CN113293214A - 一种检测神经母细胞瘤复发转移基因wnt2扩增的引物探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的引物探针及其应用，所述引物探针序列分别目的基因上游引物序列WNT2‑F：SEQ ID No:1 5’‑GCGTGGACTTACCACCATGA‑3’、目的基因下游引物序列WNT2‑R SEQ ID No:2 5’‑CTCTCGGTGGAATCTGGCTC‑3’、目的基因探针序列WNT2‑P：SEQ ID No:3 5’‑FAM‑TGACCTCGGGGGTGAGCCAGGTCA‑BHQ1‑3’、内参基因上游引物序列EFTUD2‑F：SEQ ID No:4 5’‑CTCAAAGTGCGGGGACTGAT‑3’、内参基因下游引物序列EFTUD2‑R：SEQ ID No:5 5’‑GGCATCAGGGTGACTCCAAA‑3’、内参基因探针序列EFTUD2‑P：SEQ ID No:6 5’‑HEX‑AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT‑BHQ1‑3’。上述引物探针用于数字PCR试剂盒。本发明试剂盒能快速、特异、灵敏地检测WNT2基因扩增，该试剂盒一步法扩增方法简单、成本低廉，非常适用于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA等各种样本中的基因拷贝数变异情况，适合大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤分子检测技术领域，具体涉及一种检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的引物探针及其应用。
背景技术
神经母细胞瘤(GBM)已被世界卫生组织指定为IV级癌症，是成人中最常见和致命的CNS肿瘤。目前，针对GBM患者的标准治疗包括最大程度的手术切除，然后同时进行放疗和化疗。Temozolomide(Temodal)是一种DNA烷基化剂，是最常用的化学治疗剂。尽管有这些疗法，大多数患者最终还是复发了。因此，迫切临床需要开发有效的抗GBM治疗剂。
GBM患者的预后普遍较差。GBM肿瘤具有高度异质性。另一方面，GBM似乎也具有细胞层次结构，因此存在一个GBM细胞亚群，该亚群富含肿瘤发生和扩散的能力，这些细胞驱动肿瘤的生长和治疗耐药性。大量研究表明，WNT信号在GBM中被异常激活，并且它通过维持干细胞特性来促进GBM的生长和侵袭。WNT蛋白是一类高度保守的分泌信号分子。自1982年在小鼠乳腺癌模型中发现WNT信号作为致癌基因以来，已有30种WNT信号作为细胞间相互作用，细胞命运决定和迁移的关键调节剂出现。WNT途径成分的突变会导致特定的发育缺陷，而异常的WNT信号传导往往会导致癌症。WNT配体分子与受体结合之后，可激活下游通路，导致转录因子β-Catenin稳定并转入细胞核，最终通过转录调控调节众多靶基因的表达。WNT2是GBM的一个重要靶点，它的扩增可能成为GBM诊断和预后的重要指标。
数字PCR是近十年来兴起的第三代PCR技术，主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，每个反应室或不含待检核酸靶分子，或含有至少一个待检核酸靶分子，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列。经PCR扩增后，分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为”1”，没有荧光信号的微滴判读为”0”，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例给出待检靶分子的拷贝数浓度。数字PCR定量的结果不再依赖于Ct值而直接给出靶序列的起始拷贝数浓度，具有精准、超灵敏度和不易受PCR抑制物影响等优点，能够检测低丰度的肿瘤DNA变异，降低假阴性结果，特别适应于液体活检领域(例如循环肿瘤细胞CTC或循环肿瘤DNA)。因此，开发相关利用数字PCR技术对神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增检测，有利于病程动态跟踪和药物预后监控，大幅度减轻因用药不及时或过度治疗给患者造成的健康损害及对个人、家庭及国家医疗保健体系造成的经济压力和负担，对经济、社会和科技发展有巨大的利益。
发明内容
本发明目的是提供基于数字PCR技术检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的引物探针及其应用，为实现本发明目的，使用如下的技术方案：
一种基于数字PCR技术检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的引物探针，所述数字PCR引物探针由具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物探针组成，序列为：
目的基因上游引物序列WNT2-F：5’-GCGTGGACTTACCACCATGA-3’SEQ ID NO:1、
目的基因下游引物序列WNT2-R：5’-CTCTCGGTGGAATCTGGCTC-3’SEQ ID NO:2、
目的基因探针序列WNT2-P：5’-FAM-TGACCTCGGGGGTGAGCCAGGTCA-BHQ1-3’SEQ IDNO:3、
内参基因上游引物序列EFTUD2-F：5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’SEQ ID NO:4、
