CN1981054A - 用抗wnt2单克隆抗体和sirna治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制过表达Wnt2的细胞，尤其是癌细胞生长的方法。该方法包括将该细胞与一种物质相接触，该物质能结合于Wnt2 mRNA或Wnt2蛋白、干扰Wnt2信号转导或抑制Wnt2蛋白与另一种蛋白质如卷曲蛋白受体结合。

Description

用抗WNT2单克隆抗体和SIRNA治疗癌症的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年5月14日提交的临时申请序列号60/571,323的优先权，将其内容全部纳入本文作参考。
发明领域
本发明涉及抑制过表达Wnt2蛋白的癌细胞生长的方法。该方法包括将细胞与结合于Wnt2 mRNA或Wnt2蛋白、干扰Wnt2信号转导或抑制Wnt2蛋白与其它蛋白，如卷曲蛋白受体结合的物质接触。
发明背景
肺癌是美国和世界上癌症死亡的主要原因，美国每年新诊断的病例＞170,000，世界范围内每年新诊断的病例将近一百万(Minna等，Cancer Cell.1(1)：49-52(2002))。尽管在过去的几十年中肺癌治疗中取得了长足进步，但肺癌的5年存活率仍然低于15％(Minna等，Cancer Cell.1(1)：49-52(2002))。肺癌分为两种类型：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC(占所有癌症的75-80％)由三种主要类型组成：腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌(Minna(2002))。肺癌(Lung carcinoma)和鳞状细胞癌占所有肺癌的6-70％。所采用的手术、化疗和放疗在晚期疾病中的疗效通常不能令人满意。改善肺癌治疗效果是主要的公共卫生目标。
恶性胸膜间皮瘤(MPM)是高侵袭性和挑战性的癌症，主要由肺的胸膜内层产生。美国每年诊断患有MPM的患者大约有3,000人，预计近期此肿瘤的发病率会显著升高，在2020年前后达到顶峰(Thatcher，Lung Cancer 45增刊1：S1-2(2004))。由于MPM通常是晚期阶段，基本上不可能进行治愈性切除。放疗作为单一治疗形式不能产生临床疗效，进行化疗主要受晚期疗效有限的限制(Kindler，Lung Cancer 45增刊1：S125-7(2004))。类似地，证明基于胸膜注射重组细胞因子的替代方案不能令人满意(Bard等，Lung Cancer 45增刊1：S129-31(2004))。由于目前的干预仅能提供有限的益处，总存活率很低，所以急需基于对MPM基本分子机制更全面的了解开发新治疗剂。
肺癌和MPM的分子发病机理包括多种基因，包括显性癌基因和隐性抑癌基因的表达和功能改变，以及细胞信号转导通路异常。更好地理解肺癌和MPM发病机理的分子机制应能改善肺癌患者的治疗。
分泌糖蛋白的无翅型(Wnt)家族是广泛参与发育过程和癌发生的一组信号转导分子(Polakis，Genes Dev.14：1837-51(2000)；Lustig等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.129：199-221(2003))。迄今为止鉴定了十九种人Wnt蛋白。Wnt配体与两个不同家族：Frizzled(Fz)受体家族和LDL-受体相关蛋白(LRP)家族的细胞表面受体结合引发Wnt信号转导(Akiyama，Cytokine Growth Factor Rev.11：273-82(2000))。在细胞内，Wnt信号转导活化蓬乱(dishevelled)(Dvl)蛋白，该蛋白能抑制糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化β-联蛋白，导致β-联蛋白在胞浆中稳定化。然后，稳定的β-联蛋白进入细胞核并与LEF/TCF转录因子相连。β-联蛋白-Tcf/Lef诱导重要的下游靶基因的转录，这些靶基因中许多与癌症相关。在缺乏Wnt信号的情况下，游离的β-联蛋白结合在包括轴蛋白、结肠腺瘤样息肉(APC)基因产物和糖原合成酶激酶(GSK)-3β的复合物中。轴蛋白、APC和β-联蛋白被GSK-3β的同时磷酸化导致β-联蛋白进入泛素途径并被蛋白酶体降解(Uthoff等，Int J Oncol 19(4)：803-10(2001)；Matsuzawa等，Mol Cell 7(5)：915-262001))。
蓬乱(Dvl)是位于卷曲蛋白受体下游、β-联蛋白上游的Wnt信号转导的正调节子。GSK-3磷酸化Wnt途径中的多个蛋白并在β-联蛋白的下游调节中发挥作用。APC基因突变是偶发的和遗传的结肠直肠肿瘤发生的起始事件。由于所述异常蛋白是Wnt信号转导级联反应的组成部分，APC突变体与肿瘤发生相关。该蛋白产物包含多个作为β联蛋白结合及降解位点的功能性结构域。发生在β联蛋白氨基端片段上的突变经常涉及依赖于磷酸化、泛素介导的降解，从而稳定β联蛋白。当稳定的胞质联蛋白积聚起来时，该蛋白转移至细胞核，并在那里与调控如c-myc等致癌基因表达的Tcf/Lef高迁移性转录因子组相互作用。
已知在多种细胞类型中，Wnt/β-联蛋白信号转导促进细胞生存(Orford等，J CellBiol，146(4)：855-868(1999)；Cox等，Genetics，155(4)：1725-40(2000)；Reya等，Immunity，13(1)：15-24(2000)；Satoh等，Nat Genet，24(3)：245-50(2000)；Shih等，Cancer Res，60(6)：1671-6(2000)；Chen等，J Cell Biol，152(1)：87-96(2001)；Ioannidis等，Nat Immunol，2(8)：691-7(2001))。Wnt信号途径也被认为与肿瘤的发展和/或进展相关(Bienz等，Cell，103(2)：311-20(2000)；Cox等，Genetics，155(4)：1725-40(2000)；(Polakis，Genes Dev，14(15)：1837-51(2000)；You等，J Cell Biol，157(3)：429-40(2002))。Wnt信号途径的异常激活与多种人类癌症相关，与c-Myc的过表达或扩增有关(He等，Science，281(5382)：1509-12(1998)；Miller等，Oncogene，18(55)：7860-72(1999)；Bienz等，Cell，103(2)：311-20(2000)；(Polakis等，Genes Dev，14(15)：1837-51(2000)；Brown，Breast Cancer Res，3(6)：351-5(2001))。此外，c-Myc被鉴别为结肠直肠癌细胞中β-联蛋白/Tcf的转录靶基因之一(He等，Science，281(5382)：1509-12(1998)；Miller等，Oncogene，18(55)：7860-72(1999)；You等，J CellBiol，157(3)：429-40(2002))。
除了Wnt配体之外，已经分离了分泌型卷曲相关蛋白(secreted Frizzled-relatedproteins，sFRP)家族。sFRP可以通过与跨膜卷曲蛋白受体竞争结合分泌型Wnt配体，作为Wnt信号转导的可溶的内源性调控子发挥作用(Melkonyan等，Proc Natl Acad SciUSA，94(25)：13636-41(1997))。sFRP可以通过结合Wnt蛋白并阻碍其接近细胞表面信号转导受体拮抗Wnt功能，或可以通过促进向卷曲蛋白受体递呈配体增强Wnt活性(Uthoff等，Int J Oncol 19(4)：803-10(2001))。sFRP似乎能调节凋亡易感性，对程序性细胞死亡产生拮抗作用。迄今为止，sFRP仍未与癌症起因相关联。然而据报道，sFRP在结肠直肠癌细胞系中高频率地超甲基化，此超甲基化与缺少基础sFRP表达有关(Suzuki等，Nat Genet 31(2)：141-9(2002))。
发现另一种称为Dickkopf(Dkk)的蛋白也干扰Wnt信号转导并减少胞质β-联蛋白的积累(Moon等，Cell，88(6)：725-8(1997)；Fedi等，J Biol Chem，274(27)：9465-72(1999))。Dkk-1通过与邻近卷曲蛋白受体的LDL受体相关蛋白6(LRP6)的结合拮抗Wnt诱导的信号(Nusse，Nature，411(6835)：255-6(2001))。也发现Dkk-1的过表达能使脑瘤细胞对凋亡敏感(Shou等，Oncogene，21(6)：878-89(2002))。
Wnt蛋白对细胞增殖和肿瘤生长的作用似乎取决于Wnt蛋白与其关联细胞表面受体的相互作用以及随后诱导下游信号转导。由于Wnt蛋白是分泌的配体，可用抗体干扰或抑制Wnt与其细胞表面受体的结合，从而影响下游信号转导。已经产生了抗Wnt蛋白的几种抗体。例如，抗Wnt-1(G-19)(sc-6280；Santa Cruz Biotechnology，Inc.)和抗Wnt2(H-20)(sc-5208；Santa Cruz Biotechnology，Inc.)是分别针对用作图在人Wnt-1和Wnt2蛋白的N末端附近的肽山羊多克隆抗体。Wnt2(V-16)是用作图在人来源的Wnt2的内部区域中的肽产生的山羊多克隆抗体(sc-5207；Santa CruzBiotechnology，Inc.)。
然而，当用非人动物产生多克隆单克隆抗体时，多克隆和单克隆抗体在人体中的应用受到严重限制。对人重复注射“外来”抗体如小鼠抗体，可能导致有害的超敏反应，即人抗-小鼠抗体(HAMA)或抗-独特型应答。由于人血清清除速率升高和/或患者的过敏反应，HAMA应答使重复给予变得无效。
尝试用人杂交瘤生产人源性单克隆抗体。不幸的是，与小鼠杂交瘤相比，人杂交瘤细胞系的单克隆抗体产率相对低。此外，与小鼠细胞系相比，表达免疫球蛋白的人细胞系相对不稳定，这些人细胞系的抗体生产能力是暂时的。因此，虽然人免疫球蛋白是非常理想的，人杂交瘤技术仍未达到可容易地获得具有所需抗原特异性的人单克隆抗体的阶段。因此，用遗传工程改造非人来源的抗体，产生嵌合或人源化抗体。这种遗传工程改造产生与将小鼠抗体注射给人后预计产生的HAMA应答风险相比HAMA应答风险降低的抗体。例如，可通过将非人可变区与人恒定区嫁接形成嵌合抗体(Khazaeli等(1991)，J.Immunotherapy 15：42-52)。通常，通过将非人互补决定区(CDR)嫁接在人构架区(FR)上形成人源化抗体(参见Jones等(1986)，Nature321：522-525和Reichman等(1988)，Nature 332：323-327)。一般通过将非人抗体的所有六个(三个轻链和三个重链)CDR嫁接到人抗体的构架区(FR)中形成人源化单克隆抗体(参见例如，美国专利号6,407,213)。或者，可用Fv抗体(参见美国专利号4,642,334)或单链Fv(SCFV)抗体(参见美国专利号4,946,778)降低HAMA应答的风险。
尽管在对Wnt2信号转导的理解中取的了最新的进展，这一信号途径在肿瘤形成中的作用仍不清楚。因而，在先的技术无法提供调控Wnt2途径的化合物能够(例如)用于癌症治疗的明确证据。本发明致力于解决这些问题及其他需求。
发明概述
本发明提供了抑制过表达Wnt2的细胞增殖的方法。该方法包括将所述细胞与抑制Wnt2信号转导的物质相接触，其用量能有效抑制该细胞增殖。
在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞，所述癌细胞选自乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、间皮瘤、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、肠癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤的癌细胞。
在一个实施方式中，所述物质是siRNA。在一些实施方式中，所述物质是抗-Wnt2抗体，例如，特异性结合于Wnt2蛋白，优选人Wnt2蛋白的抗体。
本发明抗体可以是多克隆或单克隆抗体。优选抗-Wnt2单克隆抗体。优选的单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
本发明还提供了特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ IDNO：2)的氨基酸序列的多肽的抗-Wnt2抗体。另一种抗-Wnt2抗体特异性结合于包含SSQRQLCHRPDVMR(SEQ ID NO：2)的多肽。
本发明也提供了与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合Wnt2蛋白的抗-Wnt2抗体，第二种抗-Wnt2抗体特异性结合于包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽。另一种抗-Wnt2抗体与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合Wnt2蛋白，第二种抗-Wnt2抗体特异性结合于包含SSQRQLCHRPDVMR(SEQ ID NO：2)的多肽。
本发明还提供了诱导过表达Wnt2的细胞凋亡的方法。该方法包括将细胞与抑制Wnt2信号转导的物质相接触，该物质的用量能有效诱导细胞凋亡。在另一方面，提供了抑制细胞中Wnt2信号转导的方法。此方法包括将过表达Wnt2的细胞与能有效抑制Wnt2信号转导的量的抗-Wnt2抗体相接触。
在本发明的优选实施方式中，提供了治疗Wnt2信号转导相关性疾病的方法。此方法包括给予需要所述治疗的对象抑制Wnt2信号转导的物质，其用量能有效治疗该疾病。所述物质可以是抗-Wnt2抗体或siRNA。所述疾病可以是癌症，优选选自：乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、间皮瘤、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、肠癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤的癌细胞。
在本发明的另一实施方式中，提供了治疗过表达Wnt2的癌症的方法。该方法包括给予对象本文所述的抗-Wnt2抗体，其用量能有效治疗所述癌症。所述抗-Wnt2抗体优选为单克隆抗体。在优选实施方式中，抗-Wnt2抗体包含(i)SEQ ID NO：56、SEQID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
本发明还提供了特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ IDNO：2)的氨基酸序列的多肽的单克隆抗-Wnt2抗体。在本发明优选实施方式中，此种单克隆抗-Wnt2抗体与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合于Wnt2蛋白，第二种抗-Wnt2抗体特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽。
本发明还提供了编码抗-Wnt2抗体和其功能片段的核酸。在优选实施方式中，编码抗-Wnt2抗体的核酸包含(i)编码VLCDR1的核酸，选自SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：113和SEQ ID NO：131所示核酸序列；(ii)编码VLCDR2的核酸，选自SEQ IDNO：72和SEQ ID NO：115所示核酸序列；(iii)编码VLCDR3的核酸，选自SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：143所示核酸序列；(iv)编码VHCDR1的核酸，选自SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：97所示核酸序列；(v)编码VHCDR2的核酸，选自SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：99所示核酸序列；和(vi)编码VHCDR3的核酸，选自SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：120所示核酸序列。
而且，本发明提供了包含抗Wnt2抗体或siRNA和药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂的药物组合物。
可在体外和/或体内实施本发明方法。本发明的方法、抗体、药物组合物和试剂盒包含本文所述的详细情况。
附图简要说明
图1.抗-Wnt2单克隆抗体诱导癌细胞凋亡。(a)该图显示了抗-Wnt2抗体治疗后NHBE细胞和四种人NSCLC细胞系(A549、H460、H1703和H1299)的0.5％结晶紫染色，(b)该图显示了用流式细胞术分析凋亡的这些例子。从上至下分别是A549、H460和H1703 NSCLC细胞，用对照抗体和抗Wnt2单克隆抗体分别处理，(c)抗Wnt2单克隆抗体对NSCLC细胞系A549的特异性细胞杀伤作用。该图显示了仅用单克隆抗体和采用与封闭肽预孵育封闭的单克隆抗体处理约72小时后A549死细胞的百分数。对照是仅用封闭肽和对照mAb。孵育后，收集细胞，用于流式细胞术分析。结果是平均值±标准差(误差线)。
图2.在NSCLC细胞系A549中抗-Wnt2单克隆抗体降低了Wnt信号转导并增强了凋亡信号转导。(a)抗-Wnt2抗体处理之前和之后对NSCLC a549的β-联蛋白、存活蛋白、细胞色素c、胱冬酶原-3和切割的胱冬酶-3进行的Western分析，(b)与对照或抗Wnt2单克隆抗体一起孵育后NSCLC细胞系A549中Tcf-依赖性转录活性的TOPFLASH试验。
图3.Wnt2 siRNA能在NSCLC细胞系A549中诱导凋亡并阻断Wnt信号转导。(a)用膜联蛋白V分析Wnt2 siRNA诱导的凋亡。从左至右分别用非沉默性对照siRNA和Wnt2 siRNA处理A549。(b)Wnt2 siRNA处理后A549细胞中的Wnt2、β-联蛋白、存活蛋白的Western分析。非沉默性siRNA用作对照。
图4.抗Wnt2单克隆抗体对肺转移的作用的体内研究。
图5.与化疗协同作用。当低剂量化疗(多西他赛)与低剂量单克隆抗Wnt2抗体联用时，在A549细胞中观察到协同作用。
图6.抗-Wnt2单克隆抗体诱导黑色素瘤细胞系和原代培养物凋亡，(a)此图显示了抗-Wnt2抗体处理后正常人上皮角化细胞(NHEK)和四种人黑色素瘤细胞系(LOX、FEMX、FEM和SK-Mel-2)的0.5％结晶紫染色图，(b)此图显示了用流式细胞术分析凋亡的这些例子。分别用对照抗体和抗Wnt2单克隆抗体处理FEMX和LOX癌细胞。FLl-H代表膜联蛋白V-FITC染色，(c)抗Wnt2单克隆抗体对FEMX和LOX癌细胞的特异性细胞杀伤作用。该图显示了仅用单克隆抗体和采用与封闭肽预孵育封闭的单克隆抗体处理约72小时后FEMX和LOX死细胞的百分数。对照是仅用封闭肽和对照mAb。孵育后，收集细胞，用于流式细胞术分析。结果是平均值±标准差(误差线)。(d)抗-Wnt2抗体处理之前和之后的Western分析。用抗Wnt2抗体处理两种黑色素瘤细胞系FEMX和LOX。评价Dvl-3、β-联蛋白、存活蛋白、细胞周期蛋白D1、细胞色素c、胱冬酶原-3和切割的胱冬酶-3的表达。肌动蛋白用作加样对照，(e)抗-Wnt2单克隆抗体处理后，LOX黑色素瘤细胞系中c-Myc和纤连蛋白基因下调。总RNA用于杂交，(f)此图显示了刚刚从恶性黑色素瘤患者取得的原代肿瘤培养物用抗-Wnt2抗体处理后的0.5％结晶紫染色。
图7.Wnt2 siRNA能在FEMX和LOX癌细胞系中诱导凋亡并阻断Wnt信号转导，(a)用膜联蛋白V分析Wnt2 siRNA诱导的凋亡。分别用非沉默性对照siRNA和Wnt2 siRNA处理LOX和FEMX癌细胞，(b)Wnt2 siRNA处理后，对LOX和FEMX细胞中的Wnt2、β-联蛋白、存活蛋白进行Western分析。肌动蛋白用作加样对照。非沉默性siRNA用作对照。(c)Wnt2 siRNA处理LOX细胞后c-Myc和纤连蛋白基因下调。总RNA用于杂交。
图8.抗-Wnt2单克隆抗体在体内抑制肿瘤生长，(a)抗-Wnt2单克隆抗体处理(和对照mAb和PBS处理)在LOX肿瘤细胞接种3天后开始，显示了处理后各个时间点上的肿瘤体积(mm3)。结果是八只动物的平均值±标准差(误差线)，(b)分别用PBS、对照单克隆抗体或抗-Wnt2单克隆抗体处理后的肿瘤重量改变。结果是八只动物的平均值±标准差(误差线)。
图9.间皮瘤组织中的Wnt-相关性基因表达分布型。(A)从16个匹配的恶性间皮瘤和邻近正常胸膜抽提RNA。抽提后，对RNA进行逆转录酶反应，用生物素-16-dUTP标记cDNA探针，与Wnt特异性阵列杂交。用化学发光反应进行检测，用膜使X线胶片曝光。作为例子，这里显示了两个匹配的样品。用黑色圆圈指出Wnt2。(B)然后根据生产商提供的GEArray Q系列人Wnt信号传导途径阵列的基因列表匹配数据。用灰色表示与正常组织相比在恶性组织中上调的基因(Wnt2是浅灰色)。(C)详细列出了在所有研究样品(8对)中上调和下调的基因。
图10.正常和间皮瘤细胞系以及组织中的Wnt2表达。(A)正常间皮细胞系(LP9)和几种恶性间皮瘤细胞系中Wnt2表达的Western印迹分析。(B)组织中Wnt2表达的Western印迹分析。由新鲜切除的肿瘤(T)和自体匹配的正常胸膜(N)制备全细胞抽提物。肌动蛋白用作对照。
图11.抗-Wnt2单克隆抗体诱导间皮瘤细胞系凋亡。(A)不用或用对照抗体(对照Ab)或浓度为10μg/ml的特异性单克隆抗-Wnt2抗体(Wnt2 mAb)处理的四种恶性胸膜间皮瘤细胞系的0.5％结晶紫染色结果。(B)用Wnt2抗体处理后H28细胞的形态学的例子。(C)不处理(白色柱)、对照抗体处理(浅灰色柱)或10μg/mlWnt2单克隆抗体处理(深灰色柱)3天后用流式细胞术测定的凋亡细胞百分数的小结。结果是平均值±SD(误差线)。(D)用流式细胞术进行凋亡分析。分别用10.0μg/ml对照抗体和10.0μg/ml抗-Wnt2抗体处理H28和513细胞约72小时。FLl-H代表膜联蛋白V-FITC染色，FL3-H代表碘化丙锭染色(PI)。
图12.Wnt2 siRNA在间皮瘤细胞系中诱导凋亡并阻断Wnt信号转导。(A)仅用lipofectamine、用非沉默性siRNA(对照siRNA)或100nM特异性Wnt2 siRNA(Wnt2siRNA)转染35天后(未处理)三种恶性胸膜间皮瘤细胞系的0.5％结晶紫染色。(B)用膜联蛋白V分析Wnt2 siRNA诱导的凋亡。如A所述转染间皮瘤细胞。(C)Wnt2 siRNA处理(100nM 72小时)、无处理和非沉默性siRNA用作对照后的Western分析。Wnt2、Dvl-3、β-联蛋白用作第一抗体，β-肌动蛋白用作加样对照。
图13.Wnt2抗体和Alimta对细胞增殖的作用。将MS1间皮瘤细胞系接种在96孔板中，用浓度逐渐升高的Wnt2抗体(虚线)、Alimta(实线)或二者(长虚线)处理。3天后通过测定细胞酶的代谢活性(这里是四唑氮转化)评价细胞增殖。结果是平均值±SD(误差线)。
图14.抗-Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的互补决定区(CDR)和构架区(FR)的氨基酸和核酸序列。显示了轻链κ和重链IgG1的序列。编号指基于与小鼠单克隆抗体(IMGT，Immunogen Genetics)比对的氨基酸残基位置。虚线是FR区，实线是CDR区。
图15.抗-Wnt2单克隆抗体8B11.D2的互补决定区(CDR)和构架区(FR)的氨基酸和核酸序列。A.轻链κ的序列。B.重链IgG1的序列。如图14所述对氨基酸残基编号。虚线是FR区，实线是CDR区。
图16.抗-Wnt2单克隆抗体17F7.E5的互补决定区(CDR)和构架区(FR)的氨基酸和核酸序列。A.轻链κ的序列。B.重链IgG1的序列。如图14所述对氨基酸残基编号。虚线是FR区，实线是CDR区。
图17.抗-Wnt2单克隆抗体8B11.H6的互补决定区(CDR)和构架区(FR)的氨基酸和核酸序列。A.轻链κ(链-1)的序列。B.轻链κ(链-2)的序列。C.重链IgG1的序列。如图14所述对氨基酸残基编号。虚线是FR区，实线是CDR区。
图18.抗-Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的互补决定区(CDR)和构架区(FR)的氨基酸和核酸序列。A.轻链κ(链-1)的序列。B.轻链κ(链-2)的序列。C.重链IgG1的序列。如图14所述对氨基酸残基编号。虚线是FR区，实线是CDR区。
定义
术语“Wnt蛋白”或“Wnt配体”是指与果蝇体节极性基因(无翅型)相关的哺乳动物蛋白家族。在人类中，Wnt家族基因通常编码具有疏水信号序列和保守的天冬酰胺连接的寡糖共有序列的分子量38-43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白(Shimizu等，CellGrowth Differ8(12)：1349-58(1997))。Wnt家族包括至少19个哺乳动物成员。示例性的Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、WNT10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15和Wnt16。本发明的优选Wnt蛋白是Wnt2，优选人Wnt2蛋白。
术语“卷曲蛋白”或“卷曲蛋白受体”是指与果蝇卷曲基因(在组织极性的发展中发挥作用)相关的哺乳动物蛋白家族。卷曲蛋白家族包括至少10个哺乳动物基因。示例性的人类卷曲蛋白受体包括Frizzled1，Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled6、Frizzled7、Frizzled8、Frizzled9和Frizzled10。果蝇卷曲蛋白的哺乳动物同源体共有多个共同结构基序。位于细胞外膜表面的N末端后的是一个信号序列、一个含10个半胱氨酸残基的恒定分布型的120个氨基酸构成的结构域以及一个由40-100个高度变化的亲水性氨基酸构成的高度多样的区域。假定的疏水片段形成由亲水环连接的7次跨膜螺旋结构，以位于细胞膜内侧的C末端结束。所述的富含半胱氨酸的结构域(CRD)和跨膜片段是高度保守的，这表明了其中细胞外CRD通过可变的连接区域与一束7次跨膜螺旋结构相连的工作模式。因此，卷曲蛋白受体具有类似于具有氨基端配体结合结构域的G-蛋白偶联受体的跨膜信号转导的动力学模型。例如，Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7涉及肺癌和结肠直肠癌(Sagara等，Commun，252(1)：117-22(1998))；Frizzled3涉及包括肺癌、宫颈癌和结肠直肠癌的人类癌细胞(Kirikoshi等，Int J Oncol 19(4)：767-71(2001))；Frizzled7涉及胃癌(Kirikoshi等，Int JOncol，19(4)：111-15(2001))；Frizzled10涉及胃癌和结肠直肠癌(Kirikoshi等，Int JOncol，19(4)：767-71(2001)；Terasaki等，Int J MolMed，9(2)：107-12(2002))。
术语“蓬乱蛋白”或“Dvl”是指蓬乱蛋白家族成员，其全长序列通常含有3个保守结构域：一个存在于Wnt拮抗蛋白轴蛋白上的DIX结构域，一个参与蛋白之间相互作用的PDZ结构域和一个在调节Rho GTP酶的蛋白中发现的DEP结构域。Dvl蛋白包括，例如Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3。包括小鼠和人类在内的多个物种的Dvl的核酸和蛋白序列是已知的。示例性的人类Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白序列可以分别通过参照序列 NP_004412、NP_004413和NM_004414得到。
Wnt信号转导尤其是Wnt2信号转导的“抑制剂”是指例如与Wnt或卷曲蛋白结合、或在已知的Wnt信号转导的检测方法中(例如，β-联蛋白水平测量，或由Tcf和Lef转录因子调控的致癌基因的表达)测得部分或完全阻碍Wnt信号转导的化合物或物质。抑制剂包括修饰形式的Wnt或卷曲蛋白，以及天然或合成的配体、拮抗剂、激动剂、抗体、小分子化合物等等。后面对检测本发明抑制剂的方法作了更详细描述。
术语″过表达Wnt2蛋白的细胞″、″过表达Wnt2 mRNA的细胞″、″过表达Wnt2蛋白的癌细胞″或″过表达Wnt2 mRNA的癌细胞″或其语法等效形式指其中Wnt2蛋白或Wnt2 mRNA的表达至少是来自相同组织的正常细胞中表达水平的2倍，经常是至少5倍的细胞或癌细胞。测定具体基因表达水平的方法是本领域内所熟知的。这样的方法包括RT-PCR、使用所述基因产物抗体等。
