛋白的步骤。
本发明的每种方法、测定或系统可以包括测量(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因的表达；或(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性的步骤。
本发明的每种方法、测定或系统可以包括选择鉴别为患有前列腺癌，PIN或ASAP的受试者用于治疗，或治疗鉴别为患有前列腺癌，PIN或ASAP的受试者的额外步骤。例如，受试者可以被选择或给予手术(例如，根治性前列腺切除术)、化疗和/或放射治疗。
对于低风险疾病(PSA<10，器官限制疾病(限制性器官疾病，organconfineddisease))手术、观察等待(watchfulwaiting)、积极监测(主动监测，activesurveillance)、放射治疗、短距离放射治疗、化学治疗都是可以选择的。患有中度风险疾病的患者(PSA>10，器官限制疾病)较少可能给予观察等待、积极监测或短距离放射治疗，因为很可能会复发。如果本文所述的标记物能预测谁可能进展好/坏，则能够更好地作出该决定。患有高风险疾病的患者(PSA>10，局部晚期)将会给予手术、放射治疗或化疗，但由生物标记物推测的增加的复发风险又可能会影响作出决定。通常首先给予复发性患者放射治疗。如果预测高风险的复发，可以在手术后提供其或化学治疗。
本发明的每种方法、测定或系统还可以包括进一步测试鉴别为可能患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者，或选择鉴别为可能患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者用于进一步的测试的额外步骤。例如，可以从受试者获取活检样品或选择受试者接受活检。如果从患者获取的样品是来自胰腺活检的组织或细胞，则从该测试样品鉴别为可能患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者可以进行重新活检(再活检，re-biopsied)或选择用于重新活检(再活检，re-biopsy)。
在下文中更详细地描述了本发明的这些和其它方面。
附图说明
图1示出了针对VPS13A的核染色的前列腺组织微阵列(TMA)。对于VPS13A肿瘤腺体染色重，而良性腺体根本没有被染色(黑色箭头)。细胞核(核，nuclei)用苏木精复染。染色是点状的，并且在很大程度上在顶端方向上(apically)分布。在高功率下，部分的组织还显示出环样结构(白色箭头)。
图2示出了VPS13A在剑桥TMA(CambridgeTMA)中的表达，通过免疫组织化学确定并按照格利森等级(G3-G5)分级。每位患者有来自两个区域的最少3个良性和6个肿瘤核，以及最多达3个含PIN的核(通常是良性的)。其中在单核中检测到清晰的良性和肿瘤，两区域独立地进行评分。
图3示出了VPS13A在Trans-AtlanticProstateGroup(TAPG)中的表达，通过在格利森等级小于或等于6、7，或者大于或等于8的患者中的IHC确定。各个核给予单独评分。
图4示出了VPS13A在卡罗林斯卡TMA(KarolinksaTMA)中的表达，通过IHC确定。每位患者有3个良性和3个肿瘤核进行评估。测定染色强度和扩展(蔓延，spread)以给出免疫反应性乘积(IRP)。利用Mann-Whitney(曼-惠特尼)双尾t-检验计算P值。
图5示出了Kaplan-Meier估计的无复发存活，其是通过分类VPS13A染色的免疫反应性乘积(IRP)。虚线指示5年的存活。
图6示出了激素难治(hormonerefractory，HR)TMA的VPS13A染色。匹配的激素依赖性(hormonenaive，HN)和HR组织(p＝0.49)之间没有统计学差异，但VPS13A可以从良性中区分(p<0.0001)。
图7示出了VPS13AmRNA在不同等级的前列腺癌中的相对表达。分析来自收集在PAXgene管中的全血的mRNA，用于循环VPS13AmRNA的表达。水平在侵袭性疾病(aggressivedisease)中在落入晚期疾病(advancedisease)之前升高显著。利用带有Kruskal-Wallis校正的单向ANOVA分析分组数据。利用Mann-Whitney成对t-检验，进行格利森3+4和4+3疾病的成对比较。所有结果均相对于平均良性结果来表示。
图8示出了VPS13A在转移患者中的相对表达。分析来自转移患者全血的循环mRNA，用于循环VPS13AmRNA的表达。利用Mann-Whitney成对t-检验，进行成对比较。所有结果均相对于平均激素依赖性结果来表示。
图9示出了VPS13A膜泡和溶酶体之间的关联。将VPS13A膜泡染色并用LAMP2染色溶酶体。用白色箭头显示共区域(co-localisation)事件。
图10示出了巴佛洛霉素(bafilomycin)处理对VPS13A膜泡整合入溶酶体膜的影响。在巴佛洛霉素处理后，VPS13A膜泡与用LAMP2染色的溶酶体膜整合(融合，integrate)。没有VPS13A在整个溶酶体膜分散的证据。
图11示出了VPS13A敲除(敲低，knockdown)对PSA分泌的影响。当将VPS13A敲除到60-70％的内源性水平时，PSA的分泌显著减少。
图12示出了用1,2-二(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)或卡西霉素(calcimycin)处理对VPS13A蛋白表达的影响。用10μMBAPTA(B)、卡西霉素(Cal)或对照(C)处理非靶向对照LNCaP细胞或siVPS13A细胞8小时。经SDS-PAGE分离蛋白裂解物并探测(probe)VPS13A和微管蛋白。
图13用BAPTA和卡西霉素处理对VPS13A膜泡和溶酶体之间融合的影响。用l00mM卡西霉素钙离子载体，或l0nMBAPTA钙螯合剂处理LNCaP细胞4小时。然后将细胞固定并针对LAMP2和VPS13A染色。利用100x镜头，计数10视野(10fieldsofview)的溶酶体数目。然后在同一视野中计数VPS13A融合事件的数目。融合事件分类为VPS13A膜泡接触或整合到LAMP2阳性溶酶体。*显示数据归一化为在各视野中溶酶体的数目。利用Mann-Whitney双尾t-检验计算P-值。
图14示出了染色VPS28的前列腺组织。对于VPS28肿瘤腺体染色重(黑色箭头)，而良性腺体根本没有染色(白色箭头)。染色是点状的并且大部分在细胞核周围。
图15示出了VPS28在剑桥TMA中的表达，通过IHC确定并按照格利森等级(G3-G5)分级。每位患者有来自两个区域的最少3个良性和6个肿瘤核。其中在单核中检测到清晰的良性和肿瘤，两区域独立地进行评分。
图16示出了VPS28在卡罗林斯卡TMA中的表达，通过IHC确定。每位患者有3个良性和3个肿瘤核进行评估。测定染色强度和扩展以给出免疫反应性乘积(IRP)。利用Mann-Whitney双尾t-检验计算P值。
图17示出了通过分类VPS28染色的免疫反应性乘积(IRP)，Kaplan-Meier估计的无复发存活。虚线指示5年的存活。
图18示出了VPS28mRNA在不同等级的前列腺癌中的相对表达。来自全血的mRNA收集在PAXgene管中，分析其循环VPS28mRNA的表达。水平在侵袭性疾病中在落入晚期疾病之前显著升高。利用带有Kruskal-Wallis校正的单向ANOVA分析分组数据。利用Mann-Whitney成对t-检验，进行格利森3+4和4+3疾病的成对比较。所有结果均相对于平均良性结果来表示。
图19示出了VPS28mRNA在转移前列腺癌患者中的相对表达。分析来自转移患者全血的循环mRNA，用于循环VPS28mRNA的表达。利用Mann-Whitney成对t-检验，进行成对比较。所有结果均相对于平均激素依赖性结果来表示。
图20示出了染色NAALADL2和PSMA的前列腺组织。沿基膜(褐色)对于NAALADL2肿瘤腺体染色重(黑色箭头)，而良性腺体根本没有染色(白色箭头)。PSMA染色顶端/腔膜(灰色箭头)。
图21示出了NAALADL2在剑桥TMA中的表达，通过IHV确定并按照格利森等级(G3-G5)分级。每位患者有来自两个区域的最少3个良性和6个肿瘤核。其中在单核中检测到清晰的良性和肿瘤，两区域独立地进行评分。
图22示出了NAALADL2在剑桥TMA中的表达，通过IHV确定并按照病理阶段分级。每位患者有来自两个区域的最少3个良性和6个肿瘤核。其中在单核中检测到清晰的良性和肿瘤，两区域独立地进行评分。
图23示出了NAALADL2在卡罗林斯卡TMA中的表达，通过IHC确定。每位患者有3个良性和3个肿瘤核进行评估，并测定染色强度和扩展以给出免疫反应性乘积(IRP)。利用Mann-Whitney双尾t-检验计算P值。
图24示出了通过分类NAALADL2染色的免疫反应性乘积(IRP)，Kaplan-Meier估计的无复发存活。虚线指示5年的存活。
图25示出了激素难治(HR)TMA的NAALADL2染色。匹配的激素依赖性(HN)和HR组织(p＝0.59)之间没有统计学差异，但NAALADL2可以从良性中区分所有肿瘤(p<0.0001)。
图26示出了NAALADL2在不同格利森评分的前列腺癌患者中的相对表达。来自全血的mRNA收集在PAXgene管中，分析其循环NAALADL2mRNA的表达。水平在侵袭性疾病中在落入晚期疾病之前显著升高。利用带有Kruskal-Wallis校正的单向ANOVA分析分组数据，利用Mann-Whitney成对t-检验，进行格利森3+4和4+3疾病的成对比较。所有结果均相对于平均良性结果来表示。
图27示出了NAALADL2在转移患者中的相对表达。分析来自转移患者全血的循环mRNA，用于循环NAALADL2mRNA的表达。利用Mann-Whitney成对t-检验，进行成对比较。所有结果均相对于平均激素依赖性结果来表示。
具体实施方式
本发明以VPS13A、VPS28和NAALADL2在前列腺癌组织中显示表达增加，并且可用作用于前列腺癌、PIN和ASAP的诊断性和预后性生物标记物的发现为基础。发明人已发现，这些生物标记物能够区分不同等级和病理阶段的前列腺癌并能够用于监测进展至更具侵袭性形式的疾病。如本文所公开的，这些生物标记也可以用于预测患有前列腺癌的患者的预后。本发明人还发现，NAALADL2也可以用作用于结肠癌、胰腺癌或乳癌的诊断性生物标记物。
人VPS13A、人VPS28和人NAALADL2的核苷酸和氨基酸序列在下面示出。VPS13A也被称为CHAC和KIAA0986。VPS28也被称为液泡蛋白分选相关蛋白28同系物(vacuolarproteinsorting-associatedprotein28homolog)、H-Vps28、ESCRT-1复合物亚基VPS28和酵母E类蛋白Vps28p同系物(homolog)。NAALADL2也被称为失活的N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶样蛋白2、NAALADaseL2、N-乙酰化α-连接的酸性二肽酶2和谷氨酸羧肽酶II型非肽酶同源物(homologue)。
如上所述，本发明涉及用于在受试者中诊断前列腺癌、PIN或ASAP的方法，用于在受试者中确定前列腺癌的等级或病理阶段的方法，用于在受试者中监测前列腺癌的进展的方法，或用于预测患有前列腺癌的受试者的预后的方法。还提供了测定、系统和存储介质。
在用于在受试者中诊断前列腺癌、PIN或ASAP的方法中，在从该受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和/或编码VPS28蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白和/或VPS28蛋白的表达和/或活性与在正常参照样品中相应一种或多种基因和/或一种或多种蛋白的表达相比增加，指示该患者可能患有前列腺癌、PIN或ASAP。
如本文所示，VPS13A和VPS28在患有BPH的受试者中的表达不增加，而因此该方法能够区分前列腺癌/PIN/ASAP和BPH的存在。
因此，本发明还提供用于诊断BPH的方法，该方法包括确定获自受试者的测试样品是否以比在正常参照样品中相应一种或多种基因和/或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达PSA，但不是VPS13A、VPS28和/或NAALADL2，其中与正常参照样品相比，测试样品中PSA的表达水平较高，但不是VPS13A、VPS28和/或NAALADL2，指示该受试者中BPH的存在。能够以该方式诊断BPH意味着怀疑患有前列腺癌的受试者被过度治疗(over-treat)的可能性较小。
在用于在受试者中确定前列腺癌的等级的方法中，在从该受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因，和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性与在正常参照样品相比增加，指示该患者中的前列腺癌等级。
一种或多种相应基因或蛋白的表达和/或活性指示前列腺癌的等级，这样一种或多种相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示前列腺癌的更高等级。
例如，在从该受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因，和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性与在正常参照样品中的相比增加，指示该患者可能患有格利森等级至少3+3的前列腺癌。例如，该受试者可能患有格利森等级3+4或4+3的前列腺癌。最可能地，该受试者患有格利森等级4+3的前列腺癌。
通常由病理学家通过组织活检的显微镜检查来确定肿瘤的格利森等级。病理学家指定最常见的肿瘤图案(图像，pattern)的等级和下一个最常见肿瘤图案的第二等级。这两种等级累加在一起以产生格利森评分(见Epstein等，2005)。以下描述了图案：
图案1：
紧密充满但分离的、均匀的、圆形到椭圆的中型(中等尺寸，medium-sized)腺泡的局限性结节(circumscribednodule)(相比于图案3较大的腺体)
图案2：
像图案1，相当局限性的，然而在肿瘤结节的边缘可能有极小的渗透(浸润)。腺体更松弛地排列并且不完全如格利森图案1那样均匀。
图案3：
