CN102380099A - Wnt2在制备抑制食管癌的药物的应用 - Google Patents

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付利
李焱
张春玉
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本发明提供了Wnt2基因在制备抑制食管癌的药物的应用，并提供了一种抑制食管癌发生发展的药物，所述药物包含抑制Wnt2基因或/和Wnt2蛋白的作用的成分。所述成分包含能封闭Wnt2基因的多肽类物质、能封闭Wnt2的抗体/配体、能阻抑或杀伤Wnt2的抗体/配体携带的杀伤性药物或核酸物质、能干扰/阻断Wnt2基因的小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA中的一种或多种。本发明的有益效果是提供了Wnt2基因在制备抑制食管癌的药物的应用，通过沉默或者抗体中和作用，阻断WNT2激活肿瘤细胞内WNT信号传导通路，从而达到抑制肿瘤生长的治疗作用。

Description

Wnt2在制备抑制食管癌的药物的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及Wnt2在制备抑制食管癌的药物的应用。
背景技术
诸多证据已经揭示出由非癌细胞和它们的间质所组成的肿瘤微环境，在癌症的发展和进程中发挥着重要的作用。我们以前的研究已经阐明了许多基因在食管癌成纤维细胞中，与它们相邻的癌旁组织成纤维细胞相比，会发生下调表达。大约43％(126/292)的下调基因与细胞增殖，细胞外基质重塑和免疫应答有关。很显然，Wnt通路中的若干成员，包括WNT2，WNT5A，LEF1以及WISP1，在肿瘤成纤维细胞中上调，意味着Wnt信号通路在食管癌中可能能参与肿瘤与间质之间的相互作用。
Wnt2蛋白是分泌性配体蛋白(大小约为40KDa)，通过在靶细胞内激活多种信号级联反应，发挥旁分泌的作用。Wnt信号通路主要分成三大支路。研究最透彻的是经典通路，它通过稳定细胞核中的β-catenin，以此来激活靶基因。Wnt蛋白能够通过激活钙调蛋白激酶II和蛋白激酶C(被称作Wnt/Ca2+通路)，以此来发挥传导作用，它还能够参与增加细胞内Ca2+浓度，或者Jun N-terminal激酶(被称作平面细胞极性通路)，它能够控制细胞骨架重排和细胞极性。经典的Wnt通路在癌症的发展中是最常见的Wnt信号通路。Wnt2基因位于染色体7q31.3位置上，，在胎儿肺中高表达，胎盘中低表达。Blasband et al.已经证明了Wnt2的高表达能够通过β-catenin通路，促进鼠细胞系C57MG的上皮细胞转化，表现了Wnt2的促癌功能。
当一些由间质分泌的Wnt配体和由上皮表达的同源受体共同存在时，Wnt蛋白是介导肿瘤与间质之间相互作用的良好中间体。我们以前的研究也已经证实了Wnt2是来源于原发性食管癌的肿瘤相关成纤维细胞高表达的WNT基因中的一员。但目前还没有报道肿瘤成纤维细胞分泌的Wnt2在食管癌的肿瘤发展中的作用。
发明内容
本发明的目的是利用Wnt2能够通过激活Wnt2/β-catenin信号通路，对食管癌细胞发挥着促进生长和侵袭的作用，而提供Wnt2基因在制备抑制食管癌的药物的应用，达到抑制肿瘤生长的治疗作用。
为实现上述目的，采用如下的技术方案：
本发明提供了Wnt2基因在制备抑制食管癌的药物的应用。
本发明提供了一种抑制食管癌发生发展的药物，所述药物包含抑制Wnt2基因或/和Wnt2蛋白的作用的成分。
所述成分包含能封闭Wnt2基因的多肽类物质、能封闭Wnt2的抗体/配体、能阻抑或杀伤Wnt2的抗体/配体携带的杀伤性药物或核酸物质、能干扰/阻断Wnt2基因的小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA中的一种或多种。
本发明的有益效果是提供了Wnt2基因在制备抑制食管癌的药物的应用，通过沉默或者抗体中和作用，阻断WNT2激活肿瘤细胞内WNT信号传导通路，从而达到抑制肿瘤生长的治疗作用。
附图说明
图1是用定量PCR(qPCR)比较10例食管癌肿瘤成纤维细胞和癌旁正常成纤维细胞之间的Wnt2表达水平的实验结果图；图1A是WNT2的表达水平的统计分析；图1B是Wnt2蛋白在肿瘤成纤维细胞中与正常成纤维细胞表达量比较的免疫印迹图；图1C是在所有已试验的食管癌细胞系中检测Wnt2蛋白的表达的实验结果图；
图2是应用免疫组织化学的方法检测51例原发性食管癌标本中Wnt2的表达细胞的实验结果图；图2A是Wnt2表达阳性的细胞在原发性食管癌中的分布的实验结果图；图2B和2C是免疫荧光染色证明Wnt2和Vimentin在同一细胞中共同表达的实验结果图；