这里所使用的“抗体”涉及与具体抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括多克隆和单克隆抗体。该术语也包括诸如嵌合抗体(如人源化小鼠抗体)和杂合抗体(如双特异性抗体)等遗传工程形式的抗体。术语“抗体”也包括抗体的抗原结合形式，这包括具有抗原结合能力的片段(例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv和rIgG，也可参见Pierce公司(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)的目录和手册，1994-1995；也可参见Kuby，J.所著《免疫学》第3版(Immunology，W.H.Freeman & Co.，New York(1998))。该术语也包括重组单链Fv片段(scFv)。术语“抗体”也包括二价或双特异性分子、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。例如在Kostelny等，(1992)J Immunol 148：1547；Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 31：1579；Hollinger等，1993，同上；Gruber等，(1994)J Immunol：5368；Zhu等，(1997)Protein Sci 6：781，Hu等，(1996)Cancer Res.56：3055；Adams等，(1993)Cancer Res.53：4026；以及McCartney等，(1995)ProteinEng.8：301中对二价和双特异性分子进行了描述。
与具体抗原具有免疫反应性的抗体可以通过诸如在噬菌体或类似载体中的重组抗体文库的筛选等重组方法(可以参见Huse等，Science 246：1275-1281(1989)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；以及Vaughan等，Nature Biotech.14：309-314(1996))，或通过用抗原或编码抗原的DNA免疫动物产生。
通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每条重链和轻链包含恒定区和可变区(这些区域也称为“结构域”)。轻链和重链可变区包含4个“构架区”，其间插入了3个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)。已经确定了构架区和CDR的范围。同种内不同的轻链或重链的构架区序列相对保守。构成抗体轻链和重链的构架区组合组成抗体的构架区，该构架区为在三维空间中定位并排列CDR提供支持。
CDR主要负责与抗原表位结合。每条链的CDR经常是指CDR1、CDR2和CDR3，按顺序从N末端开始编号，并通常也通过具体CDR所位于的链加以鉴别。这样，VHCDR3位于其所在抗体的重链可变区上，而VLCDR1是来自其所在抗体的轻链可变结构域的CDR1。
提及的“VH”或“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，这包括Fv、scFv、dsFv(二硫键稳定的Fv)或Fab的重链。提及的“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，这包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。
术语“单链Fv”或“scFv”是指这样一种抗体，其中传统双链抗体的轻链和重链可变区已连接形成单链。通常，在所述两条链之间插入连接肽，以使之正确折叠并建立活性结合位点。
“嵌合抗体”是这样一种免疫球蛋白分子，其中(a)改变、取代或交换恒定区或其部分，从而使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的种类的、效应功能和/或物种的恒定区，或是赋予嵌合抗体全新功能的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等等)相连接；或(b)用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或交换可变区或其部分。
“人源化抗体”是含有最少源自非人类免疫球蛋白序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括这样的人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的诸如小鼠、大鼠或兔等非人类种属(供体抗体)的CDR的残基所取代。在有些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区残基被相应的非人源残基所取代。人源化抗体也可以包含既不存在于受体抗体上的、也不存在于引入的CDR或骨架序列中的残基。通常，人源化抗体应包括实质上至少一个，通常是两个完整的可变结构域，其中完整的或实质上完整的CDR区域对应于非人类免疫球蛋白的CDR区域，并且完整的或实质上完整的骨架(FR)区是人免疫球蛋白共有序列的构架区。人源化抗体优选也应包括通常是人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分((Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))。从而，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中实质上少于一个完整的人的可变结构域已被来自非人类种属的相应序列所取代。
术语“完全人抗体”指除人构架区和恒定区以外还包含人可变区的免疫球蛋白。可用本领域已知的各种技术生产这种抗体。例如，体外方法包括采用在噬菌体(如，McCafferty等，1990，Nature 348：552-554；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；和Marks等，J.Mol.Biol.222：581(1991))、酵母细胞(Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15：553-557)或核糖体(Hanes和Pluckthun，1997，Proc Natl Acad Sci USA94：4937-4942)上展示的人抗体片段的重组文库。相似地，可通过将免疫球蛋白基因座引入内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转基因动物，如小鼠制备人抗体。攻击后，观察人抗体产生情况，所产生抗体在所观察的各个方面(包括基因重排、组装和抗体的所有组成成分)都非常类似于人体中产生的抗体。此方法参见例如：美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及以下科学文献：如Jakobavits，Adv Drug Deliv Rev.31：33-42 (1998)，Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上结合抗体的位置。表位可以是由邻接的氨基酸或不邻接的氨基酸通过蛋白的三级折叠并置形成的。由邻接的氨基酸构成的表位通常在与变性溶剂接触下得以保持，而由三级折叠形成的表位在变性溶剂处理下通常会丧失。表位典型地包括一个独特的空间构象中的至少3个，以及更为常见地至少5个或8-10个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括，例如，X射线结晶照相术和2维核磁共振。参见例如Glenn E.Morris主编的《分子生物学方法中的表位作图法》第66卷(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，1996))。
这里所使用的“生物学样品”是包含核酸或多肽(例如Wnt蛋白的核酸或多肽)、多核苷酸或转录物的生物组织或体液的样品。这样的样品包括但不限于分离自灵长类(例如人)或啮齿类(例如小鼠和大鼠)的组织。生物学样品也可以包括组织切片，诸如活组织切片和剖检切片样品、出于组织学目的获取的冷冻切片、血液、血浆、血清、唾液、粪便、眼泪、粘液、头发、皮肤等等。生物学样品也包括源自患者组织的移植物以及初级的和/或转化的细胞培养物。生物学样品典型地得自真核有机体，最优选得自如灵长类(例如黑猩猩或人)、牛、狗、猫、啮齿类(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、兔等哺乳动物；或鸟类；爬行动物；或鱼类。
“提供一种生物学样品”意味着获得一种用于本发明所述方法的生物学样品。最常见地，这可以通过从动物，优选人中取出细胞样品完成，不过也可以通过使用事先分离的细胞(例如，由其他人、在其他时候、以及/或为其他目的分离的细胞)、或通过在活体内实行本发明的方法得以完成。具有治疗或治疗结果历史的存档的组织会是尤其有用的。
生物样品中“Wnt2 mRNA水平”指细胞或生物样品中存在的Wnt2基因转录出的mRNA的量。此mRNA通常编码有功能的Wnt2蛋白，但也可能存在改变或消除编码蛋白功能的突变。“Wnt2 mRNA水平”不必定量，但可简单地检测，如由人主观观察检测，与或不与对照样品水平或对照样品的预计水平作比较。
生物样品中“Wnt2蛋白或多肽的水平”指翻译自细胞或生物样品中存在的Wnt2mRNA的多肽的量。此多肽可具有或不具有Wnt2蛋白功能。“Wnt2蛋白水平”不必定量，但可简单地检测，如由人主观观察检测，与或不与对照样品水平或对照样品的预计水平作比较。
在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同的”或“相同”百分数是指如使用下述默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比较运算法则或通过手工对齐排列并目测(参见例如，Altschul等，Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))测得的，相同或具有特定同一性百分数的氨基酸残基或核苷酸(例如，当相互比较并在一个对比窗口或指定区间上作最大对应度对齐排列时，在一个具体的区域上约60％相同，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两个或多个序列或亚序列。这样的序列则被称为“几乎相同的”。这一定义也涉及，或可以用于，对待测序列的评价。这一定义也包括具有缺失和/或添加，以及那些具有置换的序列，以及天然的(例如多态性或等位基因变体)和人造的变体。如下所述，优选的运算法则可以计算缺口等等。优选地，相同性存在于长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地，存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
为了序列比对，通常一条序列作为参照序列，待测序列与其比对。在使用一种序列比对算法时，待测的和参照序列被输入计算机，如果需要则指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认的程序参数，或可以指定另外的参数。序列比对算法随后在程序参数的基础上计算待测序列相对于参照序列的序列相同性百分比。
这里所使用的“比对窗口”包括从通常包括20到600、经常是约50到200、更常见的是约100到150的组中选择的邻接位置的编号之一的片段，其中序列可以与具有相同邻接位置编号的参照序列在两段序列最优化对齐后进行比对。序列对齐排列用于比对的方法是本领域内熟知的。用于比对的最佳对齐排列可以通过，例如Smith& Waterman在Adv.Appl.Math.2：482(1981)中报道的局部同源度算法、通过Needleman & Wunsch在J.Mol.Biol.48：443(1970)中报道的同源排列算法、通过Pearson & Lipman在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)中报道的搜寻相似性的方法、通过这些算法的计算机化运用(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)、或通过手工排列和目测(参见，例如Ausubel等人主编的《分子生物学现有实验方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，1995增刊)进行。
适合于确定序列相同性和序列相似性百分比的优选实施方式包括BLAST和BLAST2.0算法，这些算法在Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中作了描述。BLAST和BLAST2.0使用这里所述的参数用于确定本发明的核酸与蛋白的序列相同性百分比。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心向公众开放。这一算法包括鉴别查询序列中的W长度的短字段，该短字段与一条数据库序列中相同长度的字段对齐排列时，两者相匹配或满足一定的正值阀值T，由此首先鉴别高分值的序列对(HSPs)。T作为邻近字段分值界限的参考(Altschul等，同上)。这些初始邻近字段命中作为启动搜寻将其包含在内的更长的HSPs的依据。只要累积的排列分值能够提高，字段命中就沿每条序列往两侧延伸。例如对于核苷酸序列而言，累积的分值使用参数M(对一对匹配的残基的加分；总是大于0)和N(对不匹配残基的扣分；总是小于0的)进行计算。对于氨基酸序列来说，使用计分矩阵计算累计的分值。字段命中在每个方向上的延伸在以下情况下中断：累计排列分值从其达到的最高值下跌了X数量；由于一个或多个负得分残基排列的累积导致累计分值达到0或更低；或达到了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定对齐排列的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)作为默认值使用字段长度(W)值11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，并对双链进行比对。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序作为默认值使用字段长度3、期望值10以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))排列值(B)50、期望值10、M＝5、N＝-4，并对双链进行比对。
BLAST算法也进行两条序列间相似性的统计学分析(例如参见Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似度的一种量度是最小概率和(P(N))，这提供了一种两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然匹配的概率的指标。例如，如果在待测序列与参照序列的比对中最小概率和小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，一条核酸被认为与参照序列相似。对数值可以是大负数，例如5、10、20、30、40、70、90、110、150、170等等。
两个核酸序列或多肽几乎相同的一个标志是由第一条核酸编码的多肽与用第二条核酸编码的多肽所产生的抗体发生如下所述免疫交叉反应。因而，例如当两段肽只有保守性置换的差异时，一条多肽通常与第二条多肽几乎相同。两个核酸序列几乎相同的另一个标志是所述两个分子或其互补链在如以下所述的严格条件下互相杂交。两个核酸序列几乎相同的另一个标志是可以使用相同的引物扩增所述序列。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯净的”是指与其天然状态下被发现通常伴随的成分几乎或基本分开的材料。纯度和同质度通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC等分析化学技术确定。制剂中主要的种类的蛋白或核酸是充分纯化的。具体地说，分离的核酸是与一些与所述基因天然旁侧相连，而且所编码蛋白与所述基因编码蛋白不同的开放阅读框分离的。在有些实施方式中，术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳胶上基本上产生单一条带。优选地，这表示所述核酸或蛋白纯度至少85％、更优选至少95％、最优选至少99％。在其他实施方式中，“纯化”表示从要纯化的组合物中去除至少一种杂质。就这种意义而言，纯化不要求经纯化的化合物是同质的，例如100％纯净的。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白”在这里是可以交替使用的，是指氨基酸残基的聚合物。这一术语用于其中一个或多个氨基酸残基是对应于天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物、包含修饰的残基以及非天然氨基酸的聚合物。
术语“氨基酸”指天然的和合成的氨基酸，以及功能类似于天然氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是指那些由遗传密码编码的氨基酸以及那些随后被修饰的氨基酸(例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酰胺和O-磷丝氨酸)。氨基酸类似物指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构(例如，与1个氢原子、1个羧基、一个氨基和1个R基相连的α碳原子)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲锍。这样的类似物可以具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保持了如天然氨基酸一样的化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸通常化学结构的结构，但其功能类似于天然氨基酸的化合物。
这里氨基酸可以用其通常使用的3字母符号表示或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样地，核苷酸可以用其通用的单字母编码表示。
“保守修饰变体”用于氨基酸和核酸序列。对于具体的核酸序列而言，保守修饰变体是指那些编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列，指基本相同或相关的序列，例如天然邻接的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码大部分蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在每个由一个密码子确定丙氨酸的位置上，该密码子可以改为所述的另一个密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变体是“沉默变体”，是保守修饰变体的一种类型。这里所述每个编码多肽的核酸序列也描述了该核酸的沉默变体。本领域技术人员应当认识到，在某些情况下，核酸中的每种密码子(除了AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。相应地，关于表达产物而无关于实际探针序列，所述序列通常包括编码多肽的核酸的沉默变体。
对于氨基酸序列而言，本领域技术人员应当认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行个别的改变、添加或删除，从而在编码序列中置换、增加或删除单个氨基酸或低百分比氨基酸的是一种“保守修饰变体，只要所述的改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域内所熟知的。这样的保守修饰变体是对本发明中多态性变体、种间同源物和等位基因的补充而不是排斥。典型地相互保守置换是：1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton所著《蛋白质》(Proteins，1984))。
诸如多肽结构的大分子结构可以用组织的多种水平的术语描述。对这一组织水平的全面讨论，可以参见例如Alberts等所著《细胞分子生物学》第3版(Molecular Biologyof the Cell(第三版，1994))以及Cantor & Schimmel所著《生物物理化学》第一部分：《生物大分子构象》(Biophysical Chemistry Part I：The Conformation of BiologicalMacromolecules(1980))。“初级结构”是指具体肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽中局部有序的三维结构。这些结构通常称为结构域。结构域是通常形成紧凑单位的多肽的一部分，并且通常长度为25到大约500个氨基酸。典型的结构域由诸如β折叠和α螺旋等更低组织水平的结构部分构成。“三级结构”是指多肽单体完整的三维结构。“四级结构”是指通常通过独立的三级单位的非共价连接形成的三维结构。各向异性的术语也称为能量术语。
“标记”或“可检测部分”是能通过分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测到的合成物。例如，有用的标记包括荧光染料、电子密度试剂、酶(如经常用于ELISA的)、生物素、地高辛或半抗原以及蛋白质或其他能够进行检测的试剂，例如通过将放射性标记掺入肽中，或用于检测与所述肽特异性反应的抗体。放射性同位素可以是例如3H，14C，32P，35S或125I。在有些情况下，特别是使用针对本发明中蛋白的抗体的情况下，放射性同位素如以下所述用作有毒部分。标记可以结合到核酸、蛋白质和抗体的任何位置上。任何本领域内已知的抗体和标记偶联的方法均可使用，这些方法包括由Hunter等，Nature，144：945(1962)；David等，Biochemistry，13：1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40：219(1981)；以及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407(1982)中描述的那些方法。通过添加稳定放射性标记的肽或抗体并保护其免受降解的试剂可以延长放射性标记的肽或放射性标记的抗体组合物的寿命。可以使用任何稳定放射性标记肽或抗体的试剂或试剂组合，这包括美国专利No.5,961,955中所公开的那些试剂。
“效应子”或“效应部分”或“效应组分”是指与抗体通过连接物或化学键以共价方式或通过离子键、范德华力、静电作用或氢键以非共价方式结合(或连接，或偶联)的分子。“效应子”可以是多种分子，包括例如包括放射性化合物、荧光化合物、酶或底物、如标为标签的标记物、毒素等检测部分；可激活部分，化疗剂；脂肪酶；抗生素；或发射“重”射线(如β射线)的同位素的部分。
在涉及例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过外源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变进行改造，或所述细胞源自这样改造的细胞。因此，例如重组细胞表达细胞在天然(未重组)状态下未发现的基因或表达以另外方式异常表达、低表达或完全不表达的基因。这里的术语“重组核酸”表示通过核酸操作，例如通过使用聚合酶和内切酶，通常最初在体外形成的核酸，其以通常自然界中不存在的形式存在。这样，实现了不同序列以可操作方式连接。这样，分离的线性核酸，或通常不连接的DNA分子通过体外连接形成的表达载体，均可认为是符合本发明目的的重组子。需要理解的是，一旦制备了重组核酸并将其重新导入宿主细胞或有机体，该核酸将以非重组方式复制，也就是说使用宿主细胞的体内细胞机器而不是体外操控方式复制；然而，这样的核酸一旦以重组方式产生，虽然随后以非重组方式复制，任被认为适于本发明目的的重组子。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术制造(即通过如上所述的重组核酸的表达)的蛋白。
当用于核酸的部分时，术语“异源的”表示所述核酸包括两个或多个亚序列，这些亚序列通常在自然条件下不存在相同的相互关系。例如，所述核酸通常以重组方式产生，具有两个或多个例如来自无关基因(例如，一种来源的启动子和另一来源的编码区)的序列，经过组织形成新的功能性核酸。类似地，异源蛋白质通常包括自然条件下不存在相互关系的两个或多个亚序列(例如融合蛋白)。
当提及蛋白质或肽或抗体时，短语与抗体或抗原，如蛋白质，优选Wnt2蛋白“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)免疫反应”是指在含有蛋白质和其他生物样品的异质性种群中决定所述蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的免疫检测条件下，具体的抗体与特定蛋白结合比背景高两倍、更典型地是比背景高10到100倍。
在这样的条件下与抗体的特异性结合需要选择具有针对特定蛋白的特异性的抗体。例如，针对特定蛋白质、多态性变体、等位基因、直向同源基因、以及保守修饰变体、或剪接变体、或其部分产生的抗体可以进行选择以获得那些与Wnt2蛋白但不与其他蛋白质特异性免疫反应的抗体。这一选择可以通过扣除与其他分子交叉反应的抗体实现。多种免疫检测方式可以用于选择与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫检测经常用于选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(至于对可以用于确定特异性免疫反应的免疫检测方式和条件的描述，可以参见，例如Harlow & Lane所著《抗体：实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual(1988))。
“肿瘤细胞”包括肿瘤中的癌前期细胞、癌细胞以及正常细胞。
组织培养物中的“癌细胞”、“转化的”细胞或“转化”是指自发或诱导的、不一定包括新遗传材料摄取的表型改变。虽然转化可以用转化病毒感染和新的基因组DNA的引入或外源DNA的摄取产生，也可以自发地或与致癌试剂接触后使内源基因发生突变而产生。在本发明中，转化通常与Wnt和/或卷曲蛋白的过表达相关。转化与其他诸如细胞永生化、异常生长调控、非形态学变化和/或恶性等表型改变有关(参见Freshney所著《动物细胞培养：基础技术手册》第3版(Culture of Animal Cells a Manualof Basic Technique(第三版，1994))。
“小干扰RNA”或“siRNA”指已证明能用作引发序列特异性RNA降解中的关键中间体的分离的RNA分子，优选长度大于10个核苷酸，更优选长度大于15个核苷酸，最优选长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。19-25个核苷酸是最优选的siRNA大小。siRNA也可包括小发夹RNA(shRNA)，其中siRNA双链体的两条链被包括在一个RNA分子中。双链siRNA通常由正义和反义链组成。单链siRNA通常仅由与靶基因或mRNA互补的反义链组成。siRNA包括任何形式的RNA，优选dsRNA(较大dsRNA、部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA的蛋白酶水解切割产物)以及通过加入、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸与天然存在的RNA不同的修饰RNA。
发明详述
WO04/032838在一定程度上描述了Wnt-Fz信号传导途径在癌发生中的作用。本发明提供了可在过表达Wnt2的许多癌症中诱导凋亡的Wnt2信号传导途径抑制剂。本发明可用于治疗与Wnt2信号转导相关的疾病，特别是Wnt2信号转导影响癌细胞生长和存活的癌症。本发明特别可用于治疗癌症如乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、间皮瘤、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、肠癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤。
本发明证明，阻断Wnt2信号转导能导致Wnt-Fz途径下游组分，具体是蓬乱蛋白(Dvl)和β-联蛋白的下调。本发明也证明，通过激活JNK，由线粒体将Smac/Diablo和细胞色素C释放到胞浆中，引起抗体诱导的凋亡。细胞色素c使凋亡抑制蛋白存活蛋白失活，导致胱冬酶活化。本发明还提供了抑制体内肿瘤生长的抗-Wnt2单克隆抗体。
I.抗WNT2抗体
如上所述，本发明提供了抑制过表达Wnt2的细胞，尤其是癌细胞中Wnt2信号转导的方法。在本发明的一些实施方式中，用抗体阻断Wnt2配体与卷曲蛋白受体之间的结合。可用Wnt2或卷曲蛋白产生该抗体。
A.产生抗Wnt2单克隆抗体
