ES2639559T3 - Análisis de imágenes para el pronóstico de cáncer de mama - Google Patents

Análisis de imágenes para el pronóstico de cáncer de mama Download PDF

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Olcay SERTEL
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Abstract

Un procedimiento para determinar el pronóstico de cáncer de mama en un sujeto, que comprende: seleccionar en una muestra de cáncer de mama obtenida del sujeto al menos dos campos de visión (FOV) diferentes para cada uno de receptor de estrógenos (ER), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), Ki-67 y receptor de progesterona (PR), en el que la muestra se marca de manera detectable con anticuerpos para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR; medir la expresión de las proteínas ER, HER2, Ki-67 y PR en cada uno de los FOV seleccionados; determinar una puntuación inmunohistoquímica (IHC) combinada IHC4, siendo la puntuación inmunohistoquímica combinada una puntuación pronóstica basada en dichos cuatro marcadores medidos; medir la heterogeneidad de proteínas para ER y PR en cada uno de los FOV seleccionados; determinar una puntuación de heterogeneidad de proteínas para cada uno de ER y PR, siendo la puntuación de heterogeneidad de proteínas una indicación de la cantidad de heterogeneidad de la expresión de proteínas de un biomarcador particular en FOV diferentes; combinar las puntuaciones de heterogeneidad de proteínas y la puntuación IHC combinada, generando así una puntuación de pronóstico de salida; y determinar que el cáncer de mama en el sujeto es probable que sea agresivo si la puntuación de pronóstico de salida alcanza un valor umbral o determinar que el cáncer de mama en el sujeto es improbable que sea agresivo si la puntuación de pronóstico de salida no alcanza el valor umbral.

Description

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DESCRIPCION
Analisis de imageries para el pronostico de cancer de mama Campo
Esta solicitud se refiere a un procedimiento para determinar el pronostico de cancer de mama, tal como cancer de mama en estadio temprano.
Partes del convenio de investigacion conjunta
Ventana Medical Systems, Inc., Cleveland Clinic, y la Universidad de Melbourne son partes de convenios de investigacion conjunta que regulan las invenciones divulgadas en el presente documento.
Antecedentes
Los pacientes con cancer de mama localizado (en estadio temprano, resecable) que se someten a cirugia curativa tienen un riesgo subyacente de recidiva de cancer local o a distancia, y las personas con recidiva muestran una tasa de mortalidad incrementada. Dependiendo de la envergadura del riesgo, existen diferentes opciones de tratamiento. Por tanto, se necesita un ensayo que pueda identificar de manera fiable a los pacientes con un riesgo bajo o alto de recidiva de cancer. En consecuencia, tambien se necesitan tecnologias que puedan discriminar de manera fiable entre pacientes con alto y bajo riesgo y proporcionar a los profesionales sanitarios informacion adicional que se ha de considerar a la hora de determinar las opciones de tratamiento del paciente.
El documento JASON CHRISTIANSEN ET AL: "Validation of IHC4 algorithms for prediction of risk of recurrence in early breast cancer using both conventional and quantitative IHC approaches", 2012 ASCO ANNUAL MEETING PROCEEDINGS, vol. 30, 30 de mayo de 2012 (), XP055081113, divulga el uso de la puntuacion IHC4 combinada para predecir el riesgo de recidiva de cancer de mama.
Sumario
La presente solicitud proporciona procedimientos de pronostico o determinacion del pronostico de cancer de mama en un sujeto. Los procedimientos de la invencion comprenden seleccionar en una muestra de cancer de mama obtenida del sujeto al menos dos campos de vision (FOV) diferentes para cada uno de receptor de estrogenos (ER), receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2), Ki-67 y receptor de progesterona (PR), en los que la muestra se marca de manera detectable con anticuerpos para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR; medir la expresion de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR en cada uno de los FOV seleccionados; determinar una puntuacion inmunohistoquimica (IHC) combinada; medir la heterogeneidad de proteinas para ER y PR en cada uno de los FOV seleccionados; determinar una puntuacion de heterogeneidad de proteinas para cada uno de ER y PR; combinar la puntuacion de heterogeneidad de proteinas y la puntuacion IHC combinada, generando asi una puntuacion de pronostico de salida; y determinar que es probable que el cancer de mama en el sujeto sea agresivo si la puntuacion de pronostico de salida alcanza un valor umbral o determinar que es improbable que el cancer de mama en el sujeto sea agresivo si la puntuacion de pronostico de salida no alcanza el valor umbral.
Los campos de vision digitales en imagenes de una muestra de cancer de mama de un sujeto marcada de manera detectable con anticuerpos para un biomarcador se pueden recibir y procesar para medir la heterogeneidad de proteinas para el biomarcador.
Las mediciones de heterogeneidad se pueden combinar con una puntuacion inmunohistoquimica combinada para generar una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama.
Dicha puntuacion puede proporcionar mas informacion que la puntuacion inmunohistoquimica combinada por si sola.
Se puede soportar un flujo de trabajo digital del patologo para facilitar la seleccion de campos de vision en las imagenes.
Los anteriores y otros objetos y caracteristicas de la divulgacion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar para llevar a cabo las tecnologias descritas en el presente documento.
La FIG. 2 es un diagrama de bloques que muestra como se usan imagenes de preparaciones tenidas para diferentes
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protefnas para generar una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama.
La FIG. 3 es un esquema que muestra una vista general de un procedimiento de ejemplo.
Las FIG. 4 A-B son imagenes que muestran anotaciones ejemplares en campos de vision.
La FIG. 5 es un esquema que muestra una vista general de un procedimiento de ejemplo.
La FIG. 6 es un dibujo esquematico que muestra etapas ejemplares para obtener imagenes de inmunohistoquimica (IHC) de una muestra de tejido mamario.
La FIG. 7 es un dibujo esquematico que muestra etapas ejemplares para determinar o medir la expresion de protefnas en un campo de vision.
La FIG. 8 es un dibujo esquematico que muestra etapas ejemplares para determinar o medir la heterogeneidad de protefnas.
La FIG. 9 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar que implementa las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento.
La FIG. 10 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar que implementa las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento.
La FIG. 11 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar para identificar nucleos en una preparacion.
La FIG. 12 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar para la puntuacion del campo de vision.
La FIG. 13 es un diagrama de bloques de otro sistema ejemplar para la puntuacion del campo de vision.
La FIG. 14 es un diagrama de bloques de un clasificador ejemplar para determinar nucleos tenidos verdaderos positivos.
La FIG. 15 es un diagrama de bloques de un clasificador multietapa ejemplar para determinar nucleos tenidos verdaderos positivos.
La FIG. 16 es un diagrama de flujo de un procedimiento ejemplar de determinar una puntuacion para HER2 en intervalos de clase.
La FIG. 17 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar que incluye una herramienta de heterogeneidad que implementa las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento.
La FIG. 18 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar que implementa las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento por medio de la determinacion de una puntuacion de heterogeneidad para biomarcadores respectivos.
La FIG. 19 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar que incluye una maquina diferencial para calcular una puntuacion de heterogeneidad para un biomarcador.
La FIG. 20 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar para calcular una puntuacion de heterogeneidad para su uso en las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento.
La FIG. 21 es una captura de pantalla de una interfaz de usuario ejemplar para indicar campos de vision digitales dentro de una imagen.
La FIG. 22 es un diagrama de flujo de un procedimiento del flujo de trabajo digital del patologo ejemplar.
La FIG. 23 es un diagrama de bloques de un sistema computacional ejemplar en el que se pueden implementar modos de realizacion descritos.
La FIG. 24 es un grafico que muestra la capacidad de los procedimientos divulgados para clasificar una muestra de cancer de mama en cuanto a mayor (evolucion) o menor (sin evolucion) agresividad. Los casos mostrados en el grafico son los mismos casos usados para crear el algoritmo.
Descripcion detallada
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Abreviaturas y terminos
Las siguientes explicaciones de terminos y procedimientos se proporcionan para describir mejor la presente divulgacion y para guiar a los expertos en la tecnica en la practica de la presente divulgacion. Los datos de los numeros de acceso a GenBank a los que se hace referencia en el presente documento son las secuencias disponibles al menos tan pronto como desde el 28 de diciembre de 2012.
Anticuerpo: Moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union a antigeno que se une especificamente (inmunorreacciona con) un antigeno (tal como ER, PR, Ki-67 o HER2). Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados.
Un anticuerpo natural (tal como IgG, IgM, IgD) incluye cuatro cadenas polipeptidicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), interconectadas mediante enlaces disulfuro. Tal como se usa en el presente documento, el termino anticuerpo tambien incluye anticuerpos recombinantes producidos mediante la expresion de un acido nucleico que codifica una o mas cadenas de anticuerpo en una celula (por ejemplo, vease la patente de EE. UU. n.° 4.745.055, la patente de EE. UU. n.° 4.444.487, el documento WO 88/03565; el documento EP 256.654; el documento EP 120.694; el documento EP 125.023; Faoulkner et al, Nature 298:286, 1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison et al., Ann Rev. Immunol 2:239, 1984).
El termino anticuerpo tambien incluye un fragmento de union a antigeno de un anticuerpo natural o recombinante. Los ejemplos no limitantes especificos de fragmentos de union abarcados por el termino anticuerpo incluyen Fab, (Fab’)2, Fv y Fv monocatenario (scFv). Fab es el fragmento que contiene un fragmento monovalente de union a antigeno de una molecula de anticuerpo producida mediante digestion de anticuerpo completo con la enzima papaina para producir una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada o de manera equivalente mediante ingenieria genetica. Fab’ es el fragmento de una molecula de anticuerpo obtenida tratando el anticuerpo completo con pepsina, seguido de reduccion, para producir una cadena ligera intacta y una porcion de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab’ por cada molecula de anticuerpo. (Fab’)2 es el fragmento del anticuerpo obtenido al tratar el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reduccion posterior o de manera equivalente mediante ingenieria genetica. F(Ab’)2 es un dimero de dos fragmentos FAb’ unidos entre si mediante enlaces disulfuro. Fv es un fragmento genomanipulado que contiene la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas. El anticuerpo monocatenario (“SCA”) es una molecula genomanipulada que contiene la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada unidas mediante un enlazador polipeptidico adecuado como una molecula monocatenaria fusionada geneticamente. Los procedimientos para preparar estos fragmentos son rutinarios en la tecnica.
Afinidad de union: Afinidad de un anticuerpo por un antigeno, tal como la afinidad de un anticuerpo por un peptido ER, PR, Ki-67 o HER2. Los procedimientos de determinacion de la afinidad de anticuerpos se conocen en la tecnica e incluyen el calculo mediante una modificacion del procedimiento de Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol, 16:101-106, 1979, medicion mediante una tasa de disociacion antigeno/anticuerpo, o mediante un radioinmunoensayo de competicion. Una afinidad de union alta puede ser de al menos aproximadamente 1 x 10-8 M, al menos aproximadamente 1,5 x 10-8, al menos aproximadamente 2,0 x 10-8, al menos aproximadamente 2,5 x 10-8, al menos aproximadamente 3,0 x 10-8, al menos aproximadamente 3,5 x 10-8, al menos aproximadamente 4,0 x 10-8, al menos aproximadamente 4,5 x 10-8 o al menos aproximadamente 5,0 x 10-8 M.
Cancer de mama: Incluye cualquier tumor de la mama, tal como tumores en, cerca de o incluyendo tejido mamario epitelial (carcinoma) o estromal (sarcoma). El carcinoma ductal in situ (DCIS) es una afeccion neoplasica no invasiva de los conductos mamarios. El carcinoma lobulillar no es una enfermedad invasiva, pero es un indicador de que se puede desarrollar un carcinoma. El carcinoma infiltrante (maligno) de la mama se puede dividir en estadios (I, IIA, IIB, IIIA, IIIB y IV). Vease, por ejemplo, Bonadonna et al., (eds). Textbook of Breast Cancer: A clinical Guide the Therapy, 3.°; London, Tayloy & Francis, 2006. El DCIS se denomina en ocasiones cancer de mama en estadio 0 porque no es invasivo. Los carcinomas de mama invasivos ejemplares incluyen carcinoma NOS (no especificado de otro modo), carcinoma lobulillar, carcinoma tubular/cribriforme, carcinoma mucinoso (coloide), carcinoma medular, carcinoma papilar y carcinoma metaplasico. Un sarcoma de mama ejemplar es un tumor filodes.
Un cancer de mama en estadio temprano es uno que esta en estadio I o II. Una muestra de tejido mamario, por ejemplo, que sea positiva para ER, con ganglios linfaticos negativos y, en algunos ejemplos, negativa para HER2 tambien se puede caracterizar como cancer de mama en estadio temprano.
Los tratamientos ejemplares para el cancer de mama incluyen cirugia (por ejemplo, extraccion de parte o todo el tumor), tratamiento de bloqueo hormonal (por ejemplo, tamoxifeno), radiacion, ciclofosfamida mas doxorrubicina (adriamicina), taxano (por ejemplo, docetaxel) y anticuerpos monoclonales tales como trastuzumab (Herceptin) o pertuzumab, o combinaciones de los mismos.
Control: Una muestra o patron usado para su comparacion con una muestra experimental o de prueba (tal como una muestra mamaria). En algunos modos de realizacion, el control es una muestra normal obtenida de un paciente
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sano (o pluralidad de pacientes), tal como una muestra mamaria normal o pluralidad de muestras. En algunos ejemplos, el control es una muestra de tejido no tumoral obtenida de un paciente al que se ha diagnosticado cancer de mama, tal como tejido mamario normal. En algunos modos de realizacion, el control es una muestra (o pluralidad de muestras) de cancer de mama en estadio temprano conocida, tal como una muestra conocida por ser ER+, PR+, Ki-67+ y HER2-.
En algunos modos de realizacion, el control es un control historico o un valor de referencia estandar o un intervalo de valores (tal como una(s) muestra(s) de control previamente sometida(s) a prueba, tal como un cancer de mama conocido, muestra mamaria normal, muestra mamaria benigna, epitelio o estroma). En algunos modos de realizacion, el control es un valor estandar que representa el valor promedio (o intervalo promedio de valores) obtenido a partir de una pluralidad de muestras de pacientes, tales como muestras mamarias normales conocidas o muestras de cancer de mama temprano conocidas.
Se pueden usar muestras de control para el control con tincion. Dicho enfoque puede ser pertinente para identificar la proporcion senal/ruido de la muestra.
Poner en contacto: Poner un agente en estrecha proximidad con otro agente, permitiendo asi que los agentes interaccionen. Por ejemplo, se puede aplicar un anticuerpo a un portaobjetos de microscopio u otra superficie que contenga una muestra biologica, permitiendo asi la deteccion de proteinas en la muestra que son reconocidas especificamente por el anticuerpo.
Detectar: Determinar si un agente esta presente o ausente, y puede incluir determinar un patron. En algunos ejemplos, esto puede incluir adicionalmente la cuantificacion. Por ejemplo, el uso de un anticuerpo especifico para una proteina particular (por ejemplo, Ki-67, ER, PR o HER2) permite la deteccion de la proteina en una muestra, tal como una muestra que contiene tejido de cancer de mama. En ejemplos particulares, se detecta una senal de emision de un marcador detectable (tal como un incremento en la senal si esta presente la diana).
La deteccion puede ser en masa, de modo que se pueda observar simultaneamente un numero macroscopico de moleculas. La deteccion tambien puede incluir la identificacion de senales de moleculas individuales usando microscopia y tecnicas tales como reflexion interna total para reducir el ruido de fondo.
Receptor de estrogenos (ER): Un miembro de la familia de hormonas nucleares de receptores intracelulares que se activa por 17 p-estradiol. Los receptores de estrogenos se sobreexpresan en alrededor de un 70 % de los casos de cancer de mama, denominados "positivos para ER" (ER+).
Puntuacion H: Una indicacion de la expresion de proteinas que pondera las celulas tenidas fuertemente con mas peso que las celulas tenidas debilmente. Por ejemplo, una puntuacion H puede indicar el porcentaje de celulas que se tinen debilmente (por ejemplo, 1+) mas dos veces el porcentaje de celulas que se tinen moderadamente (por ejemplo, 2+) mas tres veces el porcentaje de celulas que se tinen fuertemente (por ejemplo, 3+) (por ejemplo, vease Cuzick et al., J. Clin. Oncol. 29:4273-8, 2011, incorporado en el presente documento mediante referencia) (vease tambien
www.pathogenesys.com/html/semi-quantitative_ihc.html). En el presente documento se describen tecnicas de calculo de la puntuacion H ejemplares.
Puntuacion de heterogeneidad: Una indicacion de la cantidad de heterogeneidad de la expresion de proteinas de un biomarcador en una muestra, tal como tincion en cuanto a ER, HER2, Ki-67 o PR en una muestra de cancer de mama. La puntuacion de heterogeneidad proporciona una medida de cuan diferente es un FOV de otro FOV, para el mismo marcador.
Receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2): Un miembro de la familia de proteinas ErbB, que es un protoncogen localizado en el brazo largo del cromosoma 17 (17q11.2-q12) humano. Aproximadamente un 25-30 % de los canceres de mama tienen una amplificacion del gen HER2/neu o sobreexpresion de su producto de proteina, denominados "positivos para HER2" (HER2+). Los pacientes HER2+ pueden recibir el anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin) como un tratamiento para el cancer de mama, y, en algunos ejemplos, se usa en combinacion con el anticuerpo monoclonal pertuzumab. La sobreexpresion de HER2 en el cancer de mama se ha asociado a una recidiva de la enfermedad incrementada y a un peor pronostico.
Puntuacion inmunohistoqui'mica (IHC) combinada: Una puntuacion de pronostico basada en un numero de marcadores IHC, en la que el numero de marcadores es mayor que uno. IHC4 es una de dichas puntuaciones basada en cuatro marcadores IHC medidos, en concreto, ER, HER2, Ki-67 y PR, en una muestra de cancer de mama (por ejemplo, vease Cuzick et al., J. Clin. Oncol. 29:4273-8, 2011 y Barton et al, Br. J. Cancer 1-6, 24 de abril de 2012, ambos incorporadas en el presente documento mediante referencia). En un ejemplo, se calcula una puntuacion IHC4 usando, por ejemplo, la siguiente formula:
IHC4 = 94,7 x {-0,100 ER10 - 0,079 PR10 + 0,586 HER2 + 0,240 In (1 + 10 x Ki67)}.
Un experto en la tecnica apreciara que son posibles otras puntuaciones IHC combinadas (por ejemplo, IHC3, IHC5 o similares).
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Ki-67: Una proteina nuclear asociada a la proliferacion celular y la transcripcion de ARN ribosomico. La inactivacion del antigeno Ki-67 da lugar a la inhibicion de la sintesis de ARN ribosomico. Ki-67 se usa, por ejemplo, como un marcador de proliferacion.
Marcador: Un agente con capacidad de deteccion, por ejemplo, mediante espectrofotometria, citometria de flujo o microscopia (tal como microscopia optica). Por ejemplo, se pueden acoplar uno o mas marcadores a un anticuerpo, permitiendo asi la deteccion de la proteina diana. Los marcadores ejemplares incluyen isotopos radioactivos, fluoroforos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y combinaciones de los mismos. En un ejemplo, el marcador es un punto cuantico (quantum dot).
Tejido o celulas normales: Tejido y celulas no malignos, no tumorales.
Puntuacion de pronostico de salida: El resultado de combinar y ponderar las puntuaciones IHC combinadas (por ejemplo, IHC4) y las puntuaciones de heterogeneidad para un sujeto, a partir de las cuales se puede determinar el pronostico de cancer de mama.
Receptor de progesterona (PR o PgR): Un receptor esteroideo intracelular que se une especificamente a progesterona. Los receptores de progesterona se sobreexpresan en algunos casos de cancer de mama, denominados "positivos para PR" (PR+).
