CN101421398A - 以双螺旋寡核酸干扰mRNA作为有效的抗癌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明是应用双螺旋寡核酸(siRNA)干扰与癌化有关的基因的mRNA,特别是Wnt1、Wnt2或Her3基因。这样的寡核酸可进行化学修饰,使用在与病毒性和非病毒性载体相接合,例如脂质复合物。这样的寡核酸显示出不凡的抗肿瘤细胞的抗增殖特性,因此可应用在抗癌治疗。
Description
技术领域
本发明是提供一种应用双股寡核酸(oligonucleotides)干扰有关癌化(carcinogenesis)基因的mRNA,尤其是指Wnt1,Wnt2或Her3基因,以作为新的抗癌剂(anti-tumour agent)。
背景技术
RNA干扰(RNA interference)是一种以后转录基因沉默化(post-transcriptionalgene silencing,PTGS)为基础的现象,同时也是一种用于分析生物体内许多途径中的功能及角色的绝佳工具。此技术在功能基因体学、对应生化途径、决定药物治疗方向以及基因治疗上都相当重要。后转录基因沉默化(PTGS)第一次描述是在植物上(Napoli,C,C.Lemieux and R.Jorgensen.Introduction of a Chimeric ChalconeSynthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of HomologousGenes in trans.Plant Cell 2:279-289,1990)。在1998年,Andrew Fire及Craig Mello等2人第一次在动物即线虫(C.elegans)上描述RNA干扰(RNAi)(Fire,A.et al.1998.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditiselegans.Nature 391,806-810),长且双股的RNA分子会诱发后转录基因沉默化。然而,在哺乳类细胞上应用核甘酸(nucleotides)也会诱发免疫反应(增加干扰素(interferon)量),以及T.Tuschl,SM.Elbashir等人发现应用短且双股的核甘酸(19-21bp)并不会诱发免疫反应(Elbashir,S.M.,J.Harborth,W.Lendeckel,A.Yalcin,K.Weber and T.Tuschl.2001.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature 411:494-498)。
基因沉默化(Gene silencing)是以双股RNA(dsRNA)分子为基础,也称为siRNA。RNAi是一种对于由双股RNA所诱发的细胞转化反应,会分解掉同源mRNA(homologous mRNA)。甚至有一些双股RNA的副本(copies)会完全破坏掉一细胞中所形成的特定基因的转录本(transcripts)。所选择的mRNA的破坏开始于RNA分解酶III(RNAse III)的活化,使长发夹状双股RNA(dsRNA)或单股RNA(ssRNA)片段断裂为长度为21-23核甘酸的双股小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。siRNA为事先制备可从外部传入细胞内。接下来,siRNA分子与一核酸酶复合物(nuclease complex)结合组成一RNA诱发沉默复合体(RNA inducedsilencing complex,RISC)。由于该RNA诱发沉默复合体中解螺旋酶(helicase)的活性,双股RNA会解开为单股。在形成该单股RNA分子后会黏合至互补mRNA上。后转录基因沉默化的最后步骤为利用RNA诱发沉默复合体的核酸酶(RISCnucleases)来分解所选择的mRNA。与传统方法如抑制(knockouts)相比,基因沉默化在动物以及细胞株模式中均可快速且轻松完成(RNAi机制如图2所示)。
本案发明人已完成深入研究并确认沉默化与癌化有关基因的表达,如Wnt1基因,利用该基因的双股寡核酸(siRNA)加以抑制肿瘤细胞增殖是一相当有效的方法。
Wnt1是一种能与"卷曲"内膜接受器结合并传送一讯号至细胞质磷酸蛋白质(cytoplasmatic phosphoproteins)的分泌蛋白质,其依序抑制肝醣合成酶激酶3Beta型(glycogen synthase kinase 3Beta,GSK-3Beta)(PoIaUs et al,Wnt signaling andcancer,Genes Dew 2000 Aug 1;14(15):1837-51)的持续高活性。该结果显示细胞核中的乙型钙调蛋白(Beta-catenin)量的稳定性及生长性。
而Wnt-1的过度表达在许多种类癌症中已受到注意,包括肺癌、结肠癌和乳癌,以及头部、颈部的肉瘤肿瘤(Katoh et al.Expression and regulation of WNT1 inhuman cancer:up-regulation of WNT1 by beta-estradiolin MCF-7,In J Oncol,2003 Jan;22(1):209-12)。
抗WNT-1单株抗体(Anti-WNT-1monoclonal antibodies)为已知。应用该抗体会增加细胞凋亡、减少肿瘤细胞增殖(H460和MCF-7株),如同抑制可移植鼠科肺癌的反应(H460)(Biao He,A Monoclonal Antibody against Wnt-1Induces Apoptosis inHuman Cancer Cells,Neoplasia,Vol.6,No.1,January/February 2004,pp.7-14)。在上述报告中,Biao He等人同样利用化学上未修饰的siRNA用于乳癌细胞株,结果使得细胞凋亡速率增加。