可用于本发明方法、药物组合物和试剂盒的抗体可以是多克隆抗-Wnt2抗体或单克隆抗-Wnt2抗体。该抗体优选为单克隆抗-Wnt2抗体。可用多种方式制备本发明单克隆抗体。优选方法采用杂交瘤方法，如Khler和Milstein，Nature 256：495(1975)所述。在杂交瘤方法中，一般用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引发产生或能够产生特异性结合于免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外免疫淋巴细胞。
免疫剂可包含SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：30-53所示的Wnt2多肽。用于产生抗Wnt2单克隆抗体的优选的人Wnt2肽序列是SSQRQLCHRHPDVMR(SEQ IDNO：2)，此肽由SEQ ID NO：1所示的人Wnt2的氨基酸残基49-63或切掉信号肽(SEQID NO：1的氨基酸残基1-25)后成熟的人Wnt2的氨基酸残基24-38组成。
通常，如果需要人来源的细胞，则采用外周血淋巴细胞(″PBL″)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则采用脾细胞或淋巴结细胞。然后，用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，59-103页(1986))。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿类、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在优选含有能抑制未融合的永生化细胞系生长或存活的一种或多种物质的合适培养基中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲本细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么此杂交瘤培养基一般包含次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(″HAT培养基″)，这些物质能防止HGPRT缺陷型细胞生长。
可用本文所述方法产生几种抗-Wnt2单克隆抗体。在本发明的优选实施方式中，Wnt2单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；或(vi)SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
在本发明的另一优选实施方式中，Wnt2单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：56、SEQID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
在本发明的又一实施方式中，列举了抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B，链1，图18)和8B11.H6(链1，图17)，此种单克隆Wnt2抗体包含(i)SEQ ID NO：56所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQID NO：84所示VLCDR3氨基酸序列。还列举了17F7.G7(亚克隆B，链2，图18)，此种单克隆Wnt2抗体包含(i)SEQ ID NO：104所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ IDNO：58所示VLCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列。列举了17F7.G7(亚克隆B，图18)，此种单克隆Wnt2抗体也可包含(i)SEQ ID NO：63所示VHCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：65所示VHCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。还列举了17F7.G7(亚克隆B，图18)，此种抗-Wnt2单克隆抗体可包含(i)SEQ ID NO：56所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：84所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。另一种抗-Wnt2单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：104所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ IDNO：63所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
另一优选的抗-Wnt2单克隆抗体，例如抗-Wnt2单克隆抗体17F7.E5(图16)包含(i)SEQ ID NO：104所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO：107所示VLCDR3氨基酸序列。在本发明的另一实施方式中，抗-Wnt2单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：104所示VLDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：107所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
另一优选的抗-Wnt2单克隆抗体例如抗-Wnt2单克隆抗体8B11.D2(图15)，它包含(i)SEQ ID NO：56所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO：84所示VLCDR3氨基酸序列。列举了抗-Wnt2单克隆抗体8B11.D2(图15)和8B11.H6(链1，图17)，此种抗Wnt2单克隆抗体也可包含(i)SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO：91所示VHCDR3氨基酸序列。在本发明的又一实施方式中，抗-Wnt2单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：56所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：84所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：91所示VHCDR3氨基酸序列。
在本发明的又一实施方式中，列举了抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6(链1，图17)，此种抗-Wnt2单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：56所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ IDNO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：84所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：91所示VHCDR3氨基酸序列。另一种优选的抗-Wnt2单克隆抗体例如8B11.H6(链2，图17)，其包含(i)SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO：126所示VLCDR3氨基酸序列。另一种Wnt-2单克隆抗体包含(i)SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO：126所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：91所示VHCDR3氨基酸序列。
如本文所述，可用包含SEQ ID NO：1-15和30-53的任何氨基酸序列的Wnt2肽产生抗Wnt2抗体。优选的抗-Wnt2抗体是特异性结合于包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽的抗体。术语“对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)”指非人Wnt2蛋白或另一种Wnt蛋白的氨基酸序列，其中各氨基酸序列对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)。与人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)比较时，这些氨基酸序列可以有一个或多个不同的氨基酸。在本发明优选实施方式中，抗-Wnt2抗体特异性结合包含SSQRQLCHRPDVMR(SEQ ID NO：2)的多肽，具体结合于所述多肽的SSQRQLCHRPDVMR(SEQ ID NO：2)表位。
B.编码抗-Wnt2抗体的核酸
可用多种方式制备本发明抗-Wnt2抗体。在本发明的一个方面，用重组方法产生抗Wnt2抗体。在此方法中，抗-Wnt2抗体由插入表达载体的核酸编码，在本领域已知的合适宿主中表达。
在本发明优选实施方式中，编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)编码VLCDR1的核酸，选白以下核酸序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：131；(ii)编码VLCDR2的核酸，选自以下核酸序列：SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：115；(iii)编码VLCDR3的核酸，选自以下核酸序列：SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：143；(iv)编码VHCDR1的核酸，选自以下核酸序列：SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：97；(v)编码VHCDR2的核酸，选自以下核酸序列：SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：99；和(vi)编码VHCDR3的核酸，选自以下核酸序列：SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：120。
在本发明的又一实施方式中，列举了抗-Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6(轻链κ，链1)，此种编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：70所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：72所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQID NO：94所示编码VLCDR3的核酸。编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸也可包含(i)如SEQ ID NO：97所示编码VHCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：99所示编码VHCDR2的核酸；和(iii)如SEQ ID NO：101所示编码VHCDR3的核酸。在本发明优选实施方式中，编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：70所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：72所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQ ID NO：94所示编码VLCDR3的核酸；(iv)如SEQ ID NO：97所示编码VHCDR1的核酸；(v)如SEQ ID NO：99所示编码VHCDR2的核酸；和(vi)如SEQ ID NO：101所示编码VHCDR3的核酸。
编码抗-Wnt2单克隆抗体的另一种优选核酸例如抗-Wnt2单克隆抗体8B11.H6(轻链κ，链2)，此种编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：131所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：115所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQ ID NO：134所示编码VLCDR3的核酸。在本发明优选实施方式中，编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：131所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：115所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQ ID NO：134所示编码VLCDR3的核酸；(iv)如SEQ ID NO：97所示编码VHCDR1的核酸；(v)如SEQ IDNO：99所示编码VHCDR2的核酸；和(vi)如SEQ ID NO：101所示编码VHCDR3的核酸。
在本发明的又一实施方式中，列举了抗-Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B，链1)，此种编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：70所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：72所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQ IDNO：94所示编码VLCDR3的核酸。列举了抗-Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B，链2)，此种编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：113所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：115所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQ IDNO：143所示编码VLCDR3的核酸。编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸也可包含(i)如SEQ ID NO：77所示编码VHCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：79所示编码VHCDR2的核酸；和(iii)如SEQ ID NO：120所示编码VHCDR3的核酸。在本发明优选实施方式中，编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：70所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：72所示编码VLCDR2的核酸；(iii)如SEQ ID NO：94所示编码VLCDR3的核酸；(iv)如SEQ ID NO：77所示编码VHCDR1的核酸；(v)如SEQID NO：79所示编码VHCDR2的核酸；和(vi)如SEQ ID NO：120所示编码VHCDR3的核酸。编码抗-Wnt2单克隆抗体的另一优选核酸包含(i)如SEQ ID NO：113所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：115所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQID NO：143所示编码VLCDR3的核酸；(iv)如SEQ ID NO：77所示编码VHCDR1的核酸；(v)如SEQ ID NO：79所示编码VHCDR2的核酸；和(vi)如SEQ ID NO：120所示编码VHCDR3的核酸。
在本发明的又一实施方式中，列举了抗-Wnt2单克隆抗体17F7.E5，此种编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：113所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：115所示编码VLCDR2的核酸；和(iii)如SEQ ID NO：117所示编码VLCDR3的核酸。编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸也可包含(i)如SEQ ID NO：77所示编码VHCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：79所示编码VHCDR2的核酸；和(iii)如SEQ ID NO：120所示编码VHCDR3的核酸。在本发明优选实施方式中，编码抗-Wnt2单克隆抗体的核酸包含(i)如SEQ ID NO：113所示编码VLCDR1的核酸；(ii)如SEQ ID NO：115所示编码VLCDR2的核酸；(iii)如SEQ ID NO：117所示编码VLCDR3的核酸；(iv)如SEQ ID NO：77所示编码VHCDR1的核酸；(v)如SEQ ID NO：79所示编码VHCDR2的核酸；和(vi)如SEQ ID NO：120所示编码VHCDR3的核酸。
C.产生重组抗-Wnt2抗体
可以重组方法采用本发明核酸产生抗Wnt2单克隆抗体。在优选实施方式中，以重组方法产生嵌合或人源化抗-Wnt2单克隆抗体。可采用重组DNA技术，其中将编码抗-Wnt2单克隆抗体或其片段的核苷酸序列，如一种或多种CDR序列插入表达载体，转化或转染入合适的宿主细胞，在适于表达的条件下培养。这些方法是本领域通常所知的，如纳入本文作参考的Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，纽约(1982)所述。“载体”指含有能够在细胞中转录的核酸的任何类型的遗传构建物。该定义也包括用于扩增核苷酸序列(编码和非编码)的载体。除了编码序列以外，载体通常包括常用于载体以帮助其构建和使用的限制性酶切位点和其它起始、终止和中间DNA序列。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或其核糖核苷酸和聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成、天然产生和非天然产生的，它们与参比核酸的结合特性相似，它们的代谢方式类似于参比核苷酸。这些类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸(酯)、氨基磷酸(酯)、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-氧-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。
可用化学技术合成本发明的抗-Wnt2单克隆抗体的编码序列或其片段和CDR序列，例如Matteucci等(JAm Chem Soc.1981，103：3185)的磷酸三酯法。在核酸序列中，术语“编码序列”指多个连续的三联核苷酸(称为密码子，各密码子对应于根据通用遗传密码由生化因子翻译出的一个氨基酸)、编码表达蛋白的整个序列或抑制蛋白质表达的反义链。“遗传编码序列”是连续密码子被非编码的间插序列或“内含子”间歇性隔断的编码密码。在mRNA加工期间，去除了内含子序列，恢复了编码该蛋白的连续密码子序列。
可通过简单地用合适碱基取代编码所需氨基酸序列的碱基修饰DNA或RNA序列。然后，可提供具有合适接头的编码序列，并将其连接入本领域通常可用的表达载体中，用该载体转化合适的宿主，产生免疫刺激肽或蛋白。可购得许多这种载体和合适的宿主系统。为了表达，可提供给编码序列可操作性连接的启动密码子和终止密码子，启动子和终止区，通常还有复制系统，以提供用于在所需细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有用于插入所需编码序列的方便的限制性位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列。将得到的表达载体转化入合适的细菌宿主中。当然，也可应用酵母或哺乳动物细胞宿主，其采用本领域技术人员已知的合适载体和控制序列。
D.嵌合和人源化抗-Wnt-2抗体
在本发明的一些实施方式中，抗-Wnt2抗体是嵌合或人源化抗体。如上所述，抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白，其中人抗体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种如小鼠、大鼠或兔的CDR残基取代。优选的小鼠VLCDR和VHCDR序列见表2。
在本发明优选实施方式中，嵌合或人源化抗-Wnt2抗体包含(i)SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所不VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；或(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
在本发明的另一优选实施方式中，嵌合或人源化抗-Wnt2抗体包含(i)SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ IDNO：58所示VLCDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
嵌合或人源化抗-Wnt2抗体的其它优选实施方式包括本文所述VLCDR和VHCDR的组合，例如抗-Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B，链1和2，图18)、8B11.H6(链1和2，图17)、17F7.E5(图16)和8B11.D2(图15)。
可用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库产生人抗体(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581(1991))。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，77页(1 985)和Boerner等，J.Immunol.147(1)：86-95(1991))。相似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠制备人抗体。攻击后，观察人抗体产生情况，所产生抗体在所观察的各个方面(包括基因重排、组装和抗体的所有组成成分)都和人体中产生的抗体非常像。此方法参见例如：美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及以下科学文献：Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
E.与Wnt2结合的单链Fv抗体
在一些实施方式中，抗体是单链Fv(scFv)。scFv抗体的VH和VL区是经折叠产生与双链抗体相似的抗原结合位点的单链。折叠后，非共价相互作用使单链抗体稳定。虽然一些抗体实施方式的VH和VL区可以直接连接在一起时，本领域技术人员将理解，可用一个或多个氨基酸组成的肽接头分开这些区域。肽接头和其应用是本领域熟知的。参见例如，Huston等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 8：5879 (1988)；Bird等，Science 242：4236(1988)；Glockshuber等，Biochemistry 29：1362(1990)；美国专利号4,946,778、美国专利号5,132,405和Stemmer等，Biotechniques 14：256-265(1993)。通常，肽接头除了连接这些区域或保持VH和VL之间的最小距离或其它空间关系以外没有特别的生物活性。然而，可选择肽接头的组成氨基酸，以影响分子的一些特性，如折叠、净电荷或疏水性。单链Fv(scFv)抗体任选地包含不多于50个氨基酸，通常不多于40个氨基酸，优选不多于30个氨基酸，更优选不多于20个氨基酸的肽接头。在一些实施方式中，肽接头是序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，优选是2、3、4、5或6个上述序列的多联体。然而，应理解，可在接头内产生一些氨基酸取代。例如，可用缬氨酸取代甘氨酸。
在本发明的优选实施方式中，scFv的VL区包含(i)SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：58所示VL CDR2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列。scFv的VH区可包含(i)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
描述了制备scFv抗体的方法。参见，Huse等，同上；Ward等，同上；Vaughan等，同上。简要说，分离免疫动物的B细胞的mRNA，制备cDNA。用对免疫球蛋白的重链和轻链的可变区特异的引物扩增cDNA。纯化PCR产物，连接核酸序列。如果需要接头肽，将编码该肽的核酸序列插入重链和轻链核酸序列之间。将编码scFv的核酸插入载体，并在合适的宿主细胞中表达。一般通过淘选噬菌体展示文库发现特异性结合于所需抗原的scFv。可用几种方法进行淘选。可用在表面表达所需抗原的细胞或用所需抗原包被的固体表面方便地进行淘选。方便的是，该表面可以是磁珠。洗掉表面上未结合的噬菌体，洗脱结合的噬菌体。
不管所选的淘选方法是什么，噬菌体展示提供的基因型和表型之间的物理联系使得测试cDNA文库，甚至是大克隆文库中每个成员与抗原的结合成为可能。
F.双特异性和偶联的抗-Wnt2抗体
在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆抗体，优选人或人源化抗体，该抗体至少对两种不同抗原具有结合特异性或对同一抗原上两个不同表位具有结合特异性。在一个实施方式中，结合特异性之一是对Wnt2蛋白的结合特异性，另一结合特异性是对另一种癌抗原的结合特异性。或者，四聚体型技术可产生多价试剂。
在一些实施方式中，将该抗体偶联于效应物部分。效应物部分可以是许多分子，包括标记部分，如放射性标记或荧光标记，或者可以是治疗部分。如果效应物部分是治疗部分，它一般是细胞毒剂。此方法中，将细胞毒剂靶向癌细胞导致直接杀伤靶细胞。一般用抗卷曲蛋白受体的抗体进行此实施方式。细胞毒剂很多并且不同，包括但不限于：细胞毒性药物或毒素或这些毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包括白喉A链、内毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、依诺霉素、耳他汀(auristatin)等。细胞毒剂也包括放射性化学物质，放射性化学物质通过将放射性同位素偶联于针对Wnt2蛋白产生的抗体，或将放射性核素结合于已共价连接于抗体的螯合剂制备。
G本发明抗体的结合亲和力
一般通过标准的抗体-抗原试验，如Biacore竞争试验、饱和试验或免疫试验如ELISA或RIA测定或确定靶抗原的结合亲和力。
可用这种试验测定抗体的解离常数。术语“解离常数”指抗体与抗原的亲和力。如果抗体的解离常数(KD＝1/K，K是亲和常数)＜1μM、优选＜100nM、最优选＜0.1nM，那么抗体和抗原之间存在结合特异性。抗体分子一般具有较低范围的KD。KD＝[Ab-Ag]/[Ab][Ag]，[Ab]是抗体平衡浓度，[Ag]是抗原平衡浓度，[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的平衡浓度。一般地，抗原和抗体之间的结合作用包括可逆的非共价结合，如静电吸引、范德华力和氢键。
本发明抗体特异性结合于Wnt2蛋白。本文中“特异性结合”指抗体与Wnt2蛋白结合的KD至少约为0.1mM，更通常至少约为1μM，优选至少约为0.1μM或更好，最优选0.01μM或更好。
H.抗-Wnt2单克隆抗体的竞争性结合