内参基因下游引物序列EFTUD2-R：5’-GGCATCAGGGTGACTCCAAA-3’SEQ ID NO:5
内参基因探针序列EFTUD2-P：5’-HEX-AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT-BHQ1-3’SEQID NO:6。
优选的，所述的目的基因引物探针是依据人基因WNT2的基因编码区域设计的，内参基因引物探针是依据人EFTUD2基因区域设计的，扩增的目的片段大小分别为85bp和109bp，扩增序列(102bp)为：
5’-GCGTGGACTTACCACCATGAAGAGTTGACCTCGGGGGTGAGCCAGGTCAAGAGCAGAGGGAGCCAGAGCCAGATTCCACCGAGAG-3’、
扩增序列(109bp)为：
5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGATTGTTAGCTCTAAAAGCTCTGGCACTATAGATAGTGATAGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCTAGAAGATTTGGAGTCACCCTGATGCC-3’。
优选的，所述的数字PCR引物探针在制备检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增检测试剂盒的应用。
本发明还提供一种检测WNT2基因扩增的数字PCR试剂盒，包括具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物探针。
试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)配制数字PCR反应液；数字PCR反应液20μl配方为：一步法反应缓冲液4μl，酶混合液2μl，10μM WNT2-F、WNT2-R、EFTUD2-F和EFTUD2-R引物各1.2μl，10μMWNT2-P和EFTUD2-P各0.6μl，待测样品DNA模板为8μl；
(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；反应程序：45℃15min；95℃10min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃15s，55℃20s，72℃20s；每步都设置2℃/sec的升降温速度；
(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。
本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；待测样本结果判定：(1)阳性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；(3)疑似阳性：1.8<目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<2.2。
本发明依据WNT2基因区域设计了一对特异性引物及探针，同时以人EFTUD2基因区域为内参对照设计了一对引物及探针，建立了基于数字PCR技术的检测方法，其优势有：
(1)高灵敏度：检测灵敏度达到10万个正常DNA分子中检测到一个WNT2扩增分子，适合液体活检样本(例如循环肿瘤细胞CTC或循环肿瘤DNA)。
(2)高特异性：本发明针对WNT2基因区域设计的特异性引物探针能特异性检测出WNT2基因的拷贝数变化，不与其他同源基因相互干扰。
(3)可排除复杂样本对实验结果的干扰：不受PCR抑制物的影响，可避免样本复杂性导致的PCR假阴性，适用于体液样本。
附图说明
图1为本发明提供的引物的有效性的实验结果示意图，为WNT2目的基因检测结果，图中孔位由左至右依次为3例WNT2基因拷贝数变异阳性样本，3例WNT2基因拷贝数变异阴性样本，通道1表示FAM通道；
图2为本发明提供的引物的有效性的实验结果示意图，为人EFTUD2内参基因检测结果，图中孔位由左至右依次为3例WNT2基因拷贝数变异阳性样本，3例WNT2基因拷贝数变异阴性样本，通道2表示HEX通道；
图3为本发明提供的引物的灵敏度的实验结果示意图，为WNT2目的基因检测结果，孔位G01～A02为临界浓度阳性样本的检测结果，孔位B02～D02为无模板对照的检测结果，通道1表示FAM通道；
图4为本发明提供的引物的灵敏度的实验结果示意图，为人EFTUD2内参基因检测结果，孔位G01～A02为临界浓度阳性样本的检测结果，孔位B02～D02为无模板对照的检测结果，通道2表示HEX通道。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的特异性引物和探针的设计
以人的WNT2为靶基因，以及人EFTUD2基因为内参基因，进行适用于ddPCR的特异性引物和探针的设计，所述的引物探针序列如下：
目的基因上游引物序列WNT2-F：5’-GCGTGGACTTACCACCATGA-3’SEQ ID NO:1、
目的基因下游引物序列WNT2-R：5’-CTCTCGGTGGAATCTGGCTC-3’SEQ ID NO:2、
目的基因探针序列WNT2-P：5’-FAM-TGACCTCGGGGGTGAGCCAGGTCA-BHQ1-3’SEQ IDNO:3、
内参基因上游引物序列EFTUD2-F：5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’SEQ ID NO:4、
