CN101932602B - 用于Artemin及相关配体的多肽和多核苷酸，及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于Aremin和相关配体，包括Persephin(PSPN)的多肽、多核苷酸和抗体。本发明也包括生产这些多肽、多核苷酸或抗体的表达载体和宿主细胞。本发明还包括特别用于癌症，并且尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌及其它癌症的诊断和治疗，包括公开的多肽、多核苷酸、抗体、表达载体、宿主细胞中的一种或多种或其组合物。尤其包括Artemin和/或相关配体的抑制物，以及这些抑制物的用途。

Description

用于 Artemin 及相关配体的多肽和多核苷酸，及其使用方法
发明领域
本发明涉及用于Artemin(ARTN)和Persephin(PSPN)的多肽、多核苷酸和抗体。本发明也涉及生产这些多肽、多核苷酸或抗体的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及使用所公开的多肽、多核苷酸、抗体、表达载体、宿主细胞中的一种或多种或其组合物来诊断和治疗尤其是癌症，并且特别是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌以及其它癌症的方法。本发明尤其涉及Artemin和/或相关配体的抑制物，以及这些抑制物的用途。
发明背景
不受控的无贴壁依赖性细胞生长是癌症的标志，而转移是癌症相关的死亡的原因。目前在寻找可以用于靶向参与细胞增殖和迁移/侵袭的特异途径的新药。这提供了对于癌症治疗的替代策略，该策略相比于传统方法如辐射、化疗和性激素疗法而言毒性较小而耐受性高。众所周知传统化疗剂对于健康细胞以及癌细胞都有毒性。此外，长时期暴露于化疗导致耐药细胞的选择。
示例性的靶向特异信号分子的抗癌剂包括 (拉帕替尼)和(曲妥珠单抗)。 是由GlaxoSmithKline针对诸如乳腺癌和肺癌的实体瘤的治疗而开发的用于表皮生长因子受体(EGFR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)的双重酪氨酸激酶抑制物。 是设计用于靶向并阻断HER2功能的人化单克隆抗体。有越来越多针对于EGFR和HER2受体的化合物进入了临床开发并且目前在临床试验。
神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)是转化生长因子β超家族的远缘成员以及GDNF家族配体(GFL)的起始成员。这一家族由四种成员组成，即GDNF、Neurturin(NRTN)、Artemin(ARTN)和Persephin(PSPN)，它们全都是有效的神经营养因子(参见例如Airaksinen，M.S.和Saarma，M.(2002)The GDNF family：signalling，biologicalfunctions and therapeutic value.Nat.Rev.Neurosci.3，383-394)。GDNF家族成员是包括信号肽的分泌蛋白。每种具有约140个氨基酸残基的成熟蛋白质序列，并且包括7个保守的且间隔相似的半胱氨酸残基。该家族成员显示出相互之间约40％的氨基酸同一性(Rosenblad等人，2000；Takahashi，2001)。
人们认为GDNF家族成员通过独特的多组分受体复合体传递信号，该复合体包括糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定的共受体(GFRα)作为配体结合组分以及RET受体酪氨酸激酶作为共同信号组分(Takahashi，2001)。RET具有典型的细胞内激酶结构域，该结构域在Ras/ERK-、PI3K/AKT-、p38/MAPK-和JNK-途径中与下游靶标相互作用来影响细胞生长、分化、存活和凋亡(Baudet等人，2000；Coulpier等人，2002)。然而，其细胞外结构域与其它受体酪氨酸激酶明显不同。RET包括四个对于RTK不常见的钙粘蛋白样结构域，和半胱氨酸富集结构域(Santoro等人，2004；Knowles等人，2006)。
与任何其它已知的受体酪氨酸激酶不同，RET不直接与其配体结合而需要细胞表面结合的GFRα作为共受体。共受体很重要地提供对于配体与受体复合体结合的信号特异性。GDNF优选结合GFRα1，NRTN结合GFRα2，ARTN结合GFRα3，PSPN结合GFRα4(Airaksinen等人，2002)。然而，这些结合特异性并不是排他的。例如，GDNF可以结合GFRα2和GFRα3，但亲和性较低，并且可以激活RET。尚不清楚这一信号是否具有生理重要性(Bespalov等人，2007)。
GDNF家族成员在发育以及在成年期间在CNS的许多区域表达。已知它们有力地促进多种类型的神经元的存活。最值得注意的是，它们能够支持多巴胺能神经元和运动神经元的存活。这些神经元群体分别在帕金森病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)病程中死亡。用GDNF敲除小鼠的研究表明它们的主要作用在于肠神经系统的发育以及肾脏器官形成的调控。
人们认为GDNF家族成员对于帕金森病(Gill等人，2003)、阿尔茨海默病(Garces等人，2001；Golden等人，2003)以及ALS(Henderson等人，1994)的治疗具有临床重要性。其它临床应用包括用作治疗酒精中毒(He等人，2005)、慢性疼痛(Gardell等人，2003)、中风(Tomac等人，2002)、癫痫(Horger等人，1998)以及药物成瘾(Airavaara等人，2004)的新型靶标。例如，GDNF和Neurturin显示出对于帕金森疾病的临床试验的前景，而Artemin目前正处于对于慢性疼痛治疗的临床试验中(Bespalov等人，2007)。近来，以证明了GDNF和Artemin影响具有胰腺炎和胰腺癌的患者的神经侵袭(Ito等人，2005；Ceyhan等人，2006a；Ceyhan等人，2006b)。
医学上长期需要新型疗法，包括新型抗癌剂。特别地，需要鉴定可以被靶向以抑制癌细胞的特异基因和蛋白质。
发明概述
本发明基于这样的发现，即除了其它作用以外，细胞配体Artemin还作用于促进癌细胞的无贴壁依赖性生长、集落形成、存活、迁移以及侵袭的活性。如此，Artemin以及相关配体提供对于癌症治疗的理想的治疗靶标。抑制Artemin和/或这些相关配体的生物活性的任何试剂将对于治疗癌症，例如癌症发作、进展、转移或复发具有潜能。
本发明涉及用于Artemin或相关配体的分离的多核苷酸。该分离的多核苷酸可以包括有义序列、互补体、反向互补体、反向序列、或其任何修饰序列。一方面，该多核苷酸包括针对于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35至171)或其修饰序列的反义多核苷酸。一方面，该多核苷酸与用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：35至171)或其修饰序列杂交。在特别的方面，反义多核苷酸选自SEQ ID NO：35至171的任何反义序列。又一方面，该多核苷酸包括针对于用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35至42)或其修饰序列的iRNA。再一方面，该iRNA使得用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35至42)或其修饰序列沉默。具体方面，该iRNA序列选自SEQ ID NO：46、47、50、51。这样的反义多核苷酸和iRNA，尤其是siRNA可以抑制用于Artemin或相关配体的多核苷酸(例如SEQ ID NO：35至42)或其修饰序列的表达。
本发明也涉及包括用于Artemin或相关配体的多核苷酸的表达载体。该表达载体可以包括有义序列、互补体、反向互补体、反向序列、或其任何修饰序列。一方面，该表达载体包括针对于用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35至171)或其修饰序列的反义多核苷酸。一方面，该多核苷酸与用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35至171)或其修饰序列杂交。特别的方面，反义多核苷酸选自SEQ ID NO：35至171的任何反义序列。另一方面，该表达载体包括针对于用于Artemin或相关配体的序列(例如SEQ ID NO：35至42)或其修饰序列的iRNA。又一方面，该iRNA使得Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQID NO：35至42)或其修饰序列沉默。具体方面，该iRNA序列选自SEQ IDNO：46、47、50、51。此表达载体可以用于抑制用于Artemin或相关配体的多核苷酸(例如SEQID NO：35至171)或其修饰序列的表达。
本发明也涉及包括至少一种表达载体的宿主细胞，例如微生物或哺乳动物宿主细胞。
本发明也涉及用于Artemin或相关配体的分离的多肽。该多肽可以包括用于Artemin或相关配体的蛋白质或肽序列，或其任何修饰序列。一方面，该多肽包括用于Artemin或相关配体的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1至34。特别的方面，该多肽包括用于Artemin或相关配体的特别的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1至3或其修饰序列。又一方面，该多肽包括用于Artemin或相关配体的氨基酸序列的抗原序列，例如SEQ ID NO：1至34。另一方面，该多肽是例如包括至少一种包括有用于Artemin或相关配体的成熟序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1至3)的片段。其它方面，该多肽包括用于Artemin或相关配体的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1至3)或其修饰序列，其包括具有在此详细描述的异源试剂的融合物或缀合物。
作为另一特征，本方面包括用于Artemin和/或相关配体的抗体。该抗体可以是，例如，多克隆或单克隆抗体，或如在此详细描述的任何修饰抗体。一方面，该抗体针对于用于Artemin或相关配体的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1至34)或其修饰序列。一方面，该抗体与用于Artemin或相关配体的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1至34)或其修饰序列相结合。特别的方面，该抗体与用于Artemin或相关配体的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1至34)的抗原方面相结合。又一方面，该抗体针对于用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：35至171)或其修饰序列。再一方面，该抗体与用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35至171)或其修饰序列相结合。具体方面，该抗体与Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35至42)相结合。
本发明涉及包括用于Artemin或相关配体的分离的多核苷酸、多肽或抗体的组合物。可选方面，该组合物可以包括根据本发明的 表达载体，或包括该表达载体的宿主细胞。该组合物可以包括在此所述任何一种生物活性修饰体。该组合物可以包括至少一种融合体或缀合物。该组合物可以配制为，例如药学组合物，如在此详细描述。
本发明也涉及作为用于根据所公开的方法来诊断或治疗，尤其是癌症，并且特别是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或其它癌症的试剂盒的一部分的本发明组合物。该试剂盒可以包括：a)如在此提出的用于Artemin或相关配体的至少一种组分(例如多肽、多核苷酸或抗体)；和b)可选的，说明书，例如，用于诊断或治疗癌症。
本发明还涉及检测和/或测量用于Artemin或相关配体的多肽水平的方法，包括：1)将来自受试者的样品与抗该多肽(例如SEQ IDNO：1至34的至少之一，或其修饰序列)或对应肽的抗体相接触；和2)测定由样品中的对应肽或多肽形成的抗体复合物的存在或水平。此方法也可以用于在受试者中诊断癌症，如在此详细描述。
本发明也涉及检测和/或测量用于Artemin或相关配体的多核苷酸水平的方法，包括：1)将来自受试者的样品与互补多核苷酸(例如与SEQ ID NO：35至171任一互补的序列，或其修饰序列)相接触；和2)测定由样品中的多核苷酸形成的杂交复合物的存在或水平。此方法也可以用于在受试者中诊断癌症，如在此详细描述。
此外，本发明涉及通过使用如在此所述的用于Artemin和/或相关配体的至少一种抑制物(例如多核苷酸或抗体)来抑制癌细胞，尤其是来自乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的癌细胞(例如抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性)的方法，该方法包括将该细胞与该抑制物接触。特别的方面，该抑制物选自化学化合物(例如小分子)拮抗剂、抗体、反义多核苷酸，和iRNA。
作为增加的特征，本发明包含在受试者中治疗癌症，尤其是乳 腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的方法，包括向受试者给予用于Artemin和/或相关配体的至少一种抑制物(例如多核苷酸或抗体)，或其组合物，例如药学组合物。特别的方面，该抑制物选自化学化合物(例如小分子)，拮抗剂、抗体、反义多核苷酸，和iRNA。
作为另一特征，本发明包含在受试者中诊断或监控癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的方法，方法包括将在此所述的至少一种抗体与来自受试者的样品相接触；和测定样品中用于Artemin和/或相关配体的多肽(例如SEQ ID NO：1至3)的水平。
作为又一特征，本发明包含在受试者中诊断或监控癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的方法，方法包括将在此所述的至少一种多核苷酸(例如探针或引物)与来自受试者的样品相接触；和测定样品中用于Artemin和/或相关配体的多核苷酸(例如RNA)(例如SEQ ID NO：35至42)的水平。
许多方面，本发明的方法利用体内或体外表达体系。其它方面，该方法使用通过重组、合成或半合成手段生产的多核苷酸或多肽，或通过内源手段(例如天然存在的组分)生产的多核苷酸或多肽。
广义上也可说本发明存在于本申请说明书中指出的或表示的部分、要素和特征，单独地或总体地，或者两种或更多种所述部分、要素或特征的任何或全部组合，而在此提及的具体整体具有本发明相关领域已知的等效物，此种已知等效物被认为包含于此如同单独提出。
下文描述本发明的其它方面和实施方式。
附图简要说明
应以其所有方面而理解的本发明的这些以及其它方面将从下面的说明中显见，该说明参考附图而仅以示例的方式给出：
图1A-C：人Artemin在人正常组织和癌细胞系中的mRNA表达模式。(A)Artemin和Persephin在乳腺癌MCF-7细胞中的表达。从MCF-7细胞分离总RNA。使用One-Step RT-PCR试剂盒(QIAGEN)通过用特异引物的RT-PCR来检测Artemin和Persephin的表达。箭头(→)表示扩增的特异条带。M，1kb plus DNA梯度(Invitrogen)。(B)通过使用特异引物的PCR在一组由不同的人组织制成的cDNA(Primgen)中扩增Artemin。在每一泳道上方标记了组织来源。β2-微球蛋白(β2M)基因用作cDNA输入对照。(C)使用One-step RT-PCR试剂盒(Qiagen)通过具有相同的Artemin特异引物对的RT-PCR检查Artemin在人癌细胞系中的表达。包括了β-肌动蛋白作为RNA输入对照。(D)按(B)的RT-PCR检验GFRα1-4和RET在三种乳腺癌细胞系中的表达。图左侧表示了PCR循环数量。