在一些实施方式中，采用抗-Wnt2单克隆抗体。优选实施方式是与第二种抗-Wnt2抗体结合于同一表位的抗-Wnt2单克隆抗体。一般通过一种抗体竞争性抑制第二种抗体与抗原结合的能力测定具体抗体与另一种抗体识别同一表位的能力。可用许多竞争性结合试验测定两种抗体对同一抗原的竞争。例如，夹心ELISA试验可用于此目的。采用捕获抗体包被孔表面，以进行此方法。然后，将亚饱和浓度的标记抗原加到捕获表面上。此蛋白将通过特异性抗体：表位相互作用结合于抗体。洗涤后，将已共价连接于可检测部分(如HRP，标记抗体定义为检测抗体)的第二抗体加入ELISA。如果此抗体能与捕获抗体识别同一表位，那么它将不能结合于靶蛋白，引物该具体表位不再可用于结合。但是，如果此第二抗体识别靶蛋白上的不同表位，那么它能够结合，并且可通过用相关底物定量活性水平(从而测定结合的抗体)检测此种结合。用一种抗体作为捕获和检测抗体，确定背景，而可通过用抗原特异性抗体捕获，并用针对抗原上标记的抗体检测获得最大信号。将背景和最大信号用作参比，可以配对方式评价抗体，以确定表位特异性。
如果采用上述试验时在第一抗体的存在下，第二抗体与抗原的结合降低至少30％、通常至少约40％、50％、60％或75％，常常至少约90％，则认为第一抗体能竞争性抑制第二抗体的结合。
II.检测WNT2表达水平的试验
本发明也提供了检测Wnt2的诊断试验。在优选实施方式中，通过测定基因转录物(如mRNA)、测定翻译蛋白的量或测定基因产物活性确定Wnt2基因活性。
用核酸杂交技术检测和/或定量基因转录物(mRNA或cDNA)的方法是本领域技术人员已知的。例如，评价mRNA的存在、不存在或量的一种方法包括Northern印迹转移。
探针可以是全长或小于全长的编码Wnt2蛋白的核酸序列。通常用(例如)放射性核苷酸或生物素标记探针，可通过本领域已知的缺口平移、随机或特定引物扩增产生探针。本领域也已描述了杂交条件。这些方法通常是本领域已知的，如Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，纽约(1982)所综述。根据经验测定较短探针的特异性。核酸探针的长度优选为20个碱基或更长。使杂交部分可视化能够定性地确定存在或不存在mRNA。
在另一优选实施方式中，可用上述基于扩增(如PCR)的方法测定转录物(如mRNA)，以直接评价DNA或mRNA的拷贝数。在优选实施方式中，用逆转录PCR(RT-PCR)评价转录物水平。用于这些方法的引物对参见SEQ ID NO：16-29。
也可通过检测或定量表达多肽检测和/或定量Wnt2基因的“活性”。可通过本领域技术人员熟知的许多方法检测和定量多肽。这些方法可包括分析生化方法，如电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、高扩散层析等。也可根据标准技术对分离的蛋白质进行测序，以鉴定多态性。
也可用许多熟知的免疫结合试验，用本发明抗体检测Wnt2蛋白，或表达它们的细胞(参见例如，美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。通用免疫试验的综述也参见《细胞生物学方法》(Methods in Cell Biology)，第37卷，Asai编，Academic Press，Inc.New York(1993)；《基础和临床免疫学》(Basic and ClinicalImmunology)，第七版，Stites和Terr编(1991)。
因此，本发明提供了检测过表达Wnt2的细胞，尤其是癌细胞的方法。一般地，分析生物样品中的Wnt2表达。在一种方法中，对对象进行活检，在体外测试收集的组织。然后，将该组织或该组织的细胞与本发明抗-Wnt2抗体相接触。得到的免疫复合物说明活检样品中存在Wnt2蛋白。为了便于所述检测，可放射性标记抗体，或将抗体偶联于作为可检测标记的效应物分子，如放射性标记。
在另一方法中，在体内用(例如)典型的成像系统检测过表达Wnt2的细胞或癌细胞。然后，用检测该标记的任何已知方法确定该标记的定位。可采用用于观察诊断图像的方便方法。例如，顺磁性同位素可用于MRI。抗体内化对延长在生物体内的寿命超过细胞外结合所提供的作用更为重要，细胞外结合易受胞外酶环境清除加上循环系统清除的影响。
上述方法也可用于预后试验或预测药物反应，即作为药理基因组标记。具体说，可用上述方法预测对本文所述治疗方案的反应。例如，可用这种方法预测对采用本发明抗-Wnt2抗体的治疗方法的反应。
III.采用抗-Wnt2抗体和SIRNA的方法
A.抑制细胞增殖
抑制Wnt2信号转导的物质，如本发明抗-Wnt2抗体和siRNA可以各种方式应用。在本发明的优选实施方式中，提供了抑制过表达Wnt2的细胞增殖的方法。过表达的Wnt2可以是Wnt2蛋白或Wnt2 mRNA。此方法包括将细胞与抑制Wnt2信号转导的物质相接触的步骤，其用量能有效抑制细胞增殖。“增殖”指细胞或者病理囊肿的生长、繁殖或增加(morbid cyst)。
在本发明优选实施方式中，在体外实施此方法。如本文进一步所述，也可在体内实施本发明方法。
在本发明的优选实施方式中，与该物质接触的细胞是癌细胞。本发明物质用于抑制选自下组的癌细胞增殖：乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、间皮瘤、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、肠癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤癌细胞。优选的癌细胞是乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、肺癌细胞、间皮瘤细胞、甲状腺癌细胞、结肠癌细胞或肝癌细胞。
B.诱导凋亡
抑制Wnt2信号转导的物质，如本发明抗-Wnt2抗体和siRNA可以各种方式应用。在本发明的另一优选实施方式中，提供了诱导过表达Wnt2的细胞凋亡的方法。此方法包括将该细胞与抑制Wnt2信号转导的物质接触，其用量能有效诱导细胞凋亡的步骤。本文公开了用于此方法的物质，如抗-Wnt2抗体或siRNA。
C.抑制Wnt2信号转导
本发明物质，如本发明抗-Wnt2抗体和siRNA可以各种方式应用。在本发明的另一优选实施方式中，提供了抑制细胞中Wnt2信号转导的方法。该方法包括将过表达Wnt2的细胞与有效抑制Wnt2信号转导的量的物质相接触的步骤。本文公开了用于此方法的物质，如抗-Wnt2抗体或siRNA。
D.治疗疾病
本发明物质，如本发明抗-Wnt2抗体和siRNA可以各种方式应用。在本发明的优选实施方式中，提供了治疗与Wnt2信号转导相关的疾病的方法。此方法包括以下步骤：给予对象，优选需要这种治疗的对象有效治疗该疾病的量的抑制Wnt2信号转导的物质。该对象优选为人。本文公开了用于此方法的物质，如抗-Wnt2抗体或siRNA。
在优选实施方式中，此疾病是癌症。本发明物质用于治疗选自下组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、间皮瘤、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、肠癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤。优选的癌症是乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、间皮瘤、甲状腺癌、结肠癌或肝癌。
本文所用术语“治疗”包括：(1)预防疾病如癌症，即在可能倾向于发生该疾病的但仍未经历该疾病的任何症状的对象中使该疾病的临床症状不发生；(2)抑制该疾病，即阻滞或降低疾病或其临床症状的发展；或(3)缓解该疾病，即使该疾病或其临床症状消退。需要这种治疗的对象优选哺乳动物，更优选人。
本发明也提供了治疗过表达Wnt2的癌症的方法。此方法包括以下步骤，给予需要这种治疗的对象一种物质，其用量能有效治疗该癌症。本文公开了用于此方法的物质，如抗-Wnt2抗体或siRNA。
E.检测对象中的癌细胞
本发明物质，如本发明抗-Wnt2抗体和siRNA可以各种方式应用。在本发明优选实施方式中，提供了检测对象中的癌细胞的方法。此方法包括以下步骤：提供来自该对象的生物样品，该生物样品包含怀疑是癌细胞的细胞，并检测该细胞中Wnt2表达水平。任选地，此方法包括将该细胞中的Wnt2表达水平与来自一个或多个健康对象的细胞中的Wnt2表达水平作比较，或与以前测定的Wnt2表达水平参比范围作比较。在本发明的一个实施方式中，通过检测Wnt2 mRNA水平检测Wnt2表达水平。在本发明的另一实施方式中，通过检测Wnt2蛋白水平检测Wnt2表达水平。本文公开了用于此方法的物质，如抗-Wnt2抗体或siRNA。
可因各种原因检测Wnt2的表达水平。检测Wnt2的表达水平可以是(i)在对象中进行癌症的筛选、诊断或预后的一部分；(ii)确定该对象对癌症的易感性的一部分；(iii)测定对象癌症的阶段或严重性的一部分；(iv)鉴定对象发生癌症的风险的一部分；或(v)监测给予诊断患有癌症的对象的抗癌药或治疗的作用的一部分。给予对象的抗癌药或治疗可包含本发明抗-Wnt2抗体或siRNA。
在本发明优选实施方式中，提供了鉴定对象癌症的阶段或严重性的方法。如本文所示，在多种癌细胞中Wnt2过表达(如表3-5)。如本文进一步所示，抗Wnt2抗体和siRNA以剂量依赖方式诱导这些细胞凋亡。因此，Wnt2的量是各种癌症风险状态(如高、中或低)的特征。可测定Wnt2、然后将它们提交给分类算法或将它们与癌症具体阶段或严重性相关的Wnt2参比量和/或模式作比较，从而确定该癌症的阶段或严重性。
采用本发明方法，测定来自准备测定癌症发生风险的对象的生物样品中Wnt2的水平。来自准备测定癌症发生风险的对象的生物样品中检测到的Wnt2水平高于来自正常或健康对象的同等生物样品中检测到的Wnt2水平，或低于预先确定的基础水平，这表明准备测定癌症发生风险的对象具有发生癌症的风险。
在本发明的另一优选实施方式中，作为对象癌症的筛选、诊断或预后的一部分，测定对象的癌症。采用本发明方法，测定来自准备筛选癌症的对象的生物样品中的Wnt2水平。来自准备筛选癌症的对象的生物样品中检测到的Wnt2水平高于来自正常或健康对象的同等生物样品中检测到的Wnt2水平，或高于预先确定的基础水平，这表明所述筛选癌症的对象患有或可能患有癌症。
如上所述，Wnt2组合物可用于治疗Wnt2过表达的癌症。然而，如本文所述，其它药物，如包含Wnt2抑制剂的组合物也可用于治疗患者的Wnt2过表达的癌症。因此，在本发明优选实施方式中，作为监测手术效果(如切除肿瘤)、给予诊断患有Wnt2过表达性癌症的对象的抗癌药或治疗的效果的一部分，测定癌症状态。给予癌症患者的手术或抗癌药或治疗的效果可包括癌症复发、癌症进展(恶化)和癌症消退(改善)。
采用本发明组合物、方法和试剂盒，在手术后的不同时间，或给予抗癌药或治疗后的不同时间测定对象的生物样品中的Wnt2水平。第一次(t1；例如在给予抗癌药或治疗之前)检测来自对象的生物样品中的Wnt2水平高于第二次(t2；如给予抗癌药或治疗之后)检测来自同一对象的同等生物样品中的Wnt2水平，则表明该对象的癌症正在消退。同样，与第一次检测的Wnt2水平相比第二次检测的Wnt2水平较高表明该对象的癌症正在进展。类似地，第一次(t1；如刚刚手术后)检测来自对象的生物样品中的Wnt2水平高于第二次(t2；如术后数周或数月)检测来自同一对象的同等生物样品中的Wnt2水平，可能表明对象的癌症没有复发。同样，与第一次检测的Wnt2水平相比第二次检测的Wnt2水平较高说明可能表明该对象的癌症正在复发。
F.用于本发明方法的siRNA
用于实施本发明方法的本发明物质包括但不限于：抗-Wnt2抗体和Wnt2的siRNA。这些物质一般能够(i)结合于Wnt2 mRNA或Wnt2蛋白，(ii)干扰Wnt2信号转导和/或(iii)抑制Wnt2蛋白与其它蛋白如卷曲蛋白受体的结合。在优选实施方式中，抑制细胞增殖的物质是Wnt2的siRNA。本发明提供了采用RNA干扰的组合物和方法来调节Wnt2表达。这些方法和组合物可用于治疗疾病(尤其是癌症)、诱导凋亡和干扰Wnt2信号转导。
在许多种类中，引入在本文中也可被称作小干扰RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)能诱导强效和特异的基因沉默，这种现象称为RNA干扰或RNAi。在线虫类秀丽新小杆线虫(C.elegans)中广泛记录了这种现象(Fire等，Nature，391，806-811，1998)，而且在其它生物体(从锥虫到小鼠)中也很普遍。根据所讨论的生物体，将RNA干扰称为“共抑制”、“转录后基因沉默”、“正义抑制”和“压抑”。RNAi是吸引人的生物科技工具，因为它提供了敲除特定基因活性的方法。它尤其可用于在以前认为不适于遗传分析或操作的物种中敲除基因表达。
RNAi通常被描述为转录后基因沉默(PTGS)现象，其中dsRNA引发胞质中的同源mRNA降解。基本过程涉及加工成较短单位(称为短干扰RNA(siRNA))的dsRNA，所述较短单位能指导识别和靶向切割同源的信使RNA(mRNA)。可以多种方式在细胞核或胞质中产生(加工后)引发RNAi/PTGS的dsRNA。将dsRNA加工成siRNA，进而降解mRNA，是两步RNA降解过程。第一步涉及将dsRNA加工成长为21-25个核苷酸(nt)的正义和反义RNA(即siRNA)的dsRNA核酸内切酶(核糖核酸酶III型；RNA酶III型)活性。在果蝇中，此RNA酶III型蛋白称为切酶(Dicer)。在第二步中，产生的反义siRNA与称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的不同的核糖核酸酶复合物组合，并用作RISC的指导物，指导其切割同源性单链mRNA。RISC在与反义siRNA配对的区域中部附近切割mRNA，然后mRNA进一步降解。不同来源的dsRNA可进入导致RNAi/PTGS的加工途径。
因此，在本发明优选实施方式中，用于本发明方法的物质是Wnt2的siRNA。可用siRNA降低Wnt2的表达水平。Wnt2的siRNA能杂交Wnt2 mRNA，从而降低或抑制Wnt2蛋白的产生。
在设计RNAi实验中，有几个需要考虑的因素，如siRNA的特性、沉默作用的持续时间和递送系统的选择。为了产生RNAi作用，引入生物体的siRNA应该含有外显子序列。而且，RNAi过程依赖同源性，所以必须仔细选择序列，以最大程度提高基因特异性，而最大程度降低同源的非基因特异性序列之间交叉干扰的可能性。siRNA与所抑制基因之间的序列相同性优选大于90％，甚至为100％。与靶基因相同性低于约80％的序列效果差得多。因此，Wnt2的siRNA和准备抑制其表达的Wnt2基因之间的同源性越大，影响不相关基因表达可能性越小。
此外，siRNA的大小很重要。本发明总地涉及Wnt2的siRNA分子，它是双链或单链，至少包含约19-25个核苷酸，能够调节Wnt2的基因表达。在本发明内容中，siRNA的长度优选小于500、200、100、50或25个核苷酸。siRNA的长度更优选约为19个核苷酸-25个核苷酸。
一个方面，本发明通常涉及至少19个核苷酸的分离siRNA分子，它至少具有与至少10个但不多于30个Wnt2的连续核苷酸基本互补的一条链，并能够降低Wnt2基因或蛋白的表达。在本发明的优选实施方式中，siRNA分子至少具有与至少10个但不多于30个人Wnt2的连续核苷酸基本互补的一条链(GenBankNo.NM 0003391，SEQ ID NO：152)。更想要的是，分离siRNA分子至少具有与包含人Wnt2的核苷酸714-732的19-25个核苷酸基本互补的一条链(GenBank No.NM 0003391，SEQ ID NO：152)。  在本发明优选实施方式中，siRNA  核酸序列是5′-GAAGATGGGAAGCGCCAAG-3′(SEQ ID NO：150)。
在另一优选实施方式中，Wnt2的siRNA分子包含与SEQ ID NO：152所示核酸序列至少90％同源、优选95％、99％或100％同源的序列。应理解，无需过多实验和采用本发明公开内容，可以设计调节Wnt2表达的Wnt2的其它siRNA，并用于实施本发明方法。
siRNA也可包含一个或多个核苷酸的改变。这种改变可包括将非核苷酸物质加入例如19-25个核苷酸RNA的末端或内部(该RNA的一个或多个核苷酸处)。在优选实施方式中，RNA分子含有3′-羟基。本发明RNA分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，包括非天然产生的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。双链寡核苷酸可含有修饰的主链，例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其它修饰主链，或可包含非天然核苷间连接。siRNA的其它修饰(如掺入2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和反转的脱氧碱基(deoxyabasic)残基)可参见公开的美国申请公开号20040019001和美国专利号6,673,611(纳入作参考)。综上所述，所有上述改变的RNA都称为修饰的siRNA。
优选地，RNAi能将Wnt2在细胞中的表达降低至少10％、20％、30％或40％，更优选至少50％、60％或70％，最优选至少75％、80％、90％、95％或更多。
可通过本领域已知的方法将siRNA引入细胞，包括例如：显微注射、电穿孔或转染含有可转录出siRNA的核酸的载体。或者，可直接以能够结合于Wnt2 mRNA转录物的形式将Wnt2的siRNA引入细胞。为了增加持续时间和膜穿透性，可将siRNA与脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、lipofectine或其衍生物混合或用它们对siRNA进行修饰。优选的是胆固醇偶联的Wnt2的siRNA(参见Song等，Nature Med.9：347-351(2003))。
G.用于本发明方法的抗-Wnt2抗体
在本发明的另一优选实施方式中，用于本发明方法的物质是本文通篇所述的抗-Wnt2抗体。抗Wnt2抗体可以是多克隆或单克隆抗-Wnt2抗体。本发明优选采用抗-Wnt2单克隆抗体。
IV.鉴定WNT信号转导的抑制剂
Wnt2蛋白(或表达它们的细胞)或Wnt信号转导途径成员如dvl也可用于药物筛选试验，以鉴定出抑制Wnt信号转导的物质。因此，本发明提供了筛选抑制癌症的组合物的新方法。
可设计用于Wnt2信号转导的试验，以检测和/或定量Wnt2信号转导途径的任何部分。例如，可测定一种物质影响胞内β-联蛋白水平或诱导靶细胞凋亡的能力。本文描述了适合于这些目的的试验。
试验可包括经设计用于测定抑制剂与Wnt2配体、卷曲蛋白受体或Wnt2信号转导级联反应的另一成员如dvl的结合活性的试验。这些试验尤其可用于鉴定能调节Wnt2活性的物质。基本上可在这种试验中测试任何物质。这些物质包括但不限于：天然或合成多肽、抗体、天然或合成的小有机分子、核酸等。
如上所述，分泌型Frizzled相关蛋白(sFRP)家族通过与卷曲蛋白受体竞争结合分泌型Wnt配体作为Wnt信号转导的可溶内源性调控子发挥作用。因而，在有些形式中，待测试剂基于卷曲蛋白受体的天然配体(如Wnt配体或sFRP)。
任何检测Wnt2信号转导的测试法满足高通量筛选。高通量测试法、结合测试法和报道基因测试法是同样熟知的。因此，例如，美国专利5,559,410公开了蛋白质的高通量筛选方法，美国专利5,585,639公开了筛选核酸结合的高通量方法(即阵列)，而美国专利5,576,220和5,541,061公开了筛选配体/抗体结合的高通量方法。
除此之外，高通量筛选系统可购得(例如可见Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；PrecisionSystems，Inc.，Natick，MA等等)。这些系统通常实现包括全部样品和试剂的移液、液体分配、定时孵育以及最终在适于测试法的探测器中对微平板读数在内的整个程序的自动化操作。这些可配置的系统提供了高通量和快速启动以及高度的适应性和定制化。这些系统的制造商提供了多种高通量系统的详细方案。因而，例如，ZymarkCorp.提供了描述用于检测基因转录调控、配体结合等等的筛选系统的技术公报。
可用于本发明的其他测试法是那些为检测癌细胞的肿瘤表型而设计的方法。这些测试法包括在细胞软琼脂上生长；锚着依赖性；生长的接触抑制及密度限制；细胞增殖；细胞死亡(凋亡)；细胞转化；生长因子或血清依赖；肿瘤特异标志水平；重组基质胶(Matrigel)入侵；体内肿瘤生长和转移；经历转移的细胞中mRNA和蛋白表达以及其他癌细胞特征。
待测试剂抑制细胞生长的能力也可以通过将待测试剂导入动物疾病模型并评估体内癌细胞生长进行评估。例如，可以将人肿瘤细胞导入如“裸鼠”等免疫受损的动物。将待测试剂(例如小分子或抗体)施给动物并将肿瘤细胞形成肿瘤的能力(通过在动物中形成的肿瘤的数量和大小进行评估)与没有接触该试剂的对照动物中的肿瘤生长进行比较。
A.基因表达的抑制剂
本发明的一个方面，Wnt信号途径的抑制剂(例如Dvl抑制剂)可以包括抑制所述途径中靶蛋白表达的核酸分子。可以使用常规的基于病毒或非病毒基因转移方法向哺乳动物细胞或目标组织导入核酸，其编码工程改造的多肽(例如该蛋白的显性阴性形式)，或核酸(例如诸如siRNA或反义RNA等靶蛋白表达的抑制剂)。非病毒载体转运系统包括DNA质粒、裸核酸以及与如脂质体等转运载体复合的核酸。病毒载体转运系统包括DNA和RNA病毒，它们在转运到细胞中后具有游离的或整合的基因组。至于基因治疗过程的综述，参见Anderson，Science 256：808-813(1992)；Nabel &Feigner，TIBTECH 11：211-217(1993)；Mitani & Caskey，TIBTECH11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11：167-175(1993)；Miller，Nature 357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience8：35-36(1995)；Kremer & Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)：31-44(1995)；Doerfler和Bohm主编的《微生物学和免疫学现有主题》(Current Topics in Microbiologyand Immunology)一书中Haddada等所著章节(1995)以及Yuetal，Gene Therapy 1：13-26(1994)。
在有些实施方式中，施用小分子干扰RNA。在哺乳动物细胞中，长双链RNA(＞30核苷酸)的引入经常引起有效的抗病毒反应，表现为蛋白合成的非特异性抑制和RNA降解。RNA干扰现象在例如Bass，Nature 411：428-29(2001)；Elbahir等，Nature411：494-98(2001)；以及Fire等，Nature 391：806-11(1998)中进行了描述和讨论，其中也探讨了制备干扰RNA的方法。siRNA抑制剂小于100个碱基对，通常30bp或更短，并通过本领域已知的手段制备。本发明示范性siRNA可以具有多达29个核苷酸、25个核苷酸、22个核苷酸、21个核苷酸、20个核苷酸、15个核苷酸、10个核苷酸、5个核苷酸或在其附近或在其之间的任何整数个核苷酸。
V.药物组合物
如上所述，可用Wnt2表达抑制剂和本发明物质治疗与Wnt2信号转导相关的疾病，如与Wnt2信号转导相关的癌症。用以给药的组合物一般会包含溶于药学上可接受的的载体(优选是水性载体)的本文详述的物质。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐溶液等等。这些溶液是无菌的，通常不含有不需要的试剂。这些组合物可以包含药学上可接受的、接近生理条件所需的辅助试剂，诸如pH调节和缓冲试剂、毒性调节试剂等等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。这些剂型中活性试剂的浓度可以变化很大，并且按照选择的给药模式和患者需求，主要在液体体积、粘性、体重等基础上选择。
因而，用于静脉内给药的典型药物组合物应是每位患者每天大约0.1到10毫克。每位患者每天可以给予0.1到大约100毫克的剂量，尤其是当对隐蔽位置给药并不进入血流的情况下，诸如对体腔或器官内腔给药。在局部用药中可以使用更高的剂量。对于精通本领域的人员而言，制备非经肠道给药的组合物的实际方法是已知的或显而易见的，并且在如《雷明顿制药科学》第15版(Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980))等出版物上有更详细的描述。
取决于给药方法，所述药物组合物可以用多种单位剂型给药。例如，适于口服给药的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸、胶囊以及锭剂。需要认识到，抗体在口服给药条件下应受到保护以免遭消化。这通常通过所述分子与组合物复合使其抗酸性和酶水解，或通过将所述分子包装在适当的抵抗性载体(如脂质体或保护屏障)中实现。保护试剂免受消化的方法是本领域内熟知的。
可为治疗性或预防性治疗施用含本发明抑制剂和物质的组合物(例如抗体)。在治疗性应用中，对遭受疾病(例如乳腺癌)折磨的患者施用组合物，其量足以治疗或至少部分阻止疾病及其并发症。足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效剂量”。这一应用的有效量取决于疾病的严重性以及患者的健康综合状况。取决于患者需要和耐受的剂量和频率，组合物可以一次或多次给药。在任何情况下，所述组合物应当提供充分量的本发明的试剂以对患者进行有效治疗。能够防止或延缓患者中癌症发展的抑制剂量称为“预防性有效剂量”。预防性治疗所需要的特定剂量会取决于医疗条件以及患者病史、需要防止的特定癌症、以及如年龄、体重、性别、给药途径、有效性等其他因素。这样的预防性治疗可以用于，例如先前得过癌症的患者以防止癌症的再次发生，或被怀疑具有发展癌症的重要可能性的患者。
出于本发明目的，“患者”或“对象”包括人和其他动物，尤其是哺乳动物。这样，所述方法可以用于人类治疗和兽医学应用。在优选的实施方式中，患者是哺乳动物、优选是灵长类动物，并且在最优选的实施方式中患者是人。
其他已知的癌症治疗方法可以与本发明的方法组合使用。例如，Wnt信号转导的抑制剂也可以用于向其他癌症治疗剂(如5FU、长春碱、放射菌素D、顺铂、氨甲叶酸等等)引导或敏化细胞。在其他实施方式中，本发明的方法可以与放疗等一起使用。
在有些情况下，所述抗体属于当与跨膜蛋白复合时激活血清补体，从而介导细胞毒性或抗原依赖的细胞毒性(ADCC)的亚型。这样，通过给予患者抗癌细胞表面的卷曲蛋白的抗体可以治疗癌症。抗体标记可以激活辅助毒素、聚集毒素有效荷载或以其他方式提供局部消融细胞的方法。在这些实施方式中，所述抗体与效应部分偶联。效应部分可以是任何数量的分子，包括诸如放射性标记或荧光标记的标记部分，或可以是治疗性部分，如细胞毒试剂。
A.Wnt2多肽用作疫苗
除了用Wnt2信号转导抑制剂给药之外，Wnt2蛋白或其免疫原性片段可以作为疫苗组合物给药以激活HTL、CTL以及抗内源蛋白的抗体反应。这样的疫苗组合物可以包括，例如，脂化肽(参见例如Vitiello等，(1995)J.Clin.Invest.95：341-349)、装入聚(D，L-丙交脂-乙交脂，″PLG″)微球的肽组合物(参见，例如，Eldridge等，(1991)Molec.Immunol.28：287-294；Alonso等(1994)Vaccine 12：299-306；Jones等(1995)Vaccine 13：675-681)、包含在免疫激活复合体(ISCOM)中的肽组合物(参见，例如，Takahashi等(1990)Nature 344：873-875；Hu等(1998)Clin.Exp.Immunol.113：235-243)、多抗原肽系统(MAP；参见例如Tarn(1988)Proc.Nat′lAcad.Set USA85：5409-5413；Tam(1996)J.Immunol.Methods 196：17-32))、病毒转运载体(Kaufmann主编的《疫苗发展概念》(Concepts in Vaccine Development de Gruyter，1996)中379页Perkus等所著的内容；Chakrabarti等(1986)Nature 320：535-537；Hu等(1986)Nature 320：537-540；Kieny等(1986)AIDS Bio/Technology 4：790-795；Top等(1971)J.Infect.Dis.124：148-154；Chanda等(1990)Virology 175：535-547)、病毒或合成来源的颗粒(参见，例如Kofler等(1996)J.Immunol.Methods 192：25-35；Eldridge等(1993)Sem.HematoL 30：16-24；Falo等(1995)Nature Med.7：649-653)。