离散的腺体单元(glandularunit)；相比于格利森图案1或2中所看到的通常较小的腺体。在非肿瘤性前列腺腺泡之中和之间渗透。大小和形状变化显著。平滑限制的小筛状肿瘤结节。
图案4：
融合的微腺泡腺体(microacinarglands)；腺腔成形较差的界限不清楚的腺体(ill-definedglands)；大筛状腺体；具有不规则边缘的筛状腺体；肾上腺样瘤(hypernephromatoid)。
图案5：
基本上无腺体分化，由实体片(solidsheet)、线，或单细胞组成；带有中心坏死的由乳突筛状或实体块(solidmasses)围绕的粉刺状癌。
在用于在受试者中确定前列腺癌的病理阶段的方法中，在从该受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因，和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性与在正常参照样品中的相比增加指示该受试者中前列腺癌的病理阶段。
一种或多种相应基因的表达或一种或多种相应蛋白的表达和/或活性指示前列腺癌的病理阶段，这样一种或多种相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示前列腺癌的更高病理阶段。
例如，在从受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因，和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性与在正常参照样品中的相比增加指示该受试者可能患有病理阶段至少pT2或pT3的前列腺癌。
以下提供了TNM病理分级系统的详细说明(取自第6版的AJCCCancerStagingManual(AJCC癌症分级手册)，2002)和第6版的UICCClassificationofMaliganantTumours(恶性肿瘤的UICC分类)。
评估(原发)肿瘤('Τ')
·TX：不能评估原发肿瘤
·T0：没有肿瘤证据
·T1：存在肿瘤，但临床上不可检测或具有以下图像
οTla：在切除的少于5％的前列腺组织中偶然发现肿瘤(由于其它的原因)
οTib：在切除的大于5％的前列腺组织中偶然发现肿瘤
οTic：由于血清PSA升高而进行的针吸活检中发现肿瘤
·T2：在检查时可以感觉到(触诊到)肿瘤，但没有扩散出前列腺
οT2a：肿瘤是在前列腺腺体双叶(lobes)的一个的一半或少于一半中。
οT2b：肿瘤是在一叶的一半以上，但不两个都有
οT2c：肿瘤是在双叶中
·T3，肿瘤扩散通过前列腺囊(prostaticcapsule)(如果仅部分通过，其仍然是T2)
οT3a：肿瘤扩散通过在一侧或两侧上的囊
οT3b：肿瘤已经侵入一个或两个精囊
·T4：肿瘤已经侵入附近的其他结构评估区域淋巴结(‘N’)
·NX：不能评估区域淋巴结
·N0：没有扩散到区域淋巴结
·N1：已经扩散到区域淋巴结评估远端转移(‘M’)
·MX：不能评估远端转移
·MO：没有远端转移
·M1：有远端转移
οM1a：癌已扩散到明显超出区域的淋巴
οMlb：癌已经扩散到骨
οMlc：癌已扩散到其它位点(不论骨受累)
在用于在受试者中监测前列腺癌的进展的方法中，在从该受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因，和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性与在从所述受试者获取的先前样品中的相比增加指示前列腺癌进展至更具侵袭性的形式。
在从该受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因，和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性与在从所述受试者获取的先前细胞或组织样品中的相比增加，可指示前列腺癌已发展到至少3+3的格利森等级。例如，前列腺癌可能已发展到3+4的格利森等级或4+3的格利森等级。最可能地，前列腺癌已发展到4+3的格利森等级。通过该方式，该方法能够指示前列腺组织从正常到格利森等级3+3、从格利森等级3+3到格利森等级3+4，或从格利森等级3+4到格利森等级4+3的进展。
在用于预测患有前列腺癌的受试者的预后的方法中，在从该受试者获取的测试样品中：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因，和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性与在正常参照样品中相应一种或多种基因和/或一种或多种蛋白的表达和/或活性相比增加，指示不良预后。
例如，一种或多种相应基因或蛋白的表达和/或活性增加可预测减少的无进展生存期(无进展存活时间)。
一种或多种相应基因或蛋白的表达和/或活性增加可指示在根治性前列腺切除术后增加的临床或生化复发可能性。这独立于激素状态。
本发明的方法、测定或系统中，受试者优选为哺乳动物。更优选地，受试者是人。最优选地，受试者是人类男性。例如，患者可以是至少40岁的人类男性。优选受试者没有预先治疗前列腺癌，例如没有预先的放射治疗。
本发明的方法、系统或测定包括以下步骤：在取自受试者的测试样品中确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2的表达和/或活性。测试样品优选全血、血浆、尿液、精液、粪便，来自胰腺活检的组织或细胞、来自根治性前列腺切除术或胆胰海绵的组织或细胞。
可以收集血液诸如全血、血清、血浆-EDTA、血浆-柠檬酸盐(plasma-citrate)或血浆肝素。可以利用PAXgene管收集循环RNA。可通过活检(TRUSP、模板、饱和度或者经针收集组织的其他方法)或者要么是开放的要么是机械的根治手术来收集组织。可收集尿液并且既可以“完整”存放或分离成尿沉淀物和上清液，并且均可以被检测。
本发明的每种方法、测定或系统还可以包括处理测试样品以得到DNA、cDNA、mRNA和/或蛋白的步骤。例如，可以利用商业化试剂盒(如QiagenTM试剂盒)或制作化学溶液以从生物流体中沉淀DNA、RNA或蛋白来获得DNA、cDNA、mRNA和/或蛋白。
在本发明的方法、测定或系统中，测试样品中VPS13、VPS28和/或NAALADL2的表达可以在mRNA水平或在蛋白水平确定。例如，VPS13A、VPS28和/或NAALADL2基因的表达可以通过分别检测VPS13A、VPS28和/或NAALADL2mRNA的水平来确定。例如，VPS13A、VPS28和/或NAALADL2mRNA可以从取自受试者的全血中获得。例如，VPS13A、VPS28和/或NAALADL2在蛋白水平的表达可以通过分别检测VPS13A、VPS28和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性来确定。
VPS13A、VPS28和/或NAALADL2mRNA的表达可通过本领域技术人员已知的任何方法来确定。例如，可以通过定量RT-PCR、数字PCR、下一代测序或RNA印迹法确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2mRNA的水平。这些方法中的每一种都是本领域的技术人员熟知的。例如，可以利用阵列、基因芯片或包括一种或多种能够与VPS13A、VPS28和/或NAALADL2特异性杂交的多核苷酸的基因组来确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2mRNA的表达。下一代测序和/或能够与VPS13A、VPS28和/或NAALADL2特异性杂交的多核苷酸可以用于检测编码VPS13A、VPS28和/或NAALADL2蛋白的基因中的缺失或突变。以下预制的Applied(应用生物系统公司)的引物/探针组可以用于检测VPS13A、VPS28和/或NAALADL2的mRNA表达：Hs00362891m1(VPS13A)、Hs00211938m1(VPS28)和Hs00822484m1(NAALADL2)。
也可以确定一种或多种管家基因(housekeepinggenes)的表达，例如rpl2或核糖体18S，以便控制存在于测试样品中的mRNA的量。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2蛋白的表达。例如，VPS13A、VPS28和NAALADL2蛋白的水平可以通过免疫组织化学、ELISA检测、蛋白印迹、流式细胞术、多重复用技术(例如，多重ELISA)，或单克隆抗体成像模态和相关细胞表面靶向技术(例如纳米点样)来确定。还可以通过成像来确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2蛋白的表达。例如，NAALADL2是跨膜蛋白，并因此，可以通过成像方法确定其表达，例如，通过利用直接针对NAALADL2细胞外结构域的抗体来检测NAALADL2。还可以通过确定VPS13A、VPS28和NAALADL2蛋白的活性来确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2蛋白的表达。例如，可以确定NAALADL2的酶活性。可以利用以下抗体确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2的表达：均识别NAALADL2的HumanProteinAtlas(人类蛋白质表达图集)012413和R&D系统(R&DSystems)AF4665；识别VPS13A的HumanProteinAtlas021662，以及均检测VPS28的HumanProteinAtlas024745和SantaCruzsc-30179。
可通过本领域技术人员已知的任何方法来确定VPS13A、VPS28和/或NAALADL2蛋白的活性。例如，可以通过分析其酶活性来确定NAALADL2的活性。
本发明的方法包括确定测试样品是否以比在正常参照样品中的相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的步骤。本发明的方法还可以包括与正常参照样品中的相应一种或多种蛋白的活性相比，确定在测试样品中VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的活性的步骤。
适用于本发明的方法、测定或系统的正常参照样品的实例包括来自受试者的良性或正常细胞或组织。在一些实施方式中，正常参照样品可以取自与测试样品相同的组织。例如，正常参照样品可以是存在于测试样品中的内部参照，如存在于测试样品中的正常、良性细胞。在一些实施方式中，正常参照样品可以是来自健康受试者，即未患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者的相应样品类型。例如，正常参照样品可以是取自健康受试者，即未患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者的全血、血浆、尿液或精液。在用于在受试者中监测前列腺癌的进展的方法中，先前样品优选与测试样品类型相同。
在用于监测受试者中的前列腺癌或PIN的进展的方法中，将测试样品中VPS13A、VPS28和/或NAALADL2的表达和/或活性与在取自所述受试者的先前样品中的相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达和/或活性进行比较。用于本发明的方法、测定或系统的先前样品优选与测试样品具有相同的类型。先前样品可以比测试样品早获得至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少六个月、至少一年、至少两年或至少三年。优选地，使用与先前细胞或组织样品相同的方法确定测试样品中VPS13A、VPS28和/或NAALADL2的表达和/或活性。
为了以比正常参照样品中或先前样品中的相应一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达“更高”的水平表达，则测试样品中的：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因，或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性优选比正常参照样品中或先前样品至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍高。
本发明的方法、测定或系统可以包括确定测试样品中编码前列腺特异性抗原(PSA)的基因的表达或PSA蛋白的表达，并计算VPS13A、VPS28和/或NAALAD12表达：PSA表达的比例的步骤。PSA的表达代表肿瘤负荷的替代测量(替代量度，surrogatemeasure)且当前用于临床诊断前列腺癌。VPS13A、VPS28和/或NAALAD12表达：PSA表达的比例越高，该受试者患有前列腺癌的可能性越大。
在本发明的方法、测定或系统中检测的基因或蛋白可以是编码VPS13A、VPS28或NAALADL2蛋白的基因的片段，或VPS13A、VPS28或NAALADL2蛋白的片段。
在本发明的方法、测定或系统中检测的基因或蛋白可以与编码VPS28、VPS13A或NAALADL2蛋白的基因，或与VPS28、VPS13A或NAALADL2蛋白具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的同源性。
在本发明的方法、测定或系统中，可以单独确定VPS13A、VPS28或NAALADL2中任何一种的表达和/或活性。替换地，可以组合确定这些基因或蛋白的任意两种或三种的表达和/或活性。例如，可以确定VPS13A和VPS28、VPS28和NAALAD2，或VPS13A和NAALADL2的表达和/或活性，或可以确定VPS13A、VPS28或NAALADL2的表达和/或活性。优选的组合包括VPS13A和VPS28，以及VPS28和NAALAD2。
在本发明的方法、测定或系统中，还可以确定一种或多种另外的基因或蛋白的表达和/或活性。例如，还可以确定PSA、PCA-3和MSMB的表达和/或活性。PSA和PCA-3的表达先前已显示出在前列腺癌中增加，而MSMB的表达则已显示出减少(Salagierski等，2012，和Whitaker等，2010)。
还可以在受试者中确定受试者的TMPRSS2-ERG状态，以分级(stratify)来自本发明的方法、测定或系统的数据(Salagierski等，2012)。