图2A-G：Artemin在乳腺癌MCF-7细胞中的强制表达的影响的特征。如所示，用表达Artemin的质粒(MCF7-ARTN)或者空载体质粒(MCF7-Vec)作为对照稳定转染细胞。(A)分离总RNA并使用One-step RT-PCR试剂盒(Qiagen)检测Artemin和β-肌动蛋白的mRNA水平。(B)对Artemin在MCF-7细胞中的强制表达和分泌的Western印迹分析。用可溶的全细胞提取物或浓缩的条件培养基在12.5％SDS-PAGE上跑胶，转移到硝酸纤维素膜，并使用山羊抗-Artemin多克隆抗体(R&D Systems)进行免疫印迹。β-肌动蛋白用作细胞裂解物的上样对照。(C，D)总细胞数检测。在具有(C)10％FBS(血清)或(D)低血清(0.2％)(无血清)的3ml的RPMI1640中，将MCF7-ARTN(ARTN)和MCF7-Vec(载体)细胞以每孔50,000个细胞的密度接种到6孔板中，一式三份。培养细胞达8天，其间每两天换培养基。每2天在胰蛋白酶化后测定细胞数。(E)BrdU掺入检测。在完全培养基(full media)的6孔板中，将MCF7-ARTN (ARTN)和MCF7-Vec(载体)细胞接种到玻璃盖玻片上，过夜孵育，随后在无血清培养基中进行血清饥饿18h。然后用BrdU脉冲标记细胞。使用试剂盒(Zymed)用抗BrdU鼠单克隆抗体的BrdU染色来检测增殖细胞。细胞核用苏木精复染色。将具有深棕色核染色的细胞计数为BrdU-标记的细胞。从每个盖玻片10个随机视野来计算BrdU-阳性细胞核相对于细胞核总数的百分数。(F，G)细胞凋亡检测。将MCF7-ARTN(ARTN)和MCF7-Vec(载体)细胞接种到含有10％血清的完全RPMI培养基的6孔板中。一天后，对细胞进行血清饥饿24h。然后固定细胞并用Hoechst33258染料(F)或用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙啶(PI)(G)染色以评估凋亡。在UV可见荧光显微镜下检查Hoechst 33258染色的细胞的核形态。将具有凋亡核特征(例如核浓缩和断裂)的细胞记作凋亡的。用百分数来表示早期(AV-阳性和PI-阴性；阴影框)和晚期(AV-和PI-阳性；空框)凋亡。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图3A-F：Artemin的强制性过表达显著促进无贴壁依赖性生长并增强细胞迁移和侵袭。(A)悬浮培养。将MCF7-ARTN(ARTN)和MCF7-Vec(载体)细胞放入预涂覆有多HEMA以防止细胞附着的6孔板的每孔中。在指示的时间，使用血细胞计数器来计数活细胞。(B)软琼脂检测。在6孔板中，将细胞接种到含有10％血清的完全RPMI 1640培养基中的0.35％琼脂中，三个重复。在孵育14天后计数形成的集落。(C)通过细胞在Matrigel中生长而形成的集落的代表性的显微照相图片。(D)MCF7-ARTN和MCF7-Vec细胞的鬼笔环肽染色。(E)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂覆的(侵袭)8μm孔径的Transwell小室的上室中，其放入含有10％FBS的完全培养基的下室中。孵育上样室24h或48h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那些细胞。(F)伤口愈合检测。细胞在生长培养基中在组织培养平皿上生长至汇合。通过用灭菌枪 头刮擦细胞单层而体外产生“划”伤。在所指示的时间照相。**，p＜0.01；***，p＜0.001。
图4A-D：Artemin的强制表达对于MCF-7移植裸鼠的体内生长的影响。将在Matrigel中的过表达Artemin的MCF7-ARTN细胞系或的MCF7-Vec对照细胞系的细胞(5×106)皮下移植免疫缺陷裸鼠的侧腹。一周两次测量肿瘤长度和宽度并且计算体积。(A)显示出相对手术天数的肿瘤体积。(B)用苏木精和曙红(H&E)对代表性肿瘤的组织学染色。(C，D)在实验最后，通过BrdU掺入来评估细胞增殖，并且通过TUNEL标记来测量细胞凋亡。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。
图5A-E：在T47D和BT549细胞中，Artemin的强制过表达显著增强无贴壁依赖性生长，细胞迁移和侵袭。用表达Artemin的质粒(T47D-ARTN和BT549-ARTN)或空载体质粒(T47D-Vec和BT549-Vec)作为对照稳定转染T47D和BT549细胞。通过RT-PCR和Western印迹来确认Artemin在这些细胞中的表达(A)。按图3所示，用稳定过表达Artemin的T47D-ARTN及其对照T47D-Vec，以及BT549-ARTN及其对照BT549-Vec细胞，进行软琼脂(B)，迁移和侵袭(C，D)检测。也示出了BT549-ARTN和BT549-Vec细胞的形态(E)。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。
图6A-F：在MCF-7细胞中由siRNA消除内源Artemin mRNA减少血清饥饿下的乳腺癌细胞增殖的存活，并且显著增加凋亡性细胞死亡。(A)将编码靶向Artemin转录本的siRNA的pSilencer-ARTN质粒(ARTN-siRNA)或阴性对照siRNA质粒pSilencer-CK(CK-siRNA)与pEGFP-C1载体(EGFP)或pEGFP-ARTN质粒(EGFP-ARTN)一起瞬时转染至MCF-7细胞中，其中Artemin cDNA插入EGFP编码序列的3’UTR。转染24h后，用UV可见荧光显微镜显现EGFP的表达。(B)RT-PCR和Western印迹。用pSilencer-ARTN质粒(MCF7-siRNA)或用阴性对照pSilencer-CK质粒(MCF7-CK)稳定转染MCF-7细胞。 分离总RNA，使用One-step RT-PCR试剂盒(Qiagen)通过RT-PCR检测Artemin和β-肌动蛋白的mRNA水平。对可溶的全细胞提取物跑12.5％SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜，并使用山羊抗-Artemin多克隆抗体(R&D Systems)进行免疫印迹。β-肌动蛋白用作细胞裂解物的上样对照。(C，D)总细胞数检测。在具有(C)10％FBS(血清)或(D)低血清(0.2％)(无血清)的3ml的RPMI 1640中，将MCF7-siRNA(siRNA)和MCF7-CK(CK)细胞以每孔50,000个细胞的密度接种到6孔板中，三个重复。细胞培养达8天，其间每两天换培养基。每2天在胰蛋白酶化后测定细胞数。(E，F)细胞凋亡检测。将细胞接种到含有10％血清的完全RPMI培养基的6孔板中。一天后，对细胞进行血清饥饿24h。然后固定细胞并用Hoechst33258染料(E)或用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙啶(PI)(F)染色以评估凋亡。在UV可见荧光显微镜下检查Hoechst 33258染色的细胞的核形态。将具有凋亡核特征(例如核浓缩和断裂)的细胞记作凋亡的。用百分数来表示早期(AV-阳性和PI-阴性；阴影框)和晚期(AV-和PI-阳性；空框)凋亡。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图7A-D：通过siRNA的内源Artemin消除显著减少无贴壁依赖性生长并减少细胞迁移和侵袭。(A)软琼脂检测。在6孔板中，将MCF7-siRNA(siRNA)和MCF7-CK(CK)细胞接种到含有10％血清的完全RPMI 1640培养基中的0.35％琼脂中，三个重复。在孵育14天后计数形成的集落。(B)由在Matrigel中生长的细胞形成的集落的代表性的显微照相图片。(C)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂覆的(侵袭)8μm孔径的Transwell小室的上室中。将这些放入含有10％FBS的完全培养基的下室中。孵育上样室24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那些细胞。(D)伤口愈合检测。细胞在生长培养基中在组织培养平皿上生长至汇 合。通过用灭菌枪头刮擦细胞单层而体外产生“划”伤。在所指示的时间照相。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图8A-C：重组人Artemin蛋白质在细菌中的生产。(A)将pQE30-ARTN质粒转化到细菌中并通过加入IPTG来诱导His-Artemin的表达。通过SDS-PAGE来分析诱导前后的全细胞裂解物并通过考马斯亮蓝染色来显现。(B)通过用山羊抗Artemin多克隆抗体(R&DSystems)的Western印迹来检测诱导前后的全细胞裂解物中的His-Artemin。(C)使用Ni-NTA(Qiagen)从裂解物中纯化His-Artemin蛋白并通过SDS-PAGE分析以及通过考马斯亮蓝染色来显现。箭头表示13.5kDa的His-Artemin条带。分子量标记也以kDa用横杠在图的左侧表示。
图9A-D：抗Artemin的兔多克隆抗体降低MCF-7细胞的存活力并抑制侵袭。(A)抗血清表征。使用兔多克隆抗体对表达Artemin的MCF7-ARTN和对照MCF7-Vec稳定细胞进行Western印迹分析。(B，C)使用在此下述的方法，用500μg/ml兔多克隆抗体(抗体)或兔对照IgG(对照IgG)通过比色MTT检测法来评估细胞存活力。以相对于没有抗体的处理(PBS)来表示存活力。(D)通过兔多克隆抗血清抑制MCF-7细胞的侵袭。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图10：抗Artemin的鸡多克隆抗体的表征。使用抗Artemin的鸡多克隆抗体对过表达Artemin的BT549-ARTN和对照BT549-Vec稳定细胞进行Western印迹分析。
图11A-C：抗Artemin的鸡多克隆抗体降低MCF-7细胞的存活力以及无贴壁依赖性生长并抑制MCF-7细胞的侵袭。(A)使用在此下述的方法，按所指示浓度用抗Artemin的鸡多克隆抗体(Anti-ARTN)或免疫前鸡对照IgY通过比色MTT检测法，来评估在含有低血清(0.2％)的培养基中生长了3天的细胞的细胞存活力。(B)在96孔板中，在按所指示浓度抗Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或免疫前对照IgY的存在下，对MCF-7细胞进行软琼脂集落形成检测。 然后使用在此下述的方法，通过比色MTT检测法来评估细胞存活力，并且以相对于没有任何处理的PBS对照的百分数来表示细胞存活力。(C)通过抗Artemin的鸡多克隆抗体抑制MCF-7细胞的侵袭。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。
图12：Artemin表达在它莫西芬(Tamoxifen)抗性的MCE-7细胞中的上调。MCF7细胞通常是它莫西芬敏感的(TAMS)。在连续暴露于浓度渐增的药物后，建立了它莫西芬抗性的(TAMR)MCE-7细胞。通过RT-PCR测定Artemin的表达，以β-肌动蛋白作为总RNA输入的对照。
图13A-C：Artemin的强制性过表达显著消除化学治疗药物诱导的死亡。在以所指示的浓度存在它莫西芬(A)、阿霉素(B)或紫杉醇(C)或它们不存在下，于含有10％血清的RPMI 1640培养基中，以每孔10,000细胞密度将MCF7-ARTN(ARTN)和MCF7-Vec(载体)细胞接种到96孔板，三个重复。使用在此下述方法，通过比色MTT检测法，相对于无药物治疗来评估细胞存活力。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。
图14A-C：Artemin的强制性过表达显著增加它莫西芬存在下的无贴壁依赖性生长。用MCF7-ARTN(ARTN)和MCF7-Vec(载体)细胞，在以指示浓度的它莫西芬存在下，将细胞接种到10％血清的完全RPMI 1640培养基中的0.35％％琼脂中而进行软琼脂检测，三个重复。在孵育14天后计数形成的集落并在(A)中表示。相对集落形成表示于(B)，将不存在它莫西芬时形成的集落数设定为100％。(C)在存在或不存在指示浓度的它莫西芬下，在Matrigel中形成的集落的3D-结构。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图15A-B：通过抗Artemin的鸡多克隆抗体结合抗雌激素对MCF-7细胞的无贴壁依赖性生长的协同抑制。在存在浓度为1μM抗雌激素的它莫西芬(TAM)(A)或浓度为100nM氟维司群(Faslodex)(ICI 182，780)(ICI)(B)下或者它们不存在下，将其单独或者 与浓度为400μg/ml的抗Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或浓度为400μg/ml的免疫前对照IgY一起，在96孔板中对MCF-7细胞进行软琼脂集落形成检测。使用在此下述方法，通过比色MTT检测法，评估细胞存活力，并以相对于对照IgY处理的百分数表示。
图16：具有增加或减少的Artemin表达的子宫内膜癌细胞的表征。为了强制Artemin的表达，用表达Artemin的质粒pIRESneo3-ARTN(细胞分别命名为RL95-2-ARTN和AN3-ARTN)或空pIRESneo3载体作为对照(细胞命名为RL95-2-CK和AN3-CK)稳定转染RL95-2和AN3。为了消除内源性Artemin表达，用pSilencer-ARTN质粒(细胞命名为RL95-2-siARTN和AN3-siARTN)或用阴性对照pSilencer-CK质粒(细胞命名为RL95-2-siCK和AN3-siCK)来稳定转染细胞。按所指示，通过RT-PCR在mRNA水平测定Artemin(ARTN)的表达而用Western印迹在蛋白质水平测定。β-肌动蛋白用作对照。
图17A-E：Artemin的强制表达增加人子宫内膜癌RL95-2细胞的细胞增殖并减少细胞凋亡。(A)总细胞数检测。在3ml的10％FBS的完全培养基中，将过表达Artemin的RL95-2-ARTN细胞以及RL95-2-CK对照细胞以每孔50,000个细胞的密度接种到6孔板中，三个重复。培养细胞达14天，其间每两天换培养基。每2天在胰蛋白酶化后测定细胞数。(B)BrdU掺入检测。在无血清培养基或在含10％血清(FBS)的完全培养基的6孔板中，将细胞接种到玻璃盖玻片上，过夜孵育，随后在无血清培养基中进行血清饥饿18h。然后用BrdU脉冲标记细胞。用抗BrdU小鼠单克隆抗体的BrdU染色来检测增殖细胞。(C)细胞凋亡检测。将细胞接种到含有10％血清的完全生长培养基的6孔板中。一天后，对细胞进行血清饥饿48h。然后固定细胞并用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙啶(PI)染色。表示早期(AV-阳性和PI-阴性；阴影条)和晚期(AV-和PI-阳性；实心条)凋亡。(D，E)实时PCR。通过实时PCR 来测定参与细胞周期控制和DNA损伤修复(D)，以及凋亡和细胞衰老(E)的若干关键标记的相对表达水平。以成倍表达表示RL95-2-ARTN细胞相对对照RL95-2-CK细胞中的相对表达水平。*，p＜0.05；**，p＜0.001。
图18A-E：Artemin的强制表达增强人子宫内膜癌RL95-2细胞的无贴壁依赖性增长(A)软琼脂检测。在6孔板中，将过表达Artemin的RL95-2-ARTN细胞以及RL95-2-CK对照细胞接种到含有10％血清的完全培养基中的0.35％琼脂，三个重复。在孵育14天后计数形成的集落。右侧示出了由细胞生长所形成的集落的代表性的显微照相图片。(B)悬浮培养。将细胞置入预涂覆有多-HEMA以防止细胞附着的6孔板的每孔中。在指示的时间，使用血细胞计数器来计数活细胞。(C，D)集落形态学。在生长因子减少的Matrigel中(C)或在涂有Matrigel的板上(D)生长细胞。在铺板后的指定时间获取相差显微镜照片。(E)转化灶形成检测。在含有10％血清的完全培养基中生长细胞并用70％乙醇中的0.2％结晶紫染色以及照相。*，p＜0.05；**，p＜0.001。
图19A-E.Artemin的强制表达增强人子宫内膜癌RL95-2细胞的迁移和侵袭。(A)在具有10％FBS的完全培养基中，将过表达Artemin的RL95-2-ARTN细胞以及RL95-2-CK对照细胞在经组织培养物处理过的塑料平皿中培养。监控细胞生长并在指示的时间照相。(B)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂覆的(侵袭)8μm孔径的Transwell小室的上室中。这些放入含有10％FBS的完全培养基的下室中。孵育上样室24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那些。(C，D)实时PCR。通过实时PCR来测定参与侵袭和转移(C)，以及细胞重塑(D)的若干关键标记的相对表达水平。表示RL95-2-ARTN细胞相对RL95-2-CK对照细胞中的表达水平。(E)细胞用四甲基异硫氰酸罗丹明B(TRITC)-缀 合的鬼笔环肽(绿)染色而核用DAPI(蓝)复染色。指示片状伪足(红色箭头)和丝状伪足(白色箭头)的形成。*，p＜0.05；**，p＜0.001。
图20A-E.通过siRNA的内源Artemin的消除减少人子宫内膜癌RL95-2细胞的细胞致癌潜能。(A)总细胞数检测。在3ml的10％FBS的完全生长培养基中，将Artemin消除的RL95-2-siARTN细胞以及对照RL95-2-siCK细胞以每孔50,000个细胞的密度接种到6孔板中，三个重复。培养细胞14天，其间每两天换培养基。每2天在胰蛋白酶化后测定细胞数。(B)BrdU掺入检测。在无血清培养基或在含10％血清(FBS)的完全培养基的6孔板中，将细胞接种到玻璃盖玻片上，并过夜孵育，随后在无血清培养基中进行血清饥饿18h。然后用BrdU脉冲标记细胞。用抗BrdU小鼠单克隆抗体的BrdU染色来检测增殖细胞。(C)细胞凋亡检测。将细胞接种到含有10％血清的完全生长培养基的6孔板中。一天后，对细胞进行血清饥饿48h。然后固定细胞并用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙啶(PI)染色以评估凋亡。表示早期(AV-阳性和PI-阴性；阴影条)和晚期(AV-和PI-阳性；实心条)凋亡。(D)软琼脂检测。在6孔板中，将细胞接种到含有10％血清的完全培养基的0.35％琼脂中，三个重复。在孵育14天后计数形成的集落。(E)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂覆的(侵袭)8μm孔径的Transwell小室的上室中。这些这放入含有10％FBS的完全培养基的下室中。孵育上样室24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那些。