疫苗组合物经常包含佐剂。许多佐剂包含设计来用于保护抗原免受快速分解代谢的试剂，诸如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答激活剂，诸如脂质A、短小棒状杆菌(Bortadella pertussis)或结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的蛋白。某些佐剂可通过商业获得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；默克佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；氢氧化铝胶体或磷酸铝等铝盐；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不可溶悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解微球；单磷酰基脂质A和quilA。诸如GM-CSF、白介素2、7、12及其他类似生长因子的细胞因子也可以用作佐剂。
疫苗可以作为核酸组合物给药，其中给予患者编码Wnt多肽的DNA或RNA或其片段。参见例如Wolff等(1990)Science 247：1465-1468；美国专利5,580,859、5,589,466、5,804,566、5,739,118、5,736,524、5,679,647；以及WO98/04720。基于DNA的转运技术的实例包括“裸DNA”、促进(布比卡因、聚合体、肽-介导的)转运、阳离子脂质复合物以及颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的转运(参见例如美国专利5,922,687)。
使用作为DNA疫苗的基因的方法是熟知的，并包括将希望的基因或其部分置于可调控的启动子或组织特异性启动子控制之下使之在患者体内表达。用作DNA疫苗的基因可以编码全长Wnt2蛋白，或可以编码所述蛋白的一部分。
在有些实施方式中，DNA疫苗包括编码佐剂分子和DNA疫苗的基因。这样的佐剂分子包括提高针对DNA疫苗所编码多肽的免疫原性反应的细胞因子。
为了治疗或预防免疫目的，本发明的肽可以用病毒或细菌载体表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，如痘苗病毒或禽痘病毒。这一方法包括使用痘苗病毒，例如，作为表达编码Wnt2多肽或多肽片段的核苷酸序列的载体。导入宿主之后，重组痘苗病毒表达免疫原性肽，并由此引起免疫应答。例如在美国专利4,722,848中描述了用于免疫方案的痘苗载体和方法。另一种载体是BCG(卡介菌Bacille CalmetteGuerin)。在Stover等(1991)Nature 351：456-460中描述了BCG载体。多种其他可用于治疗性给药或免疫的载体，例如腺病毒和腺联病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体等等会是显而易见的。参见例如Shata等(2000)Mol.Med.Today 6：66-71；Shedlock等(2000)J.Leukoc.Biol.68：793-806；以及Hipp等(2000)In Vivo 14：571-85。
VI.给予抑制剂
可以多种治疗方案使用抑制Wnt2信号转导的物质(如抗Wnt2抗体和siRNA)，可以以下方法应用该物质，包括但不限于：胃肠道外(例如静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径)、外用、口服、局部、或透皮给药。这些方法可用于预防性和/或治疗性治疗。
A.非病毒递送方法
编码本发明工程改造多肽的核酸的非病毒递送方法包括脂转染(lipofection)、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸偶合体、裸DNA、人工病毒粒以及用药剂增强的DNA摄取。例如，在美国专利5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述了脂转染，并且可购得脂转染试剂(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner在WO91/17424和WO91/16024所述的那些物质。可以向细胞(离体给药)或靶组织(体内给药)递送。
本领域技术人员熟知包含靶向脂质体如免疫脂质复合物的脂质：核酸复合物的制备(参见例如Crystal，Science 270：404-410(1995)；Blaese等，Cancer Gene Ther.2：291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)；Remy等，BioconjugateChem.5：647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad等，CancerRes.52：4817-4820(1992)；美国专利4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
B. 病毒递送方法
使用RNA或DNA病毒系统来递送目标Wnt途径蛋白(如Dvl)的抑制剂是本领域内已知的。递送这样的核酸抑制剂的常规病毒系统可包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒(lentivirus)、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒载体。
在许多基因治疗应用中，希望基因治疗载体以高特异性递送到特定组织类型(例如肺癌组织)中。一般对病毒载体进行改造使之通过表达与病毒外表面上的病毒包膜蛋白融合的配体具有针对给定的细胞类型的特异性。选择与已知存在于感兴趣细胞类型上的受体具有亲和力的配体。例如，Han等在PNAS 92：9141-9151(1995)中报道了可以改造Moloney鼠白血病病毒以表达与gp70融合的人调蛋白(heregulin)，并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。这一原理可以延伸到表达配体融合蛋白的病毒和表达受体的靶细胞的其他配对中。例如，可以改造丝状噬菌体以展示基本上对任何选择的细胞受体都具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如Fab或Fv)。虽然上面的描述主要用于病毒载体，但相同的原理可以用于非病毒载体。可以改造这样的载体，使其包含认为有助于被特定靶细胞摄取的特定摄取序列。
可以通过给予单独患者、一般通过全身给药(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部应用(如下所述)向体内递送基因治疗载体。另外，可将载体递送给离体细胞，如从单独患者取出的细胞。
本领域技术人员熟知用于诊断、研究或基因治疗的离体细胞转染(例如，通过将转染细胞重新输入宿主生物体)。在一些实施方式中，从对象生物体分离细胞，用抑制剂核酸转染并重新输回对象生物体(例如患者)。本领域技术人员熟知适于离体转染的多种细胞类型(参见，例如Freshney等，《动物细胞培养：基础技术手册》(Culture ofAnimal Cells，AManual of Basic Technique)，第3版，1994)以及其中为说明如何从患者分离并培养细胞所引用的参考文献)。
含治疗性核酸的载体(如逆转录蛋白、腺病毒、脂质体等)也可以直接给予有机体，用于体内细胞转导。另外，可以给予裸DNA。通过通常用于导入分子以与血液或组织细胞最终接触的任何途径给药。本领域技术人员可以获得并且熟知给予这种核酸的适当方法。而且，虽然可用一种以上的途径给予特定组合物，但特定途径常常比其他途径提供更快捷、更有效的反应。
药学上可接受的的载体部分由所给予的特定组合物以及用于给予该组合物的特定方法决定。因此，如下所述，本发明药物组合物存在多种合适剂型(参见例如，《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第17版，1989))。
VII.用于诊断、研究和治疗性应用的试剂盒
本发明也提供了可用于检测本文所述Wnt2核酸或蛋白的试剂盒。而且，提供了包含本文所述组合物的试剂盒，该组合物允许用户实施本发明方法。在诊断和研究应用中，这种试剂盒可包括以下物质中的任一种或全部：检测试剂、缓冲液、Wnt2特异性或卷曲蛋白特异性核酸或抗体、杂交探针和/或引物等。治疗性产品可以包括无菌盐水或其它药学上可接受的的乳液和悬液基底。
在优选实施方式中，该试剂盒包括含有如本文所述的特殊物质的试剂，其中该物质能与Wnt2蛋白或Wnt2核酸如mRNA结合，干扰Wnt2信号转导，或抑制Wnt2蛋白与其它蛋白如卷曲蛋白受体的结合。该试剂盒还可包括用于本发明物质和组合物的一个或多个容器，以及用该物质抑制过表达Wnt2的细胞增殖，治疗疾病如过表达Wnt2的癌症，诱导表达Wnt2的细胞凋亡，检测过表达Wnt2的癌细胞或实施本文所述任何方法的说明书。
在本发明的优选实施方式中，试剂盒包括SEQ ID NO：150所示siRNA或包含SEQ ID NO：152中约19-25个毗连核苷酸的核酸的siRNA，其中所述siRNA能结合Wnt2 mRNA并抑制Wnt2 mRNA翻译。此试剂盒还包括用于本发明物质和组合物的一个或多个容器，以及用所述siRNA抑制过表达Wnt2的细胞增殖，治疗疾病如过表达Wnt2的癌症，诱导表达Wnt2的细胞凋亡，检测过表达Wnt2的癌细胞或实施本文所述任何方法的说明书。任选地，该试剂盒包括对照siRNA，如包含SEQ ID NO：151所示核酸序列的siRNA。
如上所述，所述试剂盒可以包括包含实施本发明方法的说明(即使用方案)的指导材料。虽然指导材料一般包括书面或打印材料，但不限于此。能够存储此种说明书并能将它们传递给最终使用者的任何介质都包括在本发明中。这样的介质包括但不限于：电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光介质(例如CD-ROM)等。此种介质可以包括提供此种指导材料的互联网址。
本发明也提供了用于筛选Wnt2信号转导抑制剂的试剂盒。这种试剂盒可以由易于获得的材料与试剂制备。例如，这样的试剂盒可以包括一种或多种以下材料：Wnt2多肽或多核苷酸、反应试管以及测试所需Wnt2信号转导功能(例如β联蛋白水平)的说明书。
本发明的药物组合物和试剂盒包括本文所述特定物质。
虽然为了阐明和理解以说明和举例的方式详细描述了上述发明，但本领域普通技术人员根据本发明内容不难明白，可以对其进行某些改变、更改、修饰和等价物取代，而不必背离本发明构思和范围。结果是，本文所述实施方式涉及各种修饰、改变等，而本发明范围仅由所附权利要求书决定。
虽然本文所述的本发明各部分都含有多个实施方式，但是应理解，除非另有说明，本发明给定部分的各实施方式能够与本发明其它部分的各实施方式一起应用，这些应用各自形成本发明的独特实施方式。
还通过以下实施例进一步说明本发明，以下实施例仅为说明性，不旨在以任何方式限制本发明的定义和范围。
VIII.实施例
实施例1：材料和方法
1.细胞系和组织样品
人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(A549、NCI-H1703、H460和H1299)、间皮瘤癌细胞系(NCI-H2052、H28和H513)、黑色素瘤细胞系(LOX、FEM、FEMX和SK-Mel-2)、乳腺癌细胞系(MCF-7和HuL100)和结肠癌细胞系(HCT116和SW480)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。间皮瘤癌细胞系获自以下来源：LRK1A和REN由Steven Albelda博士慷慨赠予(宾西法尼亚大学(University of Pennsylvania)，美国宾西法尼亚州费城)，NCI-H2052、H28和H513来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，MS-1和NCI-H290来自NIH(美国马里兰州弗雷德里克)，LP9来自哈佛大学的细胞培养中心(Cell CultureCore Facility)(美国马萨诸塞州波士顿)。除了LP9以外的所有细胞系都用补充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640培养。LP9用含有15％培养基加10ng/ml EGF和0.4μg/ml HC的M199培养。正常的人小呼吸道上皮细胞(SAEC)和支气管上皮细胞(NHBE)获自Clonetics(Walkersville，马里兰州)，用Clonetics SAGMTM Bullet试剂盒培养。在37℃、含有5％CO2的湿培养箱中培养所有细胞。在初次进行的治愈性肿瘤切除手术过程中收集患者的新鲜肺癌组织和邻近正常肺组织以及新鲜间皮瘤组织和邻近正常胸膜组织，立即用液氮速冻(IRB#H8714-22942-01)。将这些组织样品保持在-170℃的液氮冷冻器中，待用。
2.Western印迹
采用标准实验方案。抗-Dvl3和抗-存活蛋白抗体得自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，美国加利福尼亚州)。抗-胱冬酶3抗体来自Oncogene(美国马萨诸塞州坎布里奇)。抗-β-肌动蛋白抗体获自Cell Signaling Technology，Lie.(美国马萨诸塞州贝弗利)。抗-β-联蛋白抗体购自Transduction Laboratories(肯塔基州列克星敦)。抗-细胞色素c抗体来自BD Biosciences(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。为了检测β-联蛋白和细胞色素c的改变，制备胞浆提取物，如前所述进行检测(Wang等，Mol Cell Biol19(9)：5923-9(1999))。
3.Tcf依赖性转录活性的TOPFLASH试验
如You等，Oncogene(2004)23：6170-4所述，与抗-Wnt2单克隆抗体一起孵育后，在各种细胞系中进行Tcf依赖性转录活性的TOPFLASH试验。简要说，将细胞接种到六孔板中。与对照或抗Wnt2单克隆抗体(10μg/ml)一起孵育48小时后，将TOPFLASH或FOPFLASH报道质粒瞬时转染到细胞内，如前所述(Uematsu等，CancerRes.(2003)63：4547-51)。通过pTOPFLASH：pFOPFLASH荧光素酶活性比测定Tcf-介导的基因转录。各自标准化至pRL-TK受体(共转染内标)的荧光素酶活性。重复进行三次实验。
4.凋亡分析
通过胰蛋白酶消化收获细胞，进行处理，以测定细胞表面膜联蛋白-V和碘化丙锭(PI)含量，根据生产商说明书(膜联蛋白V FITC凋亡检测试剂盒(Oncogene，美国马萨诸塞州坎布里奇)；Apotarget(BioSource International))。采用膜联蛋白-V-PI双染方案，可用双色流式细胞术区分三种细胞群体：(a)非凋亡细胞：膜联蛋白-V和PI阴性；(b)早期凋亡细胞，磷脂酰丝氨酸外露但细胞膜仍然完整，这种细胞能结合膜联蛋白V-FITC但排斥碘化丙锭；和(c)坏死或晚期凋亡阶段的细胞，被膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭标记。然后立即用流式细胞术分析染色的细胞(FACScan；Decton Dickinson，Franklin Lake，新泽西州)。根据厂商说明书用ApopTag过氧化物酶原位寡核苷酸连接凋亡检测试剂盒(Chemicon International，Temecula，CA)对从体内实验收获的肿瘤组织样品进行TUNEL染色。
5.体内肿瘤抑制研究
向5-6周龄的雌性裸小鼠的背部皮下注射体积为100μl的1×107LOX细胞。三天后，一致地形成肿瘤，然后给动物腹膜内(i.p.)注射体积为100μl的单克隆抗-Wnt2抗体、对照单克隆抗体或PBS缓冲液。单克隆抗-Wnt2和对照抗体的注射剂量均为250μg。每周注射两次。各组由8只小鼠组成。每隔一周测定肿瘤大小，用宽(x)和长(y)(x2y/2，其中x＜y)计算肿瘤体积(Sonoda等，Cancer Res 61(13)：4956-60(2001))。
6.增殖试验
Alimta(MTA)获自Eli Lilly(美国印第安纳州印第安纳波利斯)。用无菌生理盐水将Alimta稀释到10mg/ml浓度。将此储存液分成等份，储存于-80℃，在各实验前用培养基稀释。Wnt2抗体储存于4℃，如前所述地使用。通过测量四唑氮转化的代谢活性(Cell Titer 96试验，Promega，Madison，WI)测定细胞增殖。简要说，以每孔5,000个细胞接种96孔板，加入含有浓度逐渐升高的两种药物的培养基。在37℃的CO2培养箱中，孵育该板72小时。然后加入溶解/终止溶液，用荧光平板阅读器在570nm波长处记录吸光度。各实验至少以一式三份重复三次。
7.抗Wnt2单克隆抗体的DNA序列分析
用标准的DNA测序技术对杂交瘤细胞系17F7.G7、17F7.E5、8B11.D2和8B11.H6产生的单克隆抗体CDR序列进行测序。简要说，用PCR扩增第一条链cDNA的V区。引物组包括恒定区中的反向引物和杂交于信号肽区的上游引物。采用了对应于VH和VL的多个上游引物。抗-Wnt2单克隆抗体的可变区DNA序列见图14-18，例如SEQ ID NO：68、75、92、95、111、118、129、135、141和144。
8.抗-Wnt2抗体的蛋白序列分析
也通过蛋白质测序直接对抗-Wnt2单克隆抗体进行测序。简要说，还原蛋白样品，用碘乙酰胺使Cys烷基化，产生Cys(CAM)。然后，在还原条件下用SDS-PAGE电泳样品，电印迹至PVDF膜上，用酰氨黑(Amido Black)染色后各自产生轻链和重链。采用标准蛋白质测序技术。例如，亚克隆MG7的N-末端序列见SEQ ID NO：146。
9.基因表达阵列
在一些实验中，用AmpoLabelling-LPR试剂盒方案(GEArray Q人Wnt信号传导途径基因阵列，SuperArray，美国马里兰州弗雷德里克)，以定制阵列分析基因表达分布型，经设计该定制阵列能分析参与Wnt信号转导和Wnt信号转导下游的基因表达分布型。简要说，对分离自所选组织的总RNA进行RT反应，用生物素-16-dUTP(Roche)标记cDNA探针，在含有Wnt特异性阵列的杂交试管中变性和杂交过夜。采用CDD相机通过化学发光反应完成检测。用生产商提供的软件将斑点图像转变为数值数据。将表达数据与生产商提供的基因列表相匹配。代表性基因表达阵列分析见图9。
10.RNA干扰
将细胞接种到含有培养基但没有抗生素的6孔板中，测试前培养24小时。离子交换HPLC-纯化的siRNA(Wnt2 siRNA和非沉默性siRNA对照)购自Qiagen-Xeragon(Germantown，MD)。将冻干的siRNA溶解于退火缓冲液中，重新加热到95℃1分钟，然后在37℃孵育1小时。我们遵循Elbashir所述方案(Elbashir等，Methods26(2)：199-213(2002))。siRNA转染后，将板在37℃孵育3天，然后进行进一步分析。人 Wnt2 特异性 siRNA 衍生自人 Wnt2 的 mRNA 序列5′-GAAGATGGGAAGCGCCAAG-3′(SEQ ID NO：150)。对照(非沉默性)siRNA不靶向任何已知的哺乳动物基因5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′(SEQ ID NO：151)。
11.统计学分析
所示数据代表平均值(±S.E.M.)。用Excel中的不配对T-检验比较不同处理和细胞系。用双侧Student t-检验进行其它统计学比较(P＜0.01)。
实施例2 ：鉴定抗原性Wnt2肽
用各种方法测定人Wnt2蛋白的抗原性肽。例如，EMBOSS(Parker等，Biochemistry 25：5425-5432(1986))找到蛋白质中的抗原性位点。也用Kolaskar和Tangaonkar法测定抗原性肽(K&T；FEBS Lett.(1990)276(1-2)：172-4)。这两种方法都导致鉴定出人Wnt2的相似抗原性肽(表1)。虽然可用所鉴定的大多数抗原性肽序列产生特异性结合于人Wnt2的抗体，但由于各种Wnt蛋白与人Wnt2的氨基酸序列同源性，一些抗体也可结合于其它Wnt蛋白。例如，氨基酸序列SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：44与人Wnt2B(Wnt13)具有同源性；氨基酸序列SEQ ID NO：43与人Wnt2B(Wnt13)、Wnt3、Wnt3A、Wnt5B和Wnt10A具有同源性；氨基酸序列SEQ IDNO：45与人Wnt2B(Wnt13)和Wnt4具有同源性；氨基酸序列SEQ ID NO：47与人Wnt1和Wnt2B(Wnt13)具有同源性；氨基酸序列SEQ ID NO：53与人Wnt-2B(Wnt13)、Wnt3和Wnt8B具有同源性。
表1：人Wnt2的抗原性肽
人Wnt2的抗原性肽的序列和在SEQIDNO：1中的位置  SEQ ID NO   鉴定方法
49 SSQRQLCHRHPDVMR 63  2
4 PLGGIWLWLPLLLTWLTPE 22  3
37 SRVMCDNVPGLV 48  4
74 AECQHQFRQH 83  5
92 RDHSLFGRVLLR 103  6
107 ESAFVYAISSAGVVFAITRACSQGEVKSCSCD138  7
137 CDPKKMGSAKDSKG 150  8
163 YGIKFARAFVD 173  9
171 VDAKERKGKDAR 183  10
202 LKQECKCHGVSGSCTLRTCWLAM 224  11
240 GAIQVVM 246  12
265 KNDLVYFENSPDYCIR 280  13
289 TAGRVCNLTSRGMDSCEVMCCG 310  14
344 DVHTCKAPKNADWTTAT 360  15
38 RVMCDNVPGLVSSQRQLCHRHP 59  30   EMBOSS
75 ECQHQFR 81  31   EMBOSS
93 DHSLFGRVLLRS 104  32   EMBOSS
108 SAFVYAISSAGVVFAITRACSQGEVKSCSCDP139  33   EMBOSS
164 GIKFARAFVDA 174  34   EMBOSS
203 KQECKCHGVSGSCTLRTCWLAMA 225  35   EMBOSS
241 IQVVMN 247  36   EMBOSS
266 NDLVYFE 272  37   EMBOSS
275 PDYCIRD 281  38   EMBOSS
290 AGRVCNLT 297  39   EMBOSS
303 SCEVMCCGR 311  40   EMBOSS
323 KCGVKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKAP351  41   EMBOSS
37 SRVMCDNVPGLVSSQRQLCHRHP 58  42   K&T
74 AECQHQF 80  43   K&T
92 RDHSLFGRVLLR 103  44   K&T
107 ESAFVYAISSAGVVFAITRACSQGEVKSCSCD138  45   K&T
163 YGIKFARAFVD 173  46   K&T
202 LKQECKCHGVSGSCTLRTCWLAM 224  47   K&T
240 GAIQVVM 246  48   K&T
265 KNDLVYF 271  49   K&T
274 SPDYCIR 280  50   K&T
289 TAGRVCNL 296  51   K&T
302 DSCEVMCCG 310  52   K&T
322 TKCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKA350  53   K&T
实施例3：产生抗-Wnt2单克隆抗体和抗体与细胞一起孵育
用于产生单克隆抗-Wnt2抗体的抗原是对应于人Wnt2氨基酸残基49-63的合成肽(Ac-SSQRQLCHRHPDVMR-酰胺，SEQ ID NO：2)。根据亲水性(Parker等，(1986)Biochemistry 25(19)：5425-32)、抗原性(Welling等，(1985)FEBS Lett.188(2)：215-8)、可及性(Janin，Nature 277：491-2(1979))、序列同源性(BLAST搜索)和N末端邻近度用生物信息学方法选择了此抗原。
抗Wnt2小鼠单克隆抗体(IgG1)是在Rockland Inc.(Gilbertsville，宾夕法尼亚州)定制的。产生了几种杂交瘤细胞系，详细表征了其中五种：(1)17F7.G7(亚克隆A；图14)；(2)17F7.G7(亚克隆B；图18)；(3)17F7.E5(图16)；(4)8B11.D2(图15)；和(5)8B11.H6(图17)。在8B11.H6中发现了两种不同轻链，称为8B11.H6(链1)和8B11.H6(链2)。在17F7.G7(亚克隆B)中也发现了两种不同轻链(链1和链2)。这些抗-Wnt2单克隆抗体的VLCDR和VHCDR序列见表2。CDR序列、FR序列和编码它们的核酸序列的位置见图14-18。通过ELISA用该肽筛选测试品种两次，用Western印迹分析筛选亲本克隆和亚克隆。
表2：抗-Wnt2单克隆抗体的VLCDR和VHCDR序列
  抗Wnt2 mAb   VLCDR1 VLCDR2     VLCDR3
  17F7.G7(亚克隆A)   KSVSTSGYSY(SEQ ID NO：56) LVS(SEQ ID NO：58)     PDYxCSTLGSL(SEQ ID NO：60)
  17F7.G7(亚克隆B)(链1)   KSVSTSGYSY(SEQ ID NO：56) LVS(SEQ ID NO：58)     QHIRELTR(SEQ IDNO：84)
  17F7.G7(亚克隆B)(链2)   QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO：104) LVS(SEQ ID NO：58)     WQGTHFPWT(SEQ ID NO：138)
  17F7.E5   QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO：104) LVS(SEQ ID NO：58)     WQGTHFPWTLR(SEQ ID NO：107)
  8B11.D2   KSVSTSGYSY(SEQ ID NO：56) LVS(SEQ ID NO：58)     QHIRELTR(SEQ ID NO：84)
  8B11.H6(链1)   KSVSTSGYSY(SEQ ID NO：56) LVS(SEQ ID NO：58)     QHIRELTR(SEQ IDNO：84)
  8B11.H6(链2)   QRLLYSNGKTY(SEQ ID NO：125) LVS(SEQ ID NO：58)     VQGTHFPWTLR(SEQ ID NO：126)
  抗Wnt2 mAb   VHCDR1 VHCDR2     VHCDR3
  17F7.G7(亚克隆A*)   GYTFTDYV(SEQ IDNO：63) IYPGYGST(SEQ IDNO：65)     ARWGDCF CLS G(SEQ IDNO：67)
  17F7.G7(亚克隆B)   GYTFTDYV(SEQ ID NO：63) IYPGYGST(SEQ ID NO：65)     ARWGDSFAY(SEQ ID NO：110)
  17F7.E5   GYTFTDYV(SEQ ID NO：63) IYPGYGST(SEQ ID NO：65)     ARWGDSFAY(SEQ ID NO：110)
  8B11.D2   GYTFTTYV(SEQ ID NO：87) IDPYNDGT(SEQ ID NO：89)     TRGNGNYESYYAMDY(SEQ ID NO：91)
  8B11.H6   GYTFTTYV(SEQ ID NO：87) IDPYNDGT(SEQ ID NO：89)     TRGNGNYESYYAMDY(SEQ ID NO：91)
*，对17F7.G7(亚克隆A，图14)再测序，获得CDR3序列ARWGDSFAY(SEQ ID NO：110)。
通过分析这些抗体可以看出，优选某些CDR序列(见表2)。例如，本文分析的各个抗-Wnt2单克隆抗体的VLCDR2包含氨基酸序列LVS(SEQ ID NO：58)。其它CDR序列也非常相似，如VHCDR1序列 GYTFTDYV(SEQ ID NO：63)和GYTFTTYV(SEQ ID NO：87)，仅相差一个氨基酸残基。
用蛋白G(Protein G)对单克隆抗体进行亲和纯化，保藏在-80℃。根据生产商说明书用Seize X哺乳动物免疫沉淀试剂盒(Pierce Biotechnology，美国伊利诺斯州罗克福德)从细胞系提取物中沉淀Wnt2蛋白，然后进行Western印迹。在实验前一天将细胞接种到六孔板或10厘米培养皿中。然后，用含有各种浓度抗体的培养基替换正常培养基，在37℃、含有5％CO2的湿培养箱中孵育细胞。在多个时间点上，用标准方法收集细胞进行进一步分析。对照抗体是购自Sigma-Aldrich Co.(密苏里州圣路易斯)的小鼠IgG1MOPC21。抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7用于所述实验。