Pronostico: El procedimiento para determinar el resultado probable de que un sujeto tenga una enfermedad (por ejemplo, cancer de mama en estadio temprano) en ausencia de tratamiento adicional. En un ejemplo, los procedimientos divulgados permiten el pronostico de una forma mas agresiva de un cancer de mama en estadio temprano si se detecta una puntuacion de pronostico de salida por encima de un umbral. En cambio, se determina el pronostico de una forma menos agresiva de un cancer de mama en estadio temprano si se detecta una puntuacion de pronostico de salida por debajo de un umbral. Por ejemplo, el pronostico puede estar relacionado con la prediccion de acontecimientos futuros, tales como la esperanza de vida (por ejemplo, la probabilidad de supervivencia a 1 ano, 3 anos o 5 anos), prediccion de una probable recidiva (local o metastasica) de cancer de mama (por ejemplo, en 1, 3 o 5 anos). El termino similar "determinar el pronostico" tambien se usa en el presente documento.
Cuantificar: Expresar como una cantidad numerica, ya sea como una cantidad real o una cantidad relativa.
Muestra: Un especimen biologico que puede contener, por ejemplo, ADN genomico, ARN (por ejemplo, ARNm), proteina o combinaciones de los mismos, obtenida de un sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, aspirado de biopsia con aguja fina, biopsia de tejido, especimen quirurgico y material de necropsia. En un ejemplo, una muestra incluye tejido mamario, tal como el obtenido durante una biopsia por puncion, tumorectomia o mastectomia.
Estadificacion del cancer: Un cancer, tal como cancer de mama, se puede estadificar para describir el alcance o gravedad de un cancer basandose en el alcance del tumor original (primario) y el grado de diseminacion en el cuerpo. El cancer de mama se puede estadificar de acuerdo con el sistema TNM (vease el Manual de estadificacion del AJCC), donde T describe el tamano del tumor y si ha invadido tejido cercano, N describe cualesquiera ganglios linfaticos implicados y M describe metastasis (diseminacion del cancer desde una parte del cuerpo a otra).
Los estadios son como sigue: estadio 0 - carcinoma in situ; estadio I - el tumor (T) no implica ningun ganglio linfatico axilar (N); estadio IIA - T de 2-5 cm y N negativo o T < 2 cm y N positivo; estadio IIB - T > 5 cm y N negativo o T 25 cm y N positivo (< 4 nodulos axilares); estadio IIIA - T > 5 cm y N positivo o T 2-5 cm con 4 o mas ganglios axilares; estadio IIIB - el T se ha infiltrado en la pared toracica o piel y se puede haber diseminado a < 10 N axilares; estadio IIIC - T tiene > 10 N axilares, 1 o mas N supraclaviculares o infraclaviculares, o N mamario interno; y estadio IV - metastasis (M) a distancia.
Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoria que incluye mamiferos humanos y no humanos, tales como sujetos veterinarios. En un ejemplo particular, un sujeto es uno que tuvo o se sospecha que ha tenido cancer de mama, tal como un cancer de mama en estadio temprano.
Molecula diana: Una biomolecula cuya deteccion o medicion se desea, tal como un marcador de cancer de mama. Los ejemplos de moleculas diana incluyen ER, PR, Ki-67 y HER2.
En condiciones suficientes para: Una frase que se usa para describir cualquier entorno que permita la actividad deseada. Un ejemplo incluye poner en contacto un anticuerpo con una muestra de cancer de mama suficiente para permitir la deteccion de una o mas moleculas diana (por ejemplo, ER, PR, HER2, Ki-67) en la muestra y puede incluir la cuantificacion de una o mas moleculas diana en la muestra.
Sistema ejemplar para determinar el pronostico de cancer de mama
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La FIG. 1 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar para llevar a cabo las tecnologias descritas en el presente documento. En el ejemplo, se hace funcionar un dispositivo de adquisicion de imagenes 10, tal como un equipo de obtencion de imagenes de preparaciones (por ejemplo, iScan Coreo de Ventana Medical Systems, Inc. o similar) para que acepte una preparacion 5 preparada como se describe en el presente documento y generar una imagen de la preparacion 5 para su analisis como se describe en el presente documento. En la practica, se usa una pluralidad de preparaciones como se describe en el presente documento.
El sistema computacional 20 puede incluir uno o mas dispositivos de entrada 23, una o mas pantallas 24 y uno o mas ordenadores 21, que pueden ejecutar una aplicacion o plataforma de procesamiento de imagenes como se describe en el presente documento.
Los datos, tales como imagenes obtenidas, se pueden almacenar, por ejemplo, de manera remota en un servidor 12 y/o en un ordenador 21. La adquisicion de imagenes se puede realizar por separado (por ejemplo, en un sistema diferente, mediante un actor diferente o similar) del procesamiento de imagenes.
En algunas implementaciones se puede implementar un escenario basado en la nube o de software como servicio, en las que la aplicacion de procesamiento de imagenes 22 se halla parcial o totalmente fuera del ordenador 21 (por ejemplo, en el servidor 12 o en uno o mas de otros servidores).
Procedimientos ejemplares para determinar el pronostico de cancer de mama
En el presente documento se muestra que se puede determinar el pronostico de los canceres de mama, por ejemplo, canceres de mama en estadio temprano, basandose en la obtencion de una puntuacion inmunohistoquimica (IHC) combinada (tal como una puntuacion IHC4) y/o una puntuacion de heterogeneidad. Estas dos puntuaciones se combinan y ponderan, dando como resultado una puntuacion de pronostico de salida. La puntuacion de pronostico de salida resultante se puede usar para determinar el pronostico del paciente con cancer de mama. Por ejemplo, si la puntuacion de pronostico de salida esta por encima de un valor umbral, esto indica que el cancer de mama es mas agresivo o que es mas probable que recidive, mientras que una puntuacion de pronostico de salida que esta por debajo de un valor umbral indica que el cancer de mama es menos agresivo y que es menos probable que recidive Esto proporciona a los medicos y pacientes la capacidad de tomar decisiones de tratamiento y seguimiento mas apropiadas. Por ejemplo, el pronostico de salida puede ser beneficioso en la determinacion de un tratamiento apropiado (por ejemplo, elegir entre el seguimiento, una mastectomia, una tumorectomia o una tumorectomia combinada con quimioterapia).
En el presente documento se proporcionan procedimientos para determinar el pronostico de cancer de mama, tales como cancer de mama en estadio temprano, en un sujeto. En algunos ejemplos, se sabe que el cancer de mama es positivo para el receptor de estrogenos (ER+), positivo para el receptor de progesterona (PR+) y negativo para el receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2-) o positivo para el receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2+). Por ejemplo, los procedimientos se pueden usar para determinar la probable agresividad del cancer o la probabilidad de que el cancer recidive, por ejemplo, la probabilidad de que el cancer recidive en un plazo de 5 anos.
Las tecnologias del presente documento pueden generar una puntuacion IHC combinada y una puntuacion de heterogeneidad basandose en campos de vision indicados en imagenes de una o mas preparaciones que tienen tejido de cancer de mama tomado de un sujeto. A continuacion, las puntuaciones se pueden combinar para generar una puntuacion de pronostico como se describe en el presente documento. Se pueden generar diversas puntuaciones y/o calculos intermedios antes de llegar a la puntuacion IHC combinada o puntuacion de heterogeneidad como se describe en el presente documento.
En un procedimiento ejemplar, se toma una muestra de tejido de cancer de mama de un sujeto. En algunos ejemplos, la muestra de cancer de mama es una muestra de cancer de mama en estadio temprano, tal como una que es negativa para HER2 (por ejemplo, tincion IHC de menos de 2+ como se describe en el presente documento) y/o FISH amplificado, positiva para eR y/o con ganglios linfaticos negativos. De esta manera, una muestra negativa para HER2 puede ser una que (1) muestre algo de tincion IHC, tal como tincion que sea de menos de 2+ o una puntuacion H de <1 o (2) se amplifica como se indica mediante analisis de FISH, pero es una en la que un medico o patologo llegaria a la conclusion de que, de todos modos, era negativa para HER2. De manera alternativa, la muestra puede ser positiva para HER2.
Ademas de FISH, se pueden usar otros tipos de hibridacion in situ (ISH), tales como hibridacion in situ cromogenica (CISH), hibridacion in situ cromogenica de doble color (DISH) o similares.
La FIG. 2 es un diagrama de bloques que muestra como se usan las imagenes 32, 34, 36 y 38 de preparaciones tenidas para diferentes proteinas para generar una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama 58. Aunque se muestran diferentes preparaciones, se puede emplear un enfoque de micromatrices de tejidos como se describe en el presente documento, dando como resultado un menor numero de preparaciones. Por ejemplo, una
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unica preparacion puede incluir una pluralidad de secciones de tejido diferentes, que se pueden analizar cada una para una protema diferente. En otro ejemplo, se puede analizar una unica seccion de tejido para una pluralidad de protefnas. Una muestra, por ejemplo, un bloque de tejido, se divide en secciones, por ejemplo, cuatro secciones, que pueden ser o no ser secciones adyacentes o en serie de la muestra. A cada seccion se aplican agentes especfficos para los biomarcadores de interes, por ejemplo, sondas o tinciones. En un ejemplo, se aplica un agente especffico para el receptor de estrogenos ER a una seccion, se aplica un agente especffico para el PR a otra seccion y similares. Los agentes ejemplares incluyen anticuerpos y aptameros. De esta manera, la muestra se puede marcar de manera detectable con anticuerpos especfficos para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR. A continuacion, las imagenes 32, 24, 36 y 38 de las secciones de muestra se adquieren como se describe en el presente documento. A partir de las imagenes 32, 34, 36 y 38, se calculan una puntuacion H para ER 41, una positividad en porcentaje para PR 42, una positividad en porcentaje para Ki-67 43 y una puntuacion en intervalos de clase para HER2 44. La puntuacion en intervalos de clase 44 se puede convertir en una puntuacion binaria (por ejemplo, 0 o 1) 45. A continuacion, las puntuaciones se combinan como se describe en el presente documento para generar una puntuacion IHC4 55.
La puntuacion de heterogeneidad para ER 51 se basa en una determinacion de positividad en porcentaje para ER 47 y la puntuacion de heterogeneidad para PR 52 se basa en una determinacion de positividad en porcentaje para PR 42. Las puntuaciones de heterogeneidad 51 y 52 se pueden combinar como se describe en el presente documento para generar una puntuacion de heterogeneidad combinada 54.
A continuacion, la puntuacion IHC4 55 y la puntuacion de heterogeneidad combinada 54 se pueden combinar para generar una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama 58.
La FIG. 3 proporciona una vista general de un procedimiento ejemplar. El procedimiento incluye determinar una puntuacion IHC4 por medio de la expresion medida para cada uno de ER, Ki-67, PR y HER2 112, por ejemplo, determinando o midiendo una positividad en porcentaje para cada uno de PR y Ki-67, una puntuacion en intervalos de clase para HER2 (por ejemplo, en una escala tfpica de 0 a 3 para representar la intensidad, en la que 0 se asigna a tincion negativa y 3 se asigna a muestras tenidas muy intensamente) y una puntuacion H para ER. El procedimiento tambien incluye determinar una puntuacion de heterogeneidad para al menos ER y PR y en algunos ejemplos tambien para Ki-67 y HER2 114. La puntuacion IHC4 112 y la puntuacion de heterogeneidad 114 resultantes se combinan 116 para producir una puntuacion de pronostico de salida 118. Basandose en la puntuacion de pronostico de salida, se determina el pronostico 120 de cancer de mama.
En un ejemplo, se obtienen imagenes de cada preparacion y se genera una imagen digital de cada preparacion usando cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento. Se genera una puntuacion IHC combinada mediante un procedimiento implementado por ordenador basado en las preparaciones, y se genera una puntuacion de heterogeneidad para cada preparacion (o seccion de la preparacion que se analiza, tal como una region que contiene una seccion de tejido para el analisis de ER). En un modo de realizacion ejemplar, la puntuacion IHC combinada se denomina "puntuacion IHC4", ya que se utilizan cuatro biomarcadores para recabar informacion. La puntuacion IHC4 se puede combinar con las puntuaciones de heterogeneidad como se describe en el presente documento para generar una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama.
En un ejemplo, para calcular la puntuacion IHC4, el procedimiento incluye seleccionar, en la imagen de cada seccion de tejido en una o mas preparaciones de la muestra de cancer de mama que se ha marcado con un agente (tal como un anticuerpo), al menos dos campos de vision (FOV) diferentes para cada una de una imagen de preparacion de secciones de tejido para ER, una imagen de preparacion de secciones de tejido para HER2, una imagen de preparacion de secciones de tejido para Ki-67 y una imagen de preparacion de secciones de tejido para PR. En un modo de realizacion ejemplar, se seleccionan tres (3) FOV para cada preparacion o seccion para calcular la puntuacion IHC4. Se eligen regiones tumorales como campos de vision.
La FIG. 4A muestra un conjunto ejemplar de imagenes de preparaciones 180 y anotaciones mediante las cuales se seleccionan los campos de vision (FOV) 181A, 181B y 181C (por ejemplo, por un patologo) en las imagenes de preparaciones respectivas para calcular una puntuacion IHC combinada. Como se muestra, las anotaciones pueden ser independientes, sin ninguna relacion entre los campos de vision de un biomarcador. En los ejemplos, los campos de vision son rectangulares. Sin embargo, como se describe en el presente documento, se pueden usar otras tecnicas (por ejemplo, los campos de vision pueden ser otras formas conocidas o formas irregulares). En algunos ejemplos, el campo de vision es un area de interes, tal como una region anatomica de interes (por ejemplo, glandula). En un ejemplo, el campo de vision es una preparacion completa o seccion de tejido completa.
Basandose en los campos de vision, se calcula una puntuacion IHC combinada. Al calcular los componentes para la puntuacion IHC combinada, los campos de vision se pueden tomar en conjunto (por ejemplo, combinados y/o considerados colectivamente) para un biomarcador particular. Por ejemplo, la puntuacion H, la positividad en porcentaje y la puntuacion en intervalos de clase para HER2 se pueden basar en conjuntos respectivos de campos de vision tomados en conjunto (por ejemplo, la puntuacion H para ER se basa en las celulas observadas en los campos de vision). Son posibles otras tecnicas (por ejemplo, promediar puntuaciones, votar por una puntuacion, o similares).
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Por ejemplo, la puntuacion IHC combinada se puede calcular usando la formula para IHC4 de Dowsett o una variacion de la misma:
IHC4 = 94,7 x {-0,100 ER10 - 0,079 PR10 + 0,586 HER2 + 0,240 In (1 + 10 x Ki67)},
en la que ER10 es la puntuacion H/30 para ER, en la que PR10 se obtiene dividiendo el porcentaje de celulas con tincion positiva (por ejemplo, con un limite superior de un 10 % impuesto sobre el porcentaje de celulas) entre 10 para generar una variable con un intervalo de 0 a 10, en la que HER2 es la puntuacion para HER2 binaria (por ejemplo, 0 si es menos de 2+, 1 de otro modo) y Ki67 es la positividad en porcentaje para Ki-67. En la practica, ER10 se ajusta a escala a un intervalo de 0 - 10 dividiendo la puntuacion H entre 30 como se muestra en la formula.
Para algunos de los campos de vision, los nucleos con tincion positiva se diferencian de los nucleos con tincion negativa (por ejemplo, no tenidos) en cada campo de vision. A continuacion, para las preparaciones para PR y Ki-67, se calcula la positividad en porcentaje (por ejemplo, se suman el numero total de nucleos de celulas (por ejemplo, celulas malignas) con tincion positiva en cada campo de vision en la imagen digital de una preparacion y se dividen entre el numero total de nucleos con tincion positiva y negativa de cada uno de los campos de vision de una imagen digital) en una unica preparacion como sigue:
Positividad en porcentaje = numero de celulas con tincion positiva / (numero de celulas con tincion positiva + numero de celulas con tincion negativa)
En un ejemplo, la positividad en porcentaje se determina manualmente (por ejemplo, sin el uso de una imagen digital, con el uso de analisis de imagenes, o diversos otros procedimientos de analisis de imagenes.
En un ejemplo, los nucleos se detectan y clasifican como nucleos con tincion positiva o nucleos con tincion negativa por medio de las tecnicas de identificacion de nucleos descritas en el presente documento. Por ejemplo, las celulas con tincion negativa se pueden diferenciar, por ejemplo, de linfocitos y tejido estromal. Dicha tecnica puede ser superior a usar un umbral de color universal.
Adicionalmente, por ejemplo, se calcula la puntuacion H (que refleja la intensidad de las celulas tenidas y el numero de celulas tenidas para una preparacion individual) para la preparacion (o seccion de tejido) para ER. Dicha puntuacion se puede basar en los FOV tomados en conjunto colectivamente. En modos de realizacion ejemplares, se usa una escala numerica (por ejemplo, 0-300) para la puntuacion H. Para las celulas (por ejemplo, en los campos de vision) con tincion positiva, se determina la intensidad. Dicha intensidad se puede determinar por medio de un algoritmo, en comparacion con un umbral, y asignar un numero de intervalos de clase. Dicho numero de intervalos de clase puede ser, por ejemplo, 0, 1, 2 o 3. Como resultado, habra un recuento de nucleos (es decir, celulas) en cada intervalo de clase. Los recuentos de los intervalos de clase se pueden usar para calcular la puntuacion H.
La etapa intermedia de agrupar los nucleos en intervalos de clase se puede reutilizar mas tarde al calcular una puntuacion de heterogeneidad. Las intensidades positivas (por ejemplo, marron) (por ejemplo, 1, 2 y 3) se pueden agregar para determinar un recuento de nucleos con tincion positiva global segun sea necesario (por ejemplo, para la puntuacion de heterogeneidad para ER).
El calculo de la puntuacion binaria para HER2 puede incluir determinar la puntuacion en intervalos de clase (que se relaciona con la completitud de la tincion de la membrana celular y la intensidad de la membrana celular tenida) para la preparacion para HER2 (por ejemplo, basandose en los campos de vision). La puntuacion en intervalos de clase para los FOV combinados es 0, 1,2 o 3 como se describe en el presente documento. 0 o 1 se consideran negativos (0 para la puntuacion binaria) y 2 o 3 se consideran positivos (1 para la puntuacion binaria). De esta manera, se calcula una puntuacion binaria para HER2. De manera alternativa, las puntuaciones para los FOV se pueden combinar (por ejemplo, promediar, promedio y redondeo o similares) para determinar una puntuacion global para HER2.
A continuacion, se puede determinar la puntuacion IHC4 utilizando la positividad en porcentaje, puntuacion H y puntuacion binaria descritas anteriormente. La expresion de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR se puede detectar o medir en cada uno de los FOV seleccionados para ayudar a realizar estas determinaciones. Por ejemplo, se puede examinar o medir la expresion de proteinas para determinar o medir una positividad en porcentaje para cada uno de Ki-67 y PR, una puntuacion de intensidad de tincion en intervalos de clase para HER2 y una puntuacion H para ER. Basandose en esta informacion, se puede determinar o calcular una puntuacion inmunohistoquimica (IHC) combinada de acuerdo con la formula anterior.