本发明的每种方法、测定或系统可以包括从受试者获取测试样品的步骤。例如，测试样品可以是全血、血浆、血清、尿液、精液、粪便、来自胰腺活检的组织或细胞、来自根治性前列腺切除术或胆胰海绵的组织或细胞。本发明的每种方法、测定或系统还可以包括处理测试样品以得到DNA、cDNA、mRNA和/或蛋白的步骤。例如，可以利用商业化试剂盒(QiagenTM试剂盒)或制作化学溶液以从生物流体中沉淀DNA、RNA或蛋白来获得DNA、cDNA、mRNA和/或蛋白。
本发明的每种方法、测定或系统可以包括测量(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因的表达；或(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白的表达和/或活性的步骤。
本发明的每种方法、测定或系统可以包括治疗鉴别为患有前列腺癌，PIN或ASAP的受试者，或选择鉴别为患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者用于治疗的额外步骤。例如，受试者可以被给予或选择进行手术(例如，根治性前列腺切除术)、化学治疗和/或放射治疗。鉴定为患有格利森等级4+3的前列腺癌的受试者很可能需要手术和/或治疗性干预。例如，鉴定为患有格利森等级4+3的前列腺癌的受试者可以被选择进行或给予手术(例如，根治性前列腺切除术)和/或放射治疗。鉴定为患有格利森等级4+3的前列腺癌的患者可以被选择进行或给予化疗。鉴定为患有病理阶段pT2的前列腺癌的受试者很可能被选择进行或给予手术(例如，根治性前列腺切除术)。鉴定为患有病理阶段pT3的前列腺癌的患者可以被选择进行或给予手术(例如，根治性前列腺切除术)和辅助性化疗。这样的鉴定为患有病理阶段pT3的前列腺癌的受试者还可以被选择进行或给予放射治疗。
本发明的每种方法、系统或测定还可以包括进一步测试鉴别为可能患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者，或选择鉴别为可能患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者用于进一步的测试的额外步骤。例如，可以从受试者获取活检样品或选择受试者接受活检。如果从患者获取的样品是来自胰腺活检的组织或细胞，则从该测试样品鉴别为可能患有前列腺癌、PIN或ASAP的受试者可以进行重新活检或选择用于重新活检。
本发明的每种方法、测定或系统可以包括将从本发明方法获取的VPS13A、VPS28和/或NAALAD2的表达水平和/或活性输入计算机数据库以及根据测试样品中VPS13A、VPS28和/或NAALAD2的表达水平和/或活性来对受试者进行分类的步骤。
本发明的每种方法、测定或系统可以结合细胞或组织染色使用，例如苏木精和曙红染色，以提供关于前列腺癌的等级或病理阶段的诊断或预后或给予关于前列腺癌的等级或病理阶段的其他信息。
已给出包括以下试验实施例的本披露内容，本发明的其他方面和实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
试验细节
VPS13A
材料和方法
组织微阵列(TMA)和患者群组
使用来自在2001和2005之间在英国剑桥的阿登布鲁克斯(Addenbrookes)医院进行的根治性前列腺切除术的剑桥TMA-前列腺组织，利用取自石蜡包埋组织的二重(duplicate)0.6mm的核和BeecherManualTMAArrayer(Beecher手动TMA阵列点样器)来制备组织微阵列(TMA)(Whitaker等，2010)。总共，使用来自32位不同患者的组织来产生TMA。对于每位患者由专业泌尿病理学家(AnneWarren(AW))鉴定良性或正常前列腺区域(n＝4)、前列腺上皮内瘤变(PIN)(n＝4)和恶性(n＝2-6)。对于每位患者，恶性组织获自至少一个，并在可能的情况下，最多三个不同的肿瘤病灶。由专业泌尿病理学家(AW)在评分任何IHC染色之前确认病理阶段和格利森等级。
使用来自在1998和2002之间在瑞典斯德哥尔摩卡的卡罗林斯卡(Karolinska)医院进行的根治性前列腺切除术的卡罗林斯卡TMA-前列腺组织，利用取自石蜡包埋组织的3个1mm的核和BeecherManualArrayer来制备组织微阵列(TMA)。总共，使用来自257位不同患者的肿瘤组织来产生TMA。对于每位患者，恶性组织鉴定并获自至少一个，并在可能的情况下，最多三个不同的肿瘤病灶。由专业泌尿病理学家(LarsEgevad)在评分任何IHC染色之前确认病理阶段和格利森等级。每位患者的良性组织不包括在该TMA中。中位随访(medianfollowup)为61个月并基于前列腺癌相关的死亡。使用匹配的良性和肿瘤样品用于验证诊断效用。
来自美国和英国的跨大西洋前列腺组(TAPG)TMA-临床医师和科学家集合了最大的通过保守方法治疗的前列腺癌组群，具有初始血清PSA水平和集中的(centralised)格利森评分。详细的组群集合方法已在之前的文章中描述(Cuzick等，2006)。总之，本研究包括他们在诊断时年龄在76岁之下并在1990年1月到1996年12月之间诊断患有临床上局限性的(localised)前列腺癌的男性。排除在诊断的6个月内进行根治性前列腺切除术或放射治疗的、在诊断的6个月时或6个月内有转移性疾病明确证据的(通过骨扫描、X射线、CT扫描、MRI、骨活检、淋巴结活检或盆腔淋巴结清扫术(pelviclymphnodedissection))或有转移性疾病临床适应症(包括病理性骨折、软组织转移、脊柱压迫或骨痛)的患者。通过由登记数据收集人员和培训过的医务人员查阅病历来确定合格(eligibility)。集中查阅临床分期。所有患者接受由一组泌尿生殖病理学家进行的集中格利森分级并具有初始诊断的PSA血清可用。鉴定来自经尿道切除术样本的可用的块(block)，并且对于癌变区域标记相应的苏木精和曙红部分。
这些是以一系列24个块使用0.6mm的圆柱形组织的微阵列。四个核取自不同肿瘤区域，以考虑在每种情况中的肿瘤异质性，并且还取样邻近正常组织的区域。
含有来自前列腺、食管、肝脏、甲状腺、舌、软组织淋巴、乳腺(breast)、结肠、胃、舌、皮肤、肺、肾、卵巢、子宫、睾丸、胰腺、胸腺的2种肿瘤和1种正常核的多肿瘤/正常TMA-ATMA购自StrettonScientific。
将来自75位HR患者的激素难治TMA(HRTMA)前列腺组织(定义为两个连续的PSA上升)制成TMA。组织取自于2001年到2005年之间在英国剑桥的阿登布鲁克医院进行的前列腺经尿道切除术。中位随访为86个月。对于TMA，从石蜡包埋组织中取出0.6mm的核并使用Beecher手动TMA点样仪排列。在可能的情况下，从每位患者获取单独肿瘤(n＝2)、混合的肿瘤和良性(n＝2)，并且还包括单独的非匹配良性。
免疫组化
所有免疫组织化学(IHC)利用Bondmax自动染色仪执行，使用1.5MTrisEDTA，pH8.0用于抗原修复(antigenrecovery)。抗VPS13A抗体(HumanProteinAtlas)以1∶50使用，用DAPI复染以使核显现。
评分和IHC数据分析
对于使用剑桥TMA初始资格鉴定，对每个核的所有区域进行评分，这对于异种核中的相邻区域通常引起多个评分。为了使用TAPGTMA进行验证，基于主要病理学给予每个核单个分数(评分由HW和AW执行)。剑桥和TAPGTMA被评分为无(无染色存在)、弱(染色可以看到但不一致和/或弱)、中等(明显染色)或强(不能获得任何更强的染色)。卡罗林斯卡TMA由LarsEgevad和AmandaSeipel来打分，并且按照强度和癌细胞在彼此独立地等级0至3上染色的比例来计算每个核的分数。计算三种强度和打分比例的平均值以给出平均强度和比例值。然后将这些值相乘以给出免疫反应性乘积(immunoreactivityproduct，IRP)。
计算灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)是可能的，并示出结果。使用带有Kruskal-Wallis校正的单向ANOVA计算所有组的p值(n＝≥3)。利用MannWhitney双尾t-检验完成所有成对比较。
为了产生Kaplan-Meier曲线，时间-对-事件分析使用生化复发率作为结果。在Cox回归分析中评估免疫反应性乘积指数和生化复发率之间的关联，估计测定用于关联的带有相应95％置信区间的危险比(HR)。对于采用的每种蛋白，将免疫反应性乘积指数分类为三组(0-3、3-5，以及>5)，以最低类别作为参照组。进行粗分析和针对年龄、格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，以及术前PSA的调整分析。PAXgene
将来自患者的2.5ml血收集在PAXgene管中并根据生产商的使用说明存储。使用PAXgeneRNA血液试剂盒(Qiagen)通过Tepnel提取RNA，然后利用NanodropND100定量。按照之前通过qPCR分析mRNA表达(Thirkettle等，2009)。用于qPCR中的引物见表1。每组中收集12个样品(良性、格利森3+3、3+4、4+3、4+4/4+5)并在转移组中(收集)11个样品。良性男性都具有升高的PSA但阴性的活检，提示一部分(约30％)目前为止未检测到癌。
初始转移样品来自具有不同激素状态的男性范围。后续的、更详细的分析在有12位激素依赖、12位激素复发和11位激素反应性患者的良好定义群体中完成。
共聚焦显微术
按之前使用抗VPS13A抗体(1：50，HumanProteinAtlas)和LAMP2抗体(1∶500，BDBiosciences)将细胞固定并染色(8)。使用Alexafluor594和488第二抗体(MolecularProbes)将细胞进行成像并用DAPI染色。利用NikonEclipse共焦显微镜使用l00x镜头来获得所有图像。对于钙改性(calciummodifying)实验，在用10μM的钙离子载体卡西霉素(Invitrogen)或10μM的的钙螯合剂1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N'、N'-四乙酸(BAPTA)(Invitrogen)处理8小时之前，LNCaP细胞按照之前生长至～50％汇合(融合，confluence)(Whitaker等，2007)。
PSA测量
将6.67x105的已经用要么siVPS13A要么加扰对照(scrambledcontrol)稳定转染的LNCaP细胞在RPMI培养基中培养72小时，培养基中补充有10％的FBS。收获培养基并在5500rpm离心5分钟以除去细胞碎片。由阿登布鲁克医院的临床生物化学分析实验室(ClinicalBiochemistryAssayLaboratory)执行超敏PSA测试。在生长72小时后所有结果归一化到细胞数量。
细胞裂解物产生和免疫印迹
按照所描述的(8)产生蛋白裂解物，并在针对VPS13A(1∶1000，HumanProteinAtlas)、FAK(1∶1000，细胞信号技术(CellSignalingTechnology))pTyr397-FAK(1：1000，细胞信号技术)或微管蛋白(1∶2000，Abeam)的印迹前经SDS-PAGE分离。
结果
VPS13A作为诊断标记物的资格鉴定
利用免疫组织化学(IHC)在前列腺组织上对VPS13A表达进行评价。染色是点状的，并且向腔上皮细胞的顶端膜分布，这提示在胞吞中的可能作用。部分的组织还显示出相对大的圆形胞质结构(cytoplasmicstructure)(图1)，提示在吞噬作用或自噬中的可能功能。
为了评估VPS13A针对前列腺组织的特异性如何，我们使用由来自16种不同器官的多组织核(tissuecore)组成的多-肿瘤/正常组织微阵列(TMA)。VPS13A在正常肾中显示出一些表达，但在所有其他组织中的表达是低的或检测不到的。
然后在包括104位患有多良性、前列腺上皮内瘤变(PIN)和针对每位个体取样的肿瘤区域的剑桥TMA中确定VPS13A的表达，VPS13A在PIN和肿瘤中与良性相比高度显著上调(图2)(p<0.0001)。阳性预测值(PPV)为76％，且阴性预测值(NPV)为98％。
VPS13A作为诊断标记物的验证
使用独立的TAPGTMA用于验证VPS13A作为用于前列腺癌诊断标记物的效用并显示出与剑桥TMA类似的结果，PPV为73％以及NPV为87％(图3)。当通过肿瘤状态或格利森等级分级数据时，VPS13A表达是高度显著的诊断标记物(表2和3)(p<0.0001)。VPS13A染色和格利森等级可用于709种癌症核(对于单变量分析和多变量分析，使用在癌症核中的最大人工强度(手动强度，ManualIntensity)值)。表2和表3说明良性、肿瘤和PIN之间的VPS13A人工强度(MI)高度显著不同(表2，p<0.0001)，以及当分成三类时(<7、7和>7，表3，p<0.0001)的格利森评分。这证实VPS13A为有用的诊断标记物。
卡罗林斯卡TMA具有有限数量的患有良性以及肿瘤核的患者呈现在TMA上。这些患者单独分析为额外的验证群组并支持了我们的发现，即良性和肿瘤组之间VPS13A蛋白的表达显著不同(p<0.0001)(图4)。
VPS13A作为预测性标记物的资格鉴定和验证
卡罗林斯卡TMA是由有61个月的中位随访的根治性前列腺切除术样本形成，其允许分析VPS13A作为以在根治性前列腺切除术后预测复发和后续死亡的标记物。采取弱(<3)、中等(>3<5)和强(>5)VPS13AIHC的免疫反应性乘积(IRP)，产生Kaplan-Meier曲线(图5)。有弱VPS13A表达的患者有20％的机会5年内死于前列腺癌，而有中等和高表达的患者有40％的机会在5年内复发和死亡，即两倍死亡的可能性。危险比(hazardratio)显示有VPS13A升高的男性(IRP>5)在根治性前列腺切除术后有超过两倍的复发和死亡可能性(p＝0.01)(表4)。当根据年龄、格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，以及术前PSA调整危险比时，危险比降到1.9且其变得较为不显著(p＝0.06)。
TAPGTMA，由TURP样品形成，同样具有>10年的以死亡为终点的随访。当将数据由MI分成两组(0和1对2和3或MI1对2、3)时，VPS13A在单变量分析中边界显著(表5)。这最可能反映了样品收集方法相比于卡罗林斯卡样品(根治性前列腺切除术(卡罗林斯卡)对TURP(TAPG))。
VPS13不能预测激素状态