实施例4：Wnt2 mRNA在正常组织和癌组织中的表达
用cDNA阵列研究了Wnt2 mRNA在人正常组织和癌组织中的表达。简要说，通过来自正常(76)、以及肿瘤-正常匹配的(19)人RNA谱的多个RNA微阵列(Clontech)用Wnt2 cDNA探针检测Wnt2 mRNA表达。放射性标记全长Wnt2 cDNA探针，并杂交于RNA微阵列。在正常人器官中，Wnt2 mRNA在胎盘中表达，在胎肺和正常肺中表达很弱(You等，Cancer Res.64：5385-89(2004))。注意到在人RNA主要印迹(master blot)中，所有其它正常人组织中表达很少或没有表达(You等，Cancer Res.64：5385-89(2004))。在匹配的人非癌组织和癌组织中，Wnt2 mRNA常常在各种人癌组织中过表达，这些人癌包括10例结肠癌中的10例、10例直肠癌中的10例、7例肠癌中的6例、10例胃癌中的8例以及10例甲状腺癌中的4例(表3)。此外，在间皮瘤(图9)、黑色素瘤、肉瘤、子宫内膜癌、白血病、成胶质细胞瘤、食道癌、鼻咽癌、头颈癌和非癌转移中观察到Wnt2 mRNA水平升高。例如，间皮瘤细胞中的Wnt-相关性基因表达分布型见图9。
表3：Wnt2 mRNA在人癌中过表达(mRNA微阵列分析)
癌组织     Wnt2 mRNA在肿瘤中过表达
1.乳腺     4/10
2.卵巢     4/10
3.结肠     10/10
4.胃     8/10
5.肺     2/10
6.肾     1/10
7.膀胱     3/5
8.外阴     3/5
9.前列腺     2/4
10.子宫     5/10
11.宫颈     5/10
12.直肠     10/10
13.甲状腺     4/10
14.睾丸     4/10
15.皮肤     2/10
16.肠     6/7
17.胰腺     6/7
18.气管     2/3
19.肝     2/4
实施例5：单克隆抗-Wnt2抗体使细胞提取物中的人Wnt2蛋白沉淀
产生抗Wnt2 N-末端肽的单克隆抗体(参见实施例1)。为了测定单克隆抗-Wnt2抗体可否特异性结合于培养细胞中天然形式的Wnt2蛋白，仅用此单克隆抗体或与阻断肽(比抗体多30倍)预孵育后用此单克隆抗体对三种细胞系的细胞提取物进行免疫沉淀。C57Wnt2细胞系用作阳性对照。也测试了NSCLC(A549)和黑色素瘤(LOX)细胞系。在C57Wnt2、A549和LOX细胞中，单克隆抗-Wnt2抗体沉淀出Wnt2蛋白。当单克隆抗-Wnt2抗体与阻断肽预孵育时，它沉淀Wnt2蛋白的能力在所有三种细胞系中均被阻断。与阻断肽预孵育后用单克隆抗体不能使Wnt2蛋白沉淀。这些数据说明，抗-Wnt2单克隆抗体可以特异性结合于天然形式的Wnt2蛋白。
实施例6：人Wnt2蛋白在正常组织和癌组织中的表达
用此单克隆抗体检测了多种人癌细胞系(表3)中的Wnt2蛋白表达；人癌细胞系包括四种人NSCLC细胞系(A549、H1299、H1703和H460)、一种正常间皮细胞系(LP9；图10)和八种恶性间皮瘤细胞系(Met5a、LARk1A、REN、H290、H2052、MS-1、H513和H28，图10)、四种人黑色素瘤细胞系(LOX、FEM、FEMX和SK-Mel-2)、两种乳腺癌细胞系(HuL100和MCF-7)以及两种结肠癌细胞系(HCT116和SW480)。小呼吸道上皮细胞(SAEC)和正常的原代人支气管上皮细胞(NHBE)用作正常对照。在所测试的所有癌细胞系中发现了Wnt2蛋白表达。在两种原代正常肺细胞(SAEC和NHBE)中没有观察到Wnt2表达。此外，与自体匹配的正常肺组织对照相比，8块新鲜切除的NSCLC组织中的7块的Wnt2蛋白表达增加(数据未显示)。而且，5块从患者新鲜切除的胸膜间皮瘤中的5块显示出Wnt2蛋白表达，而在自体匹配的正常胸膜中没有检测到Wnt2蛋白(图10)。
实施例7；抗-Wnt2单克隆抗体介导来自癌症患者的原代细胞培养物的细胞毒 性/凋亡
由获自患者的癌组织制备新鲜原代培养物。所分析的大多数癌症高水平表达Wnt2蛋白。由癌症(如甲状腺癌、结肠癌或恶性黑色素瘤)患者新鲜制备的这些原代培养物时与抗-Wnt2单克隆抗体(约10μg/ml)一起孵育，观察细胞毒性/凋亡(“++++”；表4)。
表4：抗-Wnt2 mAb介导癌症患者的原代培养物的细胞毒性/凋亡。
患者   癌症类型     细胞毒性/凋亡
#565   肺癌     +/-
#571   肺癌     ++
#610   肺癌     ++++
#595   结肠癌     ++++
#598   结肠癌转移     ++++
#599   结肠癌转移     ++++
#560   甲状腺癌     +++
#570   卵巢癌     ++++
#547   恶性黑色素瘤     ++++
#608   恶性黑色素瘤     ++++
#714   恶性黑色素瘤     ++++
#696   间皮瘤     ++++
#569   成骨肉瘤     ++++
#588   肉瘤     ++++
#602   肉瘤转移     ++++
#603   肉瘤     ++++
以下细胞毒性/凋亡表明：+/-，约40％；++，约70％；++++，大于90％。
实施例8：抗-Wnt2抗体诱导的凋亡与Wnt2表达相关
用抗-Wnt2单克隆抗体治疗许多人癌细胞系，包括四种人NSCLC细胞系(A549、H1299、H1703和H460)、五种恶性胸膜间皮瘤细胞系(H290、H2052、MS-1、H513和H28)、四种人黑色素瘤细胞系(LOX、FEM、FEMX和SK-Mel-2)、两种乳腺癌细胞系(HuL100和MCF-7)以及两种结肠癌细胞系(HCT116和SW480)。孵育3-5天后，在所有这些细胞系中都观察到大量细胞死亡(10.0μg/ml抗体时超过90％细胞死亡，P＜0.005)(表5)。在单克隆抗体与阻断肽预孵育的情况下或对照单克隆抗体处理后，没有在这些细胞系中观察到明显的细胞病理效应。在用相同单克隆抗-Wnt2抗体处理的NHBE细胞中也没有观察到任何效应。细胞杀伤作用主要是由于诱导凋亡(孵育72小时后凋亡细胞占43.6-79.2％)。此单克隆抗体诱导凋亡是剂量和时间依赖性的(数据未显示)。采用NSCLC细胞系进行此分析的一个代表性例子见图1。诱导黑色素瘤细胞凋亡见图6，诱导间皮瘤癌细胞系凋亡见图11。此外，观察到抗-Wnt2单克隆抗体对肝细胞瘤细胞系HepG2和Hep3B的细胞毒作用(数据未显示)。
作为特异性对照，用与阻断肽(比抗体多30倍)预孵育过夜阻断的单克隆Wnt2抗体检测在A549、LOX和FEMX中诱导凋亡的情况。孵育72小时后，阻断肽明显抑制了抗-Wnt2抗体诱导的凋亡(P＜0.003)。仅用相同剂量的阻断肽(300μg/ml，72hrs)对细胞活力没有影响。仅用单克隆抗体(10μg/ml)或用与阻断肽(比抗体多30倍)预孵育阻断的单克隆抗体处理约72小时后，没有检测到显著的凋亡诱导。采用A549进行此分析的一个代表性例子见图1。在黑色素瘤细胞中进行的一个相似实验见图6。
此外，用抗-Wnt2单克隆抗体处理由黑色素瘤患者和甲状腺癌患者新鲜制备的两种原代培养物，抗体处理后，在两个患者的原代培养物中都观察到显著的胞溶现象。而且，当用低剂量的抗-Wnt2抗体(2.0μg/ml)加低剂量化疗(0.01nM多西他赛)处理A549细胞时，观察到协同作用(图5)。
表5.靶向Wnt2的单克隆抗体诱导人癌细胞系凋亡。
细胞系 Wnt2蛋白表达 靶向Wnt2的单克隆抗体诱导凋亡
正常，对照NHBESAEC -- --
肺癌A549H1299H1703H460 ++++ ++++
间皮瘤MS-1H2052H513H290H28 +++++ +++++
黑色素瘤LOXFEMXFEMSK-MEL-2 ++++ ++++
乳腺癌Hu100MCF-7 ++ ++
结肠癌HCT-116SW480 ++ ++
实施例9；抗-Wnt2单克隆抗体能抑制Wnt信号转导并通过释放细胞色素c、 下调存活蛋白和活化胱冬酶-3诱导凋亡
报道了NSCLC和间皮瘤中Dvl-3的过表达(Uematsu等，Oncogene 22(46)：7218-21(2003)；Uematsu等，Cancer Res 63(15)：4547-51(2003))。我们发现，单克隆抗-Wnt2抗体处理癌细胞后，胞浆β-联蛋白和Dvl-3下调，所述癌细胞包括NSCLC细胞系A549(图2)、黑色素瘤细胞系FEMX和LOX(图6)以及间皮瘤细胞系MS1、H28和LRK1A(数据未显示)。在单克隆抗Wnt2抗体诱导凋亡的A549、FEMX和LOX细胞中，胱冬酶-3的切割(活性)形式上调(参见图2(A549)；图6(FEMX和LOX))。与此胱冬酶-3活性一致，单克隆抗-Wnt2抗体处理后，检测到这些细胞中的细胞色素c水平升高(图6)。此外，抗体处理后，这些细胞中的凋亡抑制剂蛋白(IAP)即存活蛋白也下调(图6)。而且，单克隆抗-Wnt2抗体处理后，观察到TCF依赖性转录活性(TOPFLASH试验)(P0.01)在A549细胞中显著降低(图2)。用抗-Wnt2单克隆抗体处理LOX细胞{FIGURE？}和由恶性黑色素瘤患者新鲜制备的原代肿瘤培养物(图6)后，β-联蛋白-TCF靶向基因、c-Myc和纤连蛋白也下调。
实施例10：Wnt2 siRNA诱导癌细胞凋亡
按照Elbashir等(Elbashir等，Methods 26(2)：199-213(2002))所述方案进行RNA干扰，用靶向Wnt2的小干扰RNA(siRNA)研究Wnt2 mRNA沉默的作用。与单克隆抗-Wnt2抗体类似，用Wnt2 siRNA处理3-5天能诱导表达Wnt2的所有癌细胞系凋亡(参见图3(A549细胞)；图7(LOX和FEMX细胞)；图12(MS1、H28和LRK1A细胞)。100nM Wnt2 siRNA能明显诱导凋亡，非沉默性siRNA对照(100nM)不诱导凋亡(P＜0.01)(图3)。Wnt2 siRNA处理(100nM，72小时)后，Western印迹分析证实了Wnt2表达沉默(图3是A549细胞；图7是LOX和FEMX细胞；图12是MS1、H28和LRK1A细胞)。非沉默性siRNA用作对照(100nM，72小时)。为了测定凋亡作用是否与Wnt2信号转导抑制有关，在Wnt2 siRNA处理后观察到Dvl-3、胞浆β-联蛋白和存活蛋白的表达水平下调(图3是A549细胞；图7是LOX和FEMX细胞；图12是MS1、H28和LRK1A细胞)。也发现siRNA Wnt2处理的LOX细胞中β-联蛋白-TCF靶向基因、c-Myc和纤连蛋白下调(图7)。
实施例11：抗-Wnt2单克隆抗体抑制体内肿瘤生长
采用对肺中肿瘤发生特异的小鼠模型进行体内研究。在一个实验中，以每只小鼠3百万个细胞将恶性黑色素瘤细胞系LOX通过尾静脉接种到无胸腺裸鼠体内。然后通过腹膜内(i.p.)注射250μg单克隆抗-Wnt2抗体或PBS对照处理10只小鼠，一周两次，共四周。一周后处死小鼠。手术取出肺并称重。用Student t检验分析结果。观察抗Wnt2单克隆抗体处理的小鼠和未处理的对照小鼠之间的肺重量差异(P＜0.0418；图4)。
在另一实验中，将恶性黑色素瘤LOX细胞皮下注射入裸鼠体内。然后用250μg抗-Wnt2单克隆抗体、对照抗体或100μl PBS对照通过腹膜内注射处理动物，一周两次。相对于对照，单克隆抗-Wnt2抗体能显著抑制肿瘤生长(图8)。肿瘤建立后开始抗-Wnt2单克隆抗体注射时(肿瘤细胞接种3天后)，观察到肿瘤生长抑制(P＜0.005；图8a和8b)。收获肿瘤组织，并用TUNEL染色分析，在用抗-Wnt2单克隆抗体处理的肿瘤组织中观察到凋亡细胞。
实施例12：给予抗-Wnt2单克隆抗体对小鼠器官没有显著毒性
为了研究是否可能由给予单克隆抗Wnt2抗体引起细胞毒作用，用显微镜观察单克隆抗Wnt2抗体处理的几种小鼠组织样品，包括脑、肺、肾、心脏、小肠、大肠、胃、卵巢、皮肤、肌肉、肝和骨。有经验的病理学家进行的盲检分析在Wnt2单克隆抗体处理的小鼠中不能观察到可察觉的毒性或异常。最后，Wnt2抗体处理的小鼠在处理4周后表现得完全正常。手术切除组织样品，包埋在石蜡块中。用曙红对组织切片(5μm)进行组织化学染色，并由合格的小鼠病理学家在光学显微镜下检查。
实施例13：抗Wnt2抗体-诱导的凋亡是快速过程并且是剂量依赖的
在两种NSCLC细胞系H838和A549上进行剂量和时程实验。抗-Wnt2抗体孵育约32小时后，流式细胞术分析显示，1μg/ml抗体可诱导凋亡。浓度为20μg/ml的抗Wnt2抗体引起急剧凋亡性细胞死亡。早在孵育6小时后，就可检测到抗Wnt2抗体(浓度为8μg/ml)诱导的凋亡，孵育50小时后，发现几乎所有细胞都发生凋亡或坏死。相反，在平行实验中对照抗SOCS3抗体对这些癌细胞没有作用。抗Wnt2抗体与正常肺细胞系(CCL-75)一起孵育也不对时间或剂量敏感。
实施例14：抗Wnt2抗体-诱导的凋亡与Smac/Diablo和细胞色素c由线粒体释 放到胞浆中和JNK活化有关
在凋亡期间，Smac/Diablo(第二种线粒体衍生的胱冬酶激活物/低pI的直接IAP-结合蛋白)用于消除IAP-介导的胱冬酶抑制。凋亡刺激引起Smac/Diablo和细胞色素c由线粒体膜内空间腔释放到胞浆中。细胞色素c直接活化Apaf-1，胱冬酶-9，Smac/Diablo与多种IAP相互作用，以消除IAP介导的起始物和效应物胱冬酶的抑制。与癌细胞中胱冬酶-3活性增加、而正常细胞中不增加的上述结果一致，抗-Wnt2抗体处理后癌细胞胞浆中Smac/Diablo和细胞色素c水平升高，但在正常细胞的胞浆中没有观察到这种现象。这些结果说明，Smac/Diablo和细胞色素c可能分别通过消除存活蛋白和/或其它IAP-介导的抑制并直接活化胱冬酶参与抗-Wnt2抗体诱导的凋亡。
实施例15：Dvl活化在非小细胞肺癌中的作用
也检测了Dvl活化在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用。本实施例证明，Dvl-3在新鲜切除的NSCLC和建立的NSCLC细胞系中过表达。因此，提供了额外证据说明通过典型的β-联蛋白途径的Wnt2信号转导是由于上游事件，如Dvl表达。
分析Dvl的表达和功能，以评价Wnt2信号转导在NSCLC中的作用。八个NSCLC新鲜肿瘤(四个鳞状细胞癌和四个腺癌)和其自体匹配的正常肺组织获自早期阶段INSCLC患者，这些患者经历作为治疗的一部分肿瘤切除。患者之前没有接受任何治疗，如化疗。这些样品的Western印迹分析显示，在75％(四个鳞状细胞癌中的三个，四个腺癌中的三个)所有测试的癌细胞中，Dvl-3过表达，而相应匹配的正常显微解剖的肺组织不能显示出Dvl-3表达。而且，过表达Dvl-3的8个NSCLC肿瘤中，Western印迹分析显示出7个肿瘤的Wnt2表达水平较高。没有检测到Dvl-1或Dvl-2表达。
实施例16：单用和联用抗-Wnt2单克隆抗体、Alimta对细胞增殖的作用
评价抗-Wnt2单克隆抗体对细胞增殖的作用，并与Alimta的作用作比较。Alimt(LY231514、MTA、pemetrexed)是新型多功能抗叶酸物抗代谢物(HanauskeLung Cancer 45增刊1：S121-4(2004))。近年来，III期临床试验证明，Alimta与顺铂联用导致与单用顺铂相比功效显著增加(Vogelzang等，J.Clin.Oncol.21：2636-44(2003))。现在认为，Alimta是治疗不可手术治疗的间皮瘤的标准药物。将MS1间皮瘤细胞接种到96孔板中，用浓度逐渐增加的Wnt2抗体、Alimta单独或二者处理。三天后，通过测定细胞酶的代谢活性(此处是四唑氮转化)评价细胞增殖。当使用浓度为10μg/ml的抗-Wnt2抗体时，观察到细胞增殖降低约30％(SD+/-7％)。浓度1μg/ml的Alimta处理诱导细胞增殖降低约41.9％(SD+/-4％)，浓度为10μg/ml时细胞增殖降低约42.9％(SD+/-2％)。当浓度为10μg/ml的抗Wnt2单克隆抗体和Alimta一起使用时，细胞增殖被抑制了约51.2％(SD+/-5％，p＜0.005)。
讨论
如上所述，关于Wnt配体在人癌发生中起到的作用还知之甚少。本文所示数据证明，wnt信号在人癌细胞中起到因果作用，因此是癌症治疗靶点。
上面列出的数据证明，抗-Wnt2抗体可诱导人癌细胞凋亡。而且，我们的数据表明，抗肿瘤作用是由于阻断了wnt信号传导途径。抗Wnt抗体诱导的凋亡性细胞死亡不仅与Wnt蛋白表达相关，而且与所测试的人肿瘤细胞中dvl蛋白和胞浆β联蛋白表达降低相一致。相反，在正常细胞系中，抗Wnt抗体处理后Dvl蛋白和胞浆β-联蛋白保持相同水平。没有检测到抗体对正常细胞系的作用，这提示抗-Wnt2抗体可特异性诱导癌细胞凋亡，而不诱导正常细胞凋亡。假设多克隆抗体可能产生非特异性作用，我们采用抗-Wnt2单克隆抗体进一步研究抗-Wnt2抗体作用的特异性。抗-Wnt2单克隆抗体能够诱导过表达Wnt2蛋白的人癌细胞系，如人肺癌细胞系凋亡。与获自多克隆抗体研究的结果相似，抗-Wnt2单克隆抗体处理这些肿瘤细胞后，dvl蛋白和胞浆β联蛋白减少。然而，抗-Wnt2单克隆抗体显示的特异性比抗-Wnt2多克隆抗体高得多，如抗-Wnt2单克隆抗体仅诱导过表达Wnt2蛋白的肿瘤细胞(A549、LOX和FEMX)凋亡，在表达Wnt2蛋白的肿瘤细胞中没有可检测的作用；抗Wnt-1多克隆抗体诱导过表达Wnt2的肿瘤细胞凋亡性细胞死亡。总之，这些数据表明，抗-Wnt2抗体处理可诱导肿瘤特异性凋亡并下调人癌细胞中的Wnt-dvl-β联蛋白信号传导途径。
通过卷曲蛋白受体和蓬乱蛋白，Wnt信号活化了两条不同途径：经典途径(即β联蛋白途径)和JNK途径。蓬乱蛋白具有三个高度保守的区域：DIX、PDZ和DEP。其中，DIX和PDZ结构域是经典信号传导途径所必需的，而DEP结构域对于活化JNK途径很重要。已表明，JNK活化在凋亡启动中起重要作用(Wang，C.Y等，Mol CellBiol 19(9)：5923-9(1999))。最近，Chen等证明，Wnt-1能通过活化β联蛋白和TCF转录抑制凋亡(Chen，S等，JCell Biol 152(1)：87-96(2001))。在本研究中，抗Wnt抗体处理后观察到β-联蛋白过表达和JNK活性增加，这说明经典途径和JNK途径都参与了抗-Wnt抗体诱导的凋亡。此外，在正常问皮细胞系中Dvl过表达能下调JNK活性，用芹甙元(Apigenin)抑制Dvl以阻断CK-2活性能增加JNK活性。最可能的情况是，抗Wnt抗体处理后JNK活化是通过Dvl进行的。
而且，NSCLC细胞中siRNA-介导的Dvl表达抑制降低了β-联蛋白-介导的Tcf转录，这进一步支持了Dvl过表达对一些肺癌细胞中经典Wnt/B-联蛋白途径很重要的观点。抑制Dvl也能抑制NSCLC细胞的细胞生长和集落形成，这表明Wnt信号转导中的异常上游事件与NSCLC肿瘤发生有关。
siRNA降解Dvl导致H1703细胞生长抑制，但在A549细胞中无此作用。它们都是鳞状细胞肺癌细胞系，但H1703具有突变失活的p53，而A549具有野生型p53。因此，p53状态可以解释，至少部分解释所处理的这两种鳞状细胞肺癌细胞系之间Dvl作用的差异。
为了进一步阐明抗-Wnt抗体诱导人癌细胞凋亡的机制，我们检测了凋亡通路中的其它可能组分。例如，检测了用Wnt抗体处理的这些肿瘤细胞中Smac/Diablo释放到胞浆中的情况。Smac/Diablo(第二种线粒体衍生的胱冬酶激活物/低pI的直接IAP-结合蛋白)(Du，C.等，Cell 102(1)：33-42(2000)；Verhagen，A.M.等，Cell 102(1)：43-53(2000))通过释放IAP-介导的胱冬酶抑制起作用。凋亡刺激引起Smac/Diablo和细胞色素c由线粒体膜内空间腔释放到胞浆中。细胞色素c直接活化Apaf-1和胱冬酶-9，Smac/Diablo与多种IAP相互作用，以消除IAP介导的对起始物和效应物的胱冬酶抑制(Chai，J.等，Nature 406(6798)：855-62(2000)；Srinivasula，S.M.等，J.Bio.Chem275(46)：36152-7(2000))。与癌细胞中胱冬酶-3活性增加、而正常细胞中不增加的上述结果一致，我们发现抗-Wnt抗体处理后癌细胞胞浆中Smac/Diablo和细胞色素c水平升高，但在正常细胞的胞浆中没有观察到这种现象。我们的结果表明，Smac/Diablo和细胞色素c可能分别通过消除存活蛋白和/或其它IAP-介导的抑制并直接活化胱冬酶参与此种抗-Wnt抗体诱导的凋亡。
上述发现提示，wnt抗体可能不仅直接诱导过表达Wnt蛋白的癌细胞凋亡，而且可能通过使这些肿瘤细胞恢复正常的凋亡机制消除潜在的药物抗性。肿瘤细胞药物抗性的基础最可能是破坏了凋亡。凋亡抑制剂存活蛋白的过表达是大多数人类癌症的共同特征。已证明，靶向存活蛋白能提高肿瘤细胞对细胞毒性药物的敏感性(Grossman，D.等，Proc Natl Acad Sci USA 98(2)：635-40(2001))。已证明，反义存活蛋白足以引起人间皮瘤细胞凋亡。而且，也报道了反义存活蛋白和化疗之间的协同作用。
我们已经证明，wnt抗体处理显著降低了存活蛋白的蛋白表达水平。总之，Wnt抗体应该加强和协同标准化疗对人癌细胞的作用。
Wnt信号或卷曲蛋白受体的其它拮抗剂也应通过蓬乱蛋白诱导凋亡。例如，sFRP通过与卷曲蛋白受体竞争结合所分泌的Wnt配体用作Wnt信号转导的可溶性调节物(Melkonyan，H.S.等，Proc Natl Acad Sci USA 94(25)：13636-41(1997))。具体说，sFRP可通过结合Wnt蛋白和阻断接近其细胞表面信号受体拮抗其功能，或者sFRP可通过帮助将配体递呈给卷曲蛋白受体增强Wnt活性(Uthoff，S.M.等，Mol Carcinog31(1)：56-62(2001))。卷曲蛋白受体拮抗剂(如对胞外结构域特异的抗体或对胞内结构域特异的小分子)应该诱导过表达wnt/卷曲蛋白的人癌细胞凋亡。
总之，我们的结果表明，wnt单克隆抗体可能通过经典和JNK途径诱导人癌细胞的肿瘤特异性凋亡。我们的数据证明，Wnt/卷曲蛋白是癌症治疗中有用的治疗靶点，异种移植小鼠模型的结果提示，Wnt单克隆抗体是靶向肿瘤的癌症治疗的良好候选物。
本实施例中，我们证明，癌症中卷曲蛋白(fz)基因和/或LRP(LDL相关蛋白)基因的遗传改变导致所有Fz受体和/或LRP辅助受体的突变和/或截短形式(胞外、跨膜和/或胞内结构域)。我们检测的癌症类型包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、间皮瘤和肉瘤。上述遗传改变包括染色体缺失(纯合或杂合)、染色体易位、染色体断裂、染色体颠倒、内部小缺失、插入和点突变。Fz受体和/或LRP辅助受体的这些突变和/或截短形式导致组成性信号转导，不管是否存在Wnt配体，这进而在癌症中产生组成性下游转录活性。相反，正常细胞/组织中没有Fz受体和/或LRP辅助受体的突变形式。
本发明证明，Wnt信号传导途径中Fz受体和/或LRP辅助受体的突变和/或截短形式是癌症特异性的。它们很可能用作开发治疗性药物(如小分子、化合物、抗体、反义寡核苷酸或上述RNAi)的靶点。这些药物能够仅靶向癌症，而不靶向正常细胞。因此，本发明为上述许多癌症的治疗方案提供了很大帮助，这些癌症包括结肠癌、乳腺癌、肺癌如NSCLC、间皮瘤和肉瘤等。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅仅为了说明，本领域技术人员能够根据它们作出各种修改和改变，这些修改和改变应该包括在本申请的构思和范围以及所附权利要求的范围内。将本文引用的所有发表物、专利和专利申请全文纳入本文作参考用于所有目的。
                                         序列表
SEQ ID NO：1人Wnt2(包含信号肽)肽序列#1
MNAPLGGIWLWLPLLLTWLTPEVNSSWWYMRATGGSSRVMCDNVPGLVSSQRQLCHRHPD
VMRAISQGVAEWTAECQHQFRQHRWNCNTLDRDHSLFGRVLLRSSRESAFVYAISSAGVV
FAITRACSQGEVKSCSCDPKKMGSAKDSKGIFDWGGCSDNIDYGIKFARAFVDAKERKGK
DARALMNLHNNRAGRKAVKRFLKQECKCHGVSGSCTLRTCWLAMADFRKTGDYLWRKYNG
AIQVVMNQDGTGFTVANERFKKPTKNDLVYFENSPDYCIRDREAGSLGTAGRVCNLTSRG
MDSCEVMCCGRGYDTSHVTRMTKCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKAPKNADWTTAT
SEQ ID NO：2人Wnt2抗原性肽序列#2
49 SSQRQLCHRHPDVMR 63
SEQ ID NO：3人Wnt2抗原性肽序列#3
4 PLGGIWLWLPLLLTWLTPE 22
SEQ ID NO：4人Wnt2抗原性肽序列#4
37 SRVMCDNVPGLV 48
SEQ ID NO：5人Wnt2抗原性肽序列#5
74 AECQHQFRQH 83
SEQ ID NO：6人Wnt2抗原性肽序列#6
92 RDHSLFGRVLLR 103
SEQ ID NO：7人Wnt2抗原性肽序列#7
107 ESAFVYAISSAGVVFAITRACSQGEVKSCSCD 138
SEQ ID NO：8人Wnt2抗原性肽序列#8
137 CDPKKMGSAKDSKG 150
SEQ ID NO：9人Wnt2抗原性肽序列#9
163 YGIKFARAFVD 173
SWQ ID NO：10人Wnt2抗原性肽序列#10
171 VDAKERKGKDAR 183
SEQ ID NO：11人Wnt2抗原性肽序列#11
202 LKQECKCHGVSGSCTLRTCWLAM 224
SEQ ID NO：12人Wnt2抗原性肽序列#12
240 GAIQVVM 246
SEQ ID NO：13人Wnt2抗原性肽序列#13
265 KNDLVYFENSPDYCIR280
SEQ ID NO：14人Wnt2抗原性肽序列#14
289 TAGRVCNLTSRGMDSCEVMCCG 310
SEQ ID NO：15人Wnt2抗原性肽序列#15
344 DVHTCKAPKNADWTTAT 360
SEQ ID NO：16和P17人Wnt2 cDNA引物对#1
5′-agtctgacctgatgcagacg-3′
5′-ccagtgttcttgcagatcca-3′
SEQ ID NO：18和19人Wnt2 cDNA引物对#2
5′-atgaacgcccctctcggtgga-3′
5′-tcatgtagcggttgtccagt-3′
SEQ ID NO：20和21人Wnt2 cDMA引物对#3
5′-gtggatgcaaaggaaaggaa-3′
5′-agccagcatgtcctgagagt-3′
SEQ ID NO：22和23人Wnt2 cDNA引物对#4
5′-cgggaatctgcctttgttta-3′
5′-ttcctttcctttgcatccac-3′
SEQ ID NO：24和25人Wnt2 cDNA引物对#5
5′-ctccctctgctcttgacctg-3′
5′-cacatctggatgtcggtgac-3′
SEQ ID NO：26和27人Wnt2 cDNA引物对#6
5′-cgaagtagtcgggaatctgc-3′
5′-ttcctttcctttgcatccac-3′
SEQ ID NO：28和29人Wnt2 cDNA引物对#7
5′-cagggtgatgtgcgataatg-3′
5′gcagattcccgactacttcg-3′
SEQ ID NO：30人Wnt2抗原性肽序列#16
38 RVMCDNVPGLVSSQRQLCHRHP 59
SEQ ID NO：31人Wnt2抗原性肽序列#17
75 ECQHQFR 81
SEQ ID NO：32人Wnt2抗原性肽序列#18
93 DHSLFGRVLLRS 104
SEQ ID NO：33人Wnt2抗原性肽序列#19
108 SAFVYAISSAGVVFAITRACSQGEVKSCSCDP 139
SEQ ID NO：34人Wnt2抗原性肽序列#20
164 GIKFARAFVDA 174
SEQ ID NO：35人Wnt2抗原性肽序列#21
203 KQECKCHGVSGSCTLRTCWLAMA 225
SEQ ID NO：36人Wnt2抗原性肽序列#22
241 IQVVMN 247
SEQ ID NO：37人Wnt2抗原性肽序列#23
266 NDLVYFE 272
SEQ ID NO：38人Wnt2抗原性肽序列#24
275 PDYCIRD 281
SEQ ID NO：39人Wnt2抗原性肽序列#25
290 AGRVCNLT 297
SEQ ID NO：40人Wnt2抗原性肽序列#26
303 SCEVMCCGR 311
SEQ ID NO：41人Wnt2抗原性肽序列#27
323 KCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKAP 351
SEQ ID NO：41人Wnt2抗原性肽序列#27
37 SRVMCDNVPGLVSSQRQLCHRHP 58
SEQ ID NO：43人Wnt2抗原性肽序列#29
74 AECQHQF 80
SEQ ID NO：44人Wnt2抗原性肽序列#30