图21A-D：Artemin表达与人子宫内膜癌AN3细胞中的无贴壁依赖性生长以及迁移和侵袭显著相关。(A，B)软琼脂检测。在6孔板中，将过表达Artemin的AN3-ARTN细胞以及AN3-siCK对照细胞(A)接种到含有10％血清的完全培养基的0.35％琼脂中，三个重复。 在孵育14天后计数形成的集落。右侧示出了由细胞生长所形成的集落的代表性的显微照相图片。(C，D)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂覆的(侵袭)8μm孔径的Transwell小室的上室中。这些这放入含有10％FBS的完全培养基的下室中。孵育上样室24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那些。*，p＜0.05；**，p＜0.001。
图22A-C：抗Artemin的鸡多克隆抗体降低子宫内膜癌细胞的存活力以及无贴壁依赖性生长并抑制子宫内膜癌细胞侵袭。(A)使用在此下述的方法，按所指示浓度用抗Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或免疫前鸡对照IgY通过比色MTT检测法来评估在含有低血清(0.2％)的培养基中生长了3天的RL95-2细胞的细胞存活力。(B)在96孔板中，在400μg/ml的抗Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或免疫前对照IgY存在下，对RL95-2和AN3细胞进行软琼脂集落形成检测。然后使用在此下述的方法，通过比色MTT检测法来评估细胞存活力，并且以相对于没有任何处理的对照(PBS)的百分数来表示细胞存活力。(C)由抗Artemin的鸡多克隆抗体抑制MCF-7细胞的侵袭。**，p＜0.01。
图23A-G。Artemin的多核苷酸和多肽序列信息。(A)人Artemin(ARTN)转录本变体1cDNA(GenBank登录号：NM_003976)的核苷酸序列。(B)人Artemin(ARTN)转录本变体2cDNA(GenBank登录号：NM_057091)的核苷酸序列。(C)人Artemin(ARTN)转录本变体3cDNA(GenBank登录号：NM_057160)的核苷酸序列。(D)人Artemin(ARTN)转录本变体3cDNA(GenBank登录号：NM_057090)的核苷酸序列。(E)由转录本1和2编码的人Artemin(ARTN)同工型1前体的氨基酸序列(Entrez蛋白质ID：NP_003967和NP_476432)，小写为信号导肽。(F)由转录本3编码的人Artemin(ARTN)同工型2前体的氨基酸序列(Entrez蛋白质ID： NP_476501)，小写为信号导肽。(G)由转录本4编码的人Artemin(ARTN)同工型3前体的氨基酸序列(Entrez蛋白质ID：NP_476431)，小写为信号导肽。
图24A-D：人Artemin mRNA转录本的核苷酸序列。该序列从克隆的cDNA(例如GenBank登录号：BC062375)以及基因组序列推导。(A)转录本变体1cDNA(GenBank登录号：NM_003976)。(B)转录本变体2cDNA(GenBank登录号：NM_057091)。(C)转录本变体3cDNA(GenBank登录号：NM_057160)。(D)转录本变体3cDNA(GenBank登录号：NM_057090)。起始密码AUG和终止密码UGA有下划线且为黑体。潜在的聚腺苷酸化信号UUUAUU(AAUAAA的互补序列)也有下划线并为斜体。*表示poly(A)尾巴的可能位置。
图25A-B：Persephin的多核苷酸和多肽序列信息。(A)人Persephin(PSPN)mRNA(GenBank登录号：NM_004158)的核苷酸序列。(B)人Persephin(PSPN)前体(Entrez蛋白质ID：NP_004149)的氨基酸序列。
图26：人Persiphin mRNA转录本的核苷酸序列。该序列由克隆的cDNA(GenBank登录号：NM_004558)所推导。起始密码AUG和终止密码UGA有下划线且为黑体。
发明详述
下面是本发明的描述，包括其优选实施方式，以通用术语给出。还从提供支持本发明及其具体实施例的实验数据的“实施例”部分给出的公开内容来阐明本发明。
定义
术语“抗体”应尽可能以最宽泛的含义而理解并旨在包括完整的单克隆抗体和多克隆抗体。也旨在涵盖修饰抗体，只要它们展示出想要的生物活性。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异结合(免疫反应)的抗原 结合位点的分子。这些包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fc、Fab、Fab’、和Fab2片段，以及Fab表达文库。抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD的任何类别，它们由于分子中存在的重链性质而彼此不同。这些也包括亚型，例如IgG1、IgG2以及其它。轻链可以是κ链或λ链。在此对抗体的引述包括对于所有分型、亚型以及种类的引述。也包括嵌合抗体，例如单克隆抗体或其对于一种以上来源(例如鼠或人序列)具有特异性的修饰。还包括骆驼抗体(camelid antibody)或纳米抗体(nanobody)。应理解对于“抗体”或任何类似术语的每种引述，在此包括完整抗体，以及其任何修饰。
术语“反义”应被广义理解。旨在意指任何能够结合用于Artemin和/或相关配体的转录本的核酸(优选RNA，但包括单链DNA)。其包括能与DNA或RNA(优选mRNA)特异性杂交的寡核苷酸及其衍生物(以及其在有形成盐的基团存在时的盐)。此种寡核苷酸或寡核苷酸衍生物可以包括数量和同一性足够以允许此种杂交的核苷酸单元或者其核苷酸类似物/衍生物。多数情况下，反义寡核苷酸及其衍生物与DNA互补序列、前体-mRNA或成熟mRNA特异性结合(杂交)，如由Watson-Crick碱基配对所限定。
如在此所使用，“改变的”多核苷酸包括具有缺失、插入或置换不同核苷酸而导致编码相同或功能等效的多核苷酸的那些。多肽和抗体也可为“改变的”并且含有氨基酸残基的缺失、插入或置换，其产生沉默改变并导致功能等效序列。可根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两性性质进行有意的氨基酸置换，只要保留序列的至少一种生物活性(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的作用)或免疫原性/免疫活性。例如，负电荷氨氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；而具有相似亲水性值的不带电极性头部基团的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天冬 酰胺和谷氨酰胺，丝氨酸和苏氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。产生置换和/或缺失或添加的指南可以获自，例如通过与同源物、直系同源物(orthologue)或旁系同源物(paralogue)的序列比较，如在此的附图中所示。
术语“抗原结合位点”或“抗原结合部分”指参与抗原相互作用的免疫球蛋白分子的部分，或片段或其修饰。抗原结合位点通常由重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基所形成。在重和轻链V区内的三条高度趋异序列(divergentstretch)(称作“高度可变区”)插入更保守的侧翼序列(flankingstretch)(称作“框架区”)之间。因此，术语“框架区”或“FR”指在免疫球蛋白的高度可变区之间以及邻近高度可变区天然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高度可变区和重链的三个高度可变区在三维空间彼此相关排列以形成抗原结合表面。该抗原结合表面通常与结合抗原的三维表面互补，并且重和轻链每种的三个高度可变区称作“互补决定区”或“CDR”。氨基酸向每个结构域的分配是按照已接受的定义(参见例如Kabat Sequences ofPToteins of ImmunologicalInterest，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1987和1991；以及Chothia&LeskJ.Mol.Biol.196：901-917，1987，Chothia等人，Nature 342：878-883，1989)。
在此使用的“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽、蛋白质、或抗体，以及其任何片段的序列，以及任何天然发生的、重组的、合成的或半合成的分子。本发明的序列包括至少5、6、7、8、9、10、11、或12个氨基酸，优选至少5至10、5至15、10至15、或12至15个氨基酸。优选地，该序列保留原始氨基酸序列的生物活性(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的作用)或免疫原性/免疫活性。应理解“氨基酸序列”和类似术语并不限于与全长分子相关的完整的、原始序列，也包括其任何修饰。
在此使用的“Artemin和相关配体”指包括Artemin(ARTN)和Persephin(PSPN)的GDNF家族配体(GFL)，其可以包括相似序列和/或活性，包括但不限于Artemin(ARTN)转录本变体1、Artemin(ARTN)转录本变体2、Artemin(ARTN)转录本变体3、Artemin(ARTN)转录本变体3、Artemin(ARTN)同工型1前体、Artemin(ARTN)同工型2前体、Artemin(ARTN)同工型3前体、Persephin(PSPN)、以及Persephin(PSPN)前体。对于在本发明使用，优选人序列，但也可以使用其它同源物和直系同源物。应理解在此对于这些因素(例如Artemin(ARTN)和相关配体，如Persephin(PSPN)或相似术语)的每种引述将包括全长序列以及其任何片段或修饰(包括变体)。
术语“癌症”和“癌性的”指哺乳动物中通常具有异常或未调控的细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性特征的生理状况。癌症以及癌症病理学可以与下述相关，例如转移、对邻近细胞的正常功能的干扰、异常水平的细胞因子或其它分泌产物的释放、炎性或免疫应答的抑制或恶化、瘤形成、癌前病变(premalignancy)、恶性肿瘤、周围或远距离组织或器官例如淋巴结等的侵袭。具体包括癌症和癌症前期症状，例如乳腺癌，其可以包括上皮肿瘤、非上皮肿瘤，癌(carcinoma)(例如原位癌)，以及侵袭性乳腺癌。也包括结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、和肝癌等。
在此使用的术语“互补的”或“互补”指在允许的盐和温度条件下多核苷酸通过碱基配对的天然结合。对于序列A-G-T，互补序列是T-C-A，反向互补是A-C-T，反向序列是T-G-A。两单链分子之间的互补可能是部分的，其中只有一些核酸结合，或者当在单链分子之间存在完全互补时，其可以是全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著作用。这对于扩增反应以及iRNA和PNA的设计和应用尤其重要，该扩增反应取决于核酸链 之间的结合。
在此使用的术语“衍生的”指多核苷酸，或其互补的多核苷酸的化学修饰。此种修饰包括例如，由烷基、酰基或氨基对氢的取代。优选的方面，多核苷酸衍生物编码保留天然分子的生物或免疫功能的多肽。衍生多肽或抗体是这样的，它们经糖基化、聚乙二醇化或保留它们所来源的序列的一种或多种生物功能(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的作用)或免疫原性/免疫功能的任何类似方法所修饰。对于抗体，术语“衍生物”包括例如，杂交和重组抗体。抗体的“杂交”和“重组”形式包括，例如人化抗体、双链抗体、三链抗体以及单链抗体。
如在此所使用，术语“表位”包括能够特异地结合免疫球蛋白，或相关分子(例如scFv)，或T细胞受体的任何多肽或肽决定簇。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸和/或糖侧链，并且通常具有特异的三维结构特征，以及特异的电荷特征。表位包括两种主要类型，即，顺序表位(SE)和构象表位(CE)，抗体在顺序表位处结合由肽键连接的氨基酸残基的连续序列，而抗体在构象表位处与通过多肽链折叠到一起的非连续的残基结合。构象表位在此也称作原生表位。通过抗原-抗体复合物结晶结构的分析可知，为了被抗体识别，残基必须大体是可进行相互作用的，并且因此临近抗原表面存在。使用商业可获得的算法预测SE和CE。当解离常数≤1μM时，优选≤100nM，且最优选≤10nM，称抗体特异地结合抗原。某些方面，抑制物可以与在此所述的配体特异结合或反应。对于抗体，“特异结合”或“特异免疫反应”意指抗体与期望的抗原的一个或多个抗原决定簇反应而不与其它多肽反应(即结合)或者以较低的亲和性(例如Kd＞10-6)与其它多肽结合。
术语“表达”包括从基因或者基因的一部分生产多核苷酸和多肽，尤其是RNA(例如mRNA)的生产，并且包括由RNA或基因或基 因的一部分所编码的多肽的生产，以及与表达相关的可检测物质的出现。例如，术语“表达”的范围内包括例如由多肽-多肽相互作用、多肽-核苷酸相互作用等形成复合物。另一实例是结合配体，例如杂交探针或抗体与基因或其它多核苷酸或寡核苷酸、多肽或蛋白质片段的结合，以及该结合配体的可视化。因此，在微阵列上、在诸如Northern印迹的杂交印迹上、或者在诸如Western印迹的免疫印迹上、或在珠阵列上、或通过PCR分析的点强度的增加包括在下面的生物分子的术语“表达”之内。
如在此使用，术语“同源性”指互补程度。可为部分同源性(即一定的％同一性)或完全同源性(即100％同一性)。使用功能术语“基本上同源的”指至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列。可使用低严谨性条件下的杂交检测(例如Southern或northern印迹、溶液杂交等)来检验完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序列或杂交探针将与在低严谨性条件下完全同源序列与靶序列的结合相竞争并抑制它。这并不是说地严谨性条件是允许非特异性结合的；低严谨性条件需要两条序列的相互结合是特异性(即选择性)相互作用。
如在此使用，术语“杂交”指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何方法。
如在此使用，“插入”或“添加”指相比于天然发生的分子，导致分别加入一个或多个氨基酸残基或核苷酸的氨基酸或核苷酸序列的变化。
对Artemin和/或相关配体的“抑制”或“进行抑制”旨在指阻断或降低这些配体的生物活性和/或水平。尽管可能想要完全抑制活性，但这一需要并非必需的。例如，“抑制”可在表达和产生水平(例如转录或翻译水平)或例如通过靶向功能而发生。如在此使用，用于Artemin和/或相关配体的术语“抑制”或“抑制”指减少的例如DNA水平(例如，减少的DNA合成，增加的转换(turnover) 和/或减少的稳定性)、RNA水平(例如，减少的转录，增加的转换和/或减少的稳定性)、或多肽水平(例如减少的翻译，增加的转换和/或减少的稳定性)或活性，或翻译后修饰。抑制物也可以减少或阻断相关途径中下游或上游试剂的活性或表达水平。具体方面，本发明的抑制试剂可用于抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性，尤其是癌症细胞，如在此所述。特别地，该试剂可用于下述一种或多种：减少细胞增殖(例如通过减少细胞分裂)，增加细胞死亡(例如通过增加凋亡或坏死)或减少细胞侵袭和/或转移(例如通过减少细胞骨架活动，细胞运动性)。
术语“修饰的”或“修饰”指改变的序列和序列片段、变体以及衍生物，如在此所述。该术语包括多肽、多核苷酸、抗体和在此描述的类似试剂。
如在此使用，术语“单克隆抗体”、“MAb”或“单克隆抗体组合物”指一群抗体分子，其含有包括独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物的抗体分子的分子种类。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)是独特的。MAb包括能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点，该反应特征在于与该表位的独特结合亲和性。
如在此使用，术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指多核苷酸、寡核苷酸的序列或其片段，以及天然的、重组的、合成的或半合成的DNA或RNA，其起源可为单链或双链并且可以表示有义或反义链，或者编码或非编码区。本发明的序列优选包括至少15、21、27、33、36、39、45、51、57、或66个核苷酸，优选至少15至36、15至66、36至66、或45至66个核苷酸、或者至少100个核苷酸、或者至少1000个核苷酸。应理解在此对于“核酸序列”或“核苷酸序列”的每种引述将包括原始的全长序列以及其任何互补体或修饰。还应理解对于具有特定SEQ IDNO.的“多核苷酸”(或“寡核苷酸”或“探针”或“引物”等)的任何引述将包括DNA和相应RNA序列。
术语“寡核苷酸”指多核苷酸，典型地为探针或引物，包括但不限于单链DNA、单链或双链RNA、RNA：DNA杂交体以及双链DNA。通常通过化学方法，例如使用商购可得的自动寡核苷酸合成仪，或者多种其它方法包括体外表达系统、重组技术以及细胞和生物体中表达来合成诸如单链DNA探针寡核苷酸的寡核苷酸。
术语“患者”或“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括但不限于鸟和哺乳动物，尤其是小鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛和马。
如在此使用，“肽核酸”或“PNA”指包括通过肽骨架连接的碱基的反义分子或反基因试剂。