抗WNT-1单株抗体会诱发肉瘤细胞中的细胞凋亡(A-204)(Iwao Mikami,Efficacy of Wnt-1 monoclonal antibody in sarcoma cells,BMC Cancer 2005,5:53,24May 2005),以及在NCI-H 1703和H28肺癌细胞中(Liang You,Inhibition of Wnt-1Signaling Induces Apoptosis in β-Catenin-Deficient Mesothelioma Cells,CancerResearch 64,3474-3478,May 15,2004)。此研究也利用在MCF-7乳癌细胞,以及NCI-H1703和H28肺癌细胞中的化学上未修饰的siRNA,结果使得细胞凋亡的速率增加。
You等人同样利用未修饰的siRNA,其会诱发和单株抗体一样相似程度的细胞凋亡。在结肠癌细胞中可以得到类似结果(He et al,Blockade of Wnt-1 signalinginduces apoptosis in human colorectal cancer cells containing downstream mutations,Oncogene 2005,24:3054-3058)。
在最近报告中,Fukutomi等人(Hepatology 2005;41:1096-1105)指出在经修饰的肝肿瘤细胞中WNT-1的siRNA沉默化仅有间接效果。这些实验利用表达C型肝炎病毒核蛋白(type C hepatitis virus core protein)的肝癌细胞株细胞。表达C型肝炎病毒核蛋白是透过编码该蛋白质的载体加以转染这些细胞。此蛋白质的存在会增强WNT-1表达以及细胞增殖。应用对于上述细胞中WNT-1有特异性的siRNA会引起表达的沉默化以及抑制增殖。然而,这种实验模型,并无法提供假设在利用WNT-1特异性的siRNA、在未以病毒蛋白质修饰的细胞中同样会诱发一类似效果的证据。
在WO2004032838专利案中是揭露一种将一细胞与一可阻止WNT与其接受器间相互作用的化合物接触、加以抑制肿瘤细胞增殖的方法。如同这样抑制的例子,是利用一抗WNT-1蛋白质的单株抗体。该专利同时揭露在应用siRNA于WNT-1蛋白质后,在许多肿瘤株中细胞的凋亡发生状况。
尚未有上述公开资料揭露任何在抑制未修饰的肿瘤细胞增殖中,活化siRNA机制的寡核酸的作用,也尚未得知这样的作用。
透过细胞凋亡加以根除细胞并不是一个用以增强抗肿瘤活性的充分机制,因为在许多种类的肿瘤中,此机制是被中断或被抑制的。在其它因素的中,与p53基因中的一系列突变有关联,而其是用来调控此过程。此过程的无效也有可能是缺少促细胞凋亡蛋白因子(proapoptotic proteins)如许多种类肿瘤中的Bax或Bid,或细胞凋亡抑制物如Bcl-2的表达量增加。只有肿瘤摄取(tumour take)及/或肿瘤细胞增殖的抑制性可作为抗肿瘤活性(anti-tumour activity)的证据。
已修饰的细胞上的实验并无法协助预测自然、未经修饰细胞在肿瘤中所发生的变化。以单株抗体作为可能的处理在生物体上会具有一相当大引起免疫反应的风险。此外,单株抗体相当的昂贵,同时并无法保证它们的制造在个别接受者中均会有重复不变的反应,因为在制造过程中是使用基因改造生物。
故,亟需寻求一个新颖且有效率的处理法,其具有抗癌性质但不会引起免疫反应。这样的药物在制造上必须要能简单而且较不昂贵,最好能利用一可再现的技术性制作程序。
发明内容
本案发明人已经完成一系列实验,并推断出利用siRNA抗与癌化有关的基因,例如:Wnt1基因,在肿瘤细胞株上会对于肿瘤细胞增殖有一强力抑制。此抑制为剂量相关(dose-dependent)。
本发明成功地带来一个透过抑制肿瘤细胞生长的肿瘤治疗法问题的解决方法,利用该RNA干扰机制加以分解与癌化有关基因的mRNA,例如编码WNT-1的基因。本发明提供诱发细胞凋亡或抑制癌症细胞生长的方法,如以寡核酸作为一有效的抗癌剂。另外,本发明的应用在接受治疗病人身上仅有一非常有限会引起免疫反应的危险。双股寡核酸的制造为一可再现的程序,同时容易利用标准设备,即所谓的RNA合成器加以完成。
这样的寡核酸可能根据迄今已揭露的许多算法中之一加以设计,例如实施例1中所提出者。
有兴趣的mRNA基因序列可由数据库中取得,例如可选用基因银行(GenBank)以及NCBI参照序列数据库(NCBI Reference Sequence)。mRNA目标序列的第二级结构可利用计算机折迭算法(computer folding algorithm)设计。抗挑选出来mRNA序列的siRNA则可利用已知的算法经由计算机仿真(in silico)来产生。可在网络上找到许多算法,其是设计用来产生抗特定mRNA序列的siRNA。这些算法一般而言是根据相似但其中有些微差异的方程式。大部分的方程式是根据siRNA设计中的塔斯尔规则(Tuschl rules),但其中有一些同时也使用雷诺兹规则(Reynolds rules)。众所皆知,对于由其它算法之一所产生的siRNA必须进行核对。这就是为什么在我们的方法中要根据不同方程式使用不同的算法。在一些算法所产生的siRNA也是根据它们的热力学加以分析。在siRNA分子间自由能(free energy)的分布在描述已知序列的潜力上是一非常重要的因素。这个特征在通过RNA诱发沉默复合体(RISC)辨别引导股(guide strand)时相当的重要,因为这个复合体是辨认将被合并的一股的5'端,而且作为引导股。已知一不转录股(antisense strand)的5'端应该会较3'端不稳定,故5'端的自由能应该要比3'端的要高。根据这些规则在5'端与3'端间的GC比例(GC content)应该会有差异。更多的GC比例配对会在一不转录股的3'端。根据siRNA在热力学上的稳定性以及潜力,分子间GC比例的总数也很重要。在功能性siRNA其GC比例应该介于30%~60%之间,可确保一设计的duplex稳定不会被解开且够稳定以避免在细胞质内自行解开。在热力学分析上会建议设计siRNA在不转录股的位置10处为一低稳定度。此位置为一断裂部位故应该不会在引导股和目标mRNA间形成一强力混合,尿嘧啶碱基(U base)是建议在此位置。另一在siRNA设计中需要考虑的因素为标定二级结构的亲近性(accessibility)。此因素叙述在mRNA分子上目标区域的一单股motif。在细胞质中mRNA从未以一单股状态存在,它的二级结构含有很多发夹状、环状以及其它结构,其为在特定mRNA分子中碱基间部份配对的结果。在siRNA设计上最大的问题之一为避免潜在性的”关闭目标(off-target)”作用。此作用发生在如果特定siRNA不仅把需要的mRNA,还把其它mRNA作为目标。在这例子中有许多象blast或clustal的算法,可预测与任何已知副本(transcript)的可能的相互影响关系。