92 RDHSLFGRVLLR 103
SEQ ID NO：45人Wnt2抗原性肽序列#31
107 ESAFVYAISSAGVVFAITRACSQGEVKSCSCD 138
SEQ ID NO：46人Wnt2抗原性肽序列#32
163 YGIKFARAFVD 173
SEQ ID NO：47人Wnt2抗原性肽序列#33
202 LKQECKCHGVSGSCTLRTCWLAM 224
SEQ ID NO：48人Wnt2抗原性肽序列#34
240 GAIQVVM 246
SEQ ID NO：49人Wnt2抗原性肽序列#35
265 KNDLVYF 271
SEQ ID NO：50人Wnt2抗原性肽序列#36
274  SPDYCIR 280
SEQ ID NO：51人Wnt2抗原性肽序列#37
289 TAGRVCNL 296
SEQ ID NO：52人Wnt2抗原性肽序列#38
302 DSCEVMCCG 310
SEQ ID NO：53人Wnt2抗原性肽序列#39
322 TKCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKA 350
SEQ ID NO：54抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR和FR区(轻链κ)氨基酸序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLES
RRSPARFSGQWCLVYRLHPQTSMPVGGGGCLQPDYxCSTLGSLHVTEGGPSKN
SEQ ID NO：55抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ-1)和
17F7.G7(亚克隆B；轻链κ)的FR1(轻链κ)氨基酸序列B；轻链κ)的FR1(轻链κ)氨基酸序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS
SEQ ID NO：56抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ-1)
和17F7.G7(亚克隆B；轻链κ)的CDR1(轻链κ)氨基酸序列B；轻链κ)的CDR1(轻链κ)氨基酸序列
KSVSTSGYSY
SEQ ID NO：57抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ-1)
和17F7.G7(亚克隆B；轻链κ)的FR2(轻链κ)氨基酸序列
MHWNQQKPGQPPRLLIY
SEQ ID NO：58抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ-1)、
17F7.G7(亚克隆B；轻链κ)、17F7.E5、8B11.H6(轻链κ-2)和17F7.G7(亚克隆B；
轻链κ，链2)的CDR2(轻链κ)氨基酸序列
LVS
SEQ ID NO：59抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的FR3(轻链κ)氨基酸序列
NLESRRSPARFSGQWCLVYRLHPQTSMPVGGGGCLQ
SEQ ID NO：60抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR3(轻链κ)氨基酸序列
PDYxCSTLGSL
SEQ ID NO：61抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR和FR区(重链IgG1)氨基酸序列
GPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVLSWVKQRTGQGLEWIGEIYPGYGSTYYNEKFK
GKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARWGDCFCLSGAKGxLVxCLC
SEQ ID NO：62抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的FR1(重链IgG1)氨基酸序列
GPELVKPGASVKMSCKAS
SEQ ID NO：63抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的CSR1(重链IgG1)氨基酸序列
GYTFTDYV
SEQ ID NO：64抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的FR2(重链IgG1)氨基酸序列
LSWVKQRTGQGLEWIGE
SEQ ID NO：65抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的CDR2(重链IgG1)氨基酸序列
IYPGYGST
SEQ ID NO：66抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的FR3(重链IgG1)氨基酸序列
YYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFC
SEQ ID NO：67抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR3(重链IgG1)氨基酸序列
ARWGDCFCLSG
SEQ ID NO：68抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR和FR区(轻链κ)核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACC
ATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAAC
CAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCT
AGGAGGTCACCTGCCAGGTTCAGTGGTCAGTGGTGTCTGGTGTACAGACTTCACCCTCAG
ACATCCATGCCTGTCGGAGGAGGAGGATGCCTGCAACCTGATTATXTGTGCAGCACATTA
GGGAGCTTACACGTTACGGAGGGGGGACCAAGC
SEQ ID NO：69抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ，链1)
和17F7.G7(亚克隆B；轻链κ，链1)的FR1(轻链κ)核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACC
ATCTCATACAGGGCCAGC
SEQ ID NO：70抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ，链1)
和17F7.G7(亚克隆B；轻链κ，链1)的CDR1(轻链κ)核苷酸序列
AAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTAT
SEQ ID NO：71抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ，链1)
和17F7.G7(亚克隆B；轻链κ，链1)的FR2(轻链κ)核苷酸序列
ATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTAT
SEQ ID NO：72抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、8B11.D2、8B11.H6(轻链κ，链1)
和17F7.G7(亚克隆B；轻链κ，链1)的CDR2(轻链κ)核苷酸序列
CTTGTATCC
SEQ ID NO：73抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的FR3(轻链κ)核苷酸序列
AACCTAGAATCTAGGAGGTCACCTGCCAGGTTCAGTGGTCAGTGGTGTCTGGTGTACAGA
CTTCACCCTCAGACATCCATGCCTGTCGGAGGAGGAGGATGCCTGCAA
SEQ ID NO：74抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR3(轻链κ)核苷酸序列
CCTGATTATXTGTGCAGCACATTAGGGAGCTTA
SEQ ID NO：75抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR和FR区(重链IgG1)核苷酸序列
AGTCXGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCT
GGATACACATTCACTGACTATGTTTTAAGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTT
GAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTGGATATGGTAGTACTTACTACAATGAGAAGTTCAAG
GGCAAGGCCACACTGACTGCTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGC
CTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATGGGGGGATTGCTTTTGCT
SEQ ID NO：76抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的FR1(重链IgG1)核苷酸序列
AGTCXGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCT
SEQ ID NO：77抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的CDR1(重链IgG1)核苷酸序列
GGATACACATTCACTGACTATGTT
SEQ ID NO：78抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的FR2(重链IgG1)核苷酸序列
TTAAGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAG
SEQ ID NO：79抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的CDR2(重链IgG1)核苷酸序列
ATTTATCCTGGATATGGTAGTACT
SEQ ID NO：80抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)、17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)
的FR3(重链IgG1)核苷酸序列
TACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCTGACAAATCCTCCAACACA
GCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGT
SEQ ID NO：81抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆A)的CDR3(重链IgG1)核苷酸序列
GCAAGATGGGGGGATTGCTTTTGCT
SEQ ID NO：82抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和17F7.G7(亚克隆B；链1)的CDR和FR区(轻链κ)氨基酸序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLES
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK
SEQ ID NO：83抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和17F7.G7(亚克隆B；链1)的FR3(轻链κ)氨基酸序列
NLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
SEQ ID NO：84抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2、8B11.H6(轻链κ-1)和17F7.G7(亚克隆B；链1)
的CDR3(轻链κ)氨基酸序列
QHIRELTR
SEQ ID NO：85抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2的CDR和FR区(重链IgG1)氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYVMHWVKQKPGQGLEWIGYIDPYNDGTKY
NEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRGNGNYESYYAMDYWGQGTSVTV
SSAKTTPPSVY
SEQ ID NO：86抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2的FR1(重链IgG1)氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS
SEQ ID NO：87抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的CDR1(重链IgG1)氨基酸序列
GYTFTTYV
SEQ ID NO：88抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的FR2(重链IgG1)氨基酸序列
MHWVKQKPGQGLEWIGY
SEQ ID NO：89抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的CDR2(重链IgG1)氨基酸序列
IDPYNDGT
SEQ ID NO：90抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8 B11.H6的FR3(重链IgG1)氨基酸序列
KYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYC
SEQ ID NO：91抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的CDR3(重链IgG1)氨基酸序列
TRGNGNYESYYAMDY
SEQ ID NO：92抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2、8B11.H6(轻链κ，链1)和17F7.G7(亚克隆B；
轻链κ，链1)的CDR和FR区(轻链κ)核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACC
ATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAAC
CAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCT
GGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCAT
CCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGT
TCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA
SEQ ID NO：93抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2、8B11.H6(轻链κ，链1)和17F7.G7
(亚克隆B；轻链κ，链1)的FR3(轻链κ)核苷酸序列
AACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACC
CTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGT
SEQ ID NO：94抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2、8B11.H6(轻链κ，链1)和17F7.G7
(亚克隆B；轻链κ，链1)的CDR3(轻链κ)核苷酸序列
CAGCACATTAGGGAGCTTACACGT
SEQ ID NO：95抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2的CDR和FR区(重链IgG1)核苷酸序列
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGATG
TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTACCTATGTTATGCACTGGGTGAAACAGAAG
CCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATACATTGATCCTTACAATGATGGTACTAAGTAC
AATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
ATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGGAAT
GGTAACTACGAGAGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTC
TCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATA
SEQ ID NO：96抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2的FR1(重链IgG1)核苷酸序列
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGATG
TCCTGCAAGGCTTCT
SEQ ID NO：97抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8 B11.H6的CDR1(重链IgG1)核苷酸序列
GGATACACATTCACTACCTATGTT
SEQ ID NO：98抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的FR2(重链IgG1)核苷酸序列
ATGCACTGGGTGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAC
SEQ ID NO：99抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的CDR2(重链IgG1)核苷酸序列
ATTGATCCTTACAATGATGGTACT
SEQ ID NO：100抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的FR3(重链IgG1)核苷酸序列
AAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACA
GCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT
SEQ ID NO：101抗Wnt2单克隆抗体8B11.D2和8B11.H6的CDR3(重链IgG1)核苷酸序列
ACAAGAGGGAATGGTAACTACGAGAGTTACTATGCTATGGACTAC
SEQ ID NO：102抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的CDR和FR区(轻链κ)氨基酸序列
DIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLD
SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTLRWRHQAESI
SEQ ID NO：103抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B；链2)的FR1(轻链κ)氨基酸序列
DIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSS
SEQ ID NO：104抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B；链2)的CDR1(轻链κ)氨基酸序列
QSLLDS DGKTY
SEQ ID NO：105抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5、17F7.G7(亚克隆B；链2)和8B11.H6(轻链κ-2)
的FR2(轻链κ)氨基酸序列
LNWLLQRPGQSPKRLIY
SEQ ID NO：106抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5、17F7.G7(亚克隆B；链2)
和8B11.H6(轻链κ-2)的FR3(轻链κ)氨基酸序列
KLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC
SEQ ID NO：107抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的CDR3(轻链κ)氨基酸序列
WQGTHFPWTLR
SEQ ID NO：108抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的CDR和FR区(重链IgG1)氨基酸序列
QVQLQQSGAELGTWGFSEDVLQASGYTFTDYVLSWVKQRTGQGLEWIGEIYPGYGSTYYN
EKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARWGDSFAYWGQGTLVTVSAAKTTP
PSVY
SEQ ID NO：109抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的FR1(重链IgG1)氨基酸序列
QVQLQQSGAELGTWGFSEDVLQAS
SEQ ID NO：110抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)的CDR3(重链IgG1)氨基酸序列
ARWGDS FAY
SEQ ID NO：111抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的CDR和FR区(轻链κ)核苷酸序列
GACATTGTGATGACACAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCC
ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGG
CTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC
TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATC
AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCG
TGGACGTTGCGGTGGAGGCACCAAGCTGAATCAATCG
SEQ ID NO：112抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B，链2)的FR1(轻链κ)核苷酸序列
GACATTGTGATGACACAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCC
ATCTCTTGCAAGTCAAGT
SEQ ID NO：113抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B，链2)的CDR1(轻链κ)核苷酸序列
CAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATAT
SEQ ID NO：114抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的FR2(轻链κ)核苷酸序列
TTGAATTGGCTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTAT
SEQ ID NO：115抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5、8B11.H6(链2)和17F7.G7(亚克隆B；链2)
的CDR2(轻链κ)核苷酸序列
CTGGTGTCT
SEQ ID NO：116抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B；链2)的FR3(轻链κ)核苷酸序列
AAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACA
CTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGC
SEQ ID NO：117抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的CDR3(轻链κ)核苷酸序列
TGGCAAGGTACACATTTTCCGTGGACGTTGCGG
SEQ ID NO：118抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的CDR和FR区(重链IgG1)核苷酸序列
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGGAACCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTC
CTGCAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTTTAAGCTGGGTGAAGCAGAGAACT
GGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTGGATATGGTAGTACTTACTACAAT
GAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATG
CAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATGGGGGGAT
TCTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCC
CCATCTGTCTATAXAA
SEQ ID NO：119抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5的FR1(重链IgG1)核苷酸序列
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGGAACCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTC
CTGCAGGCTTCT
SEQ ID NO：120抗Wnt2单克隆抗体17F7.E5和17F7.G7(亚克隆B)的CDR3(重链IgG1)核苷酸序列
GCAAGATGGGGGGATTCTTTTGCTTAC
SEQ ID NO：121抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR和FR区(轻链κ-1)氨基酸序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLES
GVPYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK
SEQ ID NO：122抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的FR3(轻链κ-1)氨基酸序列
NLESGVPYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
SEQ ID NO：123抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR和FR区(轻链κ-2)氨基酸序列