内参基因下游引物序列EFTUD2-R：5’-GGCATCAGGGTGACTCCAAA-3’SEQ ID NO:5、
内参基因探针序列EFTUD2-P：5’-HEX-AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT-BHQ1-3’SEQID NO:6。
实施例2利用数字PCR检测引物和探针对神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的检测
1.血浆游离DNA提取
使用MNG公司生产的NucleoSpin Plasma XS试剂盒(货号：740901.50)对血浆样本进行核酸提取。取240μl血浆，按照提取试剂盒说明书进行核酸提取，最终用20μl洗脱液重悬。
2.数字PCR扩增反应
(1)配制数字PCR反应液；数字PCR反应液20μl配方为：一步法反应缓冲液4μl，酶混合液2μl，10μM WNT2-F、WNT2-R、EFTUD2-F和EFTUD2-R引物各1.2μl，10μMWNT2-P和EFTUD2-P各0.6μl，待测样品DNA模板为8μl；
(2)在微滴PCR的生成芯片上，加入步骤1)中的20μL微滴PCR反应体系，再加入40μL的微滴生成用油，进行微滴生成步骤，完成后将微滴化的反应体系转移至96孔板中，封膜。
(3)将封膜后的96孔板放入PCR仪中进行扩增；反应程序：45℃15min；95℃10min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃15s，55℃20s，72℃20s；每步都设置2℃/sec的升降温速度；
(4)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果(图1-图2)。
(5)检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；待测样本结果判定：(1)阳性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；(3)疑似阳性：1.8<目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<2.2。
表1.不同样本WNT2基因及EFTUD2基因检测结果。
实施例3神经母细胞瘤样本数字PCR引物探针灵敏度实验
本实验采用神经母细胞瘤阳性样品进行梯度稀释。通过实施例2给出的检测方法进行检测。结果显示本体系在0.001％的模板量下，可以检测出区别于无模板对照的拷贝数(图3-图4)。
表2.临界浓度下阳性样本WNT2基因及EFTUD2基因检测结果。
序列表
<110> 深圳华因康基因科技有限公司
<120> 一种检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的引物探针及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gcgtggactt accaccatga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctctcggtgg aatctggctc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tgacctcggg ggtgagccag gtca 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ctcaaagtgc ggggactgat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ggcatcaggg tgactccaaa 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
agcctgcttc ctgggaatgt gctgct 26
Claims (3)
1.一种检测神经母细胞瘤复发转移基因WNT2扩增的引物探针，其特征在于，所述引物探针序列分别为：
目的基因上游引物序列WNT2-F：SEQ ID No:1 5’-GCGTGGACTTACCACCATGA-3’、
目的基因下游引物序列WNT2-R：SEQ ID No:2 5’-CTCTCGGTGGAATCTGGCTC-3’、
目的基因探针序列WNT2-P：SEQ ID No:3 5’-FAM-TGACCTCGGGGGTGAGCCAGGTCA-BHQ1-3’、
内参基因上游引物序列EFTUD2-F：SEQ ID No:4 5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’、
内参基因下游引物序列EFTUD2-R：SEQ ID No:5 5’-GGCATCAGGGTGACTCCAAA-3’、
内参基因探针序列EFTUD2-P：SEQ ID No:6 5’-HEX-AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的引物探针，其特征在于，所述的引物探针序列SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO:3是根据人WNT2基因编码区域进行设计，扩增的目的片段大小为85bp，SEQ IDNO:4 ~SEQ ID NO:6是根据人EFTUD2基因区域进行设计，扩增的目的片段大小为109bp。
3.权利要求1-2的所述的引物探针在制备检测WNT2基因扩增的数字PCR试剂盒中的应用。
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