图3是应用Log-rank检验，比较Wnt2表达阴性的患者与Wnt2表达阳性的食管癌患者的生存时间结果分析图；
图4是Wnt2条件培养基的建立及Wnt2对细胞生长的作用的相关实验结果图；图4A为Wnt2条件培养基的建立的过程示意图；图4B为mRNA和蛋白质水平证明Wnt2表达的实验结果图；图4C是食管癌细胞系KYSE30在含有Wnt2的条件培养基及不含Wnt2的条件培养基中的生长速率比较图；图4D是食管癌细胞系EC109在含有Wnt2的条件培养基及不含Wnt2的条件培养基中的生长速率比较图；
图5是KYSE30细胞β-catenin的核易位观察相关实验结果图；图5A是KYSE30细胞β-catenin的核易位观察实验结果图；图5B是应用实时定量PCR方法研究β-catenin的核易位能否上调下游靶基因的表达的实验结果图；图5C是应用蛋白质免疫印迹方法检测cyclin D1和c-myc的蛋白表达水平的实验结果图；
图6是EC109细胞β-catenin的核易位相关实验结果图；图6A是EC109细胞β-catenin的核易位观察实验结果图，图6B是cyclin D1和c-myc的蛋白质表达水平检测的实验结果图，图6C是cyclin D1和c-myc的mRNA表达水平检测的实验结果图；
图7是细胞迁移和侵袭检测相关实验结果图；图7A是有/无Wnt2时，食管癌细胞的动运迁移性比较结果图；图7B是每视野侵袭细胞数实验结果图；图7C是有/无Wnt2时的蛋白表达量比较结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除非另外指明，本发明的实验将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。除非另外说明，本发明中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。
实施例1：定量PCR(qPCR)用来比较10例食管癌肿瘤成纤维细胞和癌旁正常成纤维细胞之间的Wnt2表达水平
本实施例中所用到的细胞系与原发性食管癌标本的来源等情况如下所述：两株中国食管癌细胞系(EC18和EC109)由Tsao GS教授(香港大学解剖系)慷慨提供。五株日本食管癌细胞系(KYSE30，KYSE140，KYSE180，KYSE410，KYSE510)从DSMZ(Braunschweig，Germany)，德国生物材料资源中心获得。中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)从美国Type Culture Collection(Manassas，VA)购买。原发性食管癌组织和它们相应的癌旁食管组织在中山大学肿瘤防治中心，经外科手术切除后立即收集。总共51例经福尔马林固定和石蜡包埋的食管癌组织由中山大学肿瘤防治中心慷慨提供。所有患者均未接受过术前治疗。本次研究中所使用的临床标本已经获得中山大学研究伦理审核委员会的批准。
实时定量PCR(qPCR)和半定量RT-PCR的操作方法及条件如下：用Trizol(Invitrogen)试剂提取总RNA。按照制造商提供的标准说明，应用AdvantageRT-for-PCR试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA)合成cDNA，总RNA用量为2μg。AmpliTaq(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行半定量RT-PCR。GAPDH作为对照。对于qPCR应用，使用SYBR Green PCR试剂盒(Applied Biosystems)扩增cDNA产物。扩增反应包括95℃孵育15秒，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共40个循环反应。应用ABI PRISM 7900HT序列检测系统对反产物进行定量检测。以CT法(ΔΔCT法)计算基因的相对表达水平。管家基因GAPDH作为内参照。
免疫印迹分析的步骤和条件如下：按照标准说明进行蛋白质免疫印迹，抗体分别为兔抗Wnt2(R&D Systems，Minneapolis，MN；1∶400)，兔抗cyclin D1，c-myc，α-catenin，β-catenin(Cell Signaling Technology；1∶1000)和鼠抗E-cadherin，α-SMA，Vimentin，β-actin(Santa Cruz Biotechnology；1∶2000)。