如在此使用，短语“可药用的稀释剂、运载体、和/或赋形剂”旨在包括用于制备药物组合物，并且可与根据本发明的试剂共同给予而允许该试剂表现其想要的功能的物质。这些通常是安全、无毒的，并且不是生物学上或其它方面不期望的。可药用的稀释剂、运载体、和/或赋形剂的实例包括溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳剂等。稀释剂、运载体、和/或赋形剂可含有少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。
术语“多核苷酸”(例如，“Artemin或相关配体”，其可以用于讨论多核苷酸的)当以单数或复数使用时，通常指任何核酸序列，例如任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。这包括但不限于单链和双链DNA、包括单链和双链区的DNA、单链和双链RNA，和包括单链和双链区的RNA、包括DNA和RNA的杂交分子，该DNA和RNA可为单链，或者更典型地为双链或者包括单链和双链区。包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区也包括在内。具体包括mRNA、cDNA以及基因组DNA，及其任何片段。该术语包括含有一个或多个修饰碱基(例如氚化碱基)或不常见碱基(例如肌苷)的DNA和RNA。本发明的多核苷酸可以包括编码或非编码序列，或者有义或反义序列，或者iRNA如 siRNA。应理解在此对于“多核苷酸”或相似术语的每种引述将包括全长序列以及其任何互补体或修饰。
如在此使用，术语“多肽”(例如，可以用于讨论多肽的“Artemin或相关配体”)指寡肽、肽、或蛋白质或其片段，以及天然发生的、重组的、合成的或半合成的分子。当在此叙述这些术语来意指天然发生的蛋白质分子的氨基酸序列时，该术语并不旨在将氨基酸序列限制于该全长分子的完整的、原始序列。应理解在此对于“多肽”或相似术语的每种引述将包括全长序列以及其任何修饰。
如在此使用，术语“严谨条件”或“严谨性”指由核酸、盐和温度限定的杂交条件。这些条件是本领域公知的并且可被改变以鉴定或检测相同或相关的多核苷酸序列。参见例如Sambrook，J.等人，(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarborPress，Plainview，NY，以及Ausubel，F.M.等人，(1989)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，NewYork，NY。包括低或高严谨性的众多等效条件取决于下面的因素，例如序列(例如DNA、RNA、碱基组合物)长度和性质、靶标(例如DNA、RNA、碱基组合物)性质、环境(例如在溶液中或在固体底物上固定化)、盐和其它组分(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇)的浓度以及反应温度(例如在低于探针溶解温度约5℃到低于该溶解温度约20℃至25℃的范围内)。可改变一种或多种因素以产生与上面列举的条件不同但等效的低或高严谨性条件。
如在此所指，“SEQ ID NO：”可以单独表示每条序列标识符，或者它们的任何组合，或者所有此种序列的标识符。
如在此使用，术语“基本上纯化的”或“分离的”指这样的核酸或氨基酸序列，它们从其细胞的、重组的或合成环境取出并且有至少60％，优选75％和最优选至少90％或至少99％不含在它们的环境中与它们相伴的其它组分。已经从在多核苷酸和多肽的天然状态中与其相伴的至少一种污染核酸分子中鉴定并分离出“分离的”多核苷酸和多肽。因此，应理解分离的多核苷酸和多肽是与自然下发现它们的形式或装配不同的形式。还应理解“分离的”并不需要反映该序列被纯化的确切程度(例如具体百分数)。
“治疗”以及相似术语指预防、治愈、或改善医学病症(例如医学疾病、状况或症状)或者减轻此种病症的至少一种症状的方法和组合物。特别地，这包括预防或延缓医学病症发作；治愈、纠正、降低、减缓或改善病症的身体或发展作用；和/或预防、终止、降低、或改善该病症造成的疼痛或苦楚的方法和组合物。术语“治疗”以其最广义来理解。该术语并不需要意味着治疗受试者直到完全康复。因此，如在此使用的“治疗”广义地包括抑制、降低、或预防细胞增殖、细胞存活、细胞运动性、和/或致癌性；改善细胞增殖、细胞存活、细胞运动性、和/或致癌性的症状或严重性；或者预防或降低产生细胞增殖、细胞存活、细胞运动性、和/或致癌性的风险，例如产生癌症的风险，特别是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症。
如在此使用，多肽“变体”指一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。类似地，变体抗体的一个或多个氨基酸改变。变体多核苷酸的一个或多个核苷酸改变。变体可导致“保守”改变，其中取代的氨基酸具有相似结构或化学性质，例如用异亮氨酸代替亮氨酸。更罕见地，变体可导致“非保守”改变，例如用色氨酸代替甘氨酸。类似的小改变也可包括氨基酸缺失或插入或者两者。可使用本领域公知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)来找到确定哪个氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不废除生物或免疫原活性的指南。
本发明也包括保持至少一种生物活性(例如对于细胞增殖、细胞存活、细胞运动性、和/或致癌性的作用)或者免疫原/免疫功能的变体。优选的变体是与已公开的序列具有至少80％，且更优选至 少90％序列同一性的变体。最优选的变体是与在此公开的序列具有至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的变体。通过按照下面描述来比对待比较的两条序列：测定比对部分的相同残基数，用该数除以发明(检索)序列中的总残基数，并且将结果乘以100而确定同一性百分数。有用的比对程序是AlignX(载体NTI)。
除非另有指明，否则本发明的实践将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、和生物化学的常规技术，这在本领域技术人员的范围内。文献中全面地解释了此种技术，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Sambrook等人，1989；还有Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Sambrook等人，2000；Oligonucleotide Synthesis，MY Gait编，1984；Animal Cell Culture，R.I.Freshney编，1987；Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook ofExperimentalImmunology，第四版，D.M.Weir&CC.Blackwell编，Blackwell Science Inc.，1987；GeneTransfer vectors forMammalian Cells，JAM.Miller&MAP.Calos编，1987；CurrentProtocols in Molecular Biology，FEM.Ausubel等人编，1987；以及PCR：ThePolymerase Chain Reaction，Mullis等人编，1994。
Artemin
神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)家族由四种成员组成，即Artemin、Neurturin、Persephin和GDNF。在本领域目前的理解中，成员通过结合共受体GFRα来起作用，这激活共同的酪氨酸激酶受体RET以引发下游靶标，这依次影响细胞生长、分化、存活和凋亡(Baudet等人，2000；Coulpier等人，2002)。乳腺癌MCF-7细胞表达所有该家族成员。本公开内容阐明了特别地，Artemin增强无贴壁依赖性生长和集落形成(即致癌性)，减少凋亡并增加细胞迁移/侵袭。由siRNA在MCF-7细胞中消耗内源性Artemin导致对 强制表达的相反作用。因此，本发明研究表明Artemin除了其对神经细胞的正常作用外，还影响癌细胞凋亡、迁移和侵袭，以及无贴壁依赖性生长和集落形成(即致癌性)。这些生物功能的抑制可以用来显著限制癌的发作、进展、转移和复发，尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症。
因此，在此公开的数据阐明了Artemin表达除了促进无贴壁依赖性生长和集落形成(即致癌性)以外，还促进乳腺癌MCF-7细胞的存活、迁移、和侵袭，并且可以通过由siRNA降低Artemin的表达水平或由抗体降低活性来有效抑制这些活动。如此，Artemin和相关配体代表了用于癌症，尤其用于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症的治疗和诊断的理想的新靶标。抑制Artemin和/或相关配体的生物活性和/或水平的试剂可以用于抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性，例如用于癌细胞。这些试剂可以包括，例如，化学化合物(例如小分子)、拮抗剂、抗体和iRNA。类似地，诊断剂(例如多核苷酸和抗体)可以用于确定Artemin和/或相关配体的水平，以及检测癌的状况，例如癌症发作、进展、转移或复发。
Artemin多核苷酸和多肽
本发明包括用于Artemin或相关配体的多肽，包括：包括SEQID NO：1至36、172、173中至少一种的那些，及其修饰。本发明也包括这些多肽在诊断癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症的应用。本发明还包括该多肽在制备抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性例如癌细胞的抗体的应用。本发明的多肽可在多种检测中表达和使用以确定它们的生物活性。该多肽可用于大规模合成和分离方法，例如，用于商业生产。此种多肽可用于产生抗体、分离相应的氨基酸序列，以及定量地确定氨基酸序列的水平。本发明的多肽也可以 用作组合物，例如，药物组合物或试剂盒组合物。本发明的多肽也可以用于提供健康益处。对于此种益处，该多肽可以用于制备抗体以及其组合物。
本发明的多肽包括选自下组的至少一种序列：(a)包括选自SEQID NO：1至36、172、173或其修饰中至少一种氨基酸序列的多肽；(b)包括选自SEQ ID NO：1至36、172、173或其修饰中至少一种氨基酸序列的功能结构域的多肽；以及(c)包括选自SEQ ID NO：1至36、172、173或其修饰中至少一种氨基酸序列的至少特定数量的连续残基的多肽。一个特别实施方式中，本发明包括分离的多肽，该多肽包括SEQ ID NO：1至36、172、173中至少一种的氨基酸序列。在此将所有这些序列都总体上称作本发明的多肽。
本发明包括用于Artemin或相关配体的多核苷酸，该多核苷酸包括SEQ ID NO：37至171、174，以及互补体，以及其修饰序列的那些。本发明也包括这些多核苷酸在诊断癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症的应用。本发明还包括这些多核苷酸在抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的应用，例如用于癌细胞。因此，本发明包括该多核苷酸在制备表达载体和宿主细胞、以及在制备反义多核苷酸和iRNA的应用。本发明的分离的多核苷酸在对或多或少相关的物种的基因组作图、物理作图以及基因克隆上也具有实用性。可使用本领域公知的技术，例如狭线印迹技术或微阵列分析，将用本发明多核苷酸所设计的探针用于检测在细胞中的具有充分同源性DNA和RNA序列的任何生物体中基因的存在并检查基因表达模式。用本发明多核苷酸设计的引物可用于测序和PCR扩增。本发明的多核苷酸也可用作组合物，例如药物组合物。本发明的多核苷酸也可以用于提供健康益处。对于此种益处，该多肽可以以表达载体或包括表达载体的宿主细胞存在。
本发明的多核苷酸包括至少一种选自下组的序列：(a)：包括 选自SEQ ID NO：1至36、172、173或其修饰中至少一种的氨基酸序列的编码序列的序列；(b)选自SEQ ID NO：1至36、172、173或其修饰中的至少一种的氨基酸序列的编码序列的互补体、反向序列以及反向互补体；(c)选自SEQ ID NO：1至36、172、173或其修饰中的至少一种的氨基酸序列的编码序列中含有的开放读码框；(d)选自SEQ ID NO：1至36、172、173或其修饰中的至少一种的氨基酸序列的编码序列的功能结构域；(e)包括选自SEQ ID NO：1至36、172、173或其修饰的氨基酸序列中至少一种的编码序列至少特定数量的连续残基的序列；和(f)包括SEQ ID NO：37至171、174，或其互补体，或其修饰序列的至少特定数量的连续核苷酸的序列。一个特别实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，该多核苷酸包括选自SEQ ID NO：1至36、172、173的氨基酸序列中至少一种的编码序列。另一特别实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，该多核苷酸包括选自SEQ ID NO：1至36、172、173的序列。本发明也提供寡核苷酸探针和引物以及它们的修饰。在此将所有这些多核苷酸和寡核苷酸探针和引物总体上称作本发明的多核苷酸。
本领域技术人员将理解作为遗传密码简并性的结果，可产生大量编码本发明多肽的核苷酸序列，其中一些与任何已知的及天然发生的基因的核苷酸序列具有最小同源性。因此，本发明考虑到可以基于可能的密码子选择通过选择组合而得到的核苷酸序列的所有可能的变化。根据适用于天然发生的氨基酸序列的标准三联体遗传密码进行这些组合，并且认为具体地公开了所有此种改变。
用于Artemin或相关配体的核苷酸序列，或其修饰优选地能够与天然发生序列的核苷酸序列在适当选择的严谨性条件下杂交。然而，产生具有基本上不同密码子使用的核苷酸序列或其修饰可能是有益的。可根据特殊密码子被特殊原核细胞或真核细胞宿主所利用的频率来选择密码子以增加在该特殊原核细胞或真核细胞宿主中发生多肽表达的比率。其它实质上改变核苷酸序列及其衍生物而不改 变所编码的氨基酸序列的原因包括与天然发生序列所产生的转录体相比，具有更多期望特性(例如更大的半衰期)的RNA转录体的产生。
本发明也包括完全通过合成化学来生产用于Artemin或相关配体的多核苷酸，或其修饰。生产以后，可使用本领域公知的试剂将合成序列插入到许多可用的表达载体和细胞体系的任何一种中。此外，可使用合成化学将突变引入核苷酸序列，或其任何衍生物。本发明也包括能够在如Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；MethodsEnzymol.152：399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；Methods Enzymol.152：507-511)所教导的多种严谨性条件下，与所主张的核苷酸序列，尤其是SEQ ID NO：35-171所示的那些，或其互补体，或修饰序列杂交的多核苷酸序列。
可将本领域公知的和通常可用的DNA测序方法用于实践本发明的任何实施方式。该方法可使用酶如DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASE(U.S.Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、热稳定T7聚合酶(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)，或聚合酶的组合，以及校对外切酶，如在ELONGASEAmplification System(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中所见的那些。优选地，该方法是用诸如Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、Peltier热循环仪(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)、ABI催化剂以及373和377DNA测序仪(Perkin Elmer)，或是Genome测序仪20TM(Roche Diagnostics)的仪器自动完成的。
可利用部分核苷酸序列并使用本领域已知的多种方法来延伸核酸序列以检测上游序列如启动子和调控元件。例如，一种可使用的方法“限制位点”PCR使用通用引物来回收与已知座位相邻的未知序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2：318-322)。特别地，在接头序列的引物和对已知区域特异的引物存在下，首先扩 增基因组DNA。然后使用相同的接头引物和在第一特异引物内的另一特异引物对扩增的序列进行第二轮PCR。用适当的RNA聚合酶转录每轮PCR的产物并用反转录酶来测序。
可使用市售可得的毛细管电泳系统来分析测序或PCR产物的大小或者确认其核苷酸序列。特别地，毛细管测序可使用用于电泳分离的可流动聚合物，由激光活化的四种不同荧光染料(每种用于一种核苷酸)，以及用电荷偶联设备照相机来检测发出的波长。可使用适当的软件(例如GENOTYPER和Sequence NAVIGATOR，PerkinElmer)将输出/光强度转变成电信号，并且可由计算机控制从上样到计算机分析以及电子数据显示的整个过程。对于可能在特殊样品中以有限量存在的小片DNA的测序尤其优选毛细管电泳。