在LNCaP细胞系中，没有VPS13A雄激素调节的证据。为了确定这是否与人组织中的一致，我们评估了VPS13A在激素难治TMA上的表达(图6)。虽然VPS13A可以显著区分良性和任何肿瘤样品(p<0.001)，但它不能区分激素依赖性(HN)和激素难治(HR)肿瘤(p＝0.49)。
作为替代端点的循环VPS13AmRNA
从全血中提取循环mRNA并进行qPCR，以检测循环VPS13AmRNA(图7)。在所有组的循环VPS13AmRNA的量之间的差异非常显著(p<0.0001)。与良性相比，水平在较低级肿瘤中升高，但在格利森4+4/4+5和转移组中它们急剧下降(dip)。在转移组中可检测的VPS13A可以反映该组的异类激素状态。最显著的是在出现格利森4疾病时的循环VPS13AmRNA的显著上升。格利森3+3与格利森3+4和4+3的比较，显示出高度显著的差异(p<0.0001)。另外，格利森3+4和4+3疾病中VPS13AmRNA之间有显著差异(p＝0.016)，提示循环VPS13A可能能够诊断侵袭性疾病。
在第一种实验中，转移群组是激素依赖性、激素治疗(激素反应性)和激素难治(即不再响应激素治疗)的患者的混合。为了更密切检查该转移组，第二实验检查循环RNA在12位激素依赖性、12位激素复发和11位激素响应患者中的表达(图8)。尽管激素依赖性和激素反应性患者之间有差异，但没有结果是统计学显著的。
VPS13A与溶酶体和PSA分泌相关
利用共焦显微镜，我们已经确认，VPS13A膜泡不与任何良好表征的膜泡室如早期/晚期核内体或吞噬体共定位。然而，我们利用溶酶体标记物LAMP2确实看到与溶酶体的关联。对照细胞显示VPS13A膜泡和溶酶体室之间的清晰关联，与膜泡融合的"吻与跑(kissandrun)"假设相符(图9)。此外，当用巴佛洛霉素(bafilomycin)(已知阻断溶酶体与自噬体融合)处理细胞，看到VPS13A膜泡整合入溶酶体膜(图10)。没有看到VPS13A在整个溶酶体膜上分散的迹象。
因为已知PSA在溶酶体中进行加工以产生其分泌的、活化形式，我们分析了来自用siVPS13A或加扰对照稳定转染的LNCaP细胞的培养基中分泌的PSA。当将VPS13A敲除到30-40％的内源性水平时，可在培养基中检测的PSA的分泌显著地减少(P＝0.003)(图11)。这表明包含在VPS13A膜泡中的VPS13A或运输物(载物，cargo)正在改变PSA的加工或分泌。这些结果与和良性组织相比肿瘤中升高的PSA和VPS13A一致。
VPS13A和钙
已知钙信号调节一些膜泡融合事件，并且我们通过将细胞用钙螯合剂BAPTA和钙离子载体卡西霉素处理对其进行了测试。当细胞用卡西霉素处理时，VPS13A细胞内水平增加(图12)。用BAPTA处理后VPS13A表达没有显著改变。为了确定这是否影响到VPS13A定位，针对LAMP2和VPS13A复染细胞并计数膜整合事件的数量。在用卡西霉素处理细胞中，与溶酶体关联的VPS13A膜泡的数量非常显著地下降(p＝0.0004，图13)。钙信号和VPS13A之间的连接可以解释患有癫痫的舞蹈病棘形红细胞增多症患者的表型，可能是由于钙信号缺陷。
VSP28
材料和方法
所有TMA与用于VPS13A的那些相同并以相同方式评分。
结果
VPS28作为诊断标记的资格鉴定
我们利用免疫组织化学(IHC)评估了VPS28在前列腺组织上的表达。染色为膜泡并位于腔上皮细胞的核周区域，与高尔基体一致(图14)。为了评估VPS28针对前列腺组织的特异性如何，我们使用由来自16种不同器官的多组织核组成的多-肿瘤/正常组织微阵列(TMA)。VPS28在正常结肠中显示出一些表达，但在所有其他组织中的表达是低的或检测不到的。在剑桥TMA中确定VPS28的表达，VPS28在肿瘤中与良性相比高度显著上调(图15)(p<0.0001)。阳性预测值(PPV)为74％，且阴性预测值(NPV)为98％。
VPS28作为诊断标记物的验证
卡罗林斯卡TMA具有有限数量的患有良性以及肿瘤核的患者呈现在TMA上。这些患者单独分析为额外的验证群组并支持了我们的发现，即良性和肿瘤组之间VPS28蛋白的表达显著不同(p<0.0001)(图16)。
VPS28作为预测性标记物的资格鉴定
卡罗林斯卡TMA允许分析VPS28作为以在根治性前列腺切除术后预测复发和后续死亡的标记物。采取弱(<3)、中等(>3<5)和强(>5)VPS28IHC的免疫反应性乘积(IRP)，产生Kaplan-Meier曲线(图17)。有弱或中等VPS28表达的患者有25％的机会5年内死于前列腺癌，而有高表达的患者有38％的机会在5年内复发和死亡。当根据年龄、格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，以及术前PSA调整危险比时，危险比显示有VPS28升高的男性(IRP>5)在根治性前列腺切除术后有1.9倍的复发和死亡可能性(表6)。然而，p值是不显著的。作为替代端点的循环VPS13AmRNA
从全血中提取循环mRNA并进行qPCR，以检测循环VPS28mRNA(图18)。在所有组中的循环VPS28mRNA的量之间的差异非常显著(p<0.0001)。与良性相比，水平在较低级肿瘤中升高，但在格利森4+4/4+5和转移组中它们急剧下降。可检测的VPS28在转移组中可以反映该组的异类激素状态。最显著的是在出现格利森4疾病时的循环VPS28mRNA的显著上升。格利森3+3与格利森3+4和4+3的比较显示出非常显著的差异(p<0.0001)，提示循环VPS28可用于监测格利森6患者的进展。然而，格利森3+4和4+3疾病中VPS28mRNA之间没有显著差异(p＝0.21)。当我们检验定义的转移组(12位激素依赖性、12位激素复发和11位激素响应患者)时，各组之间没有显著差异(图19)。
NAALADL2
材料和方法
所有TMA与用于VPS13A的那些相同并以相同方式评分。
集落形成试验
使用CytoSelectTM96-孔细胞转化分析(软琼脂集落形成)(CellBiolabs)。简单地说，在4次生物重复中对于每种稳定细胞系每个孔中总共接种1250个细胞。在37℃在5％CO2的孵育7天后，然后按照生产商的使用说明确定锚定非依赖性生长(anchorageindependentgrowth)的定量。
结果
NAALADL2作为诊断标记物的资格鉴定和验证
我们利用免疫组织化学(IHC)评估了NAALADL2在前列腺组织上的表达。染色为膜的并限制于的基底细胞膜，与用PSMA所见到的顶端染色形成鲜明对比(图20)。为了评估NAALADL2针对前列腺组织的特异性如何，我们使用由来自16种不同器官的多组织核组成的多-肿瘤/正常组织微阵列(TMA)。NAALADL2在乳腺、胰腺和结肠肿瘤中显示出一些表达，但在所有其他组织中的表达是低的或检测不到的。在剑桥TMA中确定NAALADL2的表达，且当通过格利森等级分级并与良性相比时是非常显著地上调的(图21)(p<0.0001)。阳性预测值(PPV)为78％，且阴性预测值(NPV)为87％。当结果由病理阶段分级时，也有显著性差异(p＝0.004)。当肿瘤已逸出前列腺囊时(pT3)，NAALADL2有尤其显著的增加(图22)。
NAALADL2作为诊断标记物的验证
卡罗林斯卡TMA具有有限数量的患有良性以及肿瘤核的患者呈现在TMA上。这些患者单独分析为额外的验证群组并支持了我们的发现，即良性和肿瘤组之间NAALADL2蛋白的表达显著不同(p<0.0001)(图23)。
NAALADL2作为预测性标记物的资格鉴定和验证
卡罗林斯卡TMA允许分析NAALADL2作为以在根治性前列腺切除术后预测复发和后续死亡的标记物。采取弱(<3)、中等(>3<5)和强(>5)NAALADL2IHC的免疫反应性乘积(IRP)，产生Kaplan-Meier曲线(图24)。有弱的或无NAALADL2表达的患者有20％的机会5年内死于前列腺癌，而有中等和高表达的患者有27％和34％的机会在5年内复发和死亡。当根据年龄、格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，以及术前PSA调整危险比时，危险比显示有NAALADL2升高的男性(IRP>5)在根治性前列腺切除术后有1.7倍的复发和死亡可能性(表7)(p＝0.036)。在HRTMA上的激素依赖性和激素难治组织之间的NAALADL2染色没有显著性差异(图25)。
作为替代端点的循环NAALADL2mRNA
从全血中提取循环mRNA并进行qPCR，以检测循环NAALADL2mRNA(图26)。在所有组中的循环NAALADL2mRNA的量之间的差异非常显著(p<0.0001)。与良性相比，水平在较低级肿瘤中升高，但在格利森4+4/4+5和转移组中它们急剧下降。可检测的NAALADL2在转移组中可以反映该组的异类激素状态。最显著的是在出现格利森4+3疾病时的循环NAALADL2mRNA的显著上升。格利森3+3与格利森3+4和4+3的比较显示出非常显著的差异(p＝0.001)。另外，格利森3+4和4+3疾病中VPS13AmRNA之间有显著的差异(p＝0.014)提示循环VPS13A可用于区分相比于格利森3疾病要求更紧急治疗的格利森4疾病。
在第一实验中，转移群组是激素依赖性、激素治疗(激素反应性)和激素难治(即不再响应激素治疗)的患者的混合。为了更密切检查该转移组，第二实验检查循环RNA在12位激素依赖性、12位激素复发和11位激素响应患者中的表达(图27)。任何组之间没有显著性差异。
VPS13A、VPS28和NAALADL2的组合分析
分析来自所有三种标记物的数据来确定一种或多种标记物的组合是否能提高这些标记物的预测能力(表8)。尽管随着一些标记物的加入危险比提高，但置信区间也增加，表明对于VPS13A和NAALADL2，其它标记物的加入不能提高预测能力。然而，通过加入VPS13A和NAALADL2，VPS28得到提高。
研究设计
所有PAXgene样品取自参与ProMPT试验的患者。该研究由机构的伦理委员会同意并从所有患者获得知情同意。我们从23名患者获得PAXgene样品-12位有PSA升高和阴性活检的对照患者(对照组)，和11位有转移性前列腺癌的患者。这些患者有可用于免疫组织化学的核活检组织病理学样本和TURP芯片。另外的84种PAXgene样品是后来获取的，用于在初始23种PAXgene样品中鉴定的表达谱(expressionprofile)的研究。84种样品由48位患有不同等级的局部性前列腺癌的患者(格利森3+3、3+4、4+3和4+4/5分别有12种样品)和36位不同激素敏感性类别的患者(激素依赖性、激素治疗和激素难治的转移性前列腺癌患者的各12种样品)构成。104患者TMA是由104位在剑桥阿登布鲁克医院进行手术的患者的根治性前列腺切除术样本构成，用于局限性前列腺癌中的组织表达分析。
RNA表达阵列
在Illumina人HT12版本4阵列上进行基因表达分析。使用Bioconductor包在R上进行所有数据分析。使用在珠阵列包(beadarraypackage)中完成的BASH和HULK算法处理来自阵列扫描仪的原始强度数据(rawintensitydata)。在所有样品组中进行数据的log2转化和分位数标准化(quantilenormalisation)。使用limma包进行差异性表达分析。利用在应用FDR校正后p<0.05的p-值截止来选择差异表达基因，FDR校正是全局应用的以校正多重对比的多重检验。
RNA提取和cDNA形成
利用PAXgeneRNA血液试剂盒(QiagenCatno.762714)从存储在PAXgene管(Tepnel)中的2.5mL全血中提取RNA。将RNA用80μL的洗脱缓冲液洗脱。通过在NanodropND1000仪器(ThermoScientific)上的吸光度(OD260nm)进行RNA定量。将有足够RNA的样品在终体积25μL中标准化至40ng/μL。对于每个样品使用高容量RNA-tocDNAMasterMix(AppliedBiosystems)将500ngRNA逆转录成cDNA。
实时聚合酶链式反应(RT-PCR)
使用AppliedBiosystems7900HT实时PCR系统实施qPCR。使用Sigma引物和SYBRGreen进行qPCR。设计引物并通过在来自细胞系的cDNA上执行RT-PCR来初始测试引物，以在PAXgene样品上使用之前确保可行性。对于每个PCR反应，每个孔中加入lμL(5ng)的cDNA和9μL含有5μLFastSYBRTMGreen、3.96μL水和0.02μL正向和反向引物的预混液(mastermix)。试验以一式三份进行。利用δ-δCt方法在将Ct值标准化到管家基因(RPLP2)后计算相对表达。在附加表中给出引物序列。针对每种基因执行Mann-Whitney和单向ANOVA检验，以确定组之间的表达差异是否显著。
免疫组织化学
所有免疫组织化学(IHC)利用Bondmax自动染色仪执行，使用用于抗原修复(antigenrecovery)的1.5MEDTA，pH8.0，和用含有300mMTris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲盐、1％驴血清(SigmaAldrich)和0.05％吐温的缓冲液稀释的相关抗体。用苏木精将核复染并用DPX将载玻片盖上盖玻片。由评估并适当标记块(block)的泌尿病理学家进行剑桥TMA组织状态的确认(格利森等级和BPH)。切割并根据预定组织微阵列(TMA)的布局(layout)来构造一式两份的0.6mm组织核。从TMA切下多5-Am部分用于免疫组化。由均对TMA计划不知情的两位观测者独立地进行评分(一位独立的专业泌尿肿瘤病理学家)。将染色基于强度分类为以下类别：无、弱、中等和高。对每个核的强度和定位达成一致意见。利用以执行带有Kruskal-Wallis校正检验的单向ANOVA的GraphPadPrism，在一致分数上完成对免疫组化数据的统计分析。
表1：用于PAXqene目标基因及对照基因(UBC、GAPDH和RPLP2)的qPCR的引物(SEQIDNO：1-12)。
总计＝2923(1384,805,734)
表2：在TAPGTMA中分解VPS13A染色用于诊断括号内格利森分数分别<7、＝7，以及<7的组。对所有组p<0.0001。
表3：在TAPGTMA中分解VPS13A染色用于诊断格利森等级。
IRP No. No.复发 HR(95％CI) HR1(95％CI)
<3 90 24(26.7) 1.0(参照) 1.0(参照)
3-5 90 42(46.7) 2.0(1.2,3.2) 1.9(1.1,3.2)
>5 77 37(48.1) 2.2(1.3,3.8) 1.9(1.1,3.3)