Aparte de la puntuacion IHC combinada colectiva (por ejemplo, IHC4) para la muestra, tambien se puede calcular la heterogeneidad, por ejemplo, la heterogeneidad de la expresion de proteinas para biomarcadores respectivos (por ejemplo, ER, PER, HER2 y Ki67). Las determinaciones de la heterogeneidad anaden valor pronostico al valor ya existente de la puntuacion IHC combinada (por ejemplo, IHC4). En un modo de realizacion ejemplar, se determina la heterogeneidad, por ejemplo, heterogeneidad regional, para cada biomarcador (por ejemplo, ER, PER, HER2 y Ki67). La FIG. 4B es un conjunto ejemplar de imagenes de preparaciones 185 que muestran anotaciones mediante las cuales se seleccionan los campos de vision 186A, 186B y 186C (por ejemplo, por un patologo) en las imagenes
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de preparaciones respectivas para calcular una puntuacion de heterogeneidad. Como se muestra, las anotaciones pueden ser independientes, sin ninguna relacion entre los campos de vision de un biomarcador. Se puede usar un conjunto de anotaciones diferente para la heterogeneidad que las usadas para la puntuacion IHC combinada. En algunos casos, puede haber un solapamiento parcial entre el FOV usado para la puntuacion IHC combinada y el FOV usado para las puntuaciones de heterogeneidad (por ejemplo, se puede compartir un campo de vision entre los mismos para un biomarcador).
En un modo de realizacion ejemplar, se determina la heterogeneidad para una preparacion (o seccion de tejido) para medir cuan diferentes son las diversas regiones tumorales de una referencia, por ejemplo, entre si. En un modo de realizacion ejemplar, un patologo selecciona un numero de campos de vision para una preparacion (o seccion de tejido). En un modo de realizacion, el patologo selecciona tres campos de vision, incluyendo cada uno regiones tumorales, por ejemplo, con diferentes positividades en porcentaje.
La heterogeneidad de proteinas para ER y PR se mide o detecta usando los FOV indicados. Por ejemplo, medir la heterogeneidad de proteinas puede incluir determinar una metrica de variabilidad (VM) para cada una de ER y PR, en la que VM = STD(PP(FSi), PP(FS2),... PP(FSn)). PP(FS) es la positividad en porcentaje para cada FOV, fS (por ejemplo, los campos de vision de una imagen digital de una muestra de tejido que se ha puesto en contacto con un agente especifico para la sonda de ER, un agente especifico para PR o similares). Basandose en la metrica de variabilidad, se determina o calcula una puntuacion de heterogeneidad para cada uno de ER y PR. Por ejemplo, la puntuacion de heterogeneidad para cada uno de ER y PR se puede calcular usando la siguiente formula, donde a = [0,1] (por ejemplo, un numero que varia desde 0 a 1) es un factor de normalizacion, y S es una puntuacion de preparaciones con positividad en porcentaje promedio como se describe en el presente documento:
( VM
imagen1
a *
0,05
VM
S < 10 %
de otro modo
Los modos de realizacion que calculan la heterogeneidad para Ki-67 pueden usar la misma formula o similar que la usada para ER y PR. La puntuacion de heterogeneidad de proteinas para HER2, que puede ser util en algunos modos de realizacion, se puede calcular usando la siguiente formula:
H=Yj\\P(FSi)-P(FSJ)\\
Vij
en la que P(FS) es la puntuacion para HER2 en intervalos de clase (por ejemplo, determinada como se describe en el presente documento) para cada campo de vision, FS. Si las puntuaciones en intervalos de clase de cada campo de vision son iguales (por ejemplo, P(FS1) = P(FS2) = P(FSn)), entonces H = 0. De esta manera, H indica cuan diferente es la expresion de proteinas en los campos de vision diferentes para un biomarcador.
En un modo de realizacion ejemplar se utiliza al menos una de las puntuaciones de heterogeneidad para determinar la puntuacion de pronostico de salida. En un modo de realizacion, las puntuaciones de heterogeneidad resultantes para las preparaciones respectivas y la puntuacion IHC combinada se combinan y ponderan, generando asi una puntuacion de pronostico de salida. En un modo de realizacion ejemplar, la puntuacion de pronostico de salida es un factor o porcentaje (P1) de la puntuacion IHC combinada mas un factor o porcentaje (P2) de una puntuacion de heterogeneidad combinada, donde P1 y P2 son mayores que 0. Por ejemplo, la puntuacion de pronostico de salida (PS) se puede calcular usando la formula:
Ps = 0,03114*IHC4 + 1,95119*puntuacion de heterogeneidad combinada
donde la puntuacion de heterogeneidad combinada es igual a la raiz cuadrada de (puntuacion de heterogeneidad para ER + puntuacion de heterogeneidad para PR). La puntuacion de pronostico de salida resultante se usa para determinar el pronostico del paciente que tiene el cancer de mama. Por ejemplo, el procedimiento puede determinar el pronostico de que sea probable que el cancer de mama en el sujeto sea agresivo o recidive (por ejemplo, en el plazo de 5 anos) si la puntuacion de pronostico de salida esta por encima de un determinado umbral o de que sea improbable que el cancer de mama en el sujeto sea agresivo o recidive si la puntuacion de pronostico de salida esta por debajo del umbral.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede incluir obtener una imagen digitalizada de la muestra de cancer de mama (por ejemplo, una que este en uno o mas portaobjetos de microscopio) que se marca de manera detectable para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR. Por ejemplo, se pueden obtener una o mas imagenes digitalizadas para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR. En algunos ejemplos, el procedimiento incluye adicionalmente seleccionar un sujeto para el que se ha determinado el pronostico de que tiene una probabilidad mas alta de recidiva, por ejemplo,
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seleccionar al paciente para un tratamiento mas agresivo.
La FIG. 5 proporciona detalles adicionales sobre un modo de realizacion particular de un procedimiento de acuerdo con la tecnologia. El procedimiento tambien puede incluir adquirir u obtener imagenes (tales como una imagen digital) de la muestra de cancer de mama tenida para detectar ER, HER2, Ki-67 y PR 108. Se seleccionan al menos dos FOV para cada una de ER, HER2, Ki-67 y PR 110, por ejemplo, seleccionados y marcados en una imagen digital. Sin embargo, el numero de FOV seleccionados puede variar (por ejemplo, puede haber 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 FOV). Despues de seleccionar los FOV 110, el procedimiento incluye detectar o medir la expresion de ER, HER2, Ki-67 y PR en cada FOV 111. Basandose en esta informacion, se determina una puntuacion IHC (por ejemplo, IHC4) por medio de la expresion para cada uno de ER, Ki-67, PR y Her2 112, por ejemplo, determinando o midiendo una positividad en porcentaje para cada uno de PR y Ki-67, una puntuacion binaria basada en una puntuacion en intervalos de clase para HER2 (por ejemplo, en una escala tipica de 0 a 3 para representar la intensidad, en la que 0 se asigna a tincion negativa y 3 se asigna a muestras que se tinen muy intensamente) y una puntuacion H para ER. El procedimiento tambien incluye detectar o medir la heterogeneidad de proteinas para cada uno de ER y PR y en algunos ejemplos tambien Ki-67 y HER2 113. Basandose en esta informacion, se determina 114 una puntuacion de heterogeneidad para al menos ER y PR y en algunos ejemplos tambien Ki-67 y HER2. La puntuacion IHC4 112 y puntuacion de heterogeneidad 114 resultantes se combinan para producir una puntuacion de pronostico de salida 118. Basandose en la puntuacion de pronostico de salida, se determina el pronostico 120 de cancer de mama.
La FIG. 6 proporciona detalles sobre un procedimiento ejemplar para obtener o adquirir las imagenes IHC de la muestra de tejido mamario que se analiza usando los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los procedimientos de obtencion y tincion de muestras son rutinarios en la tecnica. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir obtener el tejido mamario de un paciente 210, por ejemplo, de una biopsia de mama. A continuacion, el tejido resultante se fija y se somete a inclusion 212, por ejemplo, usando formalina y parafina. A continuacion, el tejido fijado y sometido a inclusion se puede cortar o seccionar y montar sobre un sustrato 214, por ejemplo, montar sobre uno o mas portaobjetos de microscopio de vidrio. En algunos ejemplos, una preparacion incluye una pluralidad de secciones de tejido, tales como al menos 2 o al menos 4 secciones. A continuacion, las secciones de tejido se pueden incubar con anticuerpos apropiados (u otros agentes de union especificos) para marcar las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR. Por ejemplo, al menos una seccion de tejido mamario se puede marcar con un anticuerpo especifico para ER, otra seccion de tejido mamario se puede marcar con un anticuerpo especifico para HER2, otra seccion de tejido mamario se puede marcar con un anticuerpo especifico para PR y otra seccion de tejido mamario se puede marcar con un anticuerpo especifico para Ki-67 216. Sin embargo, un experto en la tecnica apreciara que una unica seccion de tejido se puede marcar con mas de un anticuerpo (u otro agente de union especifico), siempre y cuando dichas proteinas marcadas sean distinguibles, por ejemplo, usando anticuerpos secundarios marcados de manera diferente. Despues de marcar las secciones de tejido, se pueden obtener las imagenes. Por ejemplo, se pueden obtener una o mas imagenes de la seccion de tejido mamario marcada con el anticuerpo especifico para ER, se pueden obtener una o mas imagenes de la seccion de tejido mamario marcada con el anticuerpo especifico para HER2, se pueden obtener una o mas imagenes de la seccion de tejido mamario marcada con el anticuerpo especifico para PR y se pueden obtener una o mas imagenes de la seccion de tejido mamario marcada con el anticuerpo especifico para Ki-67 218.
La FIG. 7 proporciona detalles sobre los parametros que se pueden medir o determinar al detectar la expresion de proteinas en cada FOV. Dichos valores se pueden usar para calcular la puntuacion IHC (por ejemplo, IHC4). Como se advierte en la FIG. 5, despues de seleccionar los FOV 110, el procedimiento incluye detectar o medir la expresion de ER, HER2, Ki-67 y PR en cada FOV 111. Como se muestra en la FIG. 7, detectar la expresion de proteinas en cada FOV puede incluir determinar o medir una positividad en porcentaje para cada uno de PR y Ki-67 410, determinar o medir una puntuacion en intervalos de clase para HER2 412 como se describe en el presente documento, y determinar o medir una puntuacion H para ER 414. Las puntuaciones se pueden combinar en una puntuacion inmunohistoquimica como se describe en el presente documento. La combinacion puede comprender convertir la puntuacion en intervalos de clase para HER2 en una puntuacion binaria para HER2.
La FIG. 8 proporciona detalles sobre los parametros que se pueden medir o determinar al medir la heterogeneidad de proteinas en cada FOV. Dichos valores se pueden usar para calcular la puntuacion de heterogeneidad. Como se observa en la FIG. 5, el procedimiento puede incluir detectar o medir la heterogeneidad de proteinas para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR 113. Como se muestra en la FIG. 8, detectar la heterogeneidad de proteinas puede incluir determinar o medir la variabilidad de la positividad en porcentaje en cada FOV y normalizar los valores, para al menos ER y PR (y en algunos ejemplos tambien para Ki-67) 510. Por ejemplo, se calcula una metrica de variabilidad (VM) para cada uno de ER y PR (y en algunos ejemplos para Ki-67), en la que VM = STD(PP(FS1), PP(FS2), ....PP(FSn), y PP(FS) es la positividad en porcentaje para cada campo de vision, FS. Como se muestra en la FIG. 8, medir la heterogeneidad de proteinas para HER2 puede incluir determinar o medir la puntuacion en intervalos de clase para cada FOV para HER2 y la variacion entre puntuaciones en intervalos de clase 512 (por ejemplo, usando la puntuacion en intervalos de clase determinada anteriormente en 412, pero incorporando al menos otro FOV).
Sistema ejemplar que implementa las tecnologias
La FIG. 9 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar 900 que implementa las tecnologias para el pronostico
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de cancer de mama descritas en el presente documento. En el ejemplo, una herramienta de procesamiento de imagenes de preparaciones 920 puede aceptar una pluralidad de imagenes de preparaciones 912 y una pluralidad de campos de vision 914 como entrada. La herramienta 920 arroja una indicacion 990 de si es probable que el cancer recidive en el sujeto. Como se describe en el presente documento, dicha indicacion 990 se puede basar en una puntuacion de pronostico de salida.
Las preparaciones pueden representar la expresion de proteinas para biomarcadores respectivos en una muestra de cancer de mama de un sujeto (por ejemplo, marcada de manera detectable con anticuerpos para los biomarcadores como se describe en el presente documento).
La herramienta 920 puede proporcionar interfaces de usuario para recibir selecciones de los campos de vision (FOV) 914 o dicha funcionalidad se puede proporcionar mediante otra herramienta o componente.
La puntuacion IHC combinada se puede calcular (por ejemplo, mediante la herramienta 920 u otra herramienta o componente) basandose en las imagenes de preparaciones y campos de vision dentro de las imagenes de preparaciones.
La herramienta 920 se hace funcionar para calcular una o mas puntuaciones de heterogeneidad 927 basandose en las imagenes de preparaciones y campos de vision dentro de las imagenes de preparaciones como se describe en el presente documento.
La herramienta de procesamiento de imagenes de preparaciones 920 puede incluir una herramienta de pronostico 930 que acepte una puntuacion IHC combinada calculada y las una o mas puntuaciones de heterogeneidad 927 como entrada y arroje una indicacion 990 de si el cancer es mas agresivo y, de esta manera, si es mas probable que recidive en el sujeto.
En la practica, los sistemas mostrados en el presente documento, tales como el sistema 900, pueden ser mas complicados, con funcionalidad adicional, entradas mas complejas y similares. Por ejemplo, una funcionalidad adicional puede calcular la puntuacion IHC combinada, la o las puntuaciones de heterogeneidad o ambas, o dichas puntuaciones pueden ser proporcionadas por otro software.
El sistema 900 y cualquiera de los demas sistemas descritos en el presente documento se pueden implementar conjuntamente con cualquiera de los componentes de hardware descritos en el presente documento, tales como los sistemas computacionales descritos a continuacion (por ejemplo, unidades de procesamiento, memoria y similares). En cualquiera de los ejemplos del presente documento, las entradas, salidas y herramientas se pueden almacenar en uno o mas medios de almacenamiento legibles por ordenador o dispositivos de almacenamiento legibles por ordenador. Las tecnologias descritas en el presente documento pueden ser genericas para las especificaciones de los sistemas operativos o hardware y se pueden aplicar en cualquier variedad de entornos para aprovechar las caracteristicas descritas.
Procedimiento implementado por ordenador ejemplar que implementa las tecnologias
La FIG. 10 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar 1000 que implementa las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento y se puede implementar, por ejemplo, en el sistema mostrado en la FIG. 9.
El procedimiento se puede realizar en una o mas imagenes de entrada de preparaciones que se reciben para su procesamiento. Por ejemplo, se puede usar una imagen de preparacion que represente una muestra de cancer de mama de un sujeto marcada de manera detectable con anticuerpos para un biomarcador como se describe en el presente documento.
En 1010 se recibe una pluralidad de campos de vision digitales dentro de una imagen. Como se describe en el presente documento, se puede recibir una indicacion de un campo de vision por medio de selecciones de imagenes visualizadas (por ejemplo, trazando un contorno sobre la imagen para un campo de vision) o una indicacion de un limite dentro de una imagen.
En 1012, la heterogeneidad de proteinas se mide entre los campos de vision digitales como se describe en el presente documento (por ejemplo, se determina la heterogeneidad interregional para los campos de vision para una imagen de preparacion dada). Por ejemplo, se puede medir la expresion de proteinas para un biomarcador para los campos de vision respectivos y comparar las mediciones frente a la variabilidad como se describe en el presente documento. En la practica, la heterogeneidad se puede medir para una pluralidad de biomarcadores (por ejemplo, como una puntuacion de heterogeneidad). Se pueden usar uno o mas de ER, PR y similares (por ejemplo, Ki-67, HER2 o similar).
Al medir la heterogeneidad de proteinas para un segundo biomarcador, se puede recibir una segunda pluralidad de campos de vision digitales dentro de una imagen visualizada que representa una muestra de cancer de mama del
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sujeto marcada de manera detectable con anticuerpos para un segundo biomarcador. La heterogeneidad de proteinas para el segundo biomarcador se puede medir (por ejemplo, como una puntuacion de heterogeneidad separada de la primera).
En 1016 se recibe una puntuacion IHC combinada para el sujeto. Se puede soportar cualquiera de las puntuaciones IHC combinadas descritas en el presente documento. La puntuacion IHC combinada puede ser para la misma muestra usada para el analisis de heterogeneidad, o se puede usar una muestra diferente del mismo sujeto.
En 1018 se genera una puntuacion de pronostico de salida basada en al menos la heterogeneidad de proteinas medida para el biomarcador entre la pluralidad de campos de vision digitales y la puntuacion inmunohistoquimica combinada para el sujeto. Como se describe en el presente documento, una puntuacion IHC combinada y una o mas puntuaciones de heterogeneidad para biomarcadores respectivos se pueden generar y usar para calcular una puntuacion de pronostico de salida.
En 1020, basandose en la puntuacion de pronostico de salida, se arroja una indicacion de pronostico (por ejemplo, indicacion 990 de si el cancer es mas agresivo y, de esta manera, es probable que recidive en el sujeto). Por ejemplo, los umbrales descritos en el presente documento se pueden usar para seleccionar entre categorias de indicaciones de pronostico; indicar un resultado positivo o negativo; o similar.
El procedimiento 1000 y cualquiera de los demas procedimientos implementados por ordenador descritos en el presente documento se pueden realizar mediante instrucciones ejecutables por ordenador (por ejemplo, provocar que un sistema computacional realice el procedimiento) almacenadas en uno o mas medios legibles por ordenador (por ejemplo, medios de almacenamiento u otros medios tangibles) o almacenadas en uno o mas dispositivos de almacenamiento legibles por ordenador.
Recepcion ejemplar del campo de vision
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, se puede recibir un campo de vision como una indicacion almacenada de un area (por ejemplo, un conjunto de pixeles, un limite o similar) dentro de una imagen o como una anotacion (por ejemplo, dibujando, trazando o similar) mediante un sistema de ordenador que hace funcionar un patologo con referencia a (por ejemplo, en) una imagen (por ejemplo, que se almacena entonces para su uso posterior).
Por ejemplo, la anotacion se puede realizar mediante una herramienta o software separado o incorporar a la herramienta o software que realiza el analisis de heterogeneidad.
Puntuacion inmunohistoquimica combinada ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento se puede combinar una puntuacion inmunohistoquimica combinada con una puntuacion de heterogeneidad para dar una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama. Por ejemplo, se puede usar la puntuacion IHC (por ejemplo, IHC4) descrita en el presente documento u otra puntuacion inmunohistoquimica combinada que combine dos o mas biomarcadores, por ejemplo, HER2, ER, PR, Ki- 67 o similar. Dicha puntuacion se puede determinar por medio de los campos de vision indicados por un patologo como se describe en el presente documento.
La heterogeneidad se puede analizar para los biomarcadores usados para generar la puntuacion IHC combinada como se describe en el presente documento y combinar con la puntuacion IHC combinada para dar como resultado una puntuacion de pronostico de salida.
Imagen ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, una imagen puede ser una imagen digital que represente una muestra de cancer de mama de un sujeto marcada de manera detectable con anticuerpos para un biomarcador particular. En la practica, dicha imagen representa una seccion de dicha muestra. Se pueden usar diferentes secciones para diferentes biomarcadores.
Las tecnologias pueden soportar una pluralidad de imagenes para los biomarcadores respectivos. Las implementaciones pueden soportar multiples biomarcadores en una unica imagen (por ejemplo, en un escenario multiplex).
Al almacenarse, una imagen se puede representar como datos de imagen, pixeles o voxeles que tienen, por ejemplo, valores de color, valores de intensidad o ambos. Los voxeles o pixeles de imagen se pueden procesar como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se pueden analizar los campos de vision dentro de las imagenes para cuantificar la expresion de proteinas dentro del campo de vision para un biomarcador dado.