1.有兴趣的mRNA的基因序列是由数据库中取得,例如选用GenBank以及NCBI的Reference Sequence。抗所选取mRNA序列的siRNA是利用已知算法经由计算机仿真(in silico)来产生。
2.接着将所设计的序列是按照根据下列规则的所有过滤数值(total filteringscore)加以排列:
(a)在算法中的频率
其为一描述有多少算法设计特定siRNA的数值,该数值是由方程式描述:
a=1*算法数量
(b)单股区域机率
其为一描述在特定mRNA分子的目标区域中有一单股motif机率的数值。该数值是利用计算机折迭算法(computer folding algorithm)计算或根据下列方程式计算:
其中:
Mss-二级结构的数目,其中在一目标区域有一单股motif。
Mt-所预估的二级结构总数。
(c)与其它mRNA序列互补
其为一描述关闭目标(off-target)的可能性的数值,该数值是由方程式描述:
c=-2*分子数量
(d)不转录股(antisense strand)5'端的自由能
其为一描述该siRNA5'端的稳定度的数值。该数值是根据最近RNA的热电学变量(thermodynamics parameters)加以计算。
(e)不转录股3'端的自由能
其为一描述该siRNA5'端的稳定度的数值。
该数值是根据最近RNA的热电学变量(thermodynamics parameters)加以计算。
(f)不转录股上位置10的自由能
其为一描述一断裂处的稳定度的数值。该数值是根据最近RNA的热电学变量加以计算。
(g)GC比例(GC content)
其为一描述siRNA分子的稳定度的数值。该数值是根据方程式加以计算:
其中:
NG-两股中鸟粪嘌呤碱基(G bases)的数量
NT-不转录股中碱基的总数。
3.为了更进一步分析所选择最佳15个siRNA。
4.接着筛选增殖的抑制,完成mRNA以及蛋白质量的减少。该实验是以高于或等于80%的转染效率(transfection efficiency)实施。
(a)每一序列的抑制数值(inhibition score)是利用因子s求出:
其中:
Rs-以一具有siRNA的探针(probe)的测量结果
Rm-以一空白探针(blankprobe)的测量结果
Rc-以一控制的探针的测量结果
数值:
i. 0当s值小于0.50
ii. 1当s值介于0.51-0.60
iii. 2当s值介于0.61-0.70
iv. 3当s值介于0.71-0.80
v. 4当s值介于0.81-0.90
vi. 5当s值介于0.91-1.00
接着将序列依照该抑制数值加以排序。
(b)为了更进一步分析siRNA其排序多于或等于所选择的最佳序列的50%。
(c)每一序列中mRNA量数值(mRNA level score)的减少量是利用因子r求出:
其中:
Es-以具有siRNA的探针侦测的目标基因相对应表达量
Ec-以具有控制的探针侦测的目标基因相对应表达量
数值:
i. 0当r值小于50
ii. 1当r值介于51-60
iii. 2当r值介于61-70
iv. 3当r值介于71-80
v. 4当r值介于81-90
vi. 5当r值介于91-100
接着将序 列依照该mRNA程度数值的减少量加以排序。
(d)每一序列中蛋白质量数值(protein level score)的减少量是利用因子t求出:
其中:
Ps-以一具有siRNA的探针所侦测的蛋白质量
Pc-以一控制的探针所侦测的量
数值:
i. 0当t值小于50
ii. 1当t值介于51-60
iii. 2当t值介于61-70
iv. 3当t值介于71-80
v. 4当t值介于81-90
vi. 5当t值介于91-100
接着将序列依照该蛋白质量数值的减少量加以排序。
5.所有的序列具有最后筛选因子(screeningfactor)z的特征:
其中:
a-依照抑制数值加以排序
b-依照mRNA量数值的减少量加以排序
c-依照蛋白质量数值的减少量加以排序。
6.接着将带有大于或等于50%最佳序列的z因子的siRNA,但没有超过3是根据细胞死亡机制分析。序列是依照下列加以排序:
(a)存活的细胞
(b)-1*坏死细胞(necrotic cells)%
(c)+1*初期凋亡细胞(early apoptotic cells)%
(d)+2*凋亡细胞%。
7.接着求出剂量相关(dose-dependent)影响的数值
(a)求出达到超过65%沉默化(silencing)效果的最低剂量,
(b)求出该影响仍可被侦测到的最长时间。
另外,为了减少免疫反应,所设计的寡核酸最好不要长于30bp,较佳长度为21-23bp。
转录(sense)及不转录(antisense)的寡核酸可能为对称或不对称,即代表2端核甘酸可能为未杂合(unhybridized),再形成黏合端(sticky ends)。为了增强它们的温度以及酵素的稳定度、药物动力学、生物有效性(bioavailability)以及细胞摄取(cellular uptake)特性,该寡核酸可能进行化学修饰。化学修饰可能与磷酸盐(phosphates)、核醣(ribose)或核酸酶(nucleases)本身有关,上述化学修饰可能仅与选定的核甘酸有关,即末端或中间,或整个寡核酸。
该寡核酸可被传送进入肿瘤细胞,不需载体,和利用一载体一样,分为病毒性和非病毒性。病毒性载体的例子有腺病毒(Adenoviruses)或类腺病毒(adeno-likeviruses),其可促进该寡核酸在传入肿瘤细胞后进行的一连串表达。
非病毒性载体是利用脂质荚膜(lipid capsules)将寡核酸传入细胞、脂质复合物或其它载体以延长它们在生物体内的半衰期及/或细胞吸收作用。
本发明的结果,可达到一相当大的肿瘤细胞增殖抑制作用。
虽然下列实施例和描述说明本发明的性质,并包括实施例加以详加说明,而本发明的一实施例是包含所有对描述过程的一般变化、改编、修饰、删除或增加,均视为后述的申请专利范围的一部分以及相等。
附图说明
图1为在浓度50nm的未处理细胞中,以16抗Wnt1基因的siRNA序列转染MCF-7细胞48小时后的抑制增殖的比例。细胞的生存能力是利用MTS检验加以测量。