趋势检验 0.010 0.061
表4：在卡罗林斯卡TMA中的VPS13A染色。1根据年龄、格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，以及术前PSA调整的危险比。
表5：两种分类(0和1对2和3或MI的1对2，3)中对于VPS13A人工强度(MI)的单变量模型。
IRP No. No.复发(％) HR(95％CI) HR1(95％CI)
<3 105 38(36.2) 1.0(参照) 1.0(参照)
3-5 84 30(35.7) 1.0(0.6,1.5) 1.1(0.7,1.9)
>5 68 30(44.1) 1.5(1.0,2.5) 1.9(1.1,3.2)
趋势检验 0.299 0.175
表6：在卡罗林斯卡TMA中的VPS28染色。1根据年龄、格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，以及术前PSA调整的危险比。
IRP No. No.复发 HR(95％CI) HR1(95％CI)
<3 56 15(26.8) 1.0(参照) 1.0(参照)
3-5 72 30(41.7) 1.6(0.9,3.0) 1.5(0.8,2.9)
>5 124 56(45.2) 1.9(1.1,3.4) 1.7(0.9,3.1)
趋势检验 0.0038 0.036
表7：在卡罗林斯卡TMA中的NAALADL2染色。1根据年龄、格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，以及术前PSA调整的危险比。
表8：组合VPS13A、VPS28和NAALADL2的效果。1根据临床变量包括手术时的格利森评分、前列腺外扩散、阳性手术切缘、膜泡浸润、临床分期，术前PSA以及年龄调整，2根据NAALADL2免疫反应性乘积指数调整，3根据VPS13A免疫反应性乘积指数调整，4根据VPS28免疫反应性乘积指数调整和5根据临床特性和另外两种生物标记物调整。
序列信息
以下显示人NAALADL2的氨基酸序列(UniProtKBQ58DX5)(SEQIDNO：13)：
MGENEASLPNTSLQGKKMAYQKVHADQRAPGHSQYLDNDDLQATALDLEWDMEKELEESGFDQFQLDGAENQNLGHSETIDLNLDSIQPATSPKGRFQRLQEESDYITHYTRSAPKSNRCNFCHVLKILCTATILFIFGILIGYYVHTNCPSDAPSSGTVDPQLYQEILKTIQAEDIKKSFRNLVQLYKNEDDMEISKKIKTQWTSLGLEDVQFVNYSVLLDLPGPSPSTVTLSSSGQCFHPNGOPCSEEARKDSSODLLYSYAAYSAKGTLKAEVIDVSYGMADDLKRIRKIKNVTNOIALLKLGKLPLLYKLSSLEKAGFGGVLLYIDPCDLPKTVNPSHDTFMVSLNPGGDPSTPGYPSVDESFRQSRSNLTSLLVQPISAPLVAKLISSPKARTKNEACSSLELPNNEIRVVSMQVQTVTKLKTVTNVVGFVMGLTSPDRYIIVGSHHHTAHSYNGQEWASSTAIITAFIRALMSKVKRGWRPDRTIVFCSWGGTAFGNIGSYEWGEDFKKVLQKNVVAYISLHSPIRGNSSLYPVASPSLQQLVVEKNNFNCTRRAQCPETNISSIQIQGDADYFINHLGVPIVQFAYEDIKTLEGPSFLSEARFSTRATKIEEMDPSFNLHETITKLSGEVILQIANEPVLPFNALDIALEVQNNLKGDQPNTHQLLAMALRLRESAELFQSDEMRPANDPKERAPIRIRMLNDILQDMEKSFLVKQAPPGFYRNILYHLDEKTSRFSILIEAWEHCKPLASNETLQEALSEVLNSINSAQVYFKAGLDVFKSVLDGKN
以下显示人NAALADL2的编码序列(NCBI基因ID：254827)(SEQIDNO：14)：
GGGTCAGTAGAAAGTCAGAAGGTCACAAAGCTTGCAGGGTAAGTGACACAACTTGAAACTGCTTGGCCCTCTTTAAAAAGAAATAATAAAATGGGAGAGAATGAAGCAAGTTTACCTAACACGTCTTTGCAAGGTAAAAAGATGGCCTATCAGAAGGTCCATGCAGATCAAAGAGCTCCAGGACACTCACAGTACTTAGACAATGATGACCTTCAAGCCACTGCCCTTGACTTAGAGTGGGACATGGAGAAGGAACTAGAGGAGTCTGGTTTTGACCAATTCCAGCTAGACAGTGCTGAGAATCAGAACCTAGGGCATTCAGAGACTATAGACCTCAATCTTGATTCCATTCAACCAGCAACTTCACCCAAAGGAAGGTTCCAGAGACTTCAAGAAGAATCTGACTACATTACCCATTATACACGATCTGCACCAAAGAGCAATCGCTGCAACTTTTGCCACGTCTTAAAAATGCTTTGCACAGCCACCATTTTATTTATTTTTGGGATTTTGATAGGTTATTATGTACATACAAATTGCCCTTCAGATGCTCCATCTTCAGGAACAGTTGATCCTCAGTTATATCAAGAGATTCTCAAGACAATCCAGGCAGAAGATATTAAGAAGTCTTTCAGAAATTTGGTACAACTATATAAAAATGAAGATGACATGGAAATTTCAAAGAAGATTAAGACTCAGTGGACCTCTTTGGCCCTAGAAGATGTACAGTTTGTAAATTACTCTGTGCTGCTTGATCTGCCAGGCCCTTCTCCCAGCACTGTGACTCTGAGCAGCAGTGGTCAATGCTTTCATCCTAATGGCCAGCCTTGCAGTGAAGAAGCCAGAAAAGATAGCAGCCAAGACCTGCTCTATTCATATGCAGCCTATTCTGCCAAAGGAACTCTCAAGGCTGAAGTCATCGATGTGAGTTATGGAATGGCAGATGATTTAAAAAGGATTAGGAAAATAAAAAACGTAACAAATCAGATCGCACTCCTGAAATTAGGAAAATTGCCACTGCTTTATAAGGTTGGTCCAGTGAATGTTATTCAGTGGTTTGGTCAATATTTTGCCTTGTTTTGTTGGAATTATATGCTTTTGTGAGTGTGGAGTGTGTGTGTGCATATAGGTGTGTGAGAGAGAGAAGGGGAGAGGAAGAAAGAGAGGCAGAGAGTGTCACAGAAAGATGCCTTTTCCACATTAGAACATTTTAATTTAAGATATTTAAGAACAATATATTTATGCCCTTATTTCTTTAGAGAGAAAATACCTTAAGTCAGGTAACACTGAGTTTGTGGGACCTTAATAAAATTGGCATACTCTTCATAATGGTACCTATCTGGAATAGTAAAAATAGAGAACCACCCTGTGTTCATCTTATGACATATGTGAAACTTCTAATCTATTATCAAATGGACTAATTATCATGTTCTCTATGTTAGACAAGTATCTAGATGATTTACIACCCTTTAGTGATTATTTTGTCAACTATACAACTACAGTTACTAACTGTGATCAGGATTTTAATTAAAATATAATTGCTAAGAGTAGCAGAATTTTGATTTATTTTATTTGAATGGAAGTTTATTAACACTCATCCACAGATACACTTATGTAATTAAGTTTCTGATGATGAACCAGCACAATAGACAGCCACTACTGCTCATTCTCGCTTCATTTCCTTTTTCTATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
以下显示人VPSl3A的氨基酸序列(UniProtQ96RL7)(SEQIDNO：15)：
MVFESVVVDVLNRFLGDYVVDLDTSQLSLGIWKGAVALKNLQIKENALSQLDVPFKVKVGHIGNLKLIIPWKNLYTQPVEAVLEEIYLLIVPSSRIKYDPLKEEKQLMEAKQQELKRIEEAKQKVVDQEQHLPEKQDTFAEKLVTQIIKNLQVKISSIHIRYEDDITNRDKPLSFGISLQNLSMQTTDQYWVPCLHDETEKLVRKLIRLDNLFAYWNVKSQMFYLSDYDNSLDDLKNGTVNENIVPEGYDFVFRPISANAKLVMNRRSDFDFSAPKINLEIELHNIAIEFNKPQYFSIMELLESVDMMAQNLPYRKFKPDVPLHHHAREWWAYAIHGVLEVNVCPRLWMWSWKHIRKHRQKVKQYKELYKKKLTSKKPPGELLVSLEELEKTLDVFNITIARQTAEVEVKKAGYKIYKEGVKDPEDNKGWFSWLWSWSEQNTNEQQPDVQPETLEEMLTPEEKALLYEAIGYSETAVDPTLLKTFEALKFFVHLKSMSIVLRENHQKPELVDIVIEEFSTLTVQRPGAQAIKFETKIDSFHITGLPDNSEKPRLLSSLDDAMSLFQITFEINPLDETVSQRCIIEAEPLEIIYDARTVNSIVEFFRPPKEVHLAQLTAATLTKLEEFRSKTATGLLYIIETQKVLDLKINLKASYIIVPQDGIFSPTSNLLLLDLGHLKVTSKSRSELPDVKQGEANLKEIMDRAYDSFDIQLTSVQLLYSRVGDNWREARKLSVSTOHILVPMHFNLELSKAMVFMDVRMPKFKIYGKLPLISLRISDKKLQGIMELIESIPKPEPVTEVSAPVKSFQIQTSTSLGTSQISQKIIPLLELPSVSEDDSEEEFFDAPCSPLEEPLQFPTGVKSIRTRKLQKQDCSVNMTTFKIRFEVPKVLIEFYHLVGDCELSVVEILVLGLGAEIEIRTYDLKANAFLKEFCLKCPEYLDENKKPVYLVTTLDNTMEDLLTLEYVKAEKNVPDLKSTYNNVIQLIKVNFSSLDIHLHTEALLNTINYLMNILPQSEEKSAPVSTTETEDKGDVIKKLALKLSTNEDIITLQILAELSCLQIFIQDQKCNISEIKIEGLDSEMIMRPSETEINAKLRNIIVLDSDITAIYKKAVYITGKEVFSFKMVSYMDATAGSAYTDMNVVDIQVNLIVGCIEVVFVTKFLYSILAFIDNFQAAKQALAEATVQAAGMAATGVKELAQRSSRMALDINIKAPVVVIPQSPVSENVFVADFGLITMTNTFHMITESQSSPPPVIDLITIKLSEMRLYRSRFINDAYQEVLDLLLPLNLEVVVERNLCWEWYQEVPCFNVNAQLKPMEFILSQEDITTIFKTLHGNIWYEKDGSASPAVTKDQYSATSGVTTNASHHSGGATVVTAAVVEVHSRALLVKTTLNISFKTDDLTMVLYSPGPKQASFTDVRDPSLKLAEFKLENIISTLKMYTDGSTFSSFSLKNCILDDKRPHVKKATPRMIGLTVGFDKKDMMDIKYRKVRDGCVTDAVFQEMYICASVEFLQTVANVFLEAYTTGTAVETSVQTWTAKEEVPTQESVKWEINVIIKNPEIVFVADMTKNDAPALVITTQCEICYKGNLENSTMTAAIKDLQVRACPFLPVKRKGKITTVLQPCDLFYQTTQKGTDPQVIDMSVKSLTLKVSPVIINTMITITSALYTTKETIPEETASSTAHLWEKKDTKTLKMWFLEESNETEKIAPTTELVPKGEMIKMNIDSIFIVLEAGIGHRTVPMILAKSRFSGEGKNWSSLINLHCQLELEVEYYNEMFGVWEPLLEPLEIDQTEDFRPWNLGIKMKKKAKMAIVESDPEEENYKVPEYKTVISFHSKDQLNITLSKCGLVMLNNLVKAFTEAATGSSADFVKDLAPFMILNSLGLTISVSPSDSFSVLNIPMAKSYVLKNGESLSMDYIRTKDNDHFNAMTSLSSKLFFILLTPVNHSTADKIPLTKVGRRLYTVRHRESGVERSIVCQIDTVEGSKKVTIRSPVQIRNHFSVPLSVYEGDTLLGTASPENEFNIPLGSYRSFIFLKPEDENYQMCEGIDFEHIIKNDGALLKKKCRSKNPSKESFLINIVPEKDNLTSLSVYSEDGWDLPYIMHLWPPILLRNLLPYKIAYYIEGIENSVFTLSEGHSAQICTAQLGKARLHLKLLDYLNHDWKSEYHIKPNQQDISFVSFTCVTEMEKTDLDIAVHMTYNTGQTVVAFHSPYWMVNKTGRMLQYKADGIHRKHPPNYKKPVLFSFQPNHFFNNNKVQLMVTDSELSNQFSIDTVGSHGAVKCKGLKMDYQVGVTIDLSSFNITRIVTFTPFYMIKNKSKYHISVAEEGNDKWLSLDLEQCIPFWPEYASSKLLIQVERSEDPPKRIYFNKQENCILLRLDNELGGIIAEVNLAEHSTVITFLDYHDGAATFLLINHTKNELVQYNQSSLSEIEDSLPPGKAVFYTWADPVGSRRLKWRCRKSHGEVTQKDDMMMPIDLGEKTIYLVSFFEGLQRIILFTEDPRVFKVTYESEKAELAEQEIAVALQDVGISLVNNYTKQEVAYIGITSSDVVWETKPKKKARWKPWSVKHREKLEREFKEYTESSPSEDKVIQLDTNVPVRLTPTGHNMKILQPHVIALRRNYLPALKVEYNTSAHQSSFRIQIYRIQIQNQIHGAVFPFVFYPVKPPKSVTMDSAPKPFTDVSIVMRSAGHSQISRIKYFKVLIQEMDLRLDLGFIYALTDLMTEAEVTENTEVELFHKDIEAFKEEYKTASLVDQSQVSLYEYFHISPIKLHLSVSLSSGREEAKDSKQNGGLIPVHSLNLLLKSIGATLTDVQDVVFKLAFFELNYQFHTTSDLQSEVIRHYSKQAIKQMYVLILGLDVLGNPFGLIREFSEGVEAFFYEPYQGAIQGPEEFVEGMALGLKALVGGAVGGLAGAASKITGAMAKGVAAMTMDEDYQQKRREAMNKQPAGFREGITRGGKGLVSGFVSGITGIVTKPIKGAQKGGAAGFFKGVGKGLVGAVARPTGGIIDMASSTFQGIKRATETSEVESLRPPRFFNEDGVIRPYRLRDGTGNQMLOVMENGRFAKYKYFTHVMINKTDMLMITRRGVLFVTKGTFGQLTCEWQYSFDEFTKEPFIVHGRRLRIEAKERVKSVFHAREFGKIINFKTPEDARWILTKLQEAREPSPSL