Campos de vision ejemplares
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En cualquiera de los ejemplos del presente documento, un campo de vision digital puede ser un area dentro de una imagen o una indicacion de dicha area y se denomina en ocasiones simplemente un “campo de vision” en el presente documento. Dichos campos de vision pueden comprender regiones de interes segun indica un patologo. En algunas implementaciones, las preparaciones se pueden comparar con otras preparaciones, de modo que el campo de vision pueda ser toda la preparacion. Sin embargo, puesto que el campo de vision es tipicamente mas pequeno que la imagen digital completa, tipicamente corresponde a un area que es mas pequena que la seccion completa que se esta formando como imagen. En la practica, dicho campo de vision digital se puede almacenar como una imagen separada o indicar mediante un limite (por ejemplo, dibujado originalmente por un patologo y almacenado electronicamente) con referencia a una imagen de referencia (por ejemplo, la imagen a partir de la que derivo el campo de vision). Las porciones de la imagen en el interior del limite se consideran dentro del campo de vision, y las porciones de la imagen que quedan fuera del limite se consideran fuera del campo de vision. Las porciones en el limite se pueden considerar dentro o fuera del campo de vision segun se desee.
Tipicamente, los campos de vision digitales son regiones contiguas de pixeles o voxeles dentro de la imagen seleccionada por un patologo de acuerdo con un protocolo apropiado. Se puede soportar cualquier forma arbitraria (por ejemplo, forma rectangular, no rectangular, cuadrada, eliptica, circular, trazada o similar) o area de interes, y se pueden proporcionar herramientas para seleccionar formas particulares (por ejemplo, una herramienta para trazado, una herramienta para elipse, una herramienta para circulo, una herramienta para cuadrado, una herramienta para rectangulo o similar). Un campo de vision puede comprender una estructura anatomica de interes (tal como una glandula).
Los campos de vision diferentes se seleccionan tipicamente para puntuaciones inmunohistoquimicas combinadas y puntuaciones de heterogeneidad; sin embargo, es posible que haya solapamiento entre las dos. En otras palabras, los campos de vision para una puntuacion inmunohistoquimica combinada se pueden reutilizar para una puntuacion de heterogeneidad y viceversa.
Al almacenar, recibir o arrojar campos de vision, se puede usar una referencia al campo de vision digital en lugar de los datos del campo de vision real.
Seleccion de campos de vision ejemplares
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, los campos de vision se pueden seleccionar de acuerdo con un protocolo apropiado para el proposito. Por ejemplo, para los campos de vision usados en una puntuacion IHC (por ejemplo, IHC4), el protocolo especifica que los campos seleccionados (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o similar) sean regiones tumorales y sean representativos (por ejemplo, con un aspecto similar) de la expresion de proteinas del biomarcador dentro del tejido tumoral. Para los campos de vision usados para una puntuacion de heterogeneidad, el protocolo especifica que se seleccionen campos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o similar) que representan diferentes (por ejemplo, heterogeneos) niveles de expresion de proteinas del biomarcador dentro del tejido tumoral. En algunos casos, se puede usar un unico campo para ambos propositos (por ejemplo, uno de los campos heterogeneos tambien se usa en una puntuacion IHC combinada).
Una interfaz de usuario presentada al usuario que realiza la seleccion (por ejemplo, un patologo) puede indicar para que proposito se seleccionan los campos de vision y tambien proporcionar orientacion en relacion con el protocolo segun sea apropiado.
Heterogeneidad de proteinas ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, la heterogeneidad de proteinas se refiere a la variacion espacial de los patrones de tincion histoquimica y molecular, tales como los patrones de tincion para los biomarcadores de cancer de mama ER, HER2, Ki-67 y PR en una muestra de cancer de mama y en ocasiones se denomina simplemente “heterogeneidad” en el presente documento. Por ejemplo, la heterogeneidad se incrementa con la variabilidad del nivel de biomarcadores en diferentes localizaciones dentro de una unica muestra. La heterogeneidad puede ser un indicador de la variacion espacial de la agresividad del tumor y/o de los patrones de crecimiento que se pueden correlacionar con un fenotipo clinico agregado (por ejemplo, un tumor que es probable que recidive).
Los procedimientos de la invencion implican medir la heterogeneidad de proteinas para ER y PR como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos o modos de realizacion que exceden el alcance reivindicado constituyen una divulgacion util para comprender la invencion.
En el presente documento se muestra que la heterogeneidad biologica de la expresion de proteinas para ER y PR se correlaciona con la recidiva impredecible de una fraccion de pacientes con cancer de mama en estadio temprano.
La heterogeneidad se puede medir mediante una metrica de variabilidad que mide cuan diferentes son los niveles de expresion de proteinas entre los campos de vision para el mismo biomarcador (por ejemplo, la variabilidad de las
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mediciones de expresion de protefnas dentro de campos de vision para un unico biomarcador). De esta manera, se puede usar heterogeneidad interregional (por ejemplo, inter-FOV).
Se puede calcular una medida cuantitativa de heterogeneidad interregional (por ejemplo, heterogeneidad entre los campos de vision) basandose en una desviacion (por ejemplo, desviacion estandar u otro momento de la distribucion) de la medicion de expresion de protefnas, PE (por ejemplo, positividad en porcentaje), en los campos de vision diferentes para un biomarcador dado (por ejemplo, Er, PR, Ki-67 o similar). Dicha medicion puede cuantificar cuan distantes estan (por ejemplo, la diseminacion de la distribucion) las mediciones de expresion de protefnas. Por ejemplo, se puede realizar un calculo de heterogeneidad ejemplar para un conjunto de campos de vision que tienen mediciones de expresion de protefnas respectivas PE(FSi), PE(FS2), ...PE(FSn) para un biomarcador dado en los campos de vision FS como sigue:
Heterogeneidad ejemplar (H) = o (PE(FSi), PE(FS2), ... PE(FSn))
El valor se puede normalizar de acuerdo con una puntuacion de preparaciones promedio (S), que puede ser el promedio de las mediciones de expresion de protefnas para una preparacion particular (por ejemplo, el promedio de PE(FSi), PE(FS2), ...PE(FSn)). Si la puntuacion de preparaciones promedio (S) esta por debajo de un umbral (por ejemplo, un 10 % o similar), se puede usar un valor de sustitucion (por ejemplo, un 5 %) como puntuacion de preparaciones promedio. La normalizacion se puede lograr dividiendo la desviacion observada entre la puntuacion de preparaciones promedio.
Para los biomarcadores que implican calculos en intervalos de clase (por ejemplo, HER2), se puede usar una suma de diferencias de intervalos de clase entre permutaciones de los campos de vision como una medida de heterogeneidad. De esta manera, la heterogeneidad se puede calcular agregando diferencias de puntuaciones en intervalos de clase para campos de vision diferentes para el marcador. Por ejemplo, la heterogeneidad para un conjunto de campos de vision (i y j) que tiene puntuaciones en intervalos de clase de expresion de protefnas respectivas (por ejemplo, 0, 1, 2, 3) P(FSi), P(FS2), ...P(FSn) para un biomarcador en intervalos de clase dado se puede calcular como sigue:
H = £||PtfSi) - F(F5;)||
ViJ
i*j
En el ejemplo, un unico campo de vision tiene una unica puntuacion en intervalos de clase. Si todas las puntuaciones en intervalos de clase son iguales, la puntuacion es 0.
Como se describe en el presente documento, se puede hacer la normalizacion de acuerdo con el biomarcador implicado.
Heterogeneidad espacial de protefnas ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento se puede medir la heterogeneidad espacial de protefnas. Dicha heterogeneidad se puede clasificar como geografica, regional, interglandular, intraglandular o similar.
Por ejemplo, la heterogeneidad geografica se puede medir midiendo la variacion en la expresion de protefnas a nivel geografico: dos bloques de tejido separados entre si mas de una distancia umbral (por ejemplo, 2 pulgadas).
La heterogeneidad regional se puede medir midiendo la variacion en la expresion de protefnas a nivel regional: en la misma seccion de tejido, por ejemplo, separacion entre 0,25 y 2 pulgadas, y campos de vision diferentes, por ejemplo, al menos a una distancia de un objetivo 4x entre si. Los campos de vision como se describen en el presente documento se pueden usar para medir dicha heterogeneidad regional.
La heterogeneidad interglandular se puede medir midiendo la variacion en la expresion de protefnas a nivel interglandular: por ejemplo, a una separacion de menos de 0,25 pulgadas y dentro de un objetivo 4x.
La heterogeneidad intraglandular se puede medir midiendo la variacion en la expresion de protefnas a nivel intraglandular: por ejemplo, las formaciones en un objetivo 20x para las categorias regional e interglandular.
Puntuaciones alternativas ejemplares de heterogeneidad
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, se pueden usar metricas de variabilidad (VM) distintas de la desviacion estandar, o, para medir la heterogeneidad de protefnas interregional. Por ejemplo, se pueden usar diferencias interregionales en las mediciones de expresion de protefnas o un maximo de las mismas (por ejemplo, con mas de dos campos de vision). Por ejemplo, se puede realizar un calculo de heterogeneidad ejemplar para un conjunto de campos de vision que tienen mediciones de expresion de protefnas (PE) respectivas para los campos de
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vision FSi, FS2, FS3 para un biomarcador dado como sigue usando una funcion de valor absoluto (ABS):
VM = MAX.
(ABS(PE(FSi) - PE(FS2)), ABS(PE(FSi) - PE(FS3)), ABS(PE(FS2) - PE(FS3)))
Dicho calculo tambien puede explicar el intervalo de variabilidad. Por ejemplo, tambien se puede tener en cuenta la diferencia interregional minima. Un calculo ejemplar puede ser de esta manera:
VMadj = VM - MIN.
(ABS(PE(FSi) - PE(FS2)), ABS(PE(FSi) - PE(FS3)), ABS(PE(FS2) - PE(FS3)))
Son posibles variaciones adicionales.
Normalization ejemplar de puntuaciones de heterogeneidad
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, la normalizacion se puede aplicar a puntuaciones de heterogeneidad (por ejemplo, una puntuacion de heterogeneidad para un biomarcador). Por ejemplo, la normalizacion se puede lograr dividiendo la desviacion observada entre la puntuacion de preparaciones promedio (por ejemplo, para el biomarcador medido) como se describe anteriormente.
Se puede lograr una normalizacion adicional basandose en el biomarcador dado implicado. Por ejemplo, basandose en la observacion historica de la heterogeneidad de la expresion de proteinas para un biomarcador dado, se puede usar un coeficiente u otra tecnica de normalizacion.
Un calculo de heterogeneidad ejemplar con un factor de normalizacion a (por ejemplo, con un intervalo de cero a uno) para una metrica de variabilidad VM (por ejemplo, desviacion estandar o similar) y S (por ejemplo, una puntuacion de preparaciones con positividad en porcentaje promedio) puede ser de esta manera:
{VM „
S < i0 %
0,05
de otro modo
Un factor de normalizacion por biomarcador, a, puede explicar las diferencias en el impacto que tiene la heterogeneidad de un biomarcador especifico en la puntuacion de pronostico. Como se observa en los datos para el analisis de heterogeneidad, dichos factores de normalizacion por biomarcador se pueden adaptar.
En un ejemplo, a era i,0 para ER y PR, y 0,75 para Ki-67. Dicho factor se puede determinar por medio de procedimientos estadisticos para determinar las ponderaciones apropiadas para el o los biomarcadores implicados (por ejemplo, para separar a los pacientes en categorias de pronostico basandose en la puntuacion de pronostico resultante).
Mediciones ejemplares de expresion de proteinas
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, la expresion de proteinas para un biomarcador dado se puede cuantificar midiendo el grado en el que se expresa la proteina (por ejemplo, en un campo de vision o colectivamente en campos de vision). Con referencia a las celulas tenidas en un campo de vision, la expresion de proteinas se puede expresar como un porcentaje de las celulas en el campo de vision con tincion positiva. Por ejemplo, se puede calcular una cuantificacion, PP(FS), de expresion de proteinas para un campo de vision, FS, para determinar la positividad en porcentaje como sigue:
PP(FS) = (recuento de celulas con tincion positiva en FS) / (recuento de celulas totales en FS)
En dicho caso, el recuento de celulas totales puede ser una suma del recuento de celulas con tincion positiva y el recuento de celulas con tincion negativa. En la practica, se puede determinar un recuento de celulas con tincion positiva, se puede determinar un recuento de celulas con tincion negativa y, basandose en ambos, se puede calcular la expresion de proteinas. Dado que la cuantificacion indica el porcentaje de celulas con tincion positiva, dicha medicion se denomina en ocasiones “positividad en porcentaje” para un campo de vision (por ejemplo, para un biomarcador dado).
Se pueden usar otras tecnicas para medir la expresion de proteinas.
Se puede usar una puntuacion en intervalos de clase como se describe en el presente documento para medir la
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expresion de protefnas (por ejemplo, para HER2).
Determination ejemplar de la positividad en porcentaje
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, la positividad en porcentaje para un campo de vision dado se puede determinar por medio de un cierto numero de tecnicas. Las tecnologias descritas en el presente documento pueden hacer uso de tecnicas actuales y futuras para determinar la positividad en porcentaje.
Algunas de dichas tecnicas realizan recuentos de nucleos celulares de celulas con tincion positiva y realizan recuentos de nucleos celulares de celulas con tincion negativa. Dicha tecnologia puede filtrar las regiones estromales y linfocitarias del campo de vision. Si se desea, la informacion de una preparacion completa se puede usar al realizar recuentos de nucleos.
De esta manera, la heterogeneidad de protefnas se puede determinar determinando las mediciones de positividad en porcentaje para los campos de vision respectivos para una imagen asociada a un biomarcador, donde las mediciones de positividad en porcentaje indican un porcentaje de celulas en los campos de vision respectivos con tincion positiva para el biomarcador. A continuacion, las mediciones de positividad en porcentaje se pueden comparar como se describe en el presente documento (por ejemplo, para generar una metrica de variabilidad).
Ademas, una determinacion de positividad en porcentaje puede incluir determinar la intensidad de la tincion y determinar un recuento de nucleos para una pluralidad de intervalos de clase (por ejemplo, 0, 1, 2, 3). Los nucleos en el intervalo de clase 0 se pueden considerar negativos, y los demas se pueden agregar como las celulas con tincion positiva. Disponer de dicha informacion de intervalos de clase puede ser util para otros propositos, tales como calcular una puntuacion H o similar.
Determination ejemplar de la implementation de la positividad en porcentaje: identification de nucleos
La FIG. 11 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar 1100 para identificar nucleos en una preparacion. En el ejemplo, el procedimiento 1100 puede usar informacion sobre la preparacion fuera de los campos de vision para el analisis.
En 1110, se recibe una imagen obtenida de preparaciones de una seccion de tejido mamario tenida como se describe en el presente documento. Dicha obtencion de imagen se puede realizar en una primera ampliacion (por ejemplo, 20x, 40x, o similar) y/o resolucion.
En 1120, se identifica la region de tejido de la preparacion. La imagen obtenida de preparaciones se puede separar en fondo de vidrio y region de tejido. Dicho analisis se puede realizar en una segunda ampliacion (por ejemplo, 1x, 2x, o similar) y/o resolucion.
En 1130, se puede realizar un analisis de componentes de colores dominantes en la region de tejido. Por ejemplo, los colores dominantes se pueden extraer de la region de tejido en la preparacion. Dicho analisis se puede realizar en una tercera ampliacion (por ejemplo, 5x o similar) y/o resolucion.
En 1140, se puede realizar una segmentacion para segmentar la region de tejido en diferentes regiones marcadas usando caracteristicas de color y textura a partir de multiples ampliaciones.
En 1150, los nucleos en la preparacion y/o campos de vision se detectan y se realiza un recuento (por ejemplo, de acuerdo con si tienen tincion positiva o negativa). De esta manera, se puede lograr una puntuacion.
Se pueden usar otras tecnicas para identificar nucleos. Por ejemplo, para identificar nucleos se puede usar cualquier tecnica que use diferenciacion de colores (por ejemplo, entre marron positivo y azul negativo) y forma (por ejemplo, analisis morfologico) de nucleos candidatos. En dichas tecnicas, el posprocesamiento morfologico puede filtrar celulas estromales y masas desviadas.
Determination ejemplar de la implementation de la positividad en porcentaje: puntuacion del FOV
La FIG. 12 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar 1200 para la puntuacion del campo de vision. En el ejemplo, se muestra un campo de vision de entrada 1210. Sin embargo, dicho analisis se puede realizar para multiples campos de vision, una o mas placas de la preparacion, toda la preparacion o cualquier otra imagen de entrada.
La segmentacion de nucleos (por ejemplo, identificacion de nucleos en una imagen) 1220 se puede realizar para identificar nucleos en el FOV. Se puede usar cualquier numero de tecnicas para identificar los nucleos.
A continuacion, se puede realizar la clasificacion de nucleos 1230 para clasificar los nucleos identificados. De nuevo, se puede usar cualquier numero de tecnicas para clasificar los nucleos como con tincion positiva o negativa.
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En 1240, se realiza la puntuacion en los nucleos clasificados, dando como resultado la positividad en porcentaje para el biomarcador. Al identificar los nucleos, se identifican las celulas correspondientes. Se puede realizar la puntuacion para un campo de vision particular, incluso si el analisis se realiza en areas fuera del campo de vision.
Determination ejemplar de la implementation de la positividad en porcentaje: puntuacion del FOV
La FIG. 13 es un diagrama de bloques de otro sistema ejemplar 1300 para la puntuacion del campo de vision. En el ejemplo, se muestra un campo de vision de entrada 1310. Sin embargo, dicho analisis se puede realizar para multiples campos de vision, una o mas placas de la preparacion, toda la preparacion o cualquier otra imagen de entrada.
Se puede realizar la segmentacion de nucleos 1320 (por ejemplo, identificacion de nucleos en una imagen). En 1322, se realiza la deteccion de semillas para la imagen de entrada para localizar las semillas procesadas por el sistema. Una semilla es un punto que se encuentra dentro de un nucleo candidato y sirve como punto de partida para localizar nucleos celulares. La deteccion de semillas puede usar tecnicas tales como funcionar en una imagen de gradiente usando un procedimiento de votacion basado en nucleos. La segmentacion en primer plano se realiza en 1324. Se puede calcular un enmascaramiento en primer plano asociado a regiones de nucleos. Se realiza la segmentacion de masas en 1326. La segmentacion en primer plano y la segmentacion de masas pueden hacer uso de las variaciones de intensidad global de una imagen a otra. Se puede extraer una representacion tipo masa para cada nucleo.
Se puede realizar la clasificacion de nucleos 1330. En 1332, se realiza la construccion de caracteristicas. En 1336, se realiza la clasificacion, con referencia a un modelo 1334 de entrenamiento. Dicho modelo puede ser especifico para el biomarcador implicado.
En 1340, se realiza la puntuacion, dando como resultado una positividad en porcentaje para el biomarcador. Al identificar los nucleos, se identifican las celulas correspondientes. Se puede realizar la puntuacion para un campo de vision particular, incluso si el analisis se realiza en areas fuera del campo de vision.
Determination ejemplar de la implementation de la positividad en porcentaje: clasificacion
La FIG. 14 es un diagrama de bloques de un clasificador ejemplar 1400 para determinar nucleos tenidos verdaderos positivos. En el ejemplo, los nucleos candidatos (por ejemplo, candidates entrantes) se procesan mediante un clasificador 1410, que los separa en dos clases: positivos 1451 y negativos 1452. Es posible que algunos candidatos entrantes no se clasifiquen en ninguna clase, que se filtren por adelantado o similar. El clasificador puede determinar como negativas 1452 las celulas (por ejemplo, asociadas con nucleos) que se determinan que son celulas que no se tinen. Algunos candidatos (por ejemplo, tejido estromal, linfocitos, etc.) pueden ser distintos de celulas que no se incluyen en (por ejemplo, se filtra de) la clasificacion de negativas 1452 o la clasificacion de positivas 1451.