统计学分析方法如下：应用SPSS13.0统计学分析软件对实验结果进行分析。计量资料数据以至少三次独立平行实验的均值±标准差表示。t检验检测不同数据的组间差异，应用Fisher’s精确检验分析Wnt2的表达与临床病理数据之间的相关性。特殊疾病生存从诊断之日一直到与癌症有关的死亡或者是最后随访日期。应用Kaplan-Meier和Log-rank检验比较生存差异，以P＜0.05判定显著性差异。
结果见图1，图1是用定量PCR(qPCR)比较10例食管癌肿瘤成纤维细胞和癌旁正常成纤维细胞之间的Wnt2表达水平的实验结果图；图1A是WNT2的表达水平的统计分析，结果表明统计分析WNT2的表达水平有显著性差异(P＜0.05，独立student’s t检验)，结果表明，Wnt2在肿瘤成纤维细胞中比正常成纤维细胞表达水平高4倍。图1B是Wnt2蛋白在肿瘤成纤维细胞中与正常成纤维细胞表达量比较的免疫印迹图；免疫印迹证明Wnt2蛋白在肿瘤成纤维细胞中比正常成纤维细胞表达量高。图1C是在所有已试验的食管癌细胞系中检测Wnt2蛋白的表达的实验结果图，该图显示，在所有已试验的食管癌细胞系中均未检测到Wnt2蛋白的表达。
实施例2：免疫组织化学方法检测Wnt2表达阳性的细胞在原发性食管癌中的分布
为了进一步研究Wnt2(+)细胞在食管癌中的分布，应用免疫组织化学的方法来检测51例原发性食管癌标本中Wnt2的表达细胞。免疫组织化学的步骤如下：使用标准的链霉亲和素-生物素-过氧化酶方法进行免疫组织化学。简略地说，将石蜡包埋的食管癌组织标本进行脱蜡，10％的正常兔血清封闭10分钟，兔抗人Wnt2多克隆抗体(MBL，1∶150稀释)4℃孵育过夜。玻片应用生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白，按照1∶100的浓度，37℃孵育30分钟。三名事先并不知悉患者临床病理数据的独立研究员对胞浆分泌的Wnt2的染色状态进行评估。肿瘤组织的间质部分能够检测到Wnt2的阳性表达，而且主要位于胞浆中。本次研究中，在20×放大倍数下，单个视野有5个或5个以上Wnt2表达阳性的细胞定义为阳性结果。
免疫荧光染色的步骤如下：将细胞接种在事先预铺有明胶的盖玻片上，置于条件培养基中培养若干个时间点，接着用4％的多聚甲醛室温固定20分钟。加入PBS-B溶液，37℃封闭细胞30分钟以去除非特异性染色，加入抗β-catenin鼠单抗隆抗体染色，4℃孵育过夜。PBS洗涤若干次，按照最适浓度，加入FITC标记的羊抗鼠二抗(eBioscience，San Diego，CA)，室温孵育1小时。最后加入DAPI复染，置于荧光显微镜下观察结果并拍照。对于免疫荧光双染，石蜡包埋的食管癌组织同时用鼠抗Vimentin和兔抗Wnt2，37℃孵育过夜。简单地洗涤后，玻片用FITC标记的羊抗鼠(eBioscience)和Texas-red羊抗兔(eBioscience)二抗室温孵育1小时。简单地洗涤后，最后加入DAPI复染。
结果见图2，图2是应用免疫组织化学的方法检测51例原发性食管癌标本中Wnt2的表达细胞的实验结果图；图2A是Wnt2表达阳性的细胞在原发性食管癌中的分布的实验结果图；由图2A可见，Wnt2(+)细胞在癌旁组织中几乎未检测到，在51例食管癌组织标本中，Wnt2(+)细胞能够在42例中检测到，阳性率为82.4％。Wnt2(+)细胞主要位于间质与肿瘤组织之间的交界部分，癌巢之间的间质，分散在肿瘤组织中。图2B和2C是免疫荧光染色证明Wnt2和Vimentin在同一细胞中共同表达的实验结果图；其中，绿色：Vimentin；红：Wnt2，该图显示，表达Wnt2(+)细胞的是成纤维细胞(图2B和C)。200倍的放大倍数下，5个或5个以上Wnt2(+)细胞定义为食管癌组织Wnt2表达阳性。本次研究中，51例食管癌标本可检测到22例阳性结果，阳性率为43.1％。
实施例3：食管癌患者预后与Wnt2表达阳性之间的相关性
本实施例进行了51例食管癌患者临床病理特征与Wnt2阳性表达之间的相关性研究。结果显示，食管癌患者Wnt2(+)与TNM分期(P＝0.001，Fisher’s精确检验)和淋巴结转移(P＝0.001，Fisher’s精确检验)显著相关；具体见表1，表1为51例食管癌标本Wnt2表达阳性与临床病理特征之间的相关性分析数据。进一步地分析，应用Log-rank检验发现，与Wnt2表达阴性的患者相比，Wnt2表达阳性的食管癌患者的生存时间缩短。(中位生存时间为51月；P＜0.0001；)，结果分析图见图3，图3是应用Log-rank检验，比较Wnt2表达阴性的患者与Wnt2表达阳性的食管癌患者的生存时间结果分析图。
表1
Figure BDA0000068561850000081
*P＜0.05(Fisher’s精确检验).