本发明的另一实施方式中，多核苷酸或其修饰可用于重组DNA分子以在合适的宿主细胞中指导用于Artemin或相关配体的多肽，或其修饰的表达。由于遗传密码的固有简并性，可产生编码基本上相同或功能上等效的氨基酸序列的其它DNA序列，而这些序列可用于克隆和表达多肽。出于多种原因，包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的改变，可以使用本领域通常已知的方法改造本发明的核苷酸序列以便改变氨基酸编码序列。通过随机片段化以及基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新组装的DNA改组可用于改造核苷酸序列。例如，定点诱变可用于插入新的限制位点，改变糖基化模式、改变密码子偏好、引入突变等等。
本发明的另一实施方式中，可将编码多肽的天然的、修饰的或重组的核酸序列与异源序列连接以编码融合蛋白。例如，编码可被市售可得的抗体所识别的嵌合序列可能是有用的。也可改造融合蛋白以含有位于本发明的多肽和异源蛋白质序列之间的切割位点，以便可切割该多肽并从外源的分子部分中纯化。
另一实施方式中，可使用本领域公知的化学方法(参见Caruthers，M.H.等人，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 215-223，Horn，T.等人，(1980)Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.225-232)整体或者部分合成核苷酸序列。或者，可使用化学方法生产多肽本身以合成氨基酸序列，或其修饰。例如，可以使用多种固相技术进行多肽合成(Roberge，J.Y.等人，(1995)Science269：202-204；Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)，并且可使用例如ABI 431A多肽合成仪(PerkinElmer)实现自动合成。可使用化学方法来单独地以及组合地化学合成多种多肽片段以生产全长分子。
可通过制备型高效液相色谱(例如Creighton，T.(1983)Proteins Structuresand Molecular Principles，WH Freeman andCo.，New York，NY)分离新合成的多肽。可通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解法；Creighton，上文)来确认合成多肽的组成。此外，可使用化学方法在直接合成和/或组合时用来自其它蛋白质的序列，或其任何部分改变该多肽的氨基酸序列或其任何部分以生产修饰的分子。
为了表达有生物活性的多肽，可将编码该多肽或功能等效物的核苷酸序列插入适当的表达载体，例如，含有所插入编码序列的转录和翻译所需元件的载体。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有编码该多肽的序列和适当的转录及翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。此种技术描述于Sambrook，J.等人，(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Plainview，NY；还有Sambrook，J.等人，(2000)Molecular Cloning，ALaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY，以及Ausubel，F.M.等人，(1989)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York，NY。
可利用多种表达载体/宿主系统以含有并表达编码本发明多肽的序列。这些包括但不限于，微生物如转化有重组噬菌体、质粒或 粘粒DNA表达载体的细菌；转化有酵母表达载体的酵母；由病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；转化有病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病病毒，TMV)或者细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)的植物细胞系统；或者动物细胞系统。对于细菌，有用的质粒包括来自Invitrogen的pET、pRSET、pTrcHis2和pBAD质粒，来自Novagen的pET和pCDF质粒，以及来自Sigma-Aldrich的DirectorTM质粒。特别地，大肠杆菌可以与表达载体pET一起使用。本发明并不受所用表达载体或宿主细胞限制。
“控制元件”或“调控序列”是那些与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译的非翻译区(例如，增强子、启动子、5′和3′非翻译区)。此种元件的强度和特异性可不同。根据所用载体系统和宿主，可使用任何数量的适合的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子例如BLUESCRIPT噬粒(Stratagene，LaJolla，CA)或pSPORT1质粒(Life Technologies)的杂交lacZ启动子等。杆状病毒多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞。可将源自植物细胞基因组的启动子或增强子(例如，热激、RUBISCO、和贮藏蛋白基因)或源自植物病毒的启动子或增强子(例如，病毒启动子或前导序列)克隆到载体中。
在细菌系统中，可根据多肽想要的应用来选择许多表达载体。例如，当需要大量多肽时，可使用指导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体。此种载体包括但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体；pIN载体(Van Heeke，G.和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)等，该多功能大肠杆菌克隆和表达载体例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可将编码多肽的序列与氨基末端Met和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基符合读框地连接到载体中，以便生产杂合蛋白。
pGEX载体(Promega，Madison，WI)也可用于作为与谷胱甘肽 S-转移酶(GST)的融合蛋白表达多肽。总体上，此种融合蛋白是可溶的并且可以易于通过吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从裂解细胞中纯化。此系统制造的蛋白质可设计为包括肝素、凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点以便可以随意从GST部分释放目的克隆多肽。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中可使用多种含有组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。综述参见Ausubel等人，(上文)和Grant等人，(1987)MethodsEnzymol.153：516-544。
特异的起始信号也可用于实现编码本发明多肽的序列的更有效翻译。此种信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子以及上游序列都插入到适当的表达载体的情形下，可不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在只插入了编码序列或其修饰的情形下，应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应在正确的读码框中以保证全部插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可为多种来源(天然的和合成的)。可通过包括适于所用特殊细胞系统的增强子(例如文献中描述的那些(Scharf，D.等人，(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-162))来增强表达效率。
此外，可依调节插入序列的表达或以想要的形式加工所表达多肽的能力选择宿主细胞。此种序列修饰包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化以及酰基化。也可使用切割“前体原(prepro)”形式多肽的翻译后加工来促进正确插入、折叠和/或功能。对翻译后活性具有特异的细胞结构(machinery)和特征机制的不同宿主细胞可获自美国典型菌种保藏中心(ATCC；Bethesda，MD)并且可进行选择以保证序列的正确修饰和加工。特异宿主细胞包括但不限于红酵母菌(Rhodotorula)、短梗霉(aureobasidium)、酵母菌属(Saccharomyces)、掷孢酵母(Sporobolomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、欧文氏菌(Erwinia)和黄杆菌 (Flavobacterium)；或这样的其它生物体如埃希氏菌(Escherichia)、乳杆菌(Lactobacillus)、杆菌(Bacillus)、放线菌(Streptomyces)等。特别的宿主细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli，其尤其适于本发明)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)等。
存在若干用于将核酸导入体外培养的真核细胞的技术。这些包括化学方法(Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84：74137417(1987)；Bothwell等人，Methodsfor Cloning and Analysisof Eukaryotic Genes，Eds.，Jones and BartlettPublishers Inc.，Boston，Mass.(1990)，Ausubel等人，Short Protocols inMolecularBiology，John Wiley and Sons，New York，NY(1992)；和Farhood，Annal.NY Acad.Sci.，716：23 34(1994))，原生质体(Bothwell，上文)或电脉冲的使用(Vatteroni等人，Mutn.Res.，291：163169(1993)；Sabelnikov，Prog.Biophys.Mol.Biol.，62：119 152(1994)；Bothwell等人，上文；和Ausubel等人，上文)，减毒病毒的使用(Davis等人，J.Virol.1996，70(6)，3781 3787；Brinster等人，J.Gen.Virol.2002，83(Pt2)，369 381；Moss，Dev.Biol.Stan.，82：55 63(1994)；以及Bothwell等人，上文)，以及物理方法(Fynan等人，上文；Johnston等人，Meth.Cell Biol.，43(Pt A)：353 365(1994)；Bothwell等人，上文；以及Ausubel等人，上文)。
可以通过下述方法实现核酸向动物组织的成功递送：阳离子脂质体(Watanabe等人，Mol.Reprod.Dev.，38：268 274(1994))，裸露DNA或RNA向动物肌肉组织的直接注射(Robinson等人，Vacc.，11：957 960(1993)；Hoffman等人，Vacc.12：1529 1533；(1994)；Xiang等人，Virol.，199：132 140(1994)；Webster等人，Vacc.， 12：14951498(1994)；Davis等人，Vacc.，12：15031509(1994)；Davis等人，Hum.Molec.Gen.，2：18471851(1993)；Dalemans等人，Ann NY Acad.Sci.1995，772，255256.Conry等人，CancerRes.1995，55(7)，1397-1400)，和胚胎(Naito等人，Mol.Reprod.Dev.，39：153161(1994)；和Burdon等人，Mol.Reprod.Dev.，33：436442(1992))，自复制RNA疫苗的肌内注射(Davis等人，J Virol1996，70(6)，37813787；Balasuriya等人，Vaccine 2002，20(1112)，16091617)或使用“基因枪”技术的DNA皮内注射(Johnston等人，上文)。
使用蛋白特异的多克隆或单克隆抗体，检测和测量本发明多肽的表达的多种方法是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附检测法(ELISA)、放射性免疫检测法(RIA)以及荧光活化细胞分选法(FACS)。两位点单克隆类免疫检测法可以用对多肽上两个不相干涉表位有反应性的单克隆抗体进行，但也可以使用竞争性结合检测法。这些以及其它检测法描述于Hampton，R.等人，(1990；Serological Methods，a laboratory Manual，APS Press，StPaul，MN)和Maddox，D.E.等人，(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)等。
许多标记和缀合技术是本领域技术人员已知的并且可用于多种核酸和氨基酸检测法。生产用于检测多核苷酸相关序列的标记杂交或PCR探针的手段包括随机引物DNA标记(oligolabeling)、缺口翻译、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。或者，可将该序列或其任何修饰克隆到用于mRNA探针生产的载体中。此种载体是本领域已知的，市售可得的并且可通过添加适当的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6和标记核苷酸而用于体外合成RNA探针。可使用多种市售可得的试剂盒Amersham Pharmacia Biotech，Promega和USBiochemical来进行这些程序。可用于便捷检测的适合的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光素、化学发光素或显色剂，以及 底物、辅因子、抑制物、磁微粒等。
可在适于多肽表达和从培养物回收的条件下培养表达载体或转换有表达载体的宿主细胞。培养物可以包括用于体外或体内表达的组分。体外表达组分包括用于兔网织红细胞裂解物、大肠杆菌裂解物、和小麦胚芽提取物的那些，例如来自Invitrogen的ExpresswayTM或RiPs系统，来自iNtRON Biotechnology的GenelatorTM系统，来自Novagen的EcoProTM或STP3TM系统，来自Promega的 Quick Coupled系统，和来自QIAGEN的EasyXpress系统。根据序列和/或所用载体，培养物生产的多肽可分泌或包含在细胞内。特殊的方面，编码噬菌体多肽的表达载体可以设计为含有信号序列，该序列引导多肽通过原核细胞或真核细胞膜的分泌。
其它构建体可包括将促进多肽纯化的氨基酸结构域。此结构域包括但不限于金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸(例如6X-HIS)模块，允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域，以及 延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)所用的结构域。有用的表位标签包括 HA、VSV-G、V5、HSV、GST、GFP、MBP、GAL4和β-半乳糖苷酶。有用的质粒包括那些包括有生物素标签(例如来自Promega的PinPoint质粒)、钙调蛋白结合蛋白(例如来自Stratagene的pCAL质粒)、链霉亲和素结合肽(例如来自Stratagene的InterPlay质粒)、c-myc或 标签(例如来自Sigma-Aldrich的Immunoprecipitation质粒)，或组氨酸标签(例如来自QIAGEN的QIAExpress质粒)。
为了促进纯化，表达载体可以包括可切割的接头序列，例如对于因子Xa或肠激酶(Invitrogen，San Diego，CA)特异的那些。例如，载体可以包括在纯化结构域和多肽之间的一种或多种接头。一种此表达载体提供包括本发明多肽和编码6个组氨酸残基的核酸，此二者在硫氧还蛋白或肠激酶切割位点之前，以用于融合蛋白 的表达。该组氨酸残基促进在IMAC(固定化金属离子亲和色谱，如Porath，J.等人，(1992)Prot.Exp.Purif.3：263-281所述)上的纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白纯化该多肽的手段。Kroll，D.J.等人，(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)提供了含有融合蛋白的载体的讨论。
抑制Artemin和/或相关配体的多核苷酸