以下显示人VPS13A的核苷酸序列(SEQIDNO：16)。几个剪接变体存在且交替的外显子是划下划线的。
ATGGTTTTCGAGTCGGTGGTCGTGGACGTGTTGAACCGGTTCTTGGGGGACTATGTGGTGGACTTGGACACGTCCCAGCTCTCTCTGGGCATCTGGAAAGGAGCTGTGGCCCTCAAGAATCTTTCAAATTAAAGAAAATGC CCTGAGTCAACTGGATGTACCATTTAAAGTTAAAGTTGGTCACATAGGTAATCTTAAACTTATAATTCCA TGGAAAAACCTTTATACTCAACCTGTTGAAGCCGTATTGGAAGAAATTTATTTACTTATAGTGCCTTCTT CTAGAATAAAATATGATCCTTTAAAAGAAGAGAAACAACTCATGGAAGCAAAGCAACAGGAACTGAAAAGAATAGAAGAAGCAAAACAAAAAGTAGTTGATCAAGAACAACATCTGCCGGAAAAACAGGACACTTTTGCA GAAAAATTAGTTACACAGATCATAAAAAATCTTCAGGTGAAAATTTCCAGTATCCATATTCGTTATGAAG ATGATATCACAAATCGGGACAAACCGCTGTCATTTGGTATTTCCCTTCAAAATCTGAGCATGCAGACAAC TGATCAATACTGGGTTCCATGTTTACATGATGAAACTGAGAAACTGGTTCGTAAGTTAATCCGATTGGATAACCTGTTTGCCTATTGGAATGTGAAGTCTCAGATGTTTTATCTTAGTGATTATGATAACTCCTTGGACG ACTTGAAGAATGGCATTGTCAATGAAAATATTGTTCCAGAAGGTTATGATTTTGTATTTCGTCCCATATCTGCTAATGCCAAACTTGTGATGAATCGCCGATCTGATTTTGACTTTTCTGCCCCCAAAATAAACTTGGAAATTGAGTTACATAACATAGCAATTGAATTTAATAAACCACAGTATTTCAGTATTATGGAGCTTCTTGAAT CAGTTGATATGATGGCACAAAATCTGCCATATAGGAAGTTCAAACCTGATGTGCCTCTTCACCACCATGC CAGAGAATGGTGGGCTTATGCTATACATGGCGTTCTTGAAGTAAATGTTTGCCCCAGGTTATGGATGTGGTCATGGAAGCATATTAGAAAACATAGGCAAAAAGTGAAGCAATATAAAGAACTGTATAAAAAAAAGTTAACAAGTAAGAAGCCACCTGGTGAACTTCTCGTGTCTTTGGAGGAGTTGGAAAAAACCTTGGATGTCTTTAA TATAACTATAGCTAGACAGACGGCAGAAGTTGAGGTAAAGAAAGCTGGATACAAAATTTACAAAGAAGGAGTAAAAGATCCAGAGGATAATAAAGGGTGGTTTAGCTGGCTATGGTCTTGGTCAGAACAAAATACTAATGAACAGCAACCAGATGTTCAACCTGAAACTCTTGAAGAAATGTTGACACCTGAAGAAAAAGCTTTACTCTA TGAAGCAATTGGCTATAGTGAAACAGCAGTTGATCCAACTTTACTAAAAACATTTGAAGCCTTGAAGTTTTTTGTCCACTTGAAAAGTATGTCTATTGTTCTAAGAGAAAATCATCAAAAACCTGAGCTGGTAGATATTGTAATAGAAGAATTTAGCACCTTAATTGTGCAAAGACCAGGAGCACAAGCAATAAAATTTGAAACTAAAAT AGATTCATTTCATATTACTGGCTTACCAGATAATTCAGAAAAACCCCGCCTCCTGTCTTCATTGGATGAT GCAATGTCACTTTTCCAAATTACATTTGAGATAAATCCATTAGATGAAACTGTTTCTCAGAGGTGTATCA TAGAAGCTGAACCTTTAGAAATCATATATGATGCAAGGACAGTGAATAGTATAGTGGAATTCTTCAGACCTCCAAAAGAGGTACATCTAGCACAGCTCACTGCAGCAACTTTGACAAAACTGGAAGAATTTCGCAGTAAGACAGCAACAGGTCTACTGTATATTATTGAAACACAGAAAGTTCTTGATCTCAAAATTAATTTGAAGGCTT CATATATTATTGTCCCACAAGATGGAATTTTTAGTCCTACATCAAATCTGCTTCTTTTGGACCTTGGTCA TCTAAAGGTGACGAGTAAAAGTCGTTCTGAATTACCAGATGTGAAACAAGGTGAGGCCAATCTTAAAGAGATAATGGATAGAGCTTATGATTCATTTGATATTCAACTTACAAGTGTACAGCTGCTTTACAGTAGAGTTGGTGATAATTGGAGAGAAGCACGAAAACTCAGTGTATCTACCCAGCATATTTTGGTACCCATGCACTTCAA TTTGGGACTGTCTAAGGCCATGGTTTTCATGGATGTAAGGATGCCCAAATTCAAGATTTATGGAAAGTTACCTCTTATTTCTTTACGAATCTCAGATAAAAAACTACAAGGGATTATGGAATTGATTGAAAGCATTCCAAAACCTGAACCAGTAACTGAAGTATCTGCCCCTGTCAAATCATTCCAGATTCAAACATCTACTTCTTTGGG AACATCACAGATTTCACAGAAAATAATTCCTCTCTTGGAACTTCCATCTGTTTCTGAAGATGATTCAGAGGAGGAATTTTTTGATGCACCATGTAGTCCCTTGGAAGAACCTCTTCAGTTTCCAACTGGAGTTAAAAGTATTCGAACCAGAAAGTTACAAAAGCAGGATTGTTCAGTAAATATGACTACATTTAAAATAAGATTTGAAGTACCAAAGGTTTTGATCGAGTTTTATCACCTTGTTGGAGATTGTGAACTATCTGTGGTAGAAATTCTTGTT TTAGGATTGGGTGCAGAAATTGAGATTAGAACATACGATTTGAAAGCAAATGCCTTTTTGAAAGAGTTCT GCTTAAAATGCCCAGAATACTTGGATGAAAACAAGAAACCAGTTTATTTGGTTACAACCCTGGATAACACAATGGAAGACCTGTTAACGCTGGAATATGTATAGGCTGAAAAGAATGTACCCGACTTGAAAAGTACCTAT AACAATGTTTTACAATTGATTAAGGTAAATTTTTCCTCTTTGGATATTCATTTACACACTGAAGCACTTCTGAATACAATAAATTATCTTCATAATATCCTTCCGCAATCAGAGGAAAAATCAGCCCCAGTGTCCACTACAGAGACTGAAGACAAAGGAGATGTCARTAAAAAATTAGGGCTTGATTCTGAGATGATTATGAGGCCTTCA GAAACTGAAATAAACGCAAAGCTAAGGAATATAATTGTTTTAGATTCTGATATAACAGCTATATACAAAA AGGCTGTTTATATCACTGGAAAAGAAGTTTTCAGCTTCAAAATGGTTTCTTACATGGATGCAACTGCTGGTTCTGCATACACAGATATGAATGTGGTTGACATTCAGGTTAATTTAATAGTTGGTTGCATTGAAGTAGTTTTTGTCACGAAATTTCTATATTCTATATTGGCTTTTATAGATAATTTTCAGGCAGCTAAACAAGCCTTGG CTGAGGCAACTGTTCAGGCAGCTGGAATGGCTGCTACTGGTGTAAAAGAACTCGCACAAAGGAGTTCCAG AATGGCACTGGATATTAACATCAAAGCCCCAGTTGTGGTCATCCCGCAGTCTCCAGTTTCTGAAAATGTT TTTGTTGCTGATTTTGGACTAATTACAATGACAAATACCTTTCATATGATAACAGAGAGCCAGAGCTCTC CCCCACCTGTTATTGATTTGATAACAATAAAGCTGAGTGAAATGCGACTATACAGATCTCGATTTATTAATGATGCATACCAGGAAGTACTGGATCTACTCCTGCCATTAAATCTTGAGGTTGTGGTTGAACGAAATTTATGCTGGGAGTGGTACCAGGAAGTTCCTTGTTTTAATGTAAATGCTCAGCTGAAACCAATGGAGTTCATTC TTAGTCAAGAAGATATAACAACTATTTTTAAAACATTGCATGGCAATATATGGTATGAAAAAGATGGTAG TGCCTCACCTGCTGTAACAAAAGACCAATACAGTGCCACTAGTGGAGTTACTACTAATGCTTCACACCAT TCAGGAGGAGCAACTGTGGTGACAGCTGCTGTGGTAGAAGTACATTCACGTGCCTTACTAGTTAAGACAACACTAAACATAAGCTTCAAAACTGATGATCTCACCATGGTGCTGTATAGTCCAGGTCCTAAACAGGCTTC CTTTACAGATGTTCGTGATCCTTCTCTGAAACTTGCTGAATTTAAATTGGAGAATATTATAAGTACTTTA AAAATGTATACAGATGGCTCAACATTTTTCTTCCTTCTCATTAAAAAACTGTATTTTAGATGATAAAAGAC CTCATGTCAAGAAAGCAACTCCTCGAATGATAGGACTGACAGTTGGTTTTGACAAAAAAGACATGATGGATATAAAGTACAGGAAAGTCAGAGATGGTTGTGTGACTGATGCGGTCTTTCAAGAAATGTATATTTGTGCAAGCGTAGAATTTCTGCAGACTGTTGCAAATGTCTTTCTTGAGGCCTACACCACAGGCACTGCTGTAGAAACCAGTGTGCAAACATGGACTGCTAAGGAAGAAGTACCTACACAGGAATCAGTGAAGTGGGAAATTAATGT TATTATTAAAAATCCTGAAATTGTGTTTGTAGCTGACATGACAAAAAATGATGCTCCTGCTTTAGTCATT ACAACACAATGTGAAATTTGCTATAAAGGTAACCTTGAAAATAGTACAATGACTGCTGCCATTAAAGATCTCCAAGTGAGAGCCTGCCCGTTTCTTCCAGTCAAGAGAAAAGGCAAAATCACTACTGTTTTGCAGCCCTGTGACTTGTTTTATCAAACTACTCAGAAAGGTACAGATCCACAAGTGATCGATATGTCAGTAAAATCCCTGACACTAAAGGTTTCACCAGTTATTATAAATACTATGATTACCATAACTTCAGCACTGTATACAACTAAGG AAACCATCCCAGAAGAAACGGCTTCTTCTACTGCACATTTATGGGAAAAGAAGGATACAAAGACTTTAAA AATGTGGTTTCTTGAAGAATCAAATGAAACTGAAAAAATAGCTCCCACAACTGAATTGGTACCCAAAGGC GAGATGATAAAAATGAACATTGATTCTATTTTTATAGTTCTTGAGGCTGGAATTGGTCATAGAACAGTAC CTATGCTTCTGGCAAAGTCACGTTTTTCAGGGGAAGGCAAAAACTGGAGTTCCCTAATAAATCTGCACTG TCAGCTTGAGCTAGAAGTGCATTATTATAATGAAATGTTTGGTGTATGGGAGCCTTTGCTTGAACCCTTAGAAATTGATCAGACTGAGGATTTTAGACCATGGAATCTTGGTATCAAGATGAAAAAGAAAGCAAAAATGG CCATTGTTGAGTCAGATCCTGAAGAAGAAAACTACAAAGTGCCAGAATATAAAACTGTCATCAGTTTCCA TTCAAAAGACCAATTAAACATTACATTATCCAAATGTGGTCTTGTAATGTTAAACAATTTAGTCAAGGCATTTACAGAAGCTGCCACTGGATCTTCAGCTGACTTCGTAAAGGATCTAGCACCATTTATGATTTTAAATTCCCTTGGACTTACTATTTCTGTTTCGCCAAGTGATTCTTTTAGTGTACTCAACATTCCTATGGCAAAATCATATGTATTGAAAAATGGAGAAAGTTTAAGTATGGATTATATCCGAACCAAGGACAATGATCATTTCAATGCAATGACCAGCCTAAGCAGCAAACTCTTCTTCATTCTTCTTACACCTGTTAACCATTCTACTGCTGATA