El clasificador puede usar caracteristicas tales como caracteristicas de color (por ejemplo, media, varianza y similares), color de fondo de tejido y contexto, forma (por ejemplo, tamano, excentricidad, alargamiento), morfologia, densidad celular y similares.
Determination ejemplar de la implementation de la positividad en porcentaje: clasificacion
La FIG. 15 es un diagrama de bloques de un clasificador binario lineal multietapa 1500 ejemplar para determinar nucleos tenidos verdaderos positivos. En el ejemplo, los nucleos candidatos (por ejemplo, masas entrantes) se procesan mediante un clasificador 1510, que los separa en dos clases preliminares:
1) marron (verdaderos positivos) y masas descartables debiles; y
2) negativos (por ejemplo, nucleos no tenidos), linfocitos y estroma.
Un clasificador 1520 separa los candidatos entrantes en estroma 1554 y negativos y linfocitos.
Otro clasificador 1530 separa los candidatos entrantes en negativos 1552 y linfocitos 1553.
Todavia otro clasificador 1540 separa los candidatos entrantes en marron (verdaderos positivos) 1551 y masas descartables marrones debiles 1555.
El recuento de verdaderos positivos 1551 y negativos 1552 se puede usar para determinar la positividad en porcentaje para un campo de vision.
Los clasificadores pueden usar caracteristicas tales como caracteristicas de color (por ejemplo, media, varianza y similares), color de fondo de tejido y contexto, forma de masa (por ejemplo, tamano, excentricidad, alargamiento),
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morfologia, densidad celular y similares.
Determination ejemplar de la puntuacion para HER2 en intervalos de clase
En cualquiera de los ejemplos del presente documento se puede generar una puntuacion en intervalos de clase para el biomarcador HER2. Para una puntuacion IHC combinada, los campos de vision para HER2 se pueden considerar colectivamente (por ejemplo, se puede realizar colectivamente el analisis en los campos de vision digitales). Para las puntuaciones de heterogeneidad, se puede generar una puntuacion en intervalos de clase para los campos de vision respectivos dentro de una imagen de una preparacion de tejido para el biomarcador HER2. En la practica, dicha puntuacion determina la completitud de la tincion para la membrana celular que rodea un nucleo.
Una puntuacion en intervalos de clase puede comprender un unico numero (por ejemplo, 0, 1,2 o 3) para HER2 (por ejemplo, para los FOV colectivamente o bien FOV respectivos) determinado como se describe en el presente documento.
Procedimiento ejemplar de puntuacion para HER2 en intervalos de clase
La FIG. 16 es un diagrama de flujo de un procedimiento ejemplar 1600 para determinar una puntuacion para HER2 en intervalos de clase y se puede usar en cualquiera de los ejemplos del presente documento en los que se usa una puntuacion para HER2 en intervalos de clase. Dicha puntuacion se puede generar colectivamente para campos de vision o para campos de vision separados como se describe en el presente documento.
El procedimiento 1600 se puede realizar para una imagen dada de una preparacion preparada y anotada como se describe en el presente documento para HER2. En 1610, el tejido en la imagen se segmenta. Por ejemplo, se pueden determinar areas estromales y no estromales.
En 1620 se pueden detectar los nucleos como se describe en el presente documento, por ejemplo, en las regiones no estromales (por ejemplo, glandula).
En 1630 se clasifican los nucleos como tenidos o contratenidos.
En 1640 se detecta la membrana celular tenida en la imagen (por ejemplo, imagen completa, FOV o similar).
En 1650 se puntuan las celulas asociando los nucleos respectivos con la membrana tenida alrededor de los mismos. Basandose en la presencia de la membrana tenida alrededor de los nucleos, una celula se clasifica en uno de los siguientes tipos: no tenida (por ejemplo, no se encuentra membrana tenida alrededor del nucleo), parcialmente tenida (por ejemplo, el nucleo de la celula esta rodeado parcialmente por la membrana tenida), completamente tenida (por ejemplo, el nucleo esta completamente rodeado por la membrana tenida). Los parametros se pueden usar como umbrales para determinar la tincion parcial y completa. Si se desea, un usuario puede ajustar dichos parametros (por ejemplo, un porcentaje alrededor requerido para calificar como parcial, un porcentaje alrededor requerido para calificar como completa). Por ejemplo, se puede determinar que las celulas con mas de una cantidad umbral (por ejemplo, un 90 %) de membrana tenida estan tenidas “completamente”.
En la practica, para las celulas detectadas (por ejemplo, correspondientes a los nucleos detectados), a una celula se le puede asignar un indicador de completitud de tincion (por ejemplo, que indica si la tincion esta completa o no, el grado de completitud o similar) y un valor de intensidad de tincion basandose en la intensidad de los pixeles para el componente de color de tincion (por ejemplo, marron) (por ejemplo, que varia desde 0 a un valor maximo, tal como 100, 255 o similar). A continuacion, dicha informacion se puede analizar para determinar la puntuacion para HER2 como se describe en el presente documento.
De esta manera, para una pluralidad de celulas que aparecen en los campos de vision digitales para HER2, se pueden determinar los valores de intensidad de tincion y los indicadores de completitud de tincion respectivos. A continuacion, se pueden analizar los valores de intensidad de tincion y los indicadores de completitud de tincion por medio de las condiciones como se describe en el presente documento.
Para una pluralidad de nucleos que aparecen en los campos de vision digitales para HER2, se puede determinar la intensidad de tincion de la membrana celular alrededor de los nucleos respectivos.
En 1660, los campos de vision (por ejemplo, colectiva o respectivamente) se puntuan basandose en las puntuaciones de celulas en el campo de vision. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes condiciones (por ejemplo, si el campo de vision califica una puntuacion mas alta, no se necesita hacer un procesamiento para las puntuaciones mas bajas):
Condicion
Puntuacion asignada
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Respuesta a la determinacion del porcentaje de celulas completamente tenidas > un umbral (por ejemplo, un 30 %)
3+
Respuesta a la determinacion (porcentaje de celulas completamente tenidas > un umbral (por ejemplo, un 10 %)) O (porcentaje de celulas completamente tenidas es > 0 % Y la mediana de la intensidad de membrana es mas baja que el umbral de intensidad fuerte)
2+
Respuesta a la determinacion (porcentaje de celulas parcialmente tenidas > 0 %) O (porcentaje de celulas completamente tenidas > 0% Y porcentaje de celulas completamente tenidas < un umbral (por ejemplo, un 10 %) Y mediana de la intensidad de membrana >= umbral de intensidad fuerte Y mediana de la intensidad de membrana < umbral de intensidad debil)
1 +
Respuesta a la determinacion de las condiciones anteriores, que no se alcanzan (por ejemplo, de otro modo)
0
Como se describe, la mediana de la intensidad de membrana se puede comparar con un umbral de intensidad fuerte. Tambien se puede determinar, para una pluralidad de nucleos que aparecen en campos de vision digitales para HER2, si la membrana celular alrededor de los nucleos se tine completamente.
De esta manera, se puede lograr la puntuacion en intervalos de clase para HER2 del campo de vision. Si se desea una puntuacion binaria, se puede omitir o combinar la etapa intermedia de determinar la puntuacion en intervalos de clase en el procedimiento.
Intensidad de tincion ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, se puede cuantificar la tincion positiva (por ejemplo, de la membrana celular) mediante una coloracion marron promedio. Por ejemplo, se puede determinar una coloracion marron promedio en la membrana mediante el valor escalar de luminancia (por ejemplo, 0-255), que se puede calcular a partir de los valores de pixeles RGB de la region de membrana. Los valores RGB se pueden convertir en valor de luminancia (L) por medio de una tecnica de conversion RGB a L*a*b*. El valor L se puede convertir desde una escala de 0 a 100 a una escala de 0 a 255.
Se puede calcular una coloracion marron promedio para una celula promediando L sobre los pixeles de membrana. La coloracion marron promedio se puede usar como la mediana de la intensidad (por ejemplo, de la membrana celular) como se describe anteriormente.
Clasificacion de nucleos ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento se pueden clasificar los nucleos con el proposito de calcular la puntuacion para HER2 en intervalos de clase. Por ejemplo, las celulas se pueden clasificar como tenidas y contratenidas, basandose en la informacion de saturacion, intensidad y de colores rojo y azul en cada celula a partir de la imagen. La informacion de saturacion e intensidad se puede usar para distinguir las celulas gris oscuro, de modo que se puedan clasificar como tenidas en lugar de no tenidas.
Por ejemplo, se pueden usar las siguientes reglas:
A. Porcentaje de tincion 1 = 100* (R - G) / (R + 1)
B. Porcentaje de tincion 2 = 100 * (R - B) / (R + 1)
C. Si el porcentaje de tincion 1 > % de tincion a nivel de pixel y porcentaje de tincion 2 > % de tincion a nivel de pixel, entonces pixel = tenido
D. Si saturacion < 45 e intensidad < 128, entonces pixel = tenido
E. Si saturacion < 128 e intensidad < 55, entonces pixel = tenido
F. Si saturacion < 255 e intensidad <= 30, entonces pixel = tenido
G. Si intensidad <= 20, entonces pixel = tenido
Usando la informacion de clasificacion de pixeles, cada nucleo se puede clasificar como tenido o no tenido basandose en el porcentaje de los pixeles tenidos dentro de cada nucleo. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes reglas:
A. Si el umbral a nivel celular > % de los pixeles tenidos dentro de cada nucleo, entonces clasificar la celula como tenida
B. Si no, clasificarla como no tenida
Los objetos de los nucleos se pueden filtrar entonces basandose en el tamano.
Controles de puntuacion para HER2 en intervalos de clase ejemplares
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Se pueden usar cuatro controles de lineas celulares para determinar si las puntuaciones para HER2 en intervalos de clase se determinan como se describe en el presente documento. Cuando se procesan y tinen como se describe en el presente documento, las lineas celulares deben tenirse como se describe en la siguiente tabla. Las lineas celulares estan disponibles de Ventana Medical Systems, Inc. como en el catalogo n.° 781-2991.
Puntuacion IHC para HER2
Linea celular N.° de copias del gen HER2
0
MCF-7 1,7
1 +
T47D 2,9
2+
MDA-MB-453 5,2
3+
BT-474 18,9
El n.° de copias del gen HER2 se determino como un promedio de tres lotes de preparaciones de control PATHWAY HER-2 4 en 1 que se determinaron usando la sonda de HER2 PathVysion®.
Se puede encontrar informacion adicional sobre la puntuacion para HER2 en la documentacion para "PATHWAY® anti-HER-2/neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody", con numero de catalogo 790-2991, disponible de Ventana Medical Systems, Inc., que se incorpora por referencia en el presente documento.
Calculo de la puntuacion H ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento se puede calcular una puntuacion H a partir de un campo de vision o campos de vision colectivamente por medio de tecnicas automatizadas. Por ejemplo, se pueden identificar los nucleos, y entonces las celulas (por ejemplo, correspondientes a los nucleos) se pueden categorizar (por ejemplo, en intervalos de clase) en cuatro intervalos de clase: 0, 1 (con tincion debil), 2 (con tincion moderada) o 3 (con tincion fuerte). Dicha tecnica se puede lograr determinando la coloracion marron promedio de una celula o agrupamiento de celulas (por ejemplo, masa).
Al examinar los componentes de color (por ejemplo, RGB o similar), se puede comparar la coloracion marron promedio con los umbrales para determinar si una celula no se tine (0), se tine debilmente (1+), se tine moderadamente (2+) o se tine fuertemente (3+). Se pueden mantener los recuentos de las celulas en los intervalos de clase, y al concluir el recuento, se puede calcular una puntuacion H basandose en el porcentaje de celulas en cada intervalo de clase como se describe en el presente documento.
Por ejemplo, dados los recuentos de celulas en una pluralidad de intervalos de clase asociados a intensidades de tincion respectivas (por ejemplo, incluyendo un intervalo de clase para intensidad cero), se puede calcular la puntuacion H sumando, para los intervalos de clase, el producto del porcentaje (por ejemplo, porcentaje de recuento de celulas, tal como el numero de celulas en un intervalo de clase dividido entre el numero total de celulas) de celulas en un intervalo de clase por el nivel de intensidad respectivo asociado al intervalo de clase. En una disposicion que tiene cuatro intervalos de clase, 0-3, la puntuacion H oscila desde 0-300. La puntuacion maxima en dicha disposicion se logra si todas (100 %) las celulas son de intensidad 3 (por ejemplo, 0 x 0 + 0 x 1 + 0 x 2 + 100 x 3=300). De esta manera, el porcentaje se puede tratar como un numero entero en lugar de una fraccion (por ejemplo, 50 % = 50). El nivel de intensidad asociado a un intervalo de clase puede ser la porcion numerica de un designador de intensidad (por ejemplo, 2+ se trata como 2).
Puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, se puede generar una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama basandose en una puntuacion IHC combinada y puntuaciones de heterogeneidad para uno o mas biomarcadores. Dicha puntuacion de pronostico se denomina a veces simplemente "puntuacion de pronostico de salida".
La puntuacion se puede generar combinando las puntuaciones IHC combinadas y las puntuaciones de heterogeneidad. Por ejemplo, las puntuaciones de heterogeneidad se pueden anadir, multiplicar o de otro modo combinar y, entonces, aplicar operaciones (por ejemplo, raiz cuadrada, exponente, coeficientes, etc.) para formar un componente de heterogeneidad con respecto a la puntuacion.
La puntuacion inmunohistoquimica combinada tambien se puede ajustar (por ejemplo, raiz cuadrada, exponente, coeficientes, etc.) para formar un componente inmunohistoquimico combinado con respecto a la puntuacion.
Entonces, los dos componentes se pueden combinar (por ejemplo, anadir, multiplicar o similar).
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Una tecnica particular para calcular la puntuacion de pronostico de salida es como sigue:
imagen2
donde Fihc es un coeficiente inmunohistoqmmico combinado, FHet es un coeficiente de heterogeneidad y HetER es una puntuacion de heterogeneidad para ER y HetpR es una puntuacion de heterogeneidad para PR. En una implementacion, Fihc = 0,03114 y Fhet = 1,95119. Sin embargo, las tecnologfas pueden soportar el ajuste de los coeficientes segun se desee. Por ejemplo, el analisis estadfstico puede indicar coeficientes apropiados que se pueden cambiar en funcion de los datos acumulados (por ejemplo, para dividir a los pacientes en categorfas como se describe en el presente documento).
indication de pronostico ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, una indicacion de pronostico puede comprender una puntuacion de pronostico de salida por sf misma, una categorfa (por ejemplo, rojo, amarillo, verde) basandose en umbrales o similar. La indicacion puede ser de una forma que indique si se predice o no (o cuan probable es) que el cancer recidive, basandose en las entradas.
La indicacion de la recidiva de cancer de mama se puede elegir (por ejemplo, entre una pluralidad de categorfas) basandose en uno o mas umbrales almacenados para la puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama. Por ejemplo, si la puntuacion alcanza un umbral, se puede elegir una primera indicacion (por ejemplo, pronostico de recidiva); si la puntuacion no alcanza el umbral, se puede elegir una segunda indicacion (por ejemplo, pronostico de no recidiva).
Dichas categorfas tambien pueden comprender un componente de tiempo (por ejemplo, se espera que recidive en un plazo de 5 anos) o similar.
Se pueden soportar multiples indicaciones (por ejemplo, una categorfa para si se espera que el cancer recidive en un plazo de 1 ano, otra categorfa para si se espera que el cancer recidive en un plazo de 5 anos, etc.).
implementation ejemplar en la plataforma de formation de imagenes
Aunque las tecnologfas se pueden implementar de forma independiente, las tecnologfas descritas en el presente documento se pueden implementar en una plataforma de patologfa digital multifuncional que ayuda a los usuarios en el analisis de los datos de imagenes de preparaciones. Por ejemplo, las tecnologfas se pueden integrar en el software de gestion de imagenes Virtuoso de Ventana Medical Systems, Inc. o soluciones comparables.
Dicha plataforma puede servir como una parte visible para las tecnologfas. Las imagenes de preparaciones y la informacion recopilada sobre ellas (por ejemplo, campos de vision) por medio de la plataforma de patologfa digital se pueden usar como entradas para las tecnologfas descritas en el presente documento.
Dicha plataforma puede proporcionar a los patologos la flexibilidad de trabajar en casos, especfmenes e imagenes en cualquier orden deseado. Las imagenes de preparaciones se pueden anotar, y puede estar disponible una variedad de otras funcionalidades.
La plataforma se puede implementar en un escenario de cliente liviano (por ejemplo, software como servicio, informatica en la nube o similar) segun se desee.
Sistema ejemplar con herramienta de heterogeneidad que implementa las tecnologi'as
La FIG. 17 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar 1700 que incluye una herramienta de heterogeneidad 1720 que implementa las tecnologfas para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento. En el ejemplo, una herramienta de heterogeneidad 1720 acepta una pluralidad de campos de vision digitales 1711A-N, 1714A-N para biomarcadores respectivos como entrada y, con la ayuda de un normalizador opcional 1725, arroja puntuaciones de heterogeneidad 1731, 1734 para los biomarcadores respectivos.
Las caracterfsticas de la FIG. 9 se pueden entremezclar o incorporar segun se desee.
Una herramienta de pronostico 1740 acepta las puntuaciones de heterogeneidad 1731, 1734 y la puntuacion IHC combinada 1750 como entrada y, con referencia a un umbral de pronostico 1745, arroja una indicacion 1790 de si es probable que el cancer recidive en el sujeto.
Procedimiento implementado por ordenador ejemplar que implementa las tecnologi'as por medio de la puntuacion de heterogeneidad para biomarcadores respectivos
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La FIG. 18 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar 1800 que implementa las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento por medio de la determinacion de una puntuacion de heterogeneidad para biomarcadores respectivos y se puede implementar, por ejemplo, en el sistema mostrado en la FIG. 17.
En 1810 se recibe una pluralidad de campos de vision digitales para biomarcadores respectivos.
En 1812, basandose en los campos de vision digitales, se determina una puntuacion de heterogeneidad para los biomarcadores respectivos.
En 1816, una puntuacion IHC combinada y las puntuaciones de heterogeneidad se combinan en una puntuacion de pronostico.
En 1818 se arroja una indicacion del pronostico (por ejemplo, una indicacion 1790 de si es probable que el cancer recidive en el sujeto) basandose en la puntuacion de pronostico.
Calculo de la puntuacion IHC combinada ejemplar
Un procedimiento implementado por ordenador puede calcular una puntuacion inmunohistoquimica combinada para un sujeto recibiendo respectivas pluralidades de campos de vision digitales dentro de imagenes respectivas que representan una muestra de cancer de mama marcada de manera detectable con anticuerpos para biomarcadores respectivos (por ejemplo, para una pluralidad de biomarcadores como se describe en el presente documento).
A continuacion, se puede determinar la positividad en porcentaje para una pluralidad de los biomarcadores como se describe en el presente documento.
A continuacion, se puede calcular la puntuacion inmunohistoquimica combinada. Dicho calculo puede comprender combinar la positividad en porcentaje para un biomarcador con la positividad en porcentaje para un segundo biomarcador.
A continuacion, se puede arrojar una puntuacion inmunohistoquimica combinada.
Los biomarcadores pueden comprender HER2, y calcular la puntuacion IHC combinada puede comprender calcular una puntuacion para HER2 (por ejemplo, en intervalos de clase, binaria o similar) como se describe en el presente documento.
Biomarcadores ejemplares
En el ejemplo de la FIG. 17 se usan los biomarcadores ER y PR para determinar la heterogeneidad regional. En la practica, la heterogeneidad de diferentes combinaciones de biomarcadores se puede calcular y combinar con una puntuacion IHC combinada para generar una puntuacion de pronostico.