图2为利用针对Wnt1的特定siRNA转染后,MCF-7细胞中的Wnt1蛋白质程度的减少量。(a)在MCF-7细胞株中经过抗Wnt1的siRNA处理48小时后,Wnt1和肌动蛋白的表达。(b)以W13、W15以及WP序列处理24小时和72小时后细胞中表达Wnt1的比例。
图3为利用抗Wnt1的siRNA处理后的细胞周期分析。(a)细胞图显示MCF-7细胞以W15和WP序列转染72小时后的DNA含量以及细胞大小。(b)统计图表示MCF-7细胞以W15和WP序列转染72小时后的细胞周期。
图4为经过W15序列处理的细胞凋亡。(a)凋亡蛋白酶(caspases)3以及7的活性。(b)MCF-7细胞经过W15序列处理后在形态上的改变。
图5为MCF-7细胞在Wnt1 siRNA后利用Annexin V以及以碘化物染色法的细胞凋亡分析。(a)细胞图表示MCF-7细胞经过W15以及WP序列转染72小时后的形态。(b)细胞图显示在利用W15和WP序列转染72小时后细胞凋亡早期和晚期、以及坏死的细胞数量。
图6为Wnt1 siRNA诱发细胞凋亡,其是由MCF-7细胞中Wnt1的蛋白质量减少所引起。(a)细胞图显示DNA含量以及Wnt1的表达量。(b)统计图表示具有Wnt1的高和低表达量的细胞数量。
图7为siRNA的排序结果。8个siRNA通过抑制数值排序(粗体字),2序列通过z数值排序(粗体红字)。用来比较WP序列的全部因子(源自文献的序列)均经过分析。
具体实施方式
材料及方法
细胞培养
人类乳癌细胞株MCF-7是取自于美国菌种中心(American Type CultureCollection(Rockville,MD,美国))。细胞培养在补充10%(v/v)胎牛血清(FCS)、50μg/ml健达霉素(gentamycin)、2.5μg/ml抗霉素(fungizone)、50UI/ml盘林西林(penicillin)、50μg/ml链霉素(streptomycin)(Invitrogen Carlsbad,USA)的培养液(DMEM)中维持,并在包含5%二氧化碳/95%湿度的空气37℃下,同时每2或3天定期继代培养(subculture)。
细胞增殖分析
为了增殖检验,在实验前一天将MCF-7细胞置于细胞培养液(Opti-MEM(Invitrogen))在96孔盘(96-well plates)的每一孔中有7 x 103个细胞。隔天将MCF-7细胞以针对Wnt1 mRNA有特异性的15个siRNA序列转染,同时依照制造商的说明书步骤利用的脂质体(Lipofectamine)RNAi MAX(Invitrogen)在浓度50nm反应48小时下扰乱siRNA序列(控制组)。利用品名”siCONTROL TOX”转染试剂(美商Dharmacon公司出品)作为转染效率的控制组。在实验48小时后,利用MTS检测(Promega,Madison,USA)以测量增殖抑制。
西方点墨分析法
西方点墨法的试剂是购自美商伯乐公司(BioRad(Hercules,USA),下称BioRad)、抗Wnt1的抗体则来自于Zymed Invitrogen,抗肌动蛋白(actin)、抗磷酸化乙型钙调蛋白(phosphor-beta-catenin)、抗c-myc以及抗胞转蛋白D1(cyclin D1)来自于美商圣塔克鲁兹生物科技公司((Santa Cruz,USA),下称Santa CruzBiotechnology),抗断裂PARP抗体则来自于美商细胞讯号公司(Cell Signaling(Beverly,USA))。西方点墨法的侦测试剂来自于美商罗氏医学仪器公司(RocheDiagnostics(Indianapolis,USA),下称Roche Diagnostics),另外高灵敏度与低背景值的冷光讯号专用底片(Light Film BioMax)则来自于美商柯达公司(Kodak(Rochester,USA),下称Kodak)。
在实验前一天将250 x 103个细胞在装有细胞培养液(Opti-MEM)的无菌25cm2三角瓶中培养直到占满60%的生长平面空间(confluence)。为了抑制(knock-down)Wnt1基因,将培养液移除并以含有siRNA的转染培养液代替,其通过该抑制数值顺序。48小时后以胰蛋白酶冲洗(trypsinization)并在4℃下以2000g离心5分钟,而沉淀细胞(cells pellet)会漂浮于冰冷的磷酸缓冲溶液(PBS)中,即可得到该培养细胞。在第二次离心后移除上清液,同时该沉淀细胞会在0.5ml完全裂解缓冲液RIPA(美商圣塔克鲁兹生物科技公司,Santa Cruz,CA,USA)中漂浮,同时在4℃下培养30分钟。该缓冲液中的漂浮细胞在4℃下以9000g离心10分钟,再将该上清液(包含全部的蛋白质碎片)小心地移除并经过一20规度注射针导引器(20-gauge syringeneedle)6次。将该溶解物以1:2(v/v)比例与含有2.5%的2-硫氢乙醇(2-mercaptoethanol)的Laemmli样本缓冲液(BioRad)混合并煮沸3分钟。包含相同量蛋白质的样本是由聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)(12% gel)以及一多变标记(BioRad)。此电泳(electrophoresis)是使用BioRad的小型电泳槽(Mini Protean III cell)以110V进行1小时。将电泳后分离的蛋白质在一PVDF膜(BioRad)上利用该MiniProtean III小型电泳槽以110V电转渍(electroblot)70分钟。将该膜在含有5% w/v脱脂牛奶的TBST(pH7.5)溶液浸泡整夜以停止反应。隔天将该膜以TBST冲洗3次10分钟,并在室温下与经1:200比例稀释的第一抗体(primary antibodies)培养1小时。再将该膜以TBST冲洗4次10分钟,同时与经1:2000比例稀释、和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)(美商西格玛奥瑞奇公司(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)提供,下称Sigma Aldrich)杂合的第二抗体再培养1小时。最后,将该膜以TBST冲洗3次10分钟,同时利用一高效能化学发光的品名”BioMAX”的感光底片(Kodak),上面的西方点墨法的侦测试剂LumiLight(Roche)标记的蛋白质(labelled proteins)即可显现。再将该感光底片上的影像利用一Kodak Edas系统分析,可测得积分光密度值(integrated optical density,IOD)。