AGATTCCTTTAACAAAAGTGGGACGACGTCTGTACACTGTAAGACACAGAGAGTCTGGCGTTGAAAGATC TATTGTTTGTCAAATTGATACAGTAGAAGGAAGTAAGAAGGTCACAATTCGCTCCCCAGTGCAGATAAGAAATCATTTTTCAGTCCCACTGTCTGTTTACGAAGGGGATACCTTATTGGGAACTGCCTCACCTGAAAATGAATTCAACATACCATTAGGATCTTACCGATCATTCATTTTTCTGAAGCCAGAAGATGAGAACTATCAAAT GTGTGAAGGAATTGACTTTGAAGAGATTATAAAAAATGATGGTGCTCTTCTAAAGAAGAAATGTAGATCT AAAAACCCTTCTAAGGAATCATTTCTCATTAATATTGTTCCAGAAAAAGATAATTTAACATCTCTATCAG TGTATTCAGAAGATGGTTGGGATTTACCATACATAATGCATTTGTGGCCACCTATCCTGCTCCGAAATCT TCTTCCTTACAAAATTGCTTATTATATAGAGGGAATTGAAAATTCGGTTTTTACTCTAAGTGAAGGACATTCAGCCCAGATTTGTACTGCACAGTTGGGTAAAGCCAGGCTACATTTAAAATTACTTGACTATCTCAATCACGATTGGAAAAGTGAATATCACATAAAGCCTAATCAGCAAGACATTAGTTTTGTCAGTTTTACTTGTGTTACAGAAATGGAAAAGACTGATTTAGATATTGCTGTCCATATGACTTACAATACTGGTCAGACAGTTGTGGCATTTCATAGTCCTTATTGGATGGTCAATAAAACTGGCCGCATGTTACAGTACAAAGCAGACGGAATTCATCGAAAGCATCCACCTAATTATAAAAAGCCAGTTCTCTTTTCTTTTCAGCCAAATCACTTTTTTAATAACAATAAGGTTCAACTTATGGTAACTGATAGTGAGTTGTCCAATCAGTTTTCAATTGATACTGTTGGTAGT CATGGAGCTGTTAAATGTAAAGGCCTGAAAATGGACTATCAAGTTGGTGTCACTATAGACCTGAGCAGTTTTAACATTACTAGAATTGTGACATTTACCCCTTTTTATATGATTAAAAACAAAAGCAAATACCATATATCAGTGGCTGAAGAAGGAAATGATAAATGGCTCTCTCTTGATTTGGAGCAGTGTATCCCCTTTTGGCCTGAG TATGCTTCTAGTAAACTTCTTATTCAAGTCGAAAGGAGTGAAGATCCTCCCAAAAGGATATATTTTAACA AGCAGGAAAATTGTATTCTATTGCGTCTAGATAACGAGCTTGGAGGTATTATAGCAGAAGTGAATTTGGCCGAGCATTCTACAGTTATTACATTTTTAGATTATCATGATGGAGCAGCTACATTCCTCTTAATAAATCACACAAAGAATGAACTTGTTCAATACAATCAAAGTTCTCTCAGTGAAATAGAAGATTCCCTCCCTCCTGGTA AAGCCGTGTTTTATACATGGGCTGATCCGGTGGGCTCTAGAAGGCTGAAGTGGAGATGTAGAAAAAGCCA TGGTGAAGTAACACAGAAGGATGATATGATGATGCCTATAGATTTGGGGGAAAAAGACAATATATTTAGTTTCATTCTTTGAAGGTTTACAACGCATTATTTTATTCACTGAAGATCCAAGGGTATTTAAAGTAACATATGAAAGTGAGAAAGCAGAGTTAGCAGAGCAAGAAATTGCAGTGGCATTACAAGATGTTGGAATTTCTCTTGTCAACAATTACACGAAGCAAGAAGTAGCCTATATAGGCATTACAAGTTCTGATGTGGTTTGGGAAACAAAG CCCAAGAAGAAGGCAAGATGGAAGCCAATGAGTGTAAAGCACACTGAGAAGTTAGAGAGAGAATTTAAGG AATATACTGAATCTTCTCCTTCAGAAGATAAGGTTATTCAGTTGGACACTAATGTTCCGGTTCGCCTAACCCCTACTGGTCATAACATGAAAATTCTGCAGCCGCATGTAATAGCTCTACGAAGAAATTATCTTCCAGCATTAAAAGTGGAATATAACACATCTGCACATCAATCATCATTTAGAATTCAGATTTACAGAATACAGATCC AAAATCAGATACATGGTGCTGTATTTCCCTTTGTGTTTTATCCTGTTAAACCTCCAAAGTCGGTCACCAT GGATTCAGCACCAAAAGCCCTTTACAGATGTCAGTATTGTCATGAGATCTGCAGGACATTCCCAGATATCACGTATTAAGTATTTCAAAGTATTGATTCAAGAAATGGATCTCAGGTTAGATCTTGGGTTTATCTATGCTT TAACAGACCTTATGACAGAAGCTGAGGTGACTGAAAATACAGAGGTTGAGCTTTTTCATAAAGATATAGAAGCTTTCAAAAGAAGAATAATAAAACAGCCTCATTAGTAGATCAATCACAAGTCAGCCTCTATGAATATTTTCATATATCTCCTATCAAGTTACATTTAAGTGTTTCACTGAGTTCCGGCAGAGAAGAAGCTAAAGATTCAA AACAAAATGGAGGACTGATTCCAGTTCATTCTTTAAATCTTTTGCTGAAGAGTATTGGTGCCACACTGAC AGATGTACAAGATGTAGTTTTTAAGCTTGCATTTTTTGAACTCAACTATCAGTTCCATACAACATCCGATCTACAGTCTGAAGTCATAAGACACTATTCAAAACAGGCCATTAAGCAGATGTATGTACTCATTCTTGGAC TTGATGTTTTGGGAAATCCATTTGGCTTAATTAGAGAATTTTCTGAAGGTGTAGAAGCATTTTTTTATGA ACCTTACCAGGGAGCCATCCAGGGTCCTGAAGAGTTTGTGGAAGGAATGGCACTAGGACTTAAGGCACTAGTTGGTGGAGCTGTTGGTGGATTGGCTGGTGCTGCCTCCAAAATCACCGGTGCTATGGCTAAGGGGGTAG CAGCTATGACCATGGATGAAGACTACCAACAGAAGAGAAGAGAAGCCATGAATAAGCAACCAGCTGGTTT TAGAGAAGGCATCACTCGTGGAGGAAAAGGCTTAGTTTCTGGATTTGTTAGTGGCATAACAGGAATTGTTACAAAACCAATCAAAGGAGCTCAAAAAGGAGGAGCAGCTGGTTTCTTTAAAGGTGTTGGGAAAGGTTTAG TAGGAGCGGTAGCAAGGCCAACTGGAGGCATCATAGACATGGCTAGCAGTACATTTCAGGGAATAAAAAGAGCTACAGAGACTTCTGAAGTGGAGAGTCTGCGACCTCCTCGGTTCTTCAATGAAGATGGAGTTATCAGACCGTACAGGTTGAGGGATGGGACTGGAAATCAAATGTTACAGGTCATGGAAAATGGAAGATTTGCAAAAT ACAAATATTTTACCCATGTCATGATCAATAAGACAGATATGCTAATGATAACCAGACGTGGTGTATTGTTTGTAACAAAGGGAACATTTGGACAACTCACGTGTGAGTGGCAGTATAGTTTTGATGAATTTACCAAAGAGCCATTCATTGTTCATGGGAGAAGATTGCGCATTGAAGCAAAGGAACGAGTGAAGTCTGTATTTCATGCCA GAGAGTTTGGAAAAATAATTAACTTCAAGACCCCAGAGGATGCCAGGTGGATCCTCACAAAGCTACAAGAAGCAAGAGAACCTTCTCCGAGCCTCTGA
再次显示人VPS13A的蛋白序列(SEQIDNO：17)，其中交替外显子(alternateexon)编码的氨基酸划下划线。跨越剪接点(splicejunction)编码的氨基酸是粗体的。
MVFESVVVDVLNRFLGDYVVVDLDTSQLSLIWK AVALKNLQIKENALSQLDVPFKVKVGHI NLKLIIP WKNLYTQPVEAVLEEIYLLIVPSS IKYDPLKEEKQLMEAKQQELKRIEEAKQKVVDQ QHLPEKQDTFA EKLVTQIIKNLQVKISSIHIRYEDDITNRDKPLSFGISLQNLSMQTTDQYWVPCLHDETEKLVRKLIRLDNLFAYWNVKSQMFYLSDYDNSLDDLKNGIVNENIVPEGYDF FRPISANAKLVMNRRSDFDFSAPKINLEIELHNIAIEFNKFQYFSIMFLLESVDMMAQNLPYPKFKPDVPLHHHARE WAYAIHGVLEVNVCPRLWMWSWKHIRKHRQKVKQYKELYKKKLTSKKPPGELLVSLEELEKTLDVFNITIARQTAEVEVKKAGYKIYKEGVKDPEDNKGWFSWLWSWSEQNTNEQQPDVQPE LEEMLTPEEKALLYEAIGYSETAVDPTLLKTFEALKFFVHLKSMSIVLRENHQKPELVDIVIEEFSTLIVQRPGAQAI FETKIDSFHITGLPDNSEKPRLLSSLDDAMSLFQITFEINPLDETVSQRCIIEAEPLEIIYDARTVNSIVEFFRPPKEVHLAQLTAATLTKLEEFRSKTAT LLYIIETQKVLDLKINLKASYIIVPQDGIFSPTSNLLLLDLGHLKVTSKSRSELPDVKQGEANLKEIMDRAYDSFDIQLTSVQLLYSRV DNWREARKLSVSTQHILVPMHFNLELSKAMVFMDVRMP FKIYGKLPLISLRISDKKLQGIMELIESIPKPEPVTEVSAPVKSFQIQTSTSLGTSQISQKIIPLLELPSVSED SEEEFFDAPCSPLEEPLQFPTGVKSIRTRKLQKQDCSVNMTTFKIRFEVPKVLIEFYHLVGDCELSVVEILV LGLGAEIEIRTYDLKANAFLKEECLKCPEYL FNKKPVYLVTTLDNTMEDLLTLEYVKAEKNVPDLKSTY NNVLQLIKVNFSSLDIHLHTEALLNTINYLHNILPQSEEKSAPVSTTETEDKGDVIKKL LDSEMIMRPS ETEINAKLRNIIVLDSDITAIYKKAVYITGKEVFSFKMVSYMDATAGSAYTDMNVVDIQVNLIVGCIEVVFVTKFLYSILAFIDNFQAAKQALAEATVQAAGMAATGVKELAQRSSRMALDINIKAPVVVIPQSPVSENV FVADFGLITMTNTFHMITESQSSPPPVIDLITIKLSEMRLY SRFINDAYQEVLDLLLPLNLEVVVEPNLCWEWYQEVPCFNVNAQLKPMEFILSQEDITTIFKTLHGNIWYEKDGSASPAVTKDQYSATSGVTTNASHH SG ATVVTAAVVEVHSRALLVKTTLNISFKTDDLTMVLYSPGPKQASFTDVRDPSLKLAEFKLENIISTL KMYTDGSTFSSFSLKNCILDDKRPHVKKATP MIGLTVGFDKKDMMDIKYRKVRDGCVTDAVFQEMYICASVEFLQTVANVFLEAYTTGTAVETSVQTWTAKEE PTQESVKWEINVIIKNPEIVFVADMTKNDAPALVI TTQCEICYKGNLENSTMTAAIKDLQVRACPFLPVKRKGKITTVLQPCDLFYQTTQKGTDPQVIDMSVKSLTLKVSPVIINTMITITSALYTTKETIPEETASSTAHLWEKKDTKTLKMWFLEESNETEKIAPTTELVPKG EMIKMNIDSIFIVLEAGIGRRTVPMLLAKSRFSGEGKNWSSLINLHCQLELEVHYYNEMFGVWEPLLEPLEIDQTEDFRPWNLGIKMKKKAKMAIVESDPEEENYKVPEYKTVISFHSKDQLNITLSKCGLVMLNNLVKAFTEAATGSSADFVKDLAPFMILNSLGLTISVSPSDSFSVLNIPMAKSYVLKNGESLSMDYIRTKDNDHFNAMTSLSSKLFFILL PVNHSTADKIPLTKVGRRLYTVRHRESGVERSIVCQIDTVEGSKKVTIRSPVQIRNHFSVPLSVYEGDTLLGTASPENEFNIPLGSY SFIFLKPEDENYQMCEGIDEEIIKNDGALLKKKCRS KNPSKESFLINIVPEKLNLTSLSVYSEDGWDLPYIMHLWPPILLRNLLPYKIAYYIEGIENSVFTLSEGHSAQICTAQLGKARLHLKLLDYLNHDWKSEYHIKPNQQDISFVSFTCVTEMEKTDLDIAVHMTYNTGQTVVAFHSPYWMVNKTGRMLQYKADGIHRKHPPNYKKPVLFSFQPNHFFNNNKVQLMVTDSELSNQFSIDTVGS HGAVKCKGLKMDYQVGVTIDLSSFNITRIVTFTPFYMIKNKsKYHISVAEEGNDKWLSLDLEQCIPFWPEYASSKLLIQVERSEDPPKRIYFNKQENCILLRLDNELGGIIAEVNLAEHSTVITFLDYHDGAATFLLINHTKNELVQYNQ SLSEIEDSLPPGKAVFYTWADPVGSRRLKWRCRKSHGEVTQKDDMMMPIDLGEKTIYLVSFFEGLQRIILFTEDPRVFKVTYESEKAELAEQEIAVALQDVGISLVNNYTKQEVAYIGIT SDVVWETK PKKKARWKPMSVKHTEKLEREFKEYTESSPSEDKVIQLDTNVPVRLTPTGHNMKILQPHVIALRRNYLPALKVEYNTSAHQSSFRIQIYRIQIQNQIHGAVFPFVFYPVKPPKSVTMDS PKPFTDVSIVMRSAGHSQISRI YFKVLIQEMDLRLDLGFIYALTDLMTEAEVTENTEVELFHKDIEAFKEEYKTASLVDQSQVSLYEYFHISPIKLHLSVSLSSGREEAKDSKQNGGLIPVHSLNLLLKSIGATLTDVQDVVFLAFFELNYQFHTTSDLQSEVIRHYSKQAIKQMYVLILGLDVLGNPFGLIREFSEGVEAFFYEPYQGAIQGPEEFVEGMALGLKALVGGAV GLAGAASKITGAMAKGVAAMTMDEDYQQKRREAMNKQPAGFREGITRGGKGLVSGFVSGITGIVTKPIK AQKGGAAGFFKGVGKGLVGAVARPTGGIIDMASSTFQGIK ATETSEVESLRPPRFFNEDGVIRPYRLRDGTGNQMLQVMENGRFAKYKYFTHVMINKTDMLMITR GVLFVTKGTFGQLTCEWQYSFDEFTKEPFIVHGRRLRIEAKERVKSVFHAREFGKIINFKTPEDARWILTKLQEAREPSPSL