如此前所述，一个实施方式中，可利用多核苷酸来抑制根据本发明的Artemin和/或相关配体。此多核苷酸可为DNA、RNA、单链或双链。用于本发明的多核苷酸在此可称作“分离的”多核苷酸。可使用本领域已知的许多技术获得分离的多核苷酸。例如，可使用例如Sambrook.，J.等人，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第二三版)，coldSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY以及Sambrook和Russell(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版)，Cold Spring HarborLaboratoryPress，Plainview，NY中描述的重组DNA技术。类似地，可使用化学合成，例如使用亚磷酰胺和固相化学。可在所公开的核酸序列数据、核苷酸碱基间的已知相对相互作用、已知的序列同一性、以及待使用的特别核酸技术的基础上设计多核苷酸，如下文将举例证明。
一个实施方式中，可利用干涉RNA(iRNA或siRNA)来抑制Artemin和/或相关配体。用于iRNA技术的多核苷酸将通常与它们的靶标具有100％的互补性。然而，应理解在iRNA保留对于其靶标的特异性以及阻断翻译的能力的情形下，不需如此。示例性的iRNA分子可为具有3’二核苷酸突出端的～18至21bp双链RNA的形式，尽管更短或更长分子也是适合的。在由适当的核酸载体体内生产iRNA的情形下，通常将采取具有茎环结构的RNA分子的形式，例如3’末端有2-3个U的约19个核苷酸的茎和9个核苷酸环。用来设计 siRNA的算法可获自Cenix(Dresden，Germany，通过Ambion，TX)。
Artemin siRNA的示例性靶序列包括：
AACTGGCCTGTACTCACTCAT(SEQ ID NO：46)
Artemin siRNA表达载体的示例性插入序列包括：
CTGGCCTGTACTCACTCAT TCAAGAGAATGAGTGAGTACAGGCCAGTTTTTTGGAA(SEQ ID NO：47)
对于这些插入物，黑体示出有义链，下划线示出反义链，而斜体字示出环序列。任何序列可以连接到这些插入物的任一端或两端，例如，可以连接限制位点以便于克隆。例如，可以为Persephin设计类似的siRNA序列。
可以根据在此名为“实施例”的部分中所述的技术生产iRNA分子。关于如何生产和设计此种分子的进一步的信息可以获自，例如：McManus MT和Sharp PA(2002)Genesilencing in mammals bysmall interfering RNAs.Nature Rev.Genet.3：737747；DillinA(2003)The specifics of small interfering RNAspecificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(11)：6289-6291；和Tuschl T(2002)Expanding small RNA interference.Nature Biotechnol.20：446-448。
本领域技术人员将理解siRNA指短/小干涉RNA，其包括双链RNA，通常包括21-23个碱基对，可以通过化学合成。相比之下，shRNA指短发夹RNA，也称作基于载体的siRNA，其包括单链RNA，例如体外或体内转录的。通常shRNA包括与靶mRNA(有义序列)同源的序列，“环”区和与靶序列互补的序列(反义序列)。shRNA形成发夹二级结构，而dicer酶切割该结构，移除发夹，并将其转变成siRNA。因此，根据需要，在此公开的序列可以用于生产shRNA，然后转变成siRNA。
本发明的另一实施方式中，使用反义分子。如在此所使用，术语“反义”应广义理解。旨在意指任何能够与用于Artemin和/或相 关配体的转录体结合的任何核酸(优选RNA，但包括单链DNA)。通常，反义分子或寡核苷酸包括约15至25个与它们的靶标mRNA完全互补的核苷酸。然而，应理解可以使用更大的反义寡核苷酸，包括全长序列。此外，应理解只要反义分子保留对于它们的靶标的特异性和抑制表达的能力，那么可使用与它们的靶标不完全互补的反义分子。
鉴于在此提供的说明以及对于Artemin和相关配体可得的序列数据，本发明所涉及领域的熟练技术人员应理解在本发明中使用的反义分子。关于反义技术的进一步信息可以获自，例如：Kandimalla ER，Manning A，Lathan C，Byrn RA，Agrawal S.Design，biochemical，biophysical and biological properties ofcooperative antisenseoligonucleotides；Nucleic Acids Res.1995 Sep 11；23(17)：3578-84；Tseng BY，BrownKD.Antisenseoligonucleotide technology in the development ofcancertherapeutics；Cancer Gene Ther.1994 Mar；1(1)：65-71；BryschW，Schlingensiepen KH.Design and application of antisenseoligonucleotides incell culture，in vivo，and as therapeuticagents；Cell Mol Neurobiol.1994 Oct；14(5)：557-68；Han J，Zhu Z，Hsu C，Finley WH.Selection of antisenseoligonucleotideson the basis of genomic frequency of thetarget sequence；Antisense ResDev.1994 Spring；4(1)：53-65。
应理解根据本发明，脱氧核酶(DNAzyme)、单链DNA、核酶、和三链螺旋DNA也可用于抑制Artemin和/或相关配体。鉴于在此提供的说明、可用的序列数据以及目前的方法学，本发明所涉及领域的普通技术人员可容易地理解核酶、脱氧核酶、三链螺旋DNA、和单链DNA。然而，作为示例，与这些技术相关的方法描述于JosephSambrook和DavidW.Russell.Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第三版)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY。
可化学修饰用于本发明的多核苷酸，包括反义的、iRNA、核酶和脱氧核酶以增加稳定性或防止降解或其它。例如，核酸分子可包括具有非天然碱基的类似物、修饰的糖(尤其是在核糖的2’位置)、或者改变的磷酸骨架。用于本发明的多核苷酸也可包括允许其所结合的任何转录本的靶向降解的序列。例如，可包括对Rnase H特异的序列。另一实例是外部指导序列(EGS)的使用，其可募集核酶(RNase P)以消化反义分子所结合的转录本。
通过用转录物组中其它序列、活化基因的全部互补体、mRNA或具体细胞中的转录体筛选具同一性的候选序列，可以帮助确保如反义寡核苷酸、iRNA、核酶、脱氧核酶和cDNA的特异性。此外，熟练技术人员可理解可使用适当算法来设计并确保此多核苷酸的特异性。
用于本发明的多核苷酸可以体外生产的核酸分子，例如单链DNA、iRNA、反义RNA、或脱氧核酶的形式使用。或者，适当的时候，它们可以适于生产合适的核酸，例如反义分子、iRNA或核酶的形式使用。本发明人考虑使用本领域可知的任何载体。例如，可使用利用CMV启动子的裸露质粒。病毒载体也可能是适合的，例如腺伴随病毒(AAV)和慢病毒。下文提供了适合的启动子和病毒载体的其它实例。使用此病毒载体的一个优势在于与向组织或肿瘤的局部给药不同，它们可允许全身给药。
用于本发明的载体或构建体可包括适当的遗传元件，例如本领域已知的启动子、增强子、复制起点，包括诱导型、组成型或组织特异型启动子。具体实施方式中，载体包括有效连接编码本发明核酸(例如反义或适当的siRNA)的区域的诱导型启动子，以便可通过控制转录的适当诱导物的存在与否来控制核酸的表达。另一实施方式中，本发明的核酸分子的侧翼为在基因组期望的位点处促进同源重组的区域，从而提供期望的核酸的染色体内整合(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935； Zijlstra等人，1989，Nature 342：435-438)。当然，载体可保持染色体外的。
本发明的另一实施方式中，使用PNA。PNA是磷酸骨架被由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元形成的非手性的和中性的骨架所代替的肽-核酸杂交体(参见例如EurekahBioscience Collection.PNA andOligonucleotide Inhibitors of HumanTelomerase.G.Gavory和S.Balasubramanian，Landes Bioscience，2003)。碱基A、G、T、C通过亚甲基羰基键接而连接到骨架的氨基氮(P.E.Nielsen等人，Science 1991.254：1497-1500；M.Egholm等人，Nature 1993.365：566-568)。PNA高特异性地结合互补序列，且相对于类似的DNA或RNA，以更高亲和性结合互补序列(M.Egholm等人，上文)。相比于相应的DNA/DNA或DNA/RNA双链，PNA/DNA或PNA/RNA杂交体也展现出更高的热稳定性(M.Egholm等人，上文)。由于不被核酶或蛋白酶所识别的非天然酰胺骨架，PNA也拥有高化学和生物稳定性(V.Demidov等人，Biochem Pharmacol 1994.48：1310-1313)。通常，PNA长度为至少5个碱基，并且包括末端赖氨酸。PNA也可聚乙二醇化以进一步延长它们的生命期(Nielsen，P.E.等人，(1993)Anticancer Drug Des.8：53-63)。作为非限制性实例，下面的反基因PNA与Artemin基因的编码DNA链的独特序列互补，并且设计为抑制mRNA合成。H-GCTGAGCAGCGTCGCAG-NH2(SEQID NO：48)。例如，可以为GDNF、Neurturin和/或Persephin设计类似的PNA序列。
除了多核苷酸抑制物，可以为Artemin和/或相关配体鉴定小分子抑制物。特别地，可以将Artemin的3D晶体结构以及Artemin-GFRα3复合体的3D晶体结构用于指导能够抑制Artemin和/或相关配体(包括GDNF、Neurturin、和/或Persephin)的高特异性小分子(参见例如，Silvian L，Jin P，Carmillo P，Boriack-Sjodin PA，Pelletier C，Rushe M，Gong B，Sah D， Pepinsky B，Rossomando A.Artemin crystal structure revealsinsights intoheparin sulfate binding.Biochemistry.2006 Jun6；45(22)：6801-12；Wang X，BalohRH，Milbrandt J，Garcia KC.Structure of artemin complexed with its receptorGFRalpha3：convergent recognition of glial cell line-derivedneurotrophicfactors.Structure.2006 Jun；14(6)：1083-92)。
用于抑制Artemin和/或相关配体的抗体
本发明包括用于Artemin和/或相关配体的抗体，例如与其至少一部分或其修饰序列结合的抗体。本发明的某些方面，抗体可用于抑制这些配体。应理解的是，出于本发明的目的，抗体的其它修饰或片段不需要完全像抗体一样作用。也就是说，该片段或其它修饰不需要能够将免疫系统细胞体内募集到结合Artemin的位点。不需要生产中和抗体。本发明所涉及领域的普通技术人员将认识到产生抗体片段的方法。本发明的抗体片段可以包括完整抗体之一的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变区。然而，作为普通实例，可使用完整抗体的蛋白水解消化，或者可通过重组核酸技术直接生产该片段。
应理解已知基本抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。人类轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别限定为IgM、IgD、IgA和IgE。在轻和重链中，可变和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区相连，而重链也包括约10或更多个氨基酸的“D”区。总体参见FundamentalImmunology Ch.7(Paul，W.，ea.，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))。每对轻/重链的可变区形成抗体结合位点。
本发明抗体可以根据同种型和表位作图以及在一些情形下，它们阻断Artemin和/或相关配体与一种或多种受体结合的能力来表征。阻断配体结合或活化的试剂可用于在此公开的多种病症治疗的方法中。也考虑识别Artemin和/或相关配体，但不能阻断受体结合的抗体。此抗体可用于检测和纯化此配体，以及如下文所详述用于诊断和监控病症在受试者中进展的方法。此抗体也可用于分析配体或其其它修饰序列的翻译后修饰。
抗体的人源化可用于降低在其它动物中产生的抗体免疫原性。可使用本领域已知的技术实现人化抗体的生产或抗体的人源化，例如在鼠抗体的人源化的情形下，使用表位定向选择。啮齿动物单克隆抗体人源化的最常用策略是CDR移植(Reichmann，L.，M.Clark，H.Waldman，和G.Winter.1998.Reshaping human antibodies fortherapy.Nature332L323-327；Jones PT，Dear PH，Foote J，Neuberger MS，Winter G.1986.Replacing thecomplementaritydetermining regions in a human antibody with those from amouse.Nature 321：522 25)以及表面重塑(Pedersen，J.T.，A.H.Henry，S.J.Searle，B.C.Guild，M.Roguska和A.R.Rees.1994.Comparison of surface accessible residuesin human and murineimmunoglobulin Fv domains.Implication for humanizationofmurine antibodies.J.Mol.Biol.235：959-973)。也可以使用表位定向选择来实现抗体的人源化(Wang等人，J.ImmunologicalMethods 241：171-184，2000)。Maynard，J.和Georgiou，G.2000.antibody engineering.Annu Rev Biomed Eng 2：339-376的方法提供了进一步的实例。
可以根据合理的设计方法以及反复优化，即由计算机模型化所辅助的框架残基的定点突变来生产人化抗体。可使用利用噬菌体展示的其它选择性人源化策略(Baca，M.，L.G.Presta，S.J. O’Connor和J.A.Wells.1997.antibody humanizationusingmonovalent phage display.J.Biol.Chem.272：10678-10684；Hoogenboom，H.R.，A.P.de Bruine，S.E.Hufton，R.M.Hoet，J.W.Arends和R.C.Roovers.1998.antibody phagedisplaytechnology and its applications.Immunotechnology.4：1-20；Jespers，L.S.，A.Roberts，S.M.Mahler，G.Winter和H.R.Hoogenboom.1994.Guiding the selection ofhuman antibodiesfrom phage display repertoires to a single epitope ofanantigen.Biotechnology(NY)12：899-903；Rader，C.和C.F.Barbas，III.1997.Phagedisplay of combinatorial antibodylibraries.Curr.Opin.Biotechnol.8：503-508；Rader，C.，D.A.Cheresh和C.F.Barbas，III.1998.A phage display approachfor rapidantibody humanization：designed combinatorial Vgenelibraries.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95：8910-8915；Rosok，M.J.，D.E.Yelton，L.J.Harris，J.Bajorath，K.E.Hellstrom，I.Hellstrom，G.A.Cruz，K.Kristensson，H.Lin，W.D.Huse和S.M.Glaser.1996.A combinatorial librarystrategy for the rapidhumanization of anticarcinoma BR96 Fab.J.Biol.Chem.271：22611-22618)。