实时聚合酶连锁反应(Real Time-PCR)
在实验前一天将250 x 103个细胞在装有细胞培养液的无菌25cm2三角瓶中培养直到占满60%的生长平面空间(confluence)。为了抑制(knock-down)Wnt1基因,将培养液移除并以含有siRNA的转染培养液代替,其通过该抑制数值顺序。48小时后以胰蛋白酶冲洗(trypsinization)并在4℃下以2000g离心5分钟,而沉淀细胞会漂浮于冰冷的磷酸缓冲溶液(PBS)中,即可得到该培养细胞。接着加入1mlTRIZOL试剂(Invitrogen)以及经过移液管数次,细胞会溶解。之后将溶解产物在室温下培养5分钟。接着在每1ml TRIZOL加入0.2ml氯仿,同时在室温下将样本培养10分钟。接着样本在4℃下以大于12,000g离心15分钟。然后将此液体转移至一全新管子中并与异丙醇混合、在室温下培养10分钟以及在4℃下以大于12,000g离心10分钟,RNA即自该液体中沈淀出来。RNA以1ml 75%冰冷的乙醇即可被冲洗掉。样本以震荡方式(vortexing)加以混合并在4℃下以大于12,000g离心5分钟。在步骤的最后,将RNA沉淀物干燥(风干5~10分钟)。最后将RNA溶解在适量的无RNase(RNase-free)的水中。
依照制造商的说明书步骤利用ImProm-II反转录酶套组(Promega)将所分离出来的RNA转录为cDNA。目标基因的mRNA的表达差异是利用Rotor-GeneTM 3000(柯伯特研究公司(CORBETT RESEARCH)提供)来测量以及利用RelativeExpression Software Tool for 加以预测相关表达。
H3F3A(histon H3A)为管家基因(House-keeping)。校正样本(Calibrator sample)来自于Stratagene公司,而针对管家基因的引子(primers)来自于Eurogenetec公司以及对于目标基因有特异性的引子(德商Qiagen公司)。将cDNA样本和适当引子与Fast StartDNA Master SYBR Green I套组(Roche)混合。
关于流式细胞仪的免疫荧光染色(Iimmunofluorescence staining for flowcytometry)
在实验前一天将250 x 103个细胞在装有Opti-MEM的无菌25cm2三角瓶中培养直到占满60%的生长平面空间(confluence)。为了抑制(knock-down)Wnt1基因,将培养液移除并以含有siRNA的转染培养液代替,其通过该抑制数值顺序。48小时后以胰蛋白酶冲洗(trypsinization)并在4℃下以2000g离心5分钟,而沉淀细胞会漂浮于冰冷的磷酸缓冲溶液(PBS)中,即可得到该培养细胞。
然后将细胞固定在1%甲醛中15分钟,以磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗2次,使其漂浮在冰冷的70%乙醇中并储存于-20℃下24小时。经过这次再将细胞以磷酸缓冲溶液(PBS)-1% BSA冲洗2次,同时与任一经(PBS)-1% BSA以1:250比例稀释的抗Wnt1的第一抗体(Zymed-Invitrogen)培养1小时。在主要培养后将细胞以(PBS)-1% BSA冲洗2次、并与一含有10μg/mlRNase A的荧光染剂(propidium iodide)溶液一起培养15分钟用以将DNA对比染色(counterstain)。接着利用BD FACSCalibur流式细胞仪(美商贝克腾迪克伊森公司(Becton Dickinson,Franklin Lake,USA)提供,下称Becton Dickinson)进行测量。
细胞凋亡分析
为了凋亡蛋白酶(caspases)3和7的活性,在实验前一天将MCF-7细胞置于96孔盘中,在每一孔中放置7 x 103个细胞以及细胞培养液(Invitrogen)。隔天将MCF-7细胞依照制造商的说明书步骤,以通过抑制数值排序的siRNA序列在浓度50nm下、利用Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen)进行转染48小时。在12小时的siRNA表现后,凋亡蛋白酶3和7的活性是依照制造商的说明书步骤、利用GloMaxTM 96微量盘冷光仪(Microplate Luminometer)(Promega)所制造的Caspase-Glo 3/7测定(Promega)加以测量。
分析以通过最后筛选测试的siRNA转染的凋亡细胞,是依照制造商的说明书步骤,通过胰蛋白酶冲洗(trypsinization)获得并利用一Annexin V FLUOS染色套组(美商罗氏医学仪器公司,Indianapolis)加以染色。接着将染色细胞立刻以流式细胞仪(FACScan,美商贝克腾迪克伊森公司,Franklin Lake,N.J.)进行分析。早期凋亡细胞与暴露磷脂丝胺酸(phosphatidylserine)但完整细胞膜与Annexin V-FITC结合然而排除荧光染剂(propidium iodide)。在坏死或细胞凋亡后期的细胞均以AnnexinV-FITC和荧光染剂加以标记。
siRNA序列的设计
许多可利用的算法之一可用于设计有效的siRNA序列。此类的算法在文献中普遍可取得,例如:
1.Elbashir SM et al.(2001)Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature.411:494-498。
2.Elbahir SM et al.(2001).Functional anatomy of siRNAs for mediating efficientRNAiin Drosophila melanogaster embryo lysate.EMBO J.20:6877-6888。