Los biomarcadores que se pueden usar pueden incluir combinaciones de uno o mas de los biomarcadores usados como parte de la puntuacion IHC combinada (por ejemplo, ER, PR, Ki-67 y HER2). Cualquiera de los demas ejemplos del presente documento se puede modificar en consecuencia (por ejemplo, para obtener campos de vision, calcular puntuaciones de heterogeneidad o similar).
Multiplexacion ejemplar
En cualquiera de los ejemplos del presente documento se pueden medir biomarcadores en un escenario multiplex. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, una unica seccion de tejido se puede marcar con mas de un anticuerpo (tal como dos anticuerpos especificos para dos biomarcadores diferentes, etc.), siempre y cuando dichas proteinas marcadas sean distinguibles, por ejemplo, usando anticuerpos secundarios marcados de manera diferente.
Tecnicas de micromatrices de tejidos ejemplares
En cualquiera de los ejemplos del presente documento se pueden aplicar tecnicas de micromatrices de tejidos para conseguir la tincion de tejidos. Por ejemplo, se puede aplicar una pluralidad de muestras de tejido a un unico sustrato, y se puede aplicar una pluralidad de agentes de tincion (por ejemplo, anticuerpos de marcaje) a las muestras (por ejemplo, un agente diferente por cada muestra de tejido). A continuacion, se pueden usar las tecnicas descritas en el presente documento para determinar una o mas puntuaciones como se describe en el presente documento (por ejemplo, basandose en imagenes de las muestras de tejido marcadas de manera detectable).
Umbrales ejemplares
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En cualquiera de los ejemplos del presente documento se pueden derivar umbrales mediante evaluacion estadistica. Por ejemplo, se pueden determinar puntos de corte usando entrenamiento y pruebas para validar un punto de corte optimo que sea el que mejor defina a los pacientes con riesgo alto frente a bajo.
Sistema ejemplar con maquina diferencial que implementa las tecnologias
La FIG. 19 es un diagrama de bloques de un sistema ejemplar 1900 que incluye una maquina diferencial 1940 para calcular una puntuacion de heterogeneidad para un biomarcador. Las caracteristicas de la FIG. 9 y/o la FIG. 17 se pueden incorporar o entremezclar segun se desee.
En el ejemplo, un analizador de imagenes de campo de vision 1920 acepta campos de vision digitales 1711A-N (por ejemplo, para un unico biomarcador) como entrada y arroja mediciones de positividad en porcentaje 1931A-N para los campos de vision respectivos.
La maquina diferencial 1940 acepta las mediciones de positividad en porcentaje 1931A-N como entrada y, con ayuda de un normalizador opcional 1945, arroja una puntuacion de heterogeneidad 1731 para el biomarcador.
Procedimiento implementado por ordenador ejemplar para calcular la puntuacion de heterogeneidad
La FIG. 20 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador ejemplar 2000 para calcular una puntuacion de heterogeneidad para su uso en las tecnologias para el pronostico de cancer de mama descritas en el presente documento y se puede implementar, por ejemplo, en el sistema mostrado en la FIG. 19.
En 2010 se recibe una pluralidad de campos de vision digitales para un biomarcador dado. Dicha imagen puede representar una muestra de cancer de mama de un sujeto marcada de manera detectable con anticuerpos para un biomarcador como se describe en el presente documento.
En 2012 se mide la expresion de proteinas para el biomarcador en los campos de vision digitales. Por ejemplo, se reciben o determinan mediciones de positividad en porcentaje para los biomarcadores respectivos.
En 2016 se mide la heterogeneidad de la expresion de proteinas medida para el biomarcador entre la pluralidad de campos de vision digitales. Por ejemplo, se calcula una puntuacion de heterogeneidad como la variabilidad entre las mediciones de positividad en porcentaje que aparecen en los campos de vision diferentes (por ejemplo, para un unico biomarcador).
La puntuacion de heterogeneidad (por ejemplo, metrica de variabilidad o puntuacion de heterogeneidad preliminar) se puede normalizar como se describe en el presente documento para ajustar la puntuacion de heterogeneidad.
En 2020 se arroja la puntuacion de heterogeneidad para el biomarcador (por ejemplo, para su uso en las tecnologias descritas en el presente documento).
Interfaz de usuario ejemplar
La FIG. 21 es una captura de pantalla de una interfaz de usuario ejemplar 2100 para indicar campos de vision digitales dentro de una imagen. Una interfaz de usuario puede adoptar la forma de una ventana, pantalla, panel o similar presentado a un usuario para aceptar entradas (por ejemplo, indicaciones de campos de vision en una imagen de preparacion visualizada).
En el ejemplo, un patologo ha seleccionado tres campos de vision 2120A, 2120B y 2120C en una preparacion visualizada para un biomarcador particular (por ejemplo, ER) con propositos de heterogeneidad. Se pueden seleccionar campos de vision independientes para diferentes biomarcadores. Se pueden seleccionar campos de vision independientes adicionales con propositos de heterogeneidad y propositos de puntuacion inmunohistoquimica combinada.
Flujo de trabajo del patologo ejemplar
La FIG. 22 es un diagrama de flujo de un procedimiento implementado por ordenador 2200 del flujo de trabajo digital del patologo ejemplar. Se puede reforzar un flujo de trabajo digital del patologo para facilitar la seleccion de campos de vision en (por ejemplo, dentro de) las imagenes.
En 2210, por medio de una interfaz de usuario que requiere campos de vision para una puntuacion IHC combinada, se recibe una pluralidad de campos de vision para la puntuacion IHC combinada dentro de una pluralidad de imagenes de preparaciones (o tejidos) visualizadas para determinar la puntuacion IHC combinada. Dicha interfaz de usuario puede comprender una pluralidad de imagenes de preparaciones (o tejidos) que representan una muestra de cancer de mama de un sujeto marcada de manera detectable con anticuerpos para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR. Recibir la pluralidad de campos de vision para la puntuacion IHC combinada puede comprender recibir una
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pluralidad de campos de vision para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR. Por ejemplo, se puede presentar una serie de preparaciones (o secciones de tejido) y el patologo puede indicar una pluralidad de campos en las preparaciones respectivas (por ejemplo, FOV para una primera preparacion, FOV para una segunda preparacion, etc.) (o una pluralidad de campos para cada seccion de tejido). Dicha indicacion se puede conseguir recibiendo anotaciones (por ejemplo, areas dibujadas) en una imagen visualizada.
En 2212, por medio de una interfaz de usuario que requiere campos de vision para una puntuacion de heterogeneidad, se recibe una pluralidad de campos de vision para una puntuacion de heterogeneidad dentro de una pluralidad de imagenes de preparaciones (o tejidos) visualizadas para determinar la puntuacion de heterogeneidad. Dicha interfaz de usuario puede comprender una pluralidad de imagenes de preparaciones (o tejidos) que representan una muestra de cancer de mama del sujeto marcada de manera detectable con anticuerpos para cada uno de ER y PR. Recibir la pluralidad de campos de vision para la puntuacion IHC combinada puede comprender recibir una pluralidad de biomarcadores de campos de vision, tales como para cada uno de ER y PR. Dicha recepcion se puede conseguir recibiendo anotaciones (por ejemplo, areas dibujadas o identificadas) en una imagen visualizada.
En 2216 se miden los valores de expresion de proteinas para los campos de vision para la puntuacion IHC combinada y se calcula una puntuacion IHC combinada a partir de los mismos.
En 2218 se miden los valores de expresion de proteinas para los campos de vision para la puntuacion de heterogeneidad y se calcula una puntuacion de heterogeneidad a partir de los mismos. Se pueden obtener de manera similar una o mas de otras puntuaciones de heterogeneidad para otros biomarcadores respectivos.
En 2220, la puntuacion IHC combinada y las una o mas puntuaciones de heterogeneidad se combinan en una puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama.
En 2222 se visualiza a una indicacion del pronostico de recidiva de cancer de mama basandose en la puntuacion de pronostico de recidiva de cancer de mama (por ejemplo, para su consideracion por parte de un patologo responsable).
Seleccion de campos de vision ejemplares
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, los campos de vision para una puntuacion IHC combinada se pueden seleccionar para que sean representativos de toda la preparacion. Una interfaz de usuario presentada al patologo puede indicarlo asi.
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, los campos de vision para una puntuacion de heterogeneidad se pueden seleccionar para que sean representativos de una region en la preparacion (por ejemplo, y de esta manera elegidos para enfatizar diferencias entre regiones). Una interfaz de usuario presentada al patologo puede indicarlo asi.
Descripcion adicional ejemplar
A. Muestras biologicas
Los procedimientos para obtener una muestra biologica de un sujeto se conocen en la tecnica. Por ejemplo, los procedimientos para obtener tejido mamario o celulas mamarias son rutinarios. Por ejemplo, se puede obtener una muestra de un tumor que contenga material celular mediante extirpacion quirurgica de todo o parte del tumor, recogiendo un aspirado con aguja fina del tumor, asi como otros procedimientos conocidos en la tecnica.
Las muestras pueden ser frescas o procesadas despues de su obtencion. En algunos ejemplos, se pueden fijar las muestras procesadas (por ejemplo, fijar en formalina) y/o someter a inclusion en cera (por ejemplo, parafina). Los fijadores para las preparaciones de celulas y tejidos montados se conocen bien en la tecnica e incluyen, sin limitacion, fijador de Bouin alcoholico al 95 %; fijador de alcohol al 95 %; fijador B5, fijador de Bouin, fijador de formalina, fijador de Karnovsky (glutaraldehido), fijador de Hartman, fijador de Hollande, solucion de Orth (fijador de dicromato) y fijador de Zenker (vease, por ejemplo, Carson, Histotechology: A Self-Instructional Text, Chicago:ASCP Press, 1997). De esta manera, la muestra puede ser una muestra de tejido de cancer de mama, fijada, sometida a inclusion en cera, tal como una muestra de tejido de cancer de mama en estadio temprano, fijada, sometida a inclusion en cera. En algunos ejemplos, la muestra es una seccion de tejido mamario tenida con hematoxilina y eosina (H&E). En algunos ejemplos, la muestra es una seccion de tejido mamario marcada con anticuerpos primarios especificos para ER, HER2, Ki-67 y PR, que se puede marcar directa o indirectamente (por ejemplo, con un anticuerpo secundario marcado), que en algunos ejemplos se tine adicionalmente con H&E.
En algunos ejemplos, la muestra (o una fraccion de la misma) esta presente sobre un soporte solido. Los soportes solidos portan la muestra biologica y permiten la deteccion apropiada de los componentes, por ejemplo, proteinas) en la muestra. Los soportes o sustratos ejemplares incluyen portaobjetos de microscopio (por ejemplo, portaobjetos
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de microscopio de vidrio o portaobjetos de microscopio de plastico), cubreobjetos (por ejemplo, cubreobjetos de vidrio o cubreobjetos de plastico), placas de cultivo de tejidos, placas de pocillos multiples, membranas (por ejemplo, nitrocelulosa o poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF)) o chips BIACORE™.
B. Biomarcadores de cancer de mama
1. Receptor de estrogenos (ER) (OMIM: 133430)
El receptor de estrogenos humano (ER o ESR) tiene dos formas diferentes, denominadas a (ESR1) y p (ESR2). ER a es la forma encontrada en las celulas de cancer de mama. Las secuencias de ER a estan disponibles
publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, los numeros de acceso NP_001116214.1, NP_001116213.1
y P03372.2 (proteinas) y NM_000125.3, NM_001122741.1 y NM_178850.2 (acidos nucleicos)).
El receptor de estrogenos es un factor de transcripcion activado por ligando compuesto de varios dominios importantes para la union a hormonas, union a ADN y activacion de la transcripcion. El empalme alternativo da como resultado varios transcritos de ARNm de ESR1, que difieren principalmente en sus regiones no traducidas en 5'.
Los anticuerpos para detectar la expresion de ER estan disponibles publicamente, tal como de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL), GeneTex (Irvine, CA), ARP American Research Products, Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ) o Abcam (Cambridge, MA), por ejemplo, los n.° de cat. sc-71064, sc-73562 y sc-7207 de Santa Cruz Biotechnology, MA1-310 de Pierce Antibodies, 790-4325 (clon SP1) de Ventana o ab2746, ab27614 o ab37438 de Abcam.
2. Receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2) (OMIM: 164870)
El gen HER2 humano se localiza en el cromosoma 17 (17q21-q22). Las secuencias de HER2 estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, numeros de acceso NP_001005862.1, P04626.1 y NP_004439.2 (proteinas) y NM_001005862.1 y NM_001982.3 (acidos nucleicos)).
La amplificacion o sobreexpresion de HER2 desempena un papel en la patogenia y evolucion de determinados tipos agresivos de cancer de mama y es un importante biomarcador y diana de tratamiento para la enfermedad.
Los anticuerpos para medir la expresion de HER2 estan disponibles publicamente, tal como de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL), GeneTex (Irvine, CA), ARP American Research Products, Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ) o Abcam (Cambridge, MA), por ejemplo, los nT de cat. 790-2991 (clon 4B5) de Ventana, sc-08, sc-81528 y sc-136294 de Santa Cruz Biotechnology y ab2428, ab16901 o ab36728 de Abcam.
3. Ki-67 (OMIM: 176741)
El gen Ki-67 humano esta localizado en el cromosoma 10. Las secuencias de Ki-67 estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, numeros de acceso NP_001139438.1, P46013.2 y NP_002408.3 (proteinas) y NM_001040058.1 y NM_001145966.1 (acidos nucleicos)).
Ki-67 es un marcador que se puede usar para determinar la fraccion de crecimiento de una poblacion celular dada. La fraccion de celulas tumorales positivas para Ki-67 (el indice de marcaje de Ki-67) se correlaciona a menudo con la evolucion clinica del cancer, tal como cancer de mama. De esta manera, se puede usar Ki-67 para determinar el pronostico de supervivencia del paciente y de recidiva del tumor.
Los anticuerpos para medir la expresion de Ki-67 estan disponibles publicamente, tal como de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL), GeneTex (Irvine, CA), ARP American Research Products, Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ) o Abcam (Cambridge, MA), por ejemplo, los nT de cat. 790-4286 (clon 30-9) de Ventana, sc-101861 (clon MIB-1), sc-15402 y sc-23900 de Santa Cruz Biotechnology y ab15580, ab16667 o ab8191 de Abcam.
4. Receptor de progesterona (PR) (OMIM: 607311)
El gen PR humano (tambien conocido como subfamilia 3 de receptores nucleares, grupo C, miembro 3, NR3C3) se localiza en el cromosoma 11 q22. Las secuencias de PR estan disponibles publicamente, por ejemplo, de GenBank® (por ejemplo, numeros de acceso NP_000917.3, AAA60081.1 y AAS00096.1 (proteinas) y NM_001202474.1 y Nm_000926.4 (acidos nucleicos)).
Se ha observado amplificacion o sobreexpresion de PR en algunos canceres de mama.
Los anticuerpos para medir la expresion de PR estan disponibles publicamente, tal como de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Thermo Scientific Pierce Antibodies (Rockford, IL), GeneTex (Irvine, CA), ARP
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American Research Products, Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ) o Abcam (Cambridge, MA), por ejemplo, los n.° de cat. 790-2223 (clon IE2) de Ventana, sc-810, sc-811 y sc-539 de Santa Cruz Biotechnology y ab2765, ab2764 o ab68195 de Abcam.
5. Secuencias variantes
Ademas de las secuencias disponibles publicamente de ER, HER2, Ki-67 y PR especificas proporcionadas en el presente documento, un experto en la tecnica apreciara que se pueden presentar variantes de dichas secuencias en un sujeto particular. Por ejemplo, se pueden presentar polimorfismos para un gen o proteina particular. Ademas, una secuencia puede variar entre diferentes organismos. En ejemplos particulares, una secuencia variante retiene la actividad biologica de su secuencia natural correspondiente. Por ejemplo, una secuencia de ER, HER2, Ki-67 o PR presente en un sujeto particular puede tener cambios conservadores de aminoacidos (tales como sustituciones muy altamente conservadoras, sustituciones altamente conservadoras o sustituciones conservadoras), tales como de 1 a 5 o de 1 a 10 sustituciones conservadoras de aminoacidos. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos ejemplares se muestran en la tabla 1.
Tabla 1: Sustituciones conservadoras de aminoacidos ejemplares
Residuo original
Sustituciones muy altamente conservadoras Sustituciones altamente conservadoras (de la matriz Blosum90) Sustituciones conservadoras (de la matriz Blosum65)
Ala
Ser Gly, Ser, Thr Cys, Gly, Ser, Thr, Val
Arg
Lys Gln, His, Lys Asn, Gln, Glu, His, Lys
Asn
Gln; His Asp, Gln, His, Lys, Ser, Thr Arg, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr
Asp
Glu Asn, Glu Asn, Gln, Glu, Ser
Cys
Ser Ninguna Ala
Gln
Asn Arg, Asn, Glu, His, Lys, Met Arg, Asn, Asp, Glu, His, Lys, Met, Ser
Glu
Asp Asp, Gln, Lys Arg, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Ser
Gly
Pro Ala Ala, Ser
His
Asn; Gln Arg, Asn, Gln, Tyr Arg, Asn, Gln, Glu, Tyr
Ile
Leu; Val Leu, Met, Val Leu, Met, Phe, Val
Leu
Ile; Val Ile, Met, Phe, Val Ile, Met, Phe, Val
Lys
Arg; Gln; Glu Arg, Asn, Gln, Glu Arg, Asn, Gln, Glu, Ser
Met
Leu; Ile Gln, Ile, Leu, Val Gln, Ile, Leu, Phe, Val
Phe
Met; Leu; Tyr Leu, Trp, Tyr Ile, Leu, Met, Trp, Tyr
Ser
Thr Ala, Asn, Thr Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Lys, Thr
Thr
Ser Ala, Asn, Ser Ala, Asn, Ser, Val
Trp
Tyr Phe, Tyr Phe, Tyr
Tyr
Trp; Phe His, Phe, Trp His, Phe, Trp
Val
Ile; Leu Ile, Leu, Met Ala, Ile, Leu, Met, Thr
En algunos modos de realizacion, una secuencia de ER, HER2, Ki-67 o PR es una variante de secuencia de una secuencia de ER, HER2, Ki-67 o PR natural, respectivamente, tal como una secuencia de proteina o acido nucleico que tiene al menos un 99 %, al menos un 98 %, al menos un 95 %, al menos un 92 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 % o al menos un 60 % de identidad de secuencia con respecto a las secuencias expuestas en un numero de acceso de GenBank® al que se hace referencia en el presente documento, en la que la variante resultante retiene la actividad biologica de ER, HER2, Ki-67 o PR. La “identidad de secuencia” es un termino usado comunmente para describir la similitud entre dos secuencias de aminoacidos (o entre dos secuencias de acidos nucleicos). La identidad de la secuencia se expresa tipicamente en terminos de identidad en porcentaje; cuanto mas alto sea el porcentaje, mas similares son las dos secuencias.
Los procedimientos para alinear secuencias para su comparacion y para determinar la identidad de secuencia se conocen bien en la tecnica. Diversos programas y algoritmos de alineacion se describen en: Smith y Waterman, Adv.
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Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research, 16:10881-10890, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165, 1992; Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331, 1994; Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett., 174:247-250, 1999. Altschul et al. presentan una consideracion detallada de procedimientos de alineacion de secuencias y calculos de homologia (J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990).
La herramienta de busqueda de alineaciones locales basicas (BLAST™, Altschul et al., J. Mol. Biol, 215:403-410, 1990) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) esta disponible publicamente de varias fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para su uso en relacion con los programas de analisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Una descripcion de como determinar la identidad de secuencia usando este programa esta disponible en Internet en la seccion de ayuda para BLAST™.