其它方面，可以使用重建有人免疫球蛋白座位的转基因动物株系(例如XenoMouse株系)生产人抗体。此株系使得能够在动物宿主中产生全人抗体(Mendez，M.J.，L.L.等人，1997.Functionaltransplant of megabase human immunoglobulin locirecapitulateshuman antibody response in mice.Nat.Gen.15：146-156)。特别地，XenoMouse动物在它们的基因组中包括含有66个人重链和32个κ轻链免疫球蛋白基因的酵母人工染色体(YAC)，其中的内源重链和κ座位通过靶向缺失而功能性失活(Mendez等人，上文)。小鼠表达人μ、δ、γ2和κ链和鼠λ链， 人κ与鼠λ的比率为75∶1(Mendez等人，上文)。XenoMouse动物早前已显示为生产针对蛋白质抗原的人抗体(Green，L.L.，等人，1994.Antigen-specific humanmonoclonal antibodies from miceengineered with human Ig heavy and light chainYACs.Nat.Gen.7：13-21；Mendez等人，上文)，并且也可应答T不依赖性抗原如多糖。作为一个实例，可以使用两组或更多组遗传上不同的XenoMouse动物生产抗体，例如Xm2a-3株系，其由一种含有重链和轻链基因的双YAC重建；以及Xm2a-5株系，其由两种YAC重建，一种具有重链而另一种具有轻链基因(Jakobovits，A.1995.Production of fully humanantibodies by transgenic mice.Curr.Opin.Biotechnol.6：561-566；也参见Russell ND等人，Production of protective human antipneumococcal antibodies bytransgenicmice with human immunoglobulin loci.Infect Immun.2000Apr；68(4)：1820-6)。
本发明涉及领域的技术人员将理解术语“双链抗体”和“三链抗体”。这些是包括通过短肽接头连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)的分子，该短肽接头太短而不能允许同一链上的两个结构域之间配对。这促进与一条或多条其它链的互补结构域配对，并促进与两个或更多个功能抗原结合位点的二聚或三聚分子的形成。生成的抗体分子可为单特异性或多特异性的(例如，在双链抗体的情形下为双特异性的)。可使用本发明涉及领域标准的方法学从两种或更多种抗体产生此抗体分子(参见例如Todorovska等人，Design and application of diabodies，triabodies，andtetrabodies for cancertargeting.J.Immunol.Methods.2001Feb 1；248(1-2)：47-66；Holliger P，Prospero T和Winter G，Diabodies：small bivalent and bispecific antibody fragments，Proc NatlAcad Sci USA，90，6444-6448，1993；以及TomlinsonI和Holliger P，Methods forgenerating multivalent and bispecific antibody fragments，Methods Enzymol，326，461-479，2000)。
可根据本领域标准方法学进行抗体的生产。例如，在生产多克隆抗体的情形下，可使用Bean描述的方法(Eric S.Bean(2001)Polyclonal Antibodies.In：Basic Methods inAntibodyProduction and Characterization antibodies.Howard，G，andBethel D.(编)，CRC Press，5：21-50，2000)。例如，可根据Stewart的方法学制备单克隆抗体(SandyJ.Stewart(2001)Monoclonal Antibody Production.In：Basic Methods inAntibodyProduction and Characterization antibodies.Howard，G.和Bethel D.(编)，CRC Press，6：51-68，2000)或“MonocolonalAntibody Production Techniques andApplications，”LawrenceB Schook编，Marcel Dekker Inc.，New York，1987)。可使用本领域标准技术亚克隆、生长和维持杂交瘤。例如，它们可在诸如DMEM或RPMI-1640的培养基中体外生长和维持。或者，这在所选择的动物中可体内作为腹水瘤进行。
也可通过标准重组技术生产用于本发明的抗体(参见例如Siegel(2002)SiegelDL，Recombinant monoclonal antibodytechnology，Transfus Clin Biol，9(1)：15-222002；Welschof，M.，C.Christ，I.Hermes，A.Keller，C.Kleist和M.Braunagel.2003.Generation and screening of a modular human scFvexpressionlibrary from multiple donors.Methods Mol.Biol.207：103-121)。本发明人认为重组技术是商业规模上优选的生产抗体的手段。可在抗体的氨基酸序列、遗传密码和其中所理解的简并性的基础上容易地鉴定编码抗体的多核苷酸。例如，可使用本领域的标准方法从杂交瘤细胞分离编码抗体的多核苷酸并随后表征。例如，可根据抗体的一部分的氨基酸序列设计多核苷酸探针并随后用该探针分离编码抗体重和/或轻链的基因。或者，可通过标准化学 合成方法学，例如使用亚磷酰胺和固相化学来产生多核苷酸。可使用标准方法学确定本发明的抗体的氨基酸序列；例如可使用Edman降解和HPLC或质谱分析。
应理解因为本发明也延及在此具体所指的抗体的片段，以及修饰，也可适当地修饰编码该抗体的核酸。例如，重链和轻链恒定结构域的编码序列可被同源人结构域所代替。或者，可将CDR(互补决定区或抗原结合位点)区移植到同源人β片层框架。以此方式，可通过重组技术产生抗体修饰，例如人化抗体。如在此所提及，可通过标准重组方法生产本发明抗体。因此，本发明也延及编码抗体、抗体片段、或其修饰的多核苷酸、包括该多核苷酸的构建体、以及包括所述构建体的宿主细胞。根据本发明的多核苷酸可为DNA、RNA或cDNA，例如双链或单链、有义或反义序列，如在此所述。
例如，可使用本发明涉及领域已知的标准方法从培养物上清、腹水或血清分离本发明抗体。下文提供此技术的实例。然而，作为其它实例，可通过一种或多种方法例如亲和色谱、离子交换色谱、相互作用色谱、凝胶过滤色谱、嗜硫凝胶色谱、色谱聚焦、蛋白A或G琼脂糖柱、羟基磷灰石柱、去垢剂提取、电泳、渗透压冲击处理、包涵体纯化、硫酸铵沉淀、用液态聚合物离心、过滤和透析来发生分离或纯化。可使用本领域标准的多种技术从转化的宿主细胞或培养基或转基因生物体回收本发明的重组抗体。应理解可使用标准方法学，例如使用Edman降解和HPLC或质谱分析来确定本发明抗体的氨基酸序列(M.W.Hunkapiller，R.M.Hewick，W.J.Dreyer和L.E.Hood.1983.High-Sequencing with a Gas-PhaseSequenator.Methods Enzymol.91：399)。
可以使用标准方法来鉴定用于抗体生产的氨基酸序列。例如，可以通过Abie Pro3.0：肽抗体设计(超文本传输协议：//www.changbioscience.com/abie/abie.html)来预测多肽的抗原节段。更具体地，可以根据Hopp-Woods scale(Hopp TP，Woods KR.Predictionof protein antigenic determinants from aminoacid sequences.Proc Natl Acad SciU S A.1981Jun；78(6)：3824-8.)和/或Kyte和Doolittle scale(Kyte J，DoolittleRF.Asimple method for displaying the hydropathic characterof a protein.J MolBiol.1982 May 5；157(1)：105-32.)来预测抗原节段。特殊的计算机程序包括MAPAG(Aguilar RC，ReteguiLA，Roguin LP Int J Biomed Comput.1994Nov-Dec；37(3)：225-35)；PEOPLE(Alix AJ.：Vaccine.1999Sep；18(3-4)：311-4)；和HYDRPHIL(E A Mesri等人，JClin Microbiol.1990June；28(6)：1219-1224)。此表位可为构象特异的，因为它们可包括非连续残基，并且可构成所预测抗原序列的多个部分(例如SEQ ID NO：9至36中任何一条的部分，参见下面)，或者所预测抗原序列的一个或多个部分的组合(例如SEQ ID NO：9至36中一种或多种的组合)，或者一种或多种全长序列(例如SEQ ID NO：9至36中一种或多种)。抗原序列可以包括能形成能在天然多肽所遇到的类似3-D结构(例如表面残基)的氨基酸或其衍生物的任何组合。
对于Artemin和/或相关配体，可以使用序列分析来预测用于抗体生产的抗原序列。这些配体的序列信息是可广泛获得的(参见例如Rosenblad C，Gronborg M，Hansen C，Blom N，Meyer M，JohansenJ，Dago L，Kirik D，Patel UA，Lundberg C，Trono D，BjorklundA，Johansen TE.In vivo protection of nigral dopamine neuronsbylentiviral gene transfer of the novel GDNF-family memberneublastin/artemin.Mol Cell Neurosci.2000Feb；15(2)：199-214.Erratum in：Mol Cell Neurosci2001Sep；18(3)：332-3)。在示例性序列分析中，Abie Pro 3.0：肽抗体设计(超文本传输协议：//www.changbioscience.com/abie/abie.html)根据Hopp-Woods scale以及Kyte和Doolittle scale(Hopp TP， Woods KR.Prediction of protein antigenicdeterminants from amino acid sequences.Proc Natl Acad Sci U S A.1981 Jun；78(6)：3824-8；Kyte J，Doolittle RF.A simple method for displaying the hydropathiccharacter of a protein.J Mol Biol.1982 May5；157(1)：105-32)显示出为两个高度抗原性的节段。
这些用于Artemin的抗原序列包括PPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARG(残基1-43，相对于140个氨基酸的经加工的最大的成熟蛋白质；SEQ ID NO：5)和GALRPPPGSRPVSQP(残基92-106；SEQ ID NO：6)。此外，14个氨基酸的27种抗原性的肽预测如下：PPPQPSRPAPPPPA(残基1-14；SEQ ID NO：7)；PPQPSRPAPPPPAP(残基2-15；SEQ ID NO：8)；PQPSRPAPPPPAPP(残基3-16；SEQ ID NO：9)；QPSRPAPPPPAPPS(残基4-17；SEQ ID NO：10)；PSRPAPPPPAPPSA(残基5-18；SEQ ID NO：11)；SRPAPPPPAPPSAL(残基6-19；SEQ ID NO：12)；RPAPPPPAPPSALP(残基7-20；SEQ ID NO：13)；PAPPPPAPPSALPR(残基8-21；SEQID NO：14)；APPPPAPPSALPRG(残基9-22；SEQ ID NO：15)；PPPPAPPSALPRGG(残基10-23；SEQ ID NO：16)；PPPAPPSALPRGGR(残基11-24；SEQ ID NO：17)；PPAPPSALPRGGRA(残基12-25；SEQ ID NO：18)；APPSALPRGGRAAR(残基14-27；SEQ IDNO：19)；PPSALPRGGRAARA(残基15-28；SEQ ID NO：20)；PSALPRGGRAARAG(残基16-29；SEQ IDNO：21)；LPRGGRAARAGGPG(残基19-32；SEQ ID NO：22)；PRGGRAARAGGPGS(残基20-33；SEQ IDNO：23)；RGGRAARAGGPGSR(残基21-34；SEQ ID NO：24)；GGRAARAGGPGSRA(残基22-35；SEQ IDNO：25)；GRAARAGGPGSRAR残基23-36；SEQ ID NO：26)；RAARAGGPGSRARA(残基24-37；SEQ IDNO：27)；ARAGGPGSRARAAG(残基26-39；SEQ ID NO：28)；AGGPGSRARAAGAR(残基28-41；SEQ IDNO：29)；GGPGSRARAAGARG(残基29-42；SEQ ID NO：30)；GALRPPPGSRPVSQ(残基92-105；SEQID NO：31)； ALRPPPGSRPVSQP(残基93-106；SEQ ID NO：32)。
除了治疗应用，针对Artemin和/或相关配体的抗体可用于纯化或用于诊断应用。例如，抗体可固定化到固相上。这将帮助纯化和/或量化样品中的多肽或肽水平。在诊断程序和纯化的情形下，不需要抗体具有抑制物活性或减少配体的表达水平。尽管如可用于某些应用，可通过用提供可检测的信号的化合物进行标记来修饰抗体；例如，可以使用酶、荧光试剂、和放射性同位素。本发明所涉及领域的普通技术人员将容易地鉴定此适合的标记体系。此外，抗体可用作载体，例如携带毒素、放射性核素、同位素、基因或其它治疗分子到细胞或组织以辅助治疗。本领域普通技术人员将容易地理解确定抗体预防、减少或抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的效力的方法。然而，作为实例，可使用本文他处所述的方法，包括在实施例部分所涉及的一种或多种检测法。
应理解，抗体或抗体片段或其修饰可用于Artemin和/或相关配体的一般目的的检测和纯化。配体可来自天然或人工源，例如细胞培养物。优选地，配体是人源。此外，如可用于某些应用，可通过由提供可检测信号的化合物所标记来修饰抗体。例如可以使用酶、荧光试剂和放射性同位素。本发明所涉及领域的普通技术人员将容易地鉴定此适合的标记体系。因此，除了针对于配体的抗体的治疗应用，抗体可用于纯化配体或用于诊断应用。例如，固定化到固相上的抗体可帮助纯化和/或量化样品中的配体水平。本发明所涉及领域的熟练技术人员将理解可进行这些步骤的适当的技术。然而，作为实例，可使用利用固定化到色谱支撑物上的抗体、抗体片段或修饰的亲和色谱。在诊断和纯化程序的情形下，不需要抗体具有抑制活性。
应理解ELISA或类似检测法可加入直接和间接检测手段，并且本发明的抗体、或抗体片段或其修饰可用于捕获或检测抗体。如应理解，可在一种检测中使用一种或多种本发明的抗体。例如，当本 发明的两种抗体不识别Artemin和/或相关配体上的相同抗原决定簇时，可将一种抗体用作捕获抗体而可将另一种抗体用作检测抗体。或者，本发明抗体可以与以前鉴定的配体抗体组合使用。如本领域普通技术人员应理解，用于ELISA的检测抗体可与在此所述的可检测标记缀合。除了ELISA，其它有用的检测法包括western印迹、放射免疫检测法、免疫沉淀检测法、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞仪、 检测法和流式微殊阵列检测法。
可通过进行检验样品中Artemin和/或相关配体的水平与确定的基础水平或标准的直接比较来获得用于诊断或大体监控受试者状态的信息。例如，可以测定正常受试者的配体的平均血清水平(即已知不存在在此所述的医学病症的受试者)。这些浓度可用作基础水平，高于这一范围的结果指示医学病症。优选地，指示为病症的所必须的水平是鉴定为正常的那些范围的统计学上显著的增加。然而，即使没有统计学上显著的增加，所获得的结果可提供对于受试者状态的有价值的信息。应理解配体的正常范围在不同体液和组织中可不同。类似地，局部配体的正常水平可在血清中正常水平的范围之外。
应理解可通过比较检验样品中存在的Artemin和/或相关配体的水平与获自一系列其它受试者的结果的数据库来进行受试者状态的诊断或大体确定。代替利用获自许多正常受试者的配体的标准或基础水平浓度，可在知晓他们不存在医学病症期间，或在有活跃的医学病症期间，从单个受试者确定基础水平浓度。这可尤其用于需要持久的监控受试者状态的疾病事件或病症进行和/或间歇的情形下。例如，可在病症缓解期间确定基础水平，此后多个时间进行的诊断程序以评估状态。这可提供关于病症进展的有价值信息，或者帮助评估该病症的治疗是否证明为成功的。
本发明一方面，本发明抗体可以用于基于免疫组织化学的应用。例如，抗体染色可以用于异常细胞(例如在肿瘤中发现的那些)的 诊断，或者用于特殊细胞事件(如细胞增殖或细胞死亡)的表征，或用于评估蛋白质(例如Artemin和相关配体)在生物组织中的定位和差异表达。对于免疫组织化学，可通过多种手段显现抗体-配体相互作用。特别地，抗体可以和能够催化生色反应的酶(例如过氧化物酶)缀合。或者，抗体可以用免疫荧光显微镜可观察到的荧光团作标签，例如FITC、罗丹明、Texas Red、Alexa 或DyLightFluor。荧光团标签尤其可用于共聚焦激光扫描显微镜，这是高度灵敏的并且可以用于显现多种蛋白质之间的相互作用。作为另一方法，可以使用二级抗体来放大抗体信号。例如，二级抗体可以缀合生物素或报告酶如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，或者缀合如在此所详述的荧光试剂。对于免疫组织化学，可以使用来自活组织检查的任何细胞或组织，或者任何如在此所述的生物样品。