3.Elbashir SM et al.(2002).Analysis of gene function in somatic mammalian cellsusing small interfering RNAs.Methods.26:199-213。
4.Reynolds A,Leake D,Boese Q,Scaringe S,Marshall WS,Khvorova A.RationalsiRNA design for RNA interference.Nat Biotechnol.2004 Mar;22(3):326-30。
5.Tuschl,T.,Elbashir,S.,HarborthJ.,and Weber,K."The siKNA User Guide",http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html(revised May6,2004)。
或以立刻可用(ready-to-use)计算机软件的类型:
1.http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html,
2.https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai,
3.http://www1.qiagen.com/PiOducts/GeneSilencing/CustomSiRna/SiRnaDesigner.aspx,
4.http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl。
这些算法的基础为引进我们希望沉默化(silence)的蛋白质的mRNA或cDNA。
编码该WNT-1蛋白质或cDNA的mRNA容易得到且公开(即在GENMED数据库中:www.ncbi.nlm.nih.gov)。
NCBI参考序列(RefSeq)NM_005430。
(http://www.ncbi.nlm.nih.ROv/entrez/viewer.fcgi?db=Nucleotide&dopt=GenBank&val-16936523)。
本发明的发明人已设计许多对于WNT1mRNA有效的siRNA序列,请参阅下列表格(表格1)。
表格1
Lp. | 转录股 | 不转录股 |
WNT1序列 | (5'-->3') | (5'-->3') |
W1 | GCGUUUAUCUUCGCUAUCATT | UGAUAGCGAAGAUAAACGCTT |
W2 | CUCAUGAACCUUCACAACATT | UGUUGUGAAGGUUCAUGAGTT |
W3 | CGACCGUAUUCUCCGAGAUTT | AUCUCGGAGAAUACGGUCGTT |
W4 | UCGUCUACUUCGAGAAAUCTT | GAUUUCUCGAAGUAGACGATT |
W5 | CACUCAAGACCCGGUUAUUTT | AAUAACCGGGUCUUGAGUGTT |
W6 | CCUCCUAAGUCCCUUCCUATT | UAGGAAGGGACUUAGGAGGTT |
W7 | CACGAGUUUGGAUGUUGUAAA | UUUACAACAUCCAAACUCGUG |
W8 | UUGCACUGAAACGUGGAUACA | UGUAUCCACGUUUCAGUGCAA |
W9 | UCAGUAUUUCCUUCCACUGUA | UACAGUGGAAGGAAAUACUGA |
W10 | ACCUGCUUACAGACUCCAAGA | CUUGGAGUCUGUAAGCAGGU |
W11 | GAACCUGCUUACAGACUCCAA | UUGGAGUCUGUAAGCAGGUUC |
W12 | GCAGCUGUUGAGCCGCAAACA | UGUUUGCGGCUCAACAGCUGC |
W13 | GUACGACCGUAUUCUCCGAGA | UCUCGGAGAAUACGGUCGUAC |
W14 | ACGACCGUAUUCUCCGAGAUG | CAUCUCGGAGAAUACGGUCGU |
W15 | UACGACCGUAUUCUCCGAGAU | AUCUCGGAGAAUACGGUCGUA |
W16 | GGUUUGUCCCAGUCAGAAATT | UUUCUGACUGGGACAAACCTA |
合成siRNA
RNA合成是利用固相产生技术,利用合成核酸(nucleic acids)的典型步骤,利用β-cyanoethyl phosphamide esters的衍生物和核醣(ribose)的2'-OH基的tert-butyldimethyl-silane保护。Phsosphamide单体依附上核醣的自由5'-OH基接着为5-benzylmercapto-1H-tetrazole所活化。此反应立即继续进行、有效率地产生寡聚物。同时将该形成的寡聚物以色析法(HPLC)或电泳(PAGE)技术加以纯化。
此合成是以一实用Biosystems公司的962RNA合成器进行。siRNA是在-20℃下利用相同摩尔数的互补RNA股在2M溶于乙醇的醋酸盐(acetate)缓冲液中轻轻的摇动1小时所产生。此溶液离心15分钟并以70%乙醇干燥。
利用一脂质载体来制备单独siRNA稀释
利用Hiperfect脂质载体稀释siRNA(WNT1_16)。
Hiperfect是购自Qiagen及供应。
每一siRNA稀释以是列稀释制备,再接着加入一适量Hiperfect。
25nm
3μl siRNA+1197μl无血清的培养液
10 x 0.75μl HiPerFect=7.5μl
5nm
200μl 25nm溶液+800μl无血清的培养液
8 x 0.75μl HiPerFect=6μl
1nm
200μl 5nm溶液+800μl无血清的培养液
10 x 0.75μl HiPerFect=7.5μl
siRNA的转染:
在实施例3中所制备的稀释是用于转染中
siRNA的转染是以3种浓度进行:1、5和25nm,Hiperfect:固定0.75 microL/孔。实验对照组包括(a)肿瘤细胞,(b)a+HiPerfect试剂。
步骤:
1.将来自体外(in vitro)培养的肿瘤细胞接种至一96孔盘,在1 x 104个细胞/孔,在100μl。该细胞在一有5%二氧化碳的潮湿环境下,以37℃培养24小时。
2.经过24小时的培养后,将该细胞在浓度为1、5或25nm(最后体积为100μl)以一适当siRNA处理,与一包括单独100μl培养液或仅有HiPerFect培养液的细胞的对照组。转染是根据制造商在HiPerFect转染试剂手册(www.qiagen.com)上的操作指南实施。
3.该细胞在上述条件下再培养24小时或72小时。
解读结果
利用SRB方法记录测试数据:
1.在培养结束之后,在每一孔中加入50μl冰冷的50% TCA(trichloroaceticacid)。
2.在40C下培养60分钟后,以流动的水冲洗该细胞5次。
3.干燥后,在每一孔中补充溶在1%醋酸中的50μl 0,4% SRB(sulforodamine B)溶液,为了将沉淀蛋白质染色。
4.在室温下培养30分钟后,以1%醋酸冲洗该孔盘5次。
5.干燥后,在每一孔中补充150μl 10nm TRIS缓冲液(tris(hydroksymethyl)aminomethane)溶解染剂。
6.该方法是用来测定通过TCA的蛋白质沉淀量。每一样本的光学密度(opticaldensity)是以光电分光仪(spectrophotometrically)以540nm测量。
“空白”(Blank)控制组是由一孔中仅含培养液的溶液所构成。阳性对照样本是由漂浮于培养液中的细胞所构成。由该光电分光仪(spectrophotometrically)所测定的OD是与一样本中存活细胞的数量成比例。
测量经siRNA处理过的个别肿瘤株细胞的增殖速率所得到的结果是收集于表格(表格2和表格3)中。
表格2.将siRNA与人类LNCap前列腺癌细胞(human LNCap prostate cancercells)一起培养72小时后的增殖抑制性
表格3.siRNA与人类ASPC-1胰脏癌(human ASPC-1 pancreatic cancer)一起培养72小时后的增殖抑制性
由抑制肿瘤细胞增殖的实验结果中,可证明应用抗Wnt1基因的siRNA对于肿瘤细胞增殖具有一显著抑制性。增殖抑制性的数值是与控制细胞单独在培养液中培养有关。另外,利用抗Wnt1的siRNA,与单独以Hiperfect脂质载体或其它基因的siRNA处理的肿瘤细胞相比、对于增殖会有一强烈许多的抑制效果,即前述的抗癌性质。
实施例1.抗Wnt1mRNA抑制细胞生长的经过设计的siRNA
MCF-7细胞的细胞增殖在经过一以对于Wnt1基因有特异性的50nm siRNA序列处理48小时后测量,利用MTS分析来测定细胞生长率。将经siRNA处理的细胞生长与未经处理的细胞(CTRL)、以扰乱无编码(non-coding)的siRNA(SC siRNA)处理的细胞以及以siControl TOX(siTOX)和Docetaxel(DOC)处理的细胞。SCsiRNA以及siTOX是用来测定分别由核酸化学性质或转染剂所引起的非特异性的细胞生长抑制,同时确认转染的效率。图1所显示的数值指出未转染的控制组细胞(non-transfected control cells)的增殖比率。在这些实验中大约88%的未编码siRNA(Non-coding siRNA)对于细胞增殖和转染效率几乎都不具效果。很少数的测试siRNA序列显示出强大的减少细胞增殖能力,在一些实例中超过50%,代表高过于抑制细胞药物(Docetaxel)。而在增殖效率上达到最佳效果为W15序列,其抑制增殖与相关的未处理细胞相差75%,同时由文献中可得知远较于docetaxel以及WP siRNA有效果(He等人.2004)。
实施例2.经设计的siRNA在递减的Wnt1 mRNA量中具有特异性且有效
接着,我们在将MCF-7以通过抑制数值排序的siRNA处理后测量其中mRNA量。mRNA减少量为siRNA作用的最直接结果。然后我们测定以抗Wnt1 mRNA的siRNA转染MCF-7细胞,是否会造成mRNA量的减少。分析是在转染48小时后进行。所有的mRNA分离、转录为cDNA以及实时聚合酶连锁反应(real-time PCR)如上述材料及方法中均已完成。在以W15序列处理MCF-7细胞后,我们观察到与未处理的控制组比较,mRNA减少了61%。此实验也受到我们序列的特异性控制。另外,我们以A549细胞进行类似实验,以确定是否有任何反应。已知在A549细胞中Wnt1不表达(He等人2004)。我们观察到A549细胞以W15序列处理48小时后,在增殖和mRNA量都没有变化。
此数据代表W15序列在递减的Wnt1 mRNA量中具特异性且有效,其为siRNA的基础作用。
实施例3.对Wnt1有特异性的siRNA会引发蛋白质量的减少
以抗Wnt1的siRNA转染后,完成MCF-7细胞中Wnt1量的西方点墨分析(Western blotting analysis)(图2a)。以W15序列处理48小时后,细胞中Wnt1量不但会减少以及较少程度,而且根据控制组减少细胞处理以W13序列的重要性,MCF-7在WP序列处理后Wnt1量有微量减少。
西方点墨分析显示,MCF-7细胞在抗Wnt1的siRNA处理后,其中的磷酸化乙型钙调蛋白(phophorylated beta-catenin)量有增加。在Wnt1量的衰退与经W15或W13序列处理的MCF-7细胞中的c-myc和cyclin D1衰退量的间,我们观察到一关联性。我们在WP序列处理后并未发现如此变化。
这数据代表抗Wnt1的W15序列在MCF-7细胞中提供Wnt1的减少量,同时与c-myc、胞转蛋白D1(cyclin D1)以及磷酸化乙型钙调蛋白量的增加量有关联。
接着,利用流式细胞仪技术测量MCF-7细胞经过siRNA处理的Wnt1表达的改变(图2b)。有87%和92%的控制组细胞在24h和72h后依次表达Wnt1,在以W15序列处理的细胞中仅有35%和29%分别表达Wnt1,而在以W13序列转染24小时和72小时后分别有80%和33%的细胞表达Wnt1,同时在以WP序列处理的细胞中分别有90%和70%的细胞表达Wnt1。
此分析显示抗Wnt1的siRNA会诱发蛋白质量减少。
实施例4.抗Wnt1的siRNA诱发细胞凋亡而非坏死(necrosis)