Para las comparaciones de secuencias de aminoacidos de mas de aproximadamente 15 aminoacidos, se emplea la funcion “secuencias de Blast 2” del programa BLAST™ (Blastp) usando la matriz BLOSUM62 predeterminada ajustada a los parametros predeterminados (coste por abrir un hueco [predeterminado = 5] coste por extender un hueco [predeterminado = 2], penalizacion por un emparejamiento erroneo [predeterminado = 3], recompensa por un emparejamiento [predeterminado = 1], valor de expectacion (E) [predeterminado = 10,0], tamano de palabra [predeterminado = 3] y numero de descripciones en una linea (V) [predeterminado = 100]. Al alinear los peptidos cortos (menos de alrededor de 15 aminoacidos), la alineacion se debe realizar usando la funcion secuencias de Blast 2 "busqueda de emparejamientos practicamente exactos y cortos" que emplea la matriz PAM30 ajustada a los parametros predeterminados (umbral esperado = 20000, tamano de palabra = 2, costes por hueco: existencia = 9 y extension = 1) usando la estadistica basada en composicion.
C. Deteccion de proteinas
En ejemplos particulares, se analiza una muestra obtenida del sujeto para determinar si contiene niveles detectables de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR, tal como una muestra de cancer de mama. De esta manera, la muestra se puede analizar para detectar o medir la presencia de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR en la muestra, por ejemplo, una medicion cualitativa o semicuantitativa. Los patrones de expresion de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR tambien se pueden usar para determinar la heterogeneidad de la expresion de proteinas.
Los procedimientos de deteccion de proteinas son rutinarios. En algunos ejemplos se usan inmunoensayos para detectar la presencia de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR en la muestra. Generalmente, los inmunoensayos incluyen el uso de uno o mas agentes de union especificos (tales como anticuerpos) que unicamente se pueden unir sustancialmente al peptido diana, tal como ER, HER2, Ki-67 y PR. Dichos agentes de union pueden incluir un marcador detectable (tal como un radiomarcador, fluoroforo o enzima) que permita la deteccion de la union a la proteina. Los inmunoensayos ejemplares que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a: inmunoelectrotransferencia (Western blot), ELISA, microscopia de fluorescencia y citometria de flujo. Un inmunoensayo particular es inmunohistoquimica.
En un ejemplo, el agente de union especifico es un anticuerpo, tal como un anticuerpo policlonal o monoclonal, o fragmento del mismo. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo quimerico. Si se desea, el anticuerpo puede incluir un marcador detectable para permitir la deteccion y, en algunos casos, la cuantificacion del complejo proteina/anticuerpo diana. En otros ejemplos, el anticuerpo se detecta con un anticuerpo secundario marcado apropiado.
En algunos ejemplos, los anticuerpos para ER, PR, HER2 y Ki-67 se obtienen de Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ). Sin embargo, un experto en la tecnica apreciara que otros anticuerpos que se pueden usar en los procedimientos y kits proporcionados en el presente documento estan disponibles comercialmente de otras fuentes, tales como: Novus Biologicals (Littleton, CO), Santa Cruz biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), Abeam (Cambridge, MA) e Invitrogen (Carlsbad, CA).
La presencia de una senal detectable por encima de los niveles de fondo o control indica la presencia de un peptido diana (por ejemplo, proteina ER, HER2, Ki-67 y PR) en la muestra. El valor obtenido para la muestra de cancer de mama de prueba se puede comparar con un valor de referencia, tal como un valor de referencia que representa un valor o intervalo de valores esperados. En algunos ejemplos, la referencia es una muestra que posee una cantidad conocida o esperada de proteina ER, HER2, Ki-67 y PR.
En algunos ejemplos, se obtiene una muestra de cancer de mama y se procesa para IHC. Por ejemplo, la muestra se puede fijar y someter a inclusion, por ejemplo, con formalina y parafina. A continuacion, la muestra se puede montar en un soporte, tal como un portaobjetos de microscopio de vidrio. Por ejemplo, se puede realizar microtomos de la muestra en una serie de secciones delgadas y las secciones se pueden montar en uno o mas portaobjetos de microscopio. En algunos ejemplos, una unica preparacion incluye multiples secciones de tejido. A continuacion, diferentes secciones de la muestra de cancer de mama se pueden marcar individualmente con anticuerpos
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especificos para proteina ER, HER2, Ki-67 o PR. Es decir, una seccion se puede marcar con anticuerpos especificos para ER y otra seccion se puede marcar con anticuerpos especificos para HER2, y asi sucesivamente. En algunos ejemplos, una unica seccion de la muestra de cancer de mama se puede marcar con anticuerpos especificos para dos o mas proteinas de ER, HER2, Ki-67 o PR. Es decir, una seccion se puede marcar con anticuerpos especificos para ER y con anticuerpos especificos para HER2, y los anticuerpos se pueden distinguir usando diferentes marcadores (en los que cada marcador es especifico para ER, HER2, Ki-67 o PR). Por ejemplo, se puede usar el BenchMark ULTRA de Ventana Medical Systems, Inc. para tenir y procesar las preparaciones.
En algunos ejemplos se obtienen imagenes de las preparaciones que contienen la muestra marcada y se digitalizan, por ejemplo, usando el iScan Coreo (Ventana). De esta manera, para cada una de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR (que se marcan de manera detectable en la muestra), se puede obtener al menos una imagen digital. Posteriormente, se seleccionan y anotan dos o mas campos de vision (FOV) para cada proteina (proteina ER, HER2, Ki-67 y PR), por ejemplo, por un patologo.
D. Calcular una puntuacion IHC combinada
Para calcular la puntuacion IHC combinada (por ejemplo, IHC4) se usa una muestra de cancer de mama con ER, HER2, Ki-67 y PR marcadas de manera detectable (por ejemplo, una o mas preparaciones, tales como 1, 2, 3 o 4 preparaciones). En un ejemplo, la muestra de cancer de mama se puede marcar con anticuerpos primarios especificos para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR y con anticuerpos secundarios marcados apropiadamente (tales como los marcados con un fluoroforo o enzima, tal como DIG). En un ejemplo se usa el kit de deteccion ultraView Red ISH DIG segun las instrucciones del fabricante (Ventana Medical Systems, Inc., n.° de catalogo 760-505).
Se pueden obtener una o mas imagenes digitales de una o mas preparaciones que contienen la muestra de cancer de mama marcada, por ejemplo, usando un software de obtencion de imagenes de microscopio. La una o mas preparaciones que contienen la una o mas muestras de cancer de mama marcadas (o una imagen digital de las mismas) se evalua en cuanto a su tincion global, por ejemplo, por un patologo. Por ejemplo, se pueden detectar regiones de heterogeneidad en la tincion para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR. Si se observa heterogeneidad regional, se selecciona al menos un FOV que tenga heterogeneidad regional (tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 areas de FOV diferentes de heterogeneidad regional en la preparacion, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 FOV), junto con al menos otros dos FOV que sean similares entre si (tal como al menos 3, al menos 4 o al menos 5 areas de FOV diferentes en la preparacion que sean similares entre si, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 FOV). Si no se observa heterogeneidad regional, se puede seleccionar un menor numero de FOV, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 FOV diferentes en la preparacion, tal como 2, 3, 4 o 5 FOV en la preparacion.
Para cada FOV seleccionado para la proteina PR y Ki-67, se determina la positividad en porcentaje. De esta manera, si se seleccionan cuatro FOV para PR, entonces la positividad en % se determina para cada uno de los cuatro FOV. Para calcular la positividad en % se determina el numero total de celulas tumorales en el FOV, asi como el numero total de celulas tumorales tenidas en el FOV (por ejemplo, que sean PR+). La positividad en % es el numero total de celulas tumorales tenidas en el FOV dividido entre el numero total de celulas tumorales en el FOV. La positividad en porcentaje para cada FOV para un marcador particular (por ejemplo, PR) se promedia, dando como resultado una positividad en % para PR y Ki-67.
Para cada FOV para HER2 se determina una puntuacion en intervalos de clase (en una escala de 0-3). Por ejemplo, para cada FOV se puede asignar una puntuacion en intervalos de clase entre 0 y 3 a la tincion basandose en la evaluacion del FOV. Se puede usar una escala de cuatro puntos para describir la inmunotincion de la membrana alrededor de un nucleo para HER2, como sigue: 0, negativo; 1, positividad debil; 2, positividad moderada; y 3+, positividad fuerte, por ejemplo, como se muestra en la tabla 2. La tincion citoplasmica todavia puede estar presente, pero no es necesario incluir dicha tincion en la determinacion.
Tabla 2: Puntuacion en intervalos de clase para HER2
Patron de tincion
Puntuacion Evaluacion de tincion para HER2
No se observa tincion de la membrana
0 Negativa
Tincion parcial debil de la membrana
1 + Negativa
Tincion completa debil de la membrana, mas de un 10 % de celulas cancerosas
2+ Positiva
Tincion completa intensa de la membrana, mas de un 10 % de celulas cancerosas
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De manera alternativa, se puede determinar una puntuacion binaria (0 o 1) para HER2 (por ejemplo, basandose en FOV individuales o en los FOV colectivamente), en la que un resultado positivo (1) corresponde a una puntuacion de tincion de 2 o 3 y un resultado negativo (0) corresponde a una puntuacion de tincion de 0 o 1. Se puede usar mayor o menor resolucion. Por ejemplo, se puede usar un sistema que usa 0, 1, 2 y 3. Internamente, la puntuacion para HER2 se puede representar como una puntuacion en intervalos de clase (por ejemplo, 0, 1, 2 o 3) o como un valor binario (por ejemplo, 0 o 1) (por ejemplo, el valor binario se determina basandose en la puntuacion en intervalos de clase).
Para los FOV seleccionados para ER, se determina una puntuacion H (por ejemplo, para los FOV individuales o los FOV colectivamente). La puntuacion H para ER es el porcentaje de celulas que muestran tincion debil, anadido a dos veces el porcentaje de celulas que se tinen moderadamente, anadido a tres veces el porcentaje de celulas de que se tinen intensamente, dividido entre 30 para llegar a una variable entre 0-10 (ER10). Una puntuacion H de mas de 1 es positiva. El porcentaje de celulas con tincion positiva para PR (por ejemplo, con limite a un 10 %) se dividio entre 10 para obtener una variable entre 0 y 10 (PR10).
De esta manera, despues de que un patologo identifique los FOV para cada uno de los cuatro marcadores, un algoritmo de formacion de imagenes puede extraer informacion digital de la preparacion (tal como una muestra de cancer de mama marcada para detectar la proteina ER, HER2, Ki-67 o PR), transformando la imagen digital en componentes de puntuacion (por ejemplo, mediciones de positividad en %, puntuacion en intervalos de clase (o binaria) y puntuacion H). Estas puntuaciones para cada marcador descritas anteriormente se usan para generar una puntuacion IHC combinada, que se calcula usando la formula:
IHC4 = 94,7 x {-0,100 ER10 - 0,079 PR10 + 0,586 HER2 + 0,240 ln (1 + 10 x Ki67)}
E. Calcular una puntuacion de heterogeneidad
La heterogeneidad se refiere a la variacion espacial de los patrones de tincion histoquimica y molecular, tales como los patrones de tincion para los biomarcadores de cancer de mama ER, HER2, Ki-67 y PR en una muestra de cancer de mama. La heterogeneidad puede ser un indicador de la variacion espacial de la agresividad del tumor y/o de los patrones de crecimiento que se pueden correlacionar con un fenotipo clinico agregado (por ejemplo, un tumor que es probable que recidive). En el presente documento se muestra que la heterogeneidad biologica de la expresion de proteinas para ER, PR, HER2 y Ki-67 se correlaciona con la recidiva impredecible de una fraccion de pacientes con cancer de mama en estadio temprano.
El procedimiento incluye cuantificar la heterogeneidad regional en la muestra para cada uno de los cuatro marcadores, que se calcula a partir de las puntuaciones del FOV seleccionado. De esta manera, para cada marcador se determina una medida cuantitativa de la heterogeneidad regional. Si el marcador es homogeneo o no detectable (por ejemplo, HER2-), entonces ese valor estara fuera del calculo de la puntuacion de heterogeneidad. Se seleccionan y anotan dos o mas campos de vision (FOV) para cada proteina (proteina ER, HER2, Ki-67 o PR), por ejemplo, por un patologo. El FOV seleccionado puede ser igual o diferente del FOV seleccionado para calcular la puntuacion IHC4.
En algunos ejemplos, se selecciona una pluralidad de FOV (por ejemplo, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 FOV o similar), por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 FOV. Como se describe anteriormente, en respuesta a la observacion de la heterogeneidad regional, se pueden seleccionar mas FOV, tal como al menos un FOV que tenga heterogeneidad regional (tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 areas de FOV diferentes de heterogeneidad regional en la preparacion, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 FOV), junto con al menos otros dos FOV que sean similares entre si (tal como al menos 3, al menos 4 o al menos 5 areas de FOV diferentes en la preparacion que sean similares entre si, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 FOV). En respuesta a la observacion de no heterogeneidad regional, se puede seleccionar un menor numero de FOV, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 FOV diferentes en la preparacion, tal como 2, 3, 4 o 5 FOV en la preparacion.
En algunos casos, puede ser deseable seleccionar FOV adicionales para establecer de manera concluyente (por ejemplo, confirmar o demostrar) que la heterogeneidad regional no esta presente. Sin embargo, si es evidente de manera concluyente que no hay heterogeneidad regional, seleccionar FOV adicionales puede consumir recursos de manera innecesaria; por lo tanto, se puede seleccionar un menor numero de FOV.
En un ejemplo, se seleccionan FOV con diferente positividad en %, puesto que estas areas indican heterogeneidad, por ejemplo, heterogeneidad regional.
Para cada una de las proteinas ER, Ki-67, HER2 y PR se determina una puntuacion de heterogeneidad. En algunos ejemplos no se determina HER2 (o el valor esta fuera, puesto que no hay heterogeneidad para HER2), por ejemplo, si la muestra es negativa para HER2. En algunos ejemplos no se determina Ki-67 (o el valor esta fuera, puesto que no hay heterogeneidad para Ki-67).
Para los marcadores ER y PR (y en algunos ejemplos tambien HER2 y Ki-67), la puntuacion de heterogeneidad se calcula como sigue. La variabilidad de las puntuaciones de positividad en porcentaje se calcula a partir de regiones heterogeneas en el FOV seleccionado. Por ejemplo, se puede determinar una metrica de variabilidad (VM) para cada marcador, en la que la VM es una indicacion de cuan diferente es un FOV seleccionado de otro FOV para la 5 misma proteina. Hay muchas maneras de que esto se pueda calcular, tal como determinar una desviacion estandar. En un ejemplo, la VM para cada uno de ER, PR y Ki-67 (y, en algunos ejemplos, HER2) se calcula como sigue:
VM = STD(PPFSi), PP(FS2), ....PP(FSn))
10 en la que PP(FS) es la positividad en porcentaje para cada campo de vision, FS. La positividad en porcentaje se puede calcular como se describe en el presente documento. A continuacion, la puntuacion de heterogeneidad para el marcador (por ejemplo, ER y PR) se calcula usando la formula (donde a = [0,1]:
H = -
' a* — ..S < 10 % <0,05
a*—,de otro modo
\
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Para HER2, se calcula una puntuacion en intervalos de clase, P(FS) (escala de 0 a 3, vease anteriormente) para cada FOV, FS. A continuacion, se puede calcular la puntuacion de heterogeneidad para HER2 usando la formula:
H= £||P(FSj)-P(FS,-)||
vtj
i*j
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Si las puntuaciones en intervalos de clase son las mismas para cada FOV, la puntuacion de heterogeneidad para HER2 es 0.
La siguiente tabla indica diferentes tipos de heterogeneidad, incluyendo heterogeneidad regional como se describe 25 en el presente documento.
Tabla 3: Tipos de heterogeneidad
Generica Proteina ER Proteina PR Proteina Ki67 Proteina HER2 Gen HER2
Geografica 2 bloques separados, > 2 pulg. entre si
Difusa-focal No aplicable n.a. n.a. n.a. n.a.
Regional 1 4x-FOV entre si, misma seccion/bloque, 0,25-2 pulg.
Difusa-focal Si Si Si Si Si
Interglandular Dentro de 4x-FOV, < 0,25 pulg. Para ambas categorias regionales
> o < 50 % de formaciones similares No No No Si Si
Intraglandular = celula-celula
> o < 50 % de celulas similares Si Si Si Si Si
Todas las formaciones en 1 20x-FOV
Si esta en capas multiples, todas o capas especificas No No No No No
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Generica Proteina ER Proteina PR Proteina Ki67 Proteina HER2 Gen HER2
Para todas las categorias regionales e interglandulares
Difusa-polarizada No No No No No
Subcelular
Nuclear, citoplasmica o membranosa Para todas las categorias regionales, inter e intraglandulares Nuclear Nuclear Nuclear Membranosa Nuclear
Intensidad
Negativa, 3 categorias positivas Si Si Si Si Si
F. Calcular una puntuacion de pronostico de salida
La puntuacion de pronostico de salida se calcula a partir de la puntuacion IHC combinada y la puntuacion de heterogeneidad descritas anteriormente. Una puntuacion de heterogeneidad combinada se genera como sigue y se puede ajustar para que incluya biomarcadores adicionales:
Puntuacion de heterogeneidad combinada = raiz cuadrada (puntuacion de heterogeneidad para ER + puntuacion de heterogeneidad para PR)
La puntuacion IHC combinada y la puntuacion de heterogeneidad combinada se incluyen en un procedimiento de analisis estadistico (por ejemplo, modelo de riesgos proporcionales de Cox), para maximizar las capacidades predictivas combinadas de ambas medidas. Por ejemplo, el modelo se puede usar para determinar la supervivencia libre de evolucion (PFS) como resultado, tal como una PFS a 1, 3 o 5 anos o de otro modo separar a los pacientes en categorias.
El resultado es una formula matematica que genera una puntuacion para predecir el riesgo de PFS a 5 anos
puntuacion de pronostico de salida = 0,03114*IHC4 + 1,95119*puntuacion de heterogeneidad combinada
De esta manera, la puntuacion de pronostico de salida es una puntuacion de riesgo alto (lo que indica que es probable que el cancer de mama en estadio temprano recidive, por ejemplo, en un plazo de 5 anos, tal como una recidiva local o una metastasis a distancia) o bien una puntuacion de riesgo bajo (lo que indica que es probable que el cancer de mama en estadio temprano no recidive).
G. Arrojar un valor de salida y pronostico
Tras la determinacion de la puntuacion IHC combinada, la puntuacion de heterogeneidad y la puntuacion de pronostico de salida, los resultados del ensayo (tales como la puntuacion de pronostico de salida), los hallazgos, el pronostico, las predicciones y/o las recomendaciones de tratamiento tipicamente se registran y comunican a los tecnicos, medicos y/o pacientes, por ejemplo. En determinados modos de realizacion, se usaran ordenadores para comunicar dicha informacion a las partes interesadas, tales como, pacientes y/o los medicos que les atienden. Basandose en el pronostico del cancer de mama, se puede modificar el tratamiento administrado a un sujeto.
En un modo de realizacion, un pronostico, prediccion y/o recomendacion de tratamiento basandose en el valor de salida se comunica a las partes interesadas tan pronto como sea posible despues de que se haya completado el ensayo y se haya generado el pronostico. Los resultados y/o informacion relacionada se pueden comunicar al sujeto por parte del medico responsable del sujeto. De manera alternativa, los resultados se pueden comunicar directamente a las partes interesadas mediante cualquier medio de comunicacion, que incluye por escrito, tal como, por ejemplo, proporcionando un informe escrito, formas electronicas de comunicacion, tal como correo electronico, o por telefono. La comunicacion se puede facilitar mediante el uso de un ordenador programado adecuadamente, tal como en el caso de comunicaciones por correo electronico. En determinados modos de realizacion, la comunicacion, que contiene los resultados de una prueba pronostica y/o conclusiones extraidas de y/o recomendaciones de tratamiento basadas en la prueba, se puede generar y entregar automaticamente a las partes interesadas usando una combinacion de hardware y software de ordenador que sera familiar para los expertos en la tecnica de las telecomunicaciones. Un ejemplo de un sistema de comunicaciones orientado a la asistencia sanitaria se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.283.761; sin embargo, la presente divulgacion no se limita a los procedimientos que utilizan este sistema de comunicaciones particular.