实施例4：Wnt2条件培养基的建立及Wnt2对细胞生长的作用的相关实验
肿瘤成纤维细胞和它们相应的癌旁成纤维细胞已经从原发性食管癌组织中分离出来。简要地说，新鲜收集的食管癌肿瘤组织和它们相应的癌旁组织在无菌的PBS溶液中被切割成尽可能小的块状。接着用胶原酶消化，用20μm无菌筛网过滤细胞悬浮液，收集得到单细胞悬液，再经过离心，洗涤，然后用5毫升含20％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，最后接种到6厘米组织培养皿中。37℃培养箱中孵育30分钟后，将未贴壁的细胞(主要是肿瘤细胞)移除，从而获得完全成纤维细胞。贴壁的成纤维细胞继续传代培养，用于后续实验。
质粒的构建和转染
使用PCR方法扩增WNT2基因，然后克隆到pcDNA3.1/V5-His TOPOTA(Invitrogen，Carlsbad，CA)载体上，按照制造商的说明，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染CHO细胞，筛选稳定表达Wnt2的阳性克隆。同时转染空载体作为阴性对照。
条件培养基(CM)的制备
应用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养稳定表达Wnt2的CHO-Wnt2细胞和空载体细胞(CHO-Vec)直到长至70％的聚合度。然后完全移除正常培养基，用含3％胎牛血清的DMEM继续培养CHO-Wnt2和CHO-Vec细胞24小时，收集培养基。1000g，离心30分钟，收集上清液作为条件培养基用于后续实验。
细胞增殖检测
为了检测Wnt2的分泌对细胞生长的作用，分别将KYSE30，EC109以每孔2×103数接种到96孔细胞培养板上。经过24小时培养后，用含有Wnt2的条件培养基，替换正常培养基，不含有Wnt2的条件培养基作为对照。根据XTT kit(Sigma，St.Louis，MO)制造商的说明，检测细胞的增殖率。
具体结果如下：
Wnt2条件培养基的建立
为了进一步研究Wnt2对食管癌细胞的影响，应用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)建立体外Wnt2分泌体系。简略地说，Wnt2表达质粒稳定转染进CHO细胞，同时设立空载体作为对照。即CHO-Wnt2和CHO-V。经过在含3％胎牛血清的DMEM培养基中培养24小时后，收集培养基作为条件培养基以用于后续研究(见图4A，图4A为Wnt2条件培养基的建立的过程示意图)。mRNA和蛋白质水平已经证明Wnt2的表达，从CHO-Wnt2中也能检测出有分泌性Wnt2存在，结果见图4B，图4B为mRNA和蛋白质水平证明Wnt2表达的实验结果图。
为了分析Wnt2对细胞生长的作用，食管癌细胞系(KYSE30和EC109)在含有Wnt2的条件培养基中培养4天，不含Wnt2的条件培养基作为对照。图4C是食管癌细胞系KYSE30在含有Wnt2的条件培养基及不含Wnt2的条件培养基中的生长速率比较图；图4D是食管癌细胞系EC109在含有Wnt2的条件培养基及不含Wnt2的条件培养基中的生长速率比较图；结果发现食管癌在Wnt2的培养基中生长速率高于不含有Wnt2培养基的食管癌细胞。
实施例5：KYSE30细胞β-catenin的核易位观察相关实验
为了研究KYSE30细胞β-catenin的核易位情况，进行了相关实验；图5是KYSE30细胞β-catenin的核易位相关实验结果图。
未加入含有Wnt2的条件培养基之前，β-catenin主要位于KYSE30的细胞膜上。当加入含Wnt2的条件培养基1小时后，细胞膜上的β-catenin开始进入胞浆中。2小时后，β-catenin已经进入到细胞核中。6小时后，β-catenin又重新回到了细胞膜上。正如所预计的，在不含Wnt2的对照条件培养基中，并未观察到KYSE30细胞β-catenin的核易位(图5A，图5A是KYSE30细胞β-catenin的核易位观察实验结果图)。为了研究β-catenin的核易位能否上调下游靶基因的表达，应用实时定量PCR和免疫印迹的方法，比较含有Wnt2的条件培养基和不含有Wnt2的条件培养基，KYSE30细胞内，cyclin D1和c-myc在mRNA和蛋白质水平的表达情况。定量PCR的结果显示CCND1和MYC在含有Wnt2的条件培养基中表达量增加。2小时后，CCND1和MYC的表达量明显增加。4小时后，CCND1和MYC表达水平下降到未加入Wnt2条件培养基时的水平(图5B；图5B是应用实时定量PCR方法研究β-catenin的核易位能否上调下游靶基因的表达的实验结果图)。