DIVMTQTPLTLSVTIGQPASFSCKSSQRLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLD
SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPWTLRWRHQAEINR
SEQ ID NO：124抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的FR1(轻链κ-2)氨基酸序列
DIVMTQTPLTLSVTIGQPASFSCKSS
SEQ ID NO：125抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR1(轻链κ-2)氨基酸序列
QRLLYSNGKTY
SEQ ID NO：126抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR3(轻链κ-2)氨基酸序列
VQGTHFPWTLR
SEQ ID NO：127抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR和FR区(重链IgG1)氨基酸序列
EVQLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYVMHWVKQKPGQGLEWIGYIDPYNDGTKY
NEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRGNGNYESYYAMDYWGQGTSVTV
SSA
SEQ ID NO：128抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的FR1(重链IgG1)氨基酸序列
EVQLQESGPELVKPGASVKMSCKAS
SEQ ID NO：129抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR和FR区(轻链κ，链2)核苷酸序列
GACATTGTGATGACACAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCT
TTCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGACTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTATTTGAATTGG
TTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC
TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATC
AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCT
TGGACGTTGCGGTGGAGGCAAGCTGAAATCAATCG
SEQ ID NO：130抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的FR1(轻链κ，链2)核苷酸序列
GACATTGTGATGACACAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCT
TTCTCTTGCAAGTCAAGT
SEQ ID NO：131抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR1(轻链κ，链2)核苷酸序列
CAGAGACTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTAT
SEQ ID NO：132抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的FR2(轻链κ，链2)核苷酸序列
TTGAPAATTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTAT
SEQ ID NO：133抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的FR3(轻链κ，链2)核苷酸序列
AAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACA
CTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGC
SEQ ID NO：134抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR3(轻链κ，链2)核苷酸序列
GTGCAAGGTACACATTTTCCTTGGACGTTGCGG
SEQ ID NO：135抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的CDR和FR区(重链IgG1)核苷酸序列
GAGGTTCAGCTGGAGGAGTCAGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGATG
TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTACCTATGTTATGCACTGGGTGAAACAGAAG
CCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATACATTGATCCTTACAATGATGGTACTAAGTAC
AATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
ATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGGAAT
GGTAACTACGAGAGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTC
TCCTCAGCC
SEQ ID NO：136抗Wnt2单克隆抗体8B11.H6的FR1(重链IgG1)核苷酸序列
GAGGTTCAGCTGGAGGAGTCAGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGATG
TCCTGCAAGGCTTCT
SEQ ID NO：137抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的CDR和FR区(轻链κ，链2)氨基酸序列
DIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLD
SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLKST
SEQ ID NO：138抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的CDR3(轻链κ，链2)氨基酸序列
WQGTHFPWT
SEQ ID NO：139抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的CDR和FR区(重链IgG1)氨基酸序列
QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYTFTDYVLSWVKQRTGQGLEWIGEIYPGYGSTYY
NEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARWGDSFAYWGQGTLVTVSAAKTT
PPSVY
SEQ ID NO：140抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的FR1(重链IgG1)氨基酸序列
QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKAS
SEQ ID NO：141抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的CDR和FR区(轻链κ，链2)核苷酸序列
GACATTGTGATGACACAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCC
ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGG
TTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC
TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATC
AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCG
TGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGAAATCAACG
SEQ ID NO：142抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的FR2(轻链κ，链2)核苷酸序列
TTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTAT
SEQ ID NO：143抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的CDR3(轻链κ，链2)核苷酸序列
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGAAATCAACG
SEQ ID NO：144抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的CDR和FR区(重链IgG1)核苷酸序列
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTG
TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTTTAAGCTGGGTGAAGCAGAGA
ACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTGGATATGGTAGTACTTACTAC
AATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCTGACAAATCCTCCAACACAGCCTAC
ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATGGGGG
GATTCTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACA
CCCCCATCTGTCTATA
SEQ ID NO：145抗Wnt2单克隆抗体17F7.G7(亚克隆B)的FR1(重链IgG1)核苷酸序列
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTG
TCCTGCAAGGCTTCT
SEQ ID NO：146抗Wnt2单克隆抗体MG7的变异κ轻链的N末端氨基酸序列
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASI
SEQ ID NO：147抗Wnt2单克隆抗体MG7的变异κ轻链的核酸序列(编码SEQ ID NO：146的氨基酸序列)
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCC
ATC
SEQ ID NO：148抗Wnt2单克隆抗体MG7的变异κ轻链的核酸序列
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCC
ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGG
TTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC
TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATC
AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCG
TGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
SEQ ID NO：149抗Wnt2单克隆抗体MG7的变异重链的核酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATG
TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTTTAAGCTGGGTGAAGCAGAGA
ACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTGGATATGGTAGTACTTACTAC
AATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCTGACAAATCCTCCAACACAGCCTAC
ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATGGGGG
GATTCTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO：150人Wnt2的沉默性si RNA
GAAGATGGGAAGCGCCAAG
SEQ ID NO：151非沉默性对照si RNA
AATTCTCCGAACGTGTCACGT
SEQ ID NO：152智人(Homo sapiens)Wnt2(GeneBank登录号：NM_003391)
1     agcagagcgg acgggcgcgc gggaggcgcg cagagctttc gggctgcagg cgctcgctgc
61    cgctggggaa ttgggctgtg ggcgaggcgg tccgggctgg cctttatcgc tcgctgggcc
121   catcgtttga aactttatca gcgagtcgcc actcgtcgca ggaccgagcg gggggcgggg
181   gcgcggcgag gcggcggccg tgacgaggcg ctcccggagc tgagcgcttc tgctctgggc
241   acgcatggcg cccgcacacg gagtctgacc tgatgcagac gcaagggggt taatatgaac
301   gcccctctcg gtggaatctg gctctggctc cctctgctct tgacctggct cacccccgag
361   gtcaactctt catggtggta catgagagct acaggtggct cctccagggt gatgtgcgat
421   aatgtgccag gcctggtgag cagccagcgg cagctgtgtc accgacatcc agatgtgatg
481   cgtgccatta gccagggcgt ggccgagtgg acagcagaat gccagcacca gttccgccag
541   caccgctgga attgcaacac cctggacagg gatcacagcc tttttggcag ggtcctactc
601   cgaagtagtc gggaatctgc ctttgtttat gccatctcct cagctggagt tgtatttgcc
661   atcaccaggg cctgtagcca aggagaagta aaatcctgtt cctgtgatcc aaagaagatg
721   ggaagcgcca aggacagcaa aggcattttt gattggggtg gctgcagtga taacattgac
781   tatgggatca aatttgcccg cgcatttgtg gatgcaaagg aaaggaaagg aaaggatgcc
841   agagccctga tgaatcttca caacaacaga gctggcagga aggctgtaaa gcggttcttg
901   aaacaagagt gcaagtgcca cggggtgagc ggctcatgta ctctcaggac atgctggctg
961   gccatggccg acttcaggaa aacgggcgat tatctctgga ggaagtacaa tggggccatc
1021  caggtggtca tgaaccagga tggcacaggt ttcactgtgg ctaacgagag gtttaagaag
1081  ccaacgaaaa atgacctcgt gtattttgag aattctccag actactgtat cagggaccga
1141  gaggcaggct ccctgggtac agcaggccgt gtgtgcaacc tgacttcccg gggcatggac
1201  agctgtgaag tcatgtgctg tgggagaggc tacgacacct cccatgtcac ccggatgacc
1261  aagtgtgggt gtaagttcca ctggtgctgc gccgtgcgct gtcaggactg cctggaagct
1321  ctggatgtgc acacatgcaa ggcccccaag aacgctgact ggacaaccgc tacatgaccc
1381  cagcaggcgt caccatccac cttcccttct acaaggactc cattggatct gcaagaacac
1441  tggacctttg ggttctttct ggggggatat ttcctaaggc atgtggcctt tatctcaacg
1501  gaagccccct cttcctccct gggggcccca ggatgggggg ccacacgctg cacctaaagc
1561  ctaccctatt ctatccatct cctggtgttc tgcagtcatc tcccctcctg gcgagttctc
1621  tttggaaata gcatgacagg ctgttcagcc gggagggtgg tgggcccaga ccactgtctc
1681  cacccacctt gacgtttctt ctttctagag cagttggcca agcagaaaaa aaagtgtctc
1741  aaaggagctt tctcaatgtc ttcccacaaa tggtcccaat taagaaattc catacttctc
1801  tcagatggaa cagtaaagaa agcagaatca actgcccctg acttaacttt aacttttgaa
1861  aagaccaaga cttttgtctg tacaagtggt tttacagcta ccacccttag ggtaattggt
1921  aattacctgg agaagaatgg ctttcaatac ccttttaagt ttaaaatgtg tatttttcaa
1981  ggcatttatt gccatattaa aatctgatgt aacaaggtgg ggacgtgtgt cctttggtac
2041  tatggtgtgt tgtatctttg taagagcaaa agcctcagaa agggattgct ttgcattact
2101  gtccccttga tataaaaaat ctttagggaa tgagagttcc ttctcactta gaatctgaag
2161  ggaattaaaa agaagatgaa tggtctggca atattctgta actattgggt gaatatggtg
2221  gaaaataatt tagtggatgg aatatcagaa gtatatctgt acagatcaag aaaaaaagga
2281  agaataaaat tcctatatca t

Claims (34)

1.一种抑制过表达Wnt2的细胞增殖的方法，所述方法包括将所述细胞与抑制Wnt2信号转导的物质相接触，其用量能有效抑制所述细胞增殖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物质是siRNA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物质是抗-Wnt2抗体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体是单克隆抗体。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体包含：
(i)SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；
(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；
(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；
(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和
(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体特异性结合包含SSQRQLCHRPDVMR(SEQ ID NO：2)的多肽。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合Wnt2，所述第二种抗-Wnt2抗体特异性结合于包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合Wnt2，所述第二种抗-Wnt2抗体特异性结合于包含SSQRQLCHRPDVMR(SEQ ID NO：2)的多肽。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在体外实施所述方法。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在体内实施所述方法。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是癌细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述癌细胞选自乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、间皮瘤、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、肠癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤的癌细胞。
14.一种诱导过表达Wnt2的细胞凋亡的方法，所述方法包括将所述细胞与抑制Wnt2信号转导的物质相接触，其用量能有效诱导细胞凋亡。
15.一种抑制细胞中的Wnt2信号转导的方法，所述方法包括将过表达Wnt2的细胞与抗-Wnt2抗体相接触，抗体用量能有效抑制Wnt2信号转导。
16.一种治疗Wnt2信号转导相关性疾病的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的对象抑制Wnt2信号转导的物质，其用量能有效治疗所述疾病。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述物质是抗-Wnt2抗体。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌症。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、间皮瘤、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤、脑癌、阴道癌、睾丸癌、肉瘤、肠癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤癌细胞。
20.一种治疗过表达Wnt2的癌症的方法，所述方法包括给予对象抗-Wnt2抗体，其用量能有效治疗所述癌症。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗Wnt2抗体是单克隆抗体。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体包含：
(i)SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；
(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；
(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；
(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和
(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体特异性结合包含SSQRQLCHRPDVMR(SEQ ID NO：2)的多肽。
25.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合Wnt2，所述第二种抗-Wnt2抗体特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合Wnt2，所述第二种抗-Wnt2抗体特异性结合包含SSQRQLCHRHPDVMR(SEQ ID NO：2)的多肽。
27.一种包含抗-Wnt2抗体和药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂的药物组合物。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体是多克隆抗体。
29.如权利要求27所述的药物组合物，其特征在于，所述抗-Wnt2抗体是单克隆抗体。
30.一种单克隆抗-Wnt2抗体，所述抗体特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63的氨基酸序列的多肽。
31.如权利要求30所述的单克隆抗Wnt2抗体，所述抗体与第二种抗-Wnt2抗体竞争结合Wnt2，所述第二种抗-Wnt2抗体特异性结合包含对应于人Wnt2的氨基酸残基49-63的氨基酸序列的多肽。
32.如权利要求30所述的单克隆抗Wnt2抗体，所述抗体包含：
(i)SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：125所示VLCDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO：58所示VLCDR2氨基酸序列；
(iii)SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：138所示VLCDR3氨基酸序列；
(iv)SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87所示VHCDR1氨基酸序列；
(v)SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89所示VHCDR2氨基酸序列；和
(vi)SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：110所示VHCDR3氨基酸序列。
33.一种编码权利要求32所述的单克隆抗体的核酸。
34.如权利要求33所述的核酸，其包含：
(i)编码VLCDR1的核酸，选自SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：131所示核酸序列；
(ii)编码VLCDR2的核酸，选自SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：115所示核酸序列；
(iii)编码VLCDR3的核酸，选自SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：143所示核酸序列；
(iv)编码VHCDR1的核酸，选自SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：97所示核酸序列；
(v)编码VHCDR2的核酸，选自SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：99所示核酸序列；和
(vi)编码VHCDR3的核酸，选自SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：120所示核酸序列。
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