利用流式细胞仪技术分析经抗Wnt1的siRNA处理的MCF-7细胞的细胞周期(图3),72小时后我们观察到41%的死亡细胞与控制组(4%)以及经WP序列处理的细胞(14%)相比。此数据显示以抗Wnt1的siRNA转染MCF-7细胞会增加细胞死亡。
为了证实哪种细胞死亡是由siRNA处理所触发,我们利用凋亡蛋白酶活性分析(caspases activation assay)。在此分析中所得到的结果显示与控制组比较的抑制增殖性。我们观察到以W15序列处理后的MCF-7细胞至少有增加5倍的凋亡蛋白酶3和7的活性,同时在以W13序列处理后大约增加4倍,而以细胞毒性docetaxel处理后只增加大约2倍(图4a),此结果藉由以W15序列处理后的MCF-7细胞的形态改变加以确认(图4b)。
那些结果显示W15序列会诱发MCF-7细胞的细胞凋亡。
接着我们测定细胞凋亡、坏死细胞以及存活细胞(viable cells)的数量。细胞凋亡的分析是利用Annexin V(AV)以及荧光染剂(propidium iodide,PI)双重染色进行。双重阴性(negative)即为存活细胞。AV阳性以及PI阴性为细胞凋亡早期的细胞,而AV阳性以及PI阳性为细胞凋亡后期的细胞。坏死细胞则为AV阴性以及PI阳性(图5)。
实施例5.由对Wnt1有特异性的siRNA所诱发的蛋白质量减少会引发细胞凋亡
流式细胞仪技术是用来确认细胞凋亡是否为以抗Wnt1的siRNA所转染的MCF-7细胞、其中Wnt1的量减少而触发的(图6)。
在控制组细胞中有87%存活细胞表达Wnt1、有9%的细胞存活并侦测不到Wnt1的表达,以及有4%的细胞生长24小时后无Wnt1表达。而在细胞生长72小时后可观察到,有90%存活细胞表达Wnt1、4%存活细胞无表达Wnt1以及3%细胞死亡无表达Wnt1。而在以针对Wnt1有特异性的siRNA处理的细胞中,在24小时后,有34%存活细胞表达Wnt1,同时有24%细胞存活无Wnt1表达以及41%细胞死亡无Wnt1表达。在72小时后有25%存活细胞表达Wnt1,同时有3%细胞存活无Wnt1表达以及68%细胞死亡无Wnt1表达。我们在WP序列处理后并未观察到这样的变化。
此数据代表细胞凋亡是由具特异性的siRNA所诱发的Wnt1量减少所触发。
序列表
<110>塞隆药商公司
<120>以双螺旋寡核酸干扰mRNA作为有效的抗癌剂
<160>
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>2369
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
Claims (13)
1、一种获得寡核酸以作为一有效抗癌剂的方法,其特征为:
(a)从数据库中取得一与癌化有关基因所编码的mRNA的已知序列,抗所挑选的mRNA序列是利用以塔斯尔规则为基础的已知算法,经由计算机仿真所产生,将设计的序列依据所有过滤数值加以排序,所挑选的寡核酸是由不到30bp、最好为21~23bp所合成。
(b)在关于寡核酸的合成方面(a)执行增殖抑制的筛选,
(c)在关于寡核酸的合成方面(a)执行mRNA量减少的筛选,
(d)在关于寡核酸的合成方面(a)执行蛋白质量减少的筛选,
(e)该所有的筛选寡核酸其特征为最后筛选因子z:
其中:
a-依照抑制数值加以排序,
b-依照mRNA量数值的减少量加以排序,
c-依照蛋白质量数值的减少量加以排序,
(f)该细胞死亡机制是以有大于或等于50%最佳序列的z因子的寡核酸分析,而且该提供癌症细胞凋亡至少50%量的寡核酸,是选作为一有效抗癌剂的寡核酸。
2、根据权利要求1所述的获得寡核酸以作为一有效抗癌剂的方法,其特征为(a)所有过滤数值是以下列变量为基础求出:算法中的频率、单股区域机率、与其它mRNA序列互补、不转录股的5′端的自由能、不转录股的3′端的自由能、在不转录股位置10的自由能、GC比例。
3、根据权利要求1所述的获得寡核酸以作为一有效抗癌剂的方法,其特征为(b)每一寡核酸的抑制数值是利用因子s求出:
其中:
Rs-以一具有siRNA的探针的测量结果,
Rm-以一空白探针的测量结果,
Rc-以一控制的探针的测量结果,
其中抑制数值为:
i. 0当s值小于0.50
ii. 1当s值介于0.51-0.60
iii. 2当s值介于0.61-0.70
iv. 3当s值介于0.71-0.80
v. 4当s值介于0.81-0.90
vi. 5当s值介于0.91-1.00
而该寡核酸根据该得到的数值加以排序。
4、根据权利要求1所述的获得寡核酸以作为一有效抗癌剂的方法,其特征为(c)mRNA量数值的减少是利用因子r求出:
其中:
Es-以具有siRNA的探针侦测的目标基因相对应表达量,
Ec-以具有控制的探针侦测的目标基因相对应表达量,
其中mRNA量的数值减少为:
i. 0当r值小于50
ii. 1当r值介于51-60
iii. 2当r值介于61-70
iv. 3当r值介于71-80
v. 4当r值介于81-90
vi. 5当r值介于91-100
而该寡核酸根据该得到的数值加以排序。
5、根据权利要求1所述的获得寡核酸以作为一有效抗癌剂的方法,其特征为
其中:
i. 0当t值小于50
ii. 1当t值介于51-60
iii. 2当t值介于61-70
iv. 3当t值介于71-80
v. 4当t值介于81-90
vi. 5当t值介于91-100
而该寡核酸根据该得到的数值加以排序。
6、根据权利要求1所述的获得寡核酸以作为一有效抗癌剂的方法,其特征为与癌化有关的基因是选自Wnt1、Her3及Wnt2其中之一。
7、该寡核酸提供根据上述申请专利范围之一的方法所得到的癌症细胞凋亡至少50%的量。
8、根据权利要求7所述的该寡核酸,其特征为选自表格1中的寡核酸。
9、一用以抑制肿瘤细胞增殖的siRNA分子,包括图1中一来自Wnt1基因的mRNA序列的一15~30连续核酸的序列。
10、根据权利要求9所述的siRNA分子,其特征为用以抑制前列腺癌细胞及/或胰脏癌细胞的增殖。
11、根据权利要求7或9所述的siRNA分子,其特征为包括一已知化学修饰。
12、根据权利要求7到11任一项所述的一抗癌药剂制造中的一siRNA分子。
13、根据权利要求12所述的siRNA分子,其特征为所制造的该抗癌药剂是用以抑制细胞凋亡的增殖及/或诱导。
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