相应地，应用蛋白质免疫印迹方法(图5C)，根据β-catenin核易位的变化，检测cyclin D1和c-myc的蛋白表达水平。经过含有Wnt2条件培养基的处理，在2小时，4小时cyclin D1和c-myc蛋白表达水平升高；见图5C，图5C是应用蛋白质免疫印迹方法检测cyclin D1和c-myc的蛋白表达水平的实验结果图。为了进一步证明Wnt2对β-catenin核易位以及cyclin D1和c-myc上调的作用，EC109细胞也经过与KYSE30同样过程的处理，β-catenin也能发生核易位，cyclinD1和c-myc的mRNA和蛋白质表达水平升高，结果见图6，图6是EC109细胞β-catenin的核易位相关实验结果图；图6A是EC109细胞β-catenin的核易位观察实验结果图，图6B是cyclin D1和c-myc的蛋白质表达水平检测的实验结果图，图6C是cyclin D1和c-myc的mRNA表达水平检测的实验结果图。
实施例6：细胞迁移和侵袭检测
细胞迁移检测，当KYSE30和EC109分别生长到足够的聚合度时，用无菌吸头在单层细上划一条直线。用PBS冲洗细胞，将含有Wnt2的条件培养基加入到培养皿中，孵育72小时。同时将不含有Wnt2的条件培养基设为对照。细胞的运动迁移能力依据划痕愈合的时间来判定，在0到72小时内选择不同的时间点在倒置显微镜中观察划痕愈合情况，随即选取三个视野进行拍照。
细胞侵袭检测，将KYSE30和EC109细胞饥饿24小时，计数细胞，将5×104细胞悬浮于0.5毫升无血清的培养基中，然后接种到预先铺有Matrigel(BDBiosciences)的上层小室，下层小室分别加入含有Wnt2和不含有Wnt2条件培养基。48小时后，侵袭细胞经过固定，染色，置于显微镜下计数。分别进行三次独立平行实验验证迁移和侵袭能力。
结果见图7，图7是细胞迁移和侵袭检测相关实验结果图。Wnt2通过诱导上皮-间质转化(EMT)增强细胞的运动性和侵袭性，相关性分析已经证明了Wnt2的阳性表达与食管癌转移有密切的联系。通过划痕实验和侵袭实验，进一步分析Wnt2的转移作用。在划痕实验中，经过24小时培养，KYSE30和EC109细胞在加入含有/无Wnt2条件培养基，可见明显差异。
图7A是有/无Wnt2时，食管癌细胞的运动迁移性比较结果图；图7A所示，经过72小时培养，与无Wnt2相比，Wnt2能够极大地增强食管癌细胞的动运迁移性。接着，我们计算了食管癌细胞通过Matrigel的能力，KYSE30和EC109细胞分别增加侵袭性53％，75％，结果见图7B，图7B是每视野侵袭细胞数实验结果图。
为了研究Wnt2对细胞迁移和侵袭的影响是否与EMT有关，若干个上皮标记物(α-catenin，β-catenin，E-cadherin)和间质标记物(α-SMA和vimentin)，通过蛋白质免疫印迹方法，在6小时的时间点上，比较有/无Wnt2时的蛋白表达量，结果见图7C，图7C是有/无Wnt2时的蛋白表达量比较结果图。图7C显示，除了E-cadherin在EC109细胞上表达缺失外，所有应检测的上皮标记物均发生明显下调，同时间质标记物均发生明显上调。这些结果证明了Wnt2通过EMT途径增强细胞的迁移性和侵袭性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.Wnt2基因在制备抑制食管癌的药物的应用。
2.一种抑制食管癌发生发展的药物，其特征在于，所述药物包含抑制Wnt2基因或/和Wnt2蛋白的作用的成分。
3.根据权利要求2所述的一种抑制食管癌发生发展的药物，其特征在于，所述成分包含能封闭Wnt2基因的多肽类物质、能封闭Wnt2的抗体/配体、能阻抑或杀伤Wnt2的抗体/配体携带的杀伤性药物或核酸物质、能干扰/阻断Wnt2基因的小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA中的一种或多种。
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