以下显示人VPS28的氨基酸序列(UniProtQ9UK41)(SEQIDNO：18)：
MFHGIPATPGIGAPGNKPELYEEVKLYKNAREREKYDNMAELFAVVKTMQALEKAYIKDCVSPSEYTAACSRLLVQYKAAFRQVQGSEISSIDEFCRKFRLDCPLAMERIKEDRPITIKDDKGNLNRCIADVVSLFITVMDKLRLEIRAMDEIQPDLRELMETMHRMSHLPPDFEGRQTVSQWLQTLSGMSASDELDDSQVRQMLFDLESAYNAFNRFLHA
以下显示人VPS28的核苷酸序列，交替外显子划下划线(NCBI基因ID51160)(SEQIDNO：19)：
ATGTTTCATGGGATCCCAGCCACGCCGGGCATAGGAGCCCCTGGGAACAAGCCGGAGCTGTATGAGGAAGTGAAGTTGTACAAGAACGCCCGGGAGAGGGAGAAGTACGACAACATGGCAGAGCTGTTTGCGGTGGTGAA GACAATGCAAGCCCTGGAGAAGGCCTACATCAAGGACTGTGTCTCCCCCAGCGAGTACACTGCAGCCTGCTCCCGGCTCCTGGTCCAATACAAAGCTGCCTTCAGGCAGGTCCAGGGCTCAGAAATCAGCTCTATTGACGAATTCTGCCGCAAGTTCCGCCTGGACTGCCCGCTGGCCATGGAGCGGATCAAGGAGGACCGGCCCATCAC CATCAAGGACGACAAGGGCAACCTCAACCGCTGCATCGCAGACGTGGTCTCGCTCTTCATCACGGTCATGGACAAGCTGCGCCTGGAGATCCGCGCCATGGATGAGATCCAGCCCGACCTGCGAGAGCTGATGGAGACCA TGCACCGCATGAGCCACCTCCCACCCGACTTTGAGGGCCGCCAGACGGTCAGCCAGTGGCTGCAGACCCTGAGCGGCATGTCGGCGTCAGATGAGCTGGACGACTCACAGGTGCGTCAGATGCTGTTCGACCTGGAGTCAGCCTACAACGCCTTCAACCGCTTCCTGCATGCCTGA
再次显示人VPS28的蛋白序列(SEQIDNO：18)，交替外显子编码的氨基酸划下划线。跨越剪接点编码的氨基酸是粗体的。
MFHGIPATPGIG PGNKPELYEEVKLYKNARERE YDNMAELFAVVKTMQALEKAYIKDCVSPS YTAACSRLLVQYKAAFRQVQGSEISSIDEFCRKFRLDCPLAMERIKEDRPITIKDDKGNLNRCIADVVSLFITVMDKLRLEIRAMDEIQPDLRELMETMHRMSHLPPDFEGRQTVSQ LQTLSGMSASDEIDDSQVRQMLFDLESAYNAFNRFLHA
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Claims (23)

1.一种用于在受试者中诊断前列腺癌、前列腺上皮内瘤变(PIN)或非典型小腺泡增殖(ASAP)的方法，所述方法包括确定从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和/或编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和/或VPS28蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括确定从所述受试者获取的所述测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括确定从所述受试者获取的所述测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的更高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中前列腺癌、PIN或ASAP的存在。
4.一种用于确定受试者中前列腺癌的等级的方法，所述方法包括检测从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达和/或活性水平指示在所述受试者中前列腺癌的等级，使得所述相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的更高的表达和/或活性指示前列腺癌的更高等级。
5.根据权利要求4所述的方法，其中从受试者获取的测试样品以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NALAADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；指示所述受试者可能患有格利森等级为至少3+3的前列腺癌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中从受试者获取的测试样品以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NALAADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
指示所述受试者可能患有格利森等级3+4或4+3的前列腺癌。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定从所述受试者获取的所述测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中前列腺癌的等级。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定从所述受试者获取的所述测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中前列腺癌的等级。
9.一种用于确定受试者中前列腺癌的病理阶段的方法，所述方法包括检测从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达或活性指示在所述受试者中前列腺癌的病理阶段，使得所述相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的更高的表达和/或活性指示前列腺癌的更高病理阶段。
10.根据权利要求9所述的方法，其中从受试者获取的测试样品以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NALAADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
指示所述受试者可能患有病理阶段pT2或pT3的前列腺癌。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述方法包括确定从所述受试者获取的所述测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中前列腺癌的病理阶段。
12.根据权利要求9至10中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定从所述受试者获取的所述测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中前列腺癌的病理阶段。
13.一种用于监测受试者中前列腺癌的进展的方法，所述方法包括确定从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在从所述受试者获取的先前样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与所述先前样品相比，在所述测试样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展到更具侵袭性的形式。
14.根据权利要求13所述的方法，其中从受试者获取的测试样品以相比于在从所述受试者获取的先前样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；指示前列腺癌进展为至少3+3的格利森等级。
15.根据权利要求14所述的方法，其中从患者获取的测试样品以相比于在从所述受试者获取的先前样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
指示前列腺癌进展为3+4或4+3的格利森等级。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，所述方法包括确定从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在从所述受试者获取的先前样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码VPS13A蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和VPS13A蛋白；
其中与所述先前样品中相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展至更具侵袭性的形式。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在从所述受试者获取的先前样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与所述先前样品中相比，在所述测试样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示前列腺癌进展至更具侵袭性的形式。
18.一种用于预测患有前列腺癌的受试者的预后的方法，所述方法包括检测从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因、编码VPS28蛋白的基因和/或编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白、VPS28蛋白和/或NAALADL2蛋白；
其中与在所述测试样品中相比，在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的较高水平的表达和/或活性指示不良预后。
19.根据权利要求18所述的方法，所述方法包括检测从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应基因或蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码VPS13A蛋白的基因和编码VPS28蛋白的基因，或者编码VPS28蛋白的基因和编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)VPS13A蛋白和VPS28蛋白，或者VPS28蛋白和NAALADL2蛋白；
其中与在所述测试样品中相比，在正常参照样品中相应基因或蛋白的较高水平的表达和/或活性指示不良预后。
20.一种用于诊断BPH的方法，所述方法包括确定从受试者获取的测试样品是否以相比于在正常参照样品中相应的一种或多种基因或一种或多种蛋白的表达更高的水平表达PSA，而非VPS13A、VPS28和/或NAALADL2，其中与所述正常参照样品相比，在所述测试样品中PSA，而非VPS13A、VPS28和/或NAALADL2的较高水平的表达指示在所述受试者中BPH的存在。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试样品是全血、血浆、血清、尿液、精液、粪便、来自胰腺活组织检查的组织或细胞、来自根治性前列腺切除术或胆胰海绵的组织或细胞。
22.一种用于诊断受试者中的结肠癌、胰腺癌或乳癌的方法，所述方法包括确定从所述受试者获取的测试样品是否以相比于在正常参照样品中编码NAALADL2蛋白的基因或NAALADL2蛋白的表达更高的水平表达：
(i)编码NAALADL2蛋白的基因；或
(ii)NAALADL2蛋白；
其中与在所述正常参照样品相比，在所述测试样品中编码NAALADL2蛋白的基因或NAALADL2蛋白的较高水平的表达和/或活性指示在所述受试者中结肠癌、胰腺癌或乳癌的存在。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述测试样品是全血、血浆、尿液、粪便、来自胰脏活组织检查或胆胰海绵的组织或细胞、来自乳房活组织检查的组织或细胞，或来自结肠活组织检查的组织或细胞。
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