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En determinados modos de realizacion de los procedimientos de la divulgacion, todas o algunas de las etapas del procedimiento, incluyendo el pronostico de cancer de mama, y la comunicacion de los resultados del ensayo o pronostico, se pueden llevar a cabo en diversas jurisdicciones (por ejemplo, extranjeras).
H. Tratamientos de seguimiento
Los procedimientos divulgados pueden incluir adicionalmente seleccionar sujetos para el tratamiento del cancer de mama, por ejemplo, si se determina el pronostico de la muestra como un cancer de mama en estadio temprano que es probable que recidive. De manera alternativa, los procedimientos divulgados pueden incluir adicionalmente seleccionar sujetos para no tratamiento (por ejemplo, solo seguimiento), si la muestra se diagnostica como un cancer de mama en estadio temprano que no es probable que recidive.
En algunos escenarios ejemplares se puede realizar una o mas de las siguientes operaciones dependiendo del pronostico del paciente: a) prescribir un regimen de tratamiento para el sujeto si el pronostico determinado del sujeto es que el cancer de mama en estadio temprano es probable que recidive (tal como el tratamiento con una o mas radioterapias y/o agentes quimoterapeuticos, cirugia adicional, seguimiento mas frecuente o combinaciones de los mismos); b) no prescribir un regimen de tratamiento para el sujeto si el pronostico determinado del sujeto es que el cancer de mama en estadio temprano no es probable que recidive; c) recomendar la administracion de un tratamiento (tal como un tratamiento con una o mas radioterapias y/o recomendar la administracion de agentes quimoterapeuticos, cirugia adicional o combinaciones de los mismos) al sujeto si el pronostico determinado del sujeto es que el cancer de mama en estadio temprano es probable que recidive; y d) recomendar no administrar un regimen de tratamiento al sujeto si el pronostico determinado del sujeto es que el cancer de mama en estadio temprano no es probable que recidive
Componentes de puntuacion ejemplares
En cualquiera de los ejemplos del presente documento, los componentes de puntuacion se pueden referir a la medicion de la expresion genica (por ejemplo, positividad en porcentaje o similar), puntuacion H, puntuacion en intervalos de clase, puntuacion binaria o similar para uno o mas biomarcadores.
Como los componentes se combinan, los componentes resultantes pueden representar biomarcadores plurales. Descripcion adicional ejemplar
Para las medidas de la heterogeneidad y calculo IHC, en lugar de puntuaciones manuales de microscopia, las preparaciones se pueden digitalizar y los algoritmos de analisis de imagenes automatizado pueden calcular la positividad en porcentaje, la puntuacion en intervalos de clase (por ejemplo, y convertirla a puntuacion binaria) y la puntuacion H para los campos (FOV) seleccionados por el patologo.
En cada preparacion digitalizada asociada a los cuatro marcadores mencionados anteriormente, el patologo anota las regiones especificas para cuantificar la intensidad interregional y la heterogeneidad regional. Usando el analisis de imagenes automatizado para cada region, se calculan los recuentos de celulas con tincion positiva y negativa, la positividad en porcentaje y la puntuacion en intervalos de clase (0, 1+, 2+, 3+).
Para cuantificar la heterogeneidad interregional se pueden usar metricas de heterogeneidad basadas en estas puntuaciones regionales. La puntuacion de heterogeneidad se basa en los recuentos de celulas negativas y positivas (1+, 2+ y 3+) en los FOV seleccionados por el patologo. La puntuacion de heterogeneidad capta la variacion de las puntuaciones dentro de los FOV seleccionados. Usando los FOV anotados por el patologo, la puntuacion es una funcion normalizada de la desviacion estandar de las puntuaciones de FOV diferentes. El parametro de normalizacion elegido es dependiente del marcador, lo que refleja el hecho de que, en general, la puntuacion de positividad en porcentaje interregional tiene una variabilidad mas alta para una puntuacion de positividad de preparacion global mas alta.
Sistema computacional ejemplar
La FIG. 23 ilustra un ejemplo generalizado de un sistema computacional adecuado 2300 en el que se pueden implementar varias de las innovaciones descritas. El sistema computacional 2300 no pretende sugerir ninguna limitacion en cuanto al alcance de uso o funcionalidad, puesto que las innovaciones se pueden implementar en diversos sistemas computacionales para uso general o para uso especial. Los sistemas computacionales, como se describen en el presente documento, se pueden usar para implementar una funcionalidad automatizada (por ejemplo, se llevan a cabo procedimientos, acciones y similares mediante un sistema computacional como se describe en el presente documento).
Con referencia a la FIG. 23, el sistema computacional 2300 incluye una o mas unidades de procesamiento 2310, 2315 y memoria 2320, 2325. En la FIG. 23 se incluye esta configuracion basica 2330 dentro de una linea
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discontinua. Las unidades de procesamiento 2310, 2315 ejecutan instrucciones ejecutables por ordenador. Una unidad de procesamiento puede ser una unidad de procesamiento central (CPU) para uso general, un procesador en un circuito integrado de aplicacion especifica (ASIC) o cualquier otro tipo de procesador. En un sistema de procesamiento multiple, multiples unidades de procesamiento ejecutan instrucciones ejecutables por ordenador para incrementar la potencia de procesamiento. Por ejemplo, la FIG. 23 muestra una unidad de procesamiento central 2310, asi como una unidad de procesamiento de graficos o unidad de coprocesamiento 2315. La memoria tangible 2320, 2325 puede ser una memoria volatil (por ejemplo, registros, cache, RAM), memoria no volatil (por ejemplo, ROM, EEPROM, memoria rapida, etc.) o alguna combinacion de las dos, accesible para la o las unidades de procesamiento. La memoria 2320, 2325 almacena el software 2380 que implementa una o mas de las innovaciones descritas en el presente documento, en forma de instrucciones ejecutables por ordenador adecuadas para su ejecucion por la o las unidades de procesamiento.
Un sistema computacional puede tener caracteristicas adicionales. Por ejemplo, el sistema computacional 2300 incluye un almacenamiento 2340, uno o mas dispositivos de entrada 2350, uno o mas dispositivos de salida 2360 y una o mas conexiones de comunicacion 2370. Un mecanismo de interconexion (no mostrado), tal como un bus, controlador o red, interconecta los componentes del sistema computacional 2300. Tipicamente, el software del sistema operativo (no mostrado) proporciona un entorno operativo para otro software que se ejecuta en el sistema computacional 2300 y coordina las actividades de los componentes del sistema computacional 2300.
El almacenamiento tangible 2340 puede ser extraible o no extraible e incluye discos magneticos, cintas magneticas o casetes, CD-ROM, DVD o cualquier otro medio que se pueda usar para almacenar informacion de una manera no transitoria y al que se pueda acceder dentro del sistema computacional 2300. El almacenamiento 2340 almacena instrucciones para el software 2380 que implementa una o mas de las innovaciones descritas en el presente documento.
El o los dispositivos de entrada 2350 pueden ser un dispositivo de entrada tactil, tal como un teclado, raton, pen o bola rastreadora, un dispositivo de entrada de voz, un dispositivo de obtencion de imagenes u otro dispositivo que proporcione una entrada al sistema computacional 2300. Para la codificacion de video, el/los dispositivo(s) de entrada (2350) puede(n) ser una camara, tarjeta de video, tarjeta sintonizadora de TV o dispositivo similar que acepte la entrada de video en forma analogica o digital, o un CD-ROM o CD-RW que lea muestras de video en el sistema computacional 2300. El o los dispositivos de salida (2360) pueden ser una pantalla, impresora, altavoz, grabadora de CD u otro dispositivo que proporcione una salida desde el sistema computacional 2300.
La o las conexiones de comunicacion (2370) posibilitan la comunicacion a traves de un medio de comunicacion a otra entidad computacional. El medio de comunicacion transmite informacion, tal como instrucciones ejecutables por ordenador, entrada o salida de audio o video u otros datos en una senal de datos modulada. Una senal de datos modulada es una senal que tiene una o mas de sus caracteristicas ajustadas o cambiadas de tal manera que se codifica informacion en la senal. A modo de ejemplo, y sin limitacion, los medios de comunicacion pueden usar un vehiculo electrico, optico, de RF u otro.
Las innovaciones se pueden describir en el contexto general de los medios legibles por ordenador. Los medios legibles por ordenador son cualquier medio tangible al que se pueda acceder dentro un entorno computacional. A modo de ejemplo, y sin limitacion, con el sistema computacional 2300, los medios legibles por ordenador incluyen la memoria 2320, 2325, el almacenamiento 2340 y combinaciones de cualquiera de los anteriores.
Las innovaciones se pueden describir en el contexto general de las instrucciones ejecutables por ordenador, tal como las incluidas en los modulos de programa, que se ejecutan en un sistema computacional en un procesador real o virtual de destino. En general, los modulos de programa incluyen rutinas, programas, bibliotecas, objetos, clases, componentes, estructuras de datos, etc. que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. La funcionalidad de los modulos de programa se puede combinar o dividir entre modulos de programa segun se desee en diversos modos de realizacion. Las instrucciones ejecutables por ordenador para los modulos de programa se pueden ejecutar dentro de un sistema computacional local o distribuido.
Los terminos “sistema” y “dispositivo” se usan indistintamente en el presente documento. A menos que el contexto indique claramente de otro modo, ningun termino implica ninguna limitacion sobre un tipo de sistema computacional o dispositivo computacional. En general, un sistema computacional o dispositivo computacional puede ser local o distribuido, y puede incluir cualquier combinacion de hardware para uso especial y/o hardware para uso general con software que implementa la funcionalidad descrita en el presente documento.
Por razones de presentacion, la descripcion detallada usa terminos como “determinar” y “usar” para describir las operaciones de ordenador en un sistema computacional. Estos terminos son abstracciones de alto nivel para las operaciones realizadas por un ordenador y no se deben confundir con actos realizados por un ser humano. Las operaciones de ordenador reales correspondientes a estos terminos varian dependiendo de la implementacion.
Medios legibles por ordenador
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Cualquiera de los medios legibles por ordenador del presente documento puede ser no transitorio (por ejemplo, memoria, almacenamiento magnetico, almacenamiento optico o similar).
Cualquiera de las acciones de almacenamiento descritas en el presente documento se puede implementar almacenando en uno o mas medios legibles por ordenador (por ejemplo, medios de almacenamiento legibles por ordenador u otros medios tangibles).
Cualquiera de las cosas descritas como almacenadas se puede almacenar en uno o mas medios legibles por ordenador (por ejemplo, medios de almacenamiento legibles por ordenador u otros medios tangibles).
Cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento se puede implementar mediante instrucciones ejecutables por ordenador en (por ejemplo, codificadas en) uno o mas medios legibles por ordenador (por ejemplo, medios de almacenamiento legibles por ordenador u otros medios tangibles). Dichas instrucciones pueden hacer que un ordenador realice el procedimiento. Las tecnologias descritas en el presente documento se pueden implementar en una variedad de lenguajes de programacion.
Procedimientos en dispositivos de almacenamiento legibles por ordenador
Cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento se puede implementar mediante instrucciones ejecutables por ordenador almacenadas en uno o mas dispositivos de almacenamiento legibles por ordenador (por ejemplo, memoria, almacenamiento magnetico, almacenamiento optico o similar) Dichas instrucciones pueden hacer que un ordenador realice el procedimiento.
Implementacion del riesgo de recidiva de cancer de mama en estadio temprano ejemplar y resultados
Este ejemplo describe procedimientos usados para predecir el riesgo de recidiva de cancer de mama en estadio temprano.
Muestras de cancer de mama de aproximadamente 20 pacientes se marcaron con anticuerpos especificos para ER, PR, HER2 y Ki-67.
Se formaron imagenes de estas muestras marcadas resultantes en portaobjetos de microscopio usando patologia digital. Se seleccionaron tres FOV para cada uno de ER, PR, HER2 y Ki-67. Se uso un software para cuantificar la tincion celular en porcentaje (por ejemplo, positividad en porcentaje) y la intensidad para cada FOV. De esta manera, se determino la positividad en porcentaje. Ademas, se determinaron tres medidas diferentes de heterogeneidad basandose en la variabilidad de las intensidades y la tincion celular en porcentaje para los tres FOV.
La tincion celular en porcentaje e intensidad resultantes para cada FOV para cada uno de ER, PR, HER2 y Ki-67 se promediaron (por ejemplo, se promediaron los FOV para ER). Esto da como resultado un valor de tincion celular en porcentaje y un valor de intensidad para cada uno de ER, PR, HER2 y Ki-67. Estos valores se usaron para calcular la puntuacion IHC4 usando esta formula:
IHC4 = 94,7 x {-0,100 ER10 - 0,079 PR10 + 0,586 HER2 + 0,240 ln (1+ 10 x Ki67)}
Usando la puntuacion IHC4 y los 12 valores de heterogeneidad (uno para cada uno de los tres FOV para cada uno de ER, PR, HER2 y Ki-67), se modelizaron cada una de las medidas de heterogeneidad y la puntuacion IHC4 usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox, que modeliza el tiempo hasta la metastasis a distancia. Las tres medidas de heterogeneidad fueron muy similares, por lo que se uso la primera medida de heterogeneidad para cada uno de los cuatro ensayos.
Usando las cinco variables, la puntuacion IHC4 y una puntuacion de heterogeneidad para cada ensayo (ER, PR, Ki- 67 y HER2), se modelizo la puntuacion IHC4 con cada una de las puntuaciones de heterogeneidad por separado (usando el modelo Cox).
Basandose en los resultados, se determino que la medida de la puntuacion de heterogeneidad para PR fue la mas util para determinar el tiempo hasta la metastasis a distancia, con ER anadiendo un cierto poder predictivo.
Se determino si la relacion entre la puntuacion de heterogeneidad y el riesgo era lineal o no; puesto que hay una suposicion de que cada cambio de unidad en la puntuacion de heterogeneidad da como resultado el mismo incremento en el riesgo de metastasis a distancia. Los datos se transformaron (tomando la raiz cuadrada, log natural, etc.) y la variable transformada se introdujo en el modelo de Cox. Se selecciono la raiz cuadrada, puesto que fue la que mas incremento la capacidad predictiva.
La modificacion final de la medicion de heterogeneidad implico tomar la puntuacion de heterogeneidad (HET)para ER y PR, sumarlas y tomar la raiz cuadrada. Puntuacion de heterogeneidad = raiz cuadrada (HETPR+HETER). La puntuacion de HET resultante y la puntuacion IHC4 se introdujeron en un modelo de riesgos proporcionales de Cox
que toma las dos variables lineales y encuentra la mejor combinacion lineal de las dos para predecir el tiempo hasta la metastasis a distancia. La formula resultante es:
Puntuacion de riesgo de salida = 1,95119*(raiz cuadrada (HETpr+HETer)) + 0,03114*IHC4 5
Como se muestra en la FIG. 24, este procedimiento clasifico con precision una muestra de cancer de mama como una que es mas (evolucion) o menos (sin evolucion) agresiva. Los casos mostrados en la FIG. 24 son los mismos casos usados para crear el algoritmo.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para determinar el pronostico de cancer de mama en un sujeto, que comprende: seleccionar en una muestra de cancer de mama obtenida del sujeto al menos dos campos de vision (FOV) diferentes para cada uno de receptor de estrogenos (ER), receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2), Ki-67 y receptor de progesterona (PR), en el que la muestra se marca de manera detectable con anticuerpos para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR;
    medir la expresion de las proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR en cada uno de los FOV seleccionados;
    determinar una puntuacion inmunohistoquimica (IHC) combinada IHC4, siendo la puntuacion inmunohistoquimica combinada una puntuacion pronostica basada en dichos cuatro marcadores medidos;
    medir la heterogeneidad de proteinas para ER y PR en cada uno de los FOV seleccionados;
    determinar una puntuacion de heterogeneidad de proteinas para cada uno de ER y PR, siendo la puntuacion de heterogeneidad de proteinas una indicacion de la cantidad de heterogeneidad de la expresion de proteinas de un biomarcador particular en FOV diferentes;
    combinar las puntuaciones de heterogeneidad de proteinas y la puntuacion IHC combinada, generando asi una puntuacion de pronostico de salida; y
    determinar que el cancer de mama en el sujeto es probable que sea agresivo si la puntuacion de pronostico de salida alcanza un valor umbral o determinar que el cancer de mama en el sujeto es improbable que sea agresivo si la puntuacion de pronostico de salida no alcanza el valor umbral.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la muestra de cancer de mama es una muestra de cancer de mama en estadio temprano.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que la muestra de cancer de mama en estadio temprano es negativa para HER2, positiva para ER y con ganglios linfaticos negativos.
  4. 4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el procedimiento determina un riesgo de recidiva de cancer de mama a 5 anos.
  5. 5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente obtener una imagen digitalizada de la muestra de cancer de mama que se marca de manera detectable para cada uno de ER, HER2, Ki- 67 y PR.
  6. 6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que medir la expresion de proteinas ER, HER2, Ki-67 y PR comprende determinar:
    la positividad en porcentaje para cada uno de ER, Ki-67 y PR; la puntuacion en intervalos de clase para HER2; y la puntuacion H para ER.
  7. 7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que determinar una puntuacion IHC combinada comprende usar la formula IHC4 = 94,7 x {-0,100 ER10 - 0,079 PR10 + 0,586 HER2 + 0,240 In (1 + 10 x Ki67)}, en la que ER10 es la puntuacion H para ER, en la que PR10 es una puntuacion de positividad en porcentaje ajustada para PR, en la que HER2 es la puntuacion en intervalos de clase para HER2 y Ki67 es la positividad en porcentaje para Ki-67.
  8. 8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que medir la heterogeneidad de proteinas para ER, HER2, Ki-67 y PR comprende determinar una metrica de variabilidad (VM) para cada uno de ER, HER2, Ki-67 y PR, en la que VM = STD(PP(FSi), PP(FS2). ...PP(FSn)), y PP(FS) es una positividad en porcentaje para cada campo de vision, Fs.
  9. 9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que determinar una puntuacion de heterogeneidad de proteinas para cada uno de ER y PR comprende usar la formula
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    25
    S < 10 %
    0,05 .
    m , ,
    de otro modo
    en la que
  10. 10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que determinar una puntuacion de heterogeneidad de protemas para HER2 comprende usar la formula
    imagen1
    en la que P es una puntuacion en intervalos de clase para cada campo de vision,
  11. 11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que generar una puntuacion de pronostico de salida comprende usar la formula:
    puntuacion de pronostico de salida = (coeficiente inmunohistoqmmico combinado)*IHC4 + (coeficiente de heterogeneidad)*puntuacion de heterogeneidad combinada, en la que la puntuacion de heterogeneidad combinada es igual a la rafz cuadrada (puntuacion de heterogeneidad para ER + puntuacion de heterogeneidad para PR).
  12. 12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que:
    el coeficiente inmunohistoqmmico combinado es igual a 0,03114; y el coeficiente de heterogeneidad es igual a 1,95119.
  13. 13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que una o mas de las etapas se realizan mediante un ordenador programado adecuadamente.
  14. 14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la seleccion de al menos dos FOV diferentes en una muestra de cancer de mama es realizada por un patologo.
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