如在此所述，根据本发明生产的抗体可尤其用作治疗剂，例如，用于预防、减少、或抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性。一个广义实施方式，本发明提供阻断至少一种配体与一种或多种受体相互作用，或者更广义地，阻断配体与结合因子相互作用的方法，该方法包括接触根据本发明的抗体、抗体片段或其修饰。该方法可在体内或体外进行。
抑制Artemin和/或相关配体的组合物
用于抑制Artemin和/或相关配体的试剂(例如，化学化合物如小分子、以及拮抗剂、抗体、反义多核苷酸和iRNA)可以其自身使用，或者以组合可药用稀释剂、运载体、和/或赋形剂中一种或多种的组合物的形式使用。本发明所涉及领域的技术人员将容易地理解可用于本发明组合物的多种可药用稀释剂、运载体、和/或赋形剂。如应理解，对于此种稀释剂、运载体和/或赋形剂的选择将在一定程度上由所用试剂的性质、想要的组合物剂型以及给药模式所指示。作为实例，在给予多核苷酸的情形下，例如适于表达反义或 iRNA的载体，适合的运载体包括等渗溶液、水、水性盐溶液、水性葡萄糖溶液等。
除了标准稀释剂、运载体和/或赋形剂，本发明药学组合物可与其它组分一起，或以某种方式来配制，使得增强试剂活性或帮助保护试剂的完整性。例如，组合物可进一步包括佐剂或者在给予受试者时，提供针对降解的保护或减少试剂抗原性的组分。或者，可改良该试剂以便允许靶向特定的细胞、组织或肿瘤。
可配制试剂以结合缓释体系。因为这一情形，组合物可包括成型制品形式的半渗透聚合物基质，例如膜，或微胶囊。缓释基质包括多乳酸化合物(美国专利No.3,773,919；EP58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐(酯)的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers：22：547-56)、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.：15：267)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.：15：267)、或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
本发明试剂也可配制成脂质体。可使用本发明所涉及领域已知的技术配制包括所述组合物的脂质体。作为实例，参见DE3,218,121、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP143,949、EP142,641、日本专利申请83-118008、美国专利No.4,485,045和4,544,545、以及EP 102,324。通常，脂质体为小(从或约200至800埃)单层(unilamellar)型，其中脂含量大于约30mol胆固醇百分数，针对最有效的治疗来调整所选比例。也可对用于本发明的试剂聚乙二醇化以增加它们的寿命。
此外，考虑根据本发明的组合物可与能在特殊情况下有益于受试者的其它成分一起配制，例如，适当的时候，可有益于掺入一种或多种抗肿瘤试剂。此种试剂的实例包括：烷基化试剂，例如苯丁酸氮芥(例如LeukeranTM)、环磷酰胺(例如EndoxanTM、CycloblastinTM、NeosarTM、CyclophosphamideTM)、异环磷酰胺(例 如HoloxanTM、IfexTM、MesnexTM)、塞替派(例如ThioplexTM、ThiotepaTM)；和抗代谢物/S-相抑制物，例如甲氨蝶呤钠(例如FolexTM、AbitrexateTM、EdertrexateTM)、5-氟尿嘧啶(例如EfudixTM、EfudexTM)、羟基脲(例如DroxiaTM、Hydroxyurea、HydreaTM)、安吖啶、吉西他滨(例如GemzarTM)、达卡巴嗪、硫鸟嘌呤(例如LanvisTM)。
还包括抗代谢物/有丝分裂毒，例如依托泊苷(etoposide)(EtopophosTM、Etoposide、ToposarTM)、长春碱(例如VelbeTM、VelbanTM)、去乙酰长春酰胺(vindestine)(例如EldesineTM)、长春瑞滨(vinorelbine)(例如NavelbineTM)、紫杉酚(paclitaxel)(例如TaxolTM)；抗生素型试剂，例如阿霉素(例如RubexTM)、博来霉素(例如BlenoxaneTM)、放线菌素D(例如CosmegenTM)、道诺霉素(例如CerubidinTM)、丝裂霉素(例如MutamyciTM)；激素类试剂，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)(例如CytadrenTM)、阿那曲唑(anastrozole)(例如ArimidexTM)、雌莫司汀(estramustine)(例如EstracytTM、EmcytTM)、戈舍瑞林(goserelin)(例如ZoladexTM)、六甲基三聚氰胺(例如HexametTM)、来曲唑(letrozole)(例如FemaraTM)、阿那曲唑(anastrozole)(例如ArimidexTM)和它莫西芬(tamoxifen)(例如EstroxynTM、GenoxTM、NovaldexTM、SoltamoxTM、TamofenTM)。
还包括任何两种或更多种抗新生瘤试剂的组合，例如阿霉素/5-氟尿嘧啶/环磷酰胺(FAC)；和环磷酰胺/甲氨喋呤/5-氟尿嘧啶(CMF)。尤其有用的是包括，例如至少两种或更多种下述试剂的组合，该试剂例如环磷酰胺(例如CYTOXAN)，甲氨喋呤(例如RHEUMATREX)，5-氟尿嘧啶(例如ADRUCIL)，阿霉素(doxorubicin)(例如ADRIAMYCIN)，和环磷酰胺(例如CYTOXAN)。用于转移性疾病的试剂例如卡培他滨(capecitabine)(例如XELODA)，多柔比星(例如ADRIAMYCIN)，包括其脂质体制剂，吉西他滨 (gemcitabine)(例如GEMZAR)，紫杉烷类包括紫杉醇(例如TAXOL)和多西紫杉醇(例如TAXOTERE)，长春瑞滨(例如NAVELBINE)，和曲妥珠单抗(trastuzumab)(例如HERCEPTIN)。本发明所涉及领域的普通技术人员将容易地理解其它可有益处的试剂的实例。根据已接受的药学实践，本发明的试剂也可与除了在此所具体提及的化合物和试剂以外的那些一起配制。
如应理解，在给予多核苷酸的情形下，可将它们包装进病毒递送体系，该病毒体系可自身配制成在此所述的组合物。本发明所涉及领域的技术人员可理解具有在此所述的本发明性质的多种适合的病毒载体。然而，作为实例，可以使用逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒(AAV)。本发明所涉及领域的技术人员将容易地理解可用于实施本发明的此种载体的方法。然而，仅作为实例，逆转录病毒载体的使用报道于Miller等人，1993，Meth.Enzymol.217：581-599，和Boesen等人，1994，Biotherapy 6：291-302；腺病毒载体的使用报道于例如Kozarsky和Wilson，1993，CurrentOpinion in Genetics andDevelopment 3：499-503；Rosenfeld等人，1991，Science 252：431-434；Rosenfeld等人，1992，Cell68：143-155；Mastrangeli等人，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公开号WO94/12649；和Wang，等人，1995，GeneTherapy 2：775-783；而AAV的使用报道于Walsh等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；美国专利No.5,436,146。
根据所用给药模式以及所用的适当的药学赋形剂、稀释剂和/或运载体，本发明组合物可适于常规剂型例如溶液、可口服给予的液体、可注射的液体、片剂、包衣片剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、透皮贴剂、悬剂、乳剂、缓释制剂、凝胶、气雾剂、脂质体、粉剂和免疫脂质体。所选剂型将反映期望使用的给药模式、待治疗的病症以及所用试剂的性质。特别优选的剂型包括可口服给予的片剂、凝胶、丸剂、胶囊、半固体、粉剂、缓释制剂、悬剂、酏剂、 气雾剂、软膏或用于局部给药的溶液、以及可注射的液体。熟练技术人员将容易的理解适当的剂型和配制方法。通常，通过将特定试剂和成分相互接触或混合来制备组合物。然后，如果需要，将产物成型为想要的制剂。作为实例，配制组合物的某些方法可见于参考文献如Gennaro AR：Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第二十版，Lippincott，Williams&Wilkins，2000。
可以根据组合物类型，单位剂量大小，运载体、稀释剂和/或赋形剂的种类以及本领域普通技术人员公知的其它因素来广泛地改变本发明试剂在组合物中的量。总体上，最终的组合物可以包括按重量计(％w)，0.0001％至100％w的本发明的活性物，优选0.001％w至10％w，剩下的为存在的任何其它活性试剂和/或运载体、稀释剂和/或赋形剂。
治疗方法
尽管本发明人最初的研究涉及乳腺癌细胞，但预测Artemin和/或相关配体也作用于小肠和肾；以及心脏、前列腺、子宫、正常结肠、胃、皮肤、气管、脑、小脑、胎脑、脊髓、胎盘、脂肪组织、软骨；以及也作用于胸腺。具体地，预测这些配体作用于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌等。因此，本发明人考虑对于Artemin和/或相关配体的抑制可用于特征在于增加的或异常的细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的多种病症的治疗。
一个实施方式中，本发明涉及通过抑制Artemin和/或相关配体来预防、降低、或抑制细胞增殖、细胞存活和/或细胞运动性的方法。优选地，该方法用于治疗受试者中特征为异常的细胞增殖、细胞存活和/或细胞运动性的病症。这些异常表征可在受试者中的一种或多种细胞类型中发生并且可以包括转移性病症。特定的病症包括例如，癌症(例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺 癌、胃癌或肝癌)和子宫内膜异位。病症的实例包括癌症例如腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤、畸胎瘤和肾上腺、膀胱、骨、脑、乳腺、子宫颈、胆囊、神经节、胃肠道、食道、胃、肠、结肠、直肠、心脏、肾、肝、肺、骨髓、肌肉、生殖道、子宫、卵巢、阴茎、前列腺、胰脏、甲状旁腺、唾腺、皮肤、脾脏、睾丸、胸腺和甲状腺的癌症。
多种实施方式中，病症为乳腺、前列腺、结肠、肺、胰脏、子宫内膜或卵巢的上皮肿瘤，或者鳞状细胞癌，或黑素瘤或肾癌或肿瘤。对于乳腺癌，这些可以包括上皮肿瘤(例如来自细胞内层导管或小叶)或非上皮肿瘤(例如来自支撑基质)，例如血管肉瘤，原发间质肉瘤以及叶状肿瘤。乳腺癌也可以包括癌(carcinoma)如，原位癌以及侵袭性癌症。原位癌包括癌细胞在导管或小叶中的增殖而并没有基质组织的侵袭。原位小叶癌(LCIS)在任一乳房中包括可以指示增加的后继侵袭癌风险的不能触知的损害。在乳腺癌中，侵袭癌通常包括腺癌，该腺癌大多数包括浸润导管型癌而剩下的包括浸润小叶癌。乳腺癌的罕见形式包括髓样癌、粘液癌以及小管癌。乳腺癌病症也包括佩吉特乳头病以及转移性乳腺癌。
对于结肠癌，这通常可以包括结肠、直肠和/或肛门的癌症，并且尤其是腺癌，以及还有癌(例如鳞状泄殖腔源性癌)、黑素瘤、淋巴癌、和肉瘤。也包括表皮样(非角化型鳞状细胞或基底细胞样)癌。结肠癌可与特殊类型的息肉或其它损害相关，例如管状腺瘤、管绒毛状腺瘤(例如绒毛腺管状息肉)、绒毛状(例如乳头状)腺瘤(有或没有腺癌)、增生性息肉、错构瘤、幼年息肉、息肉样癌、假息肉、脂肪瘤或平滑肌瘤。该癌可与家庭性息肉病以及相关病症如加德纳综合症或普-杰二氏综合症相关。该癌可与例如慢性瘘、辐射的肛门皮肤、白斑、性病性淋巴肉芽肿、鲍文病(上皮内癌)、尖锐湿疣或人乳头瘤病毒相关。其它方面，该癌可与基底细胞癌、乳房外佩吉特病、泄殖腔源性癌或恶性黑色素瘤相关。
对于子宫内膜癌，这些可以包括腺癌以及浆液性乳头状癌、透明细胞、鳞状以及粘液癌。也包括癌前状态例如子宫内膜增生。子宫内膜癌可与肥胖、多囊卵巢综合症、未育、晚绝经、产生雌激素的肿瘤、停止排卵(排卵功能障碍)以及没有孕酮的雌激素疗法和遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)综合症中一种或多种相关。
本发明所涉及领域普通技术人员可容易地理解可应用本发明，尤其是关于在此提供的Artemin的表达的其它类型的病症。此外，考虑本发明的性质以及在此报道的结果，本发明所涉及领域的普通技术人员将理解本发明可用于多种不同动物。因此，诊断细胞治疗方法可以应用于任何目标动物。特别地，本发明可应用于哺乳动物，更特别地，人。
本发明所涉及领域的普通技术人员将理解用于抑制Artemin和/或相关配体的多种手段和试剂。作为实例，核酸技术包括iRNA、反义、和三链螺旋DNA可用于抑制表达。可使用针对于Artemin和/或相关配体的替代的抗体，或此种抗体的功能衍生物。在此详细地描述了示例性试剂。用于本发明的那些试剂将优选地展现一种或多种下述特性：1)预防、降低或抑制细胞生长的能力；2)预防、降低或抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的能力；3)预防、降低或抑制Artemin和/或相关配体的表达或活性的能力；4)预防、减少、降低或控制肿瘤转移的能力。优选地，适合的试剂将展现这些特性中的两种或更多种。
如在此所示，Artemin编码为在某些癌细胞中表达并且也由至少一种正常成人细胞子集表达的细胞因子。因此可以将Artemin和相关配体认作肿瘤相关抗原。根据在正常和癌细胞中表达和接触的差别，若干方法可以用于靶向这些配体(一般地，综述于Paul，Fundamental Immunology，1999，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，Chapter 37)。癌细胞可能以高得多的水平表达肿瘤相关抗原并且可以在治疗上利用正常和癌细胞之间的表达水 平的此种差别(参见例如Brown JP，等人，Quantitativeanalysisof melanoma-associated antigen p97 in norml andneoplastictissues.Proc Natl Acad Sci USA 1981；78：539-543)。由于抗原特异的效应细胞对于癌细胞比对正常细胞的接触更好，因此也可获得靶向。例如，由于不完整的糖基化(例如，在上皮粘蛋白的情形下)，在癌细胞上表达的这些抗原可能更可用于结合。对于癌细胞，增加的MHC分子表达可使肿瘤成为T细胞的直接靶标(参见例如Uyttenhove C等人，Theexpression of mouse gene P1A intestis does not prevent safe induction ofcytolytic T cellsagainst a P1A-encoded tumor antigen.Int J Cancer1997；70：349-356)。
涉及固有或获得性免疫的多种免疫治疗策略可以用于控制与Artemin和/或相关配体相关的癌症，包括(a)活菌疫苗(例如BCG)的局部应用；(b)细胞因子的使用；(c)针对Artemin的主动免疫；(d)用针对Artemin和/或相关配体的抗体的被动治疗；和(e)效应细胞(例如T细胞)的过继转移。针对Artemin和/或相关配体的主动免疫可以用抗Artemin和/或相关配体的鼠单克隆抗体诱导免疫应答或被动免疫。对于一般指导，参见例如RiethmüllerG等人，Monoclonal Antibody therapy for resected Dukes’Ccolorectal cancer：seven-year outcome of a multicenterrandomized trial.J Clin Oncol 1998；16：1788-1794；Riethmüller G等人，Randomized trial of monoclonal Antibodyforadjuvant therapy of resected Dukes’C colorectal carcinoma.German CancerAid 17-1A Study Group.Lancet1994；343：1177-1183；Herlyn DM等人，Inhibition ofgrowth ofcolorectal carcinoma in nude mice by monoclonal Antibody.Cancer Res1980；40：717-721。
对于免疫，纯抗原在诱导获得性(例如抗原特异的)免疫应答上通常无效，除非使用某些佐剂来刺激固有免疫性。因此，设计许多方法以通过使用化学和/或细菌试剂来刺激接种位点的固有免疫性。可以为特殊的MHC单倍型设计用于疫苗的合成肽(参见例如 ToesRE等人，Peptide vaccination can lead to enhanced tumorgrowth through specificT-cell tolerance induction.Proc NatlAcad Sci USA 1996；93：7855-7860)。可以将抗原肽加载到热激蛋白上(或作为重组病毒样颗粒)以增加免疫效力。通常，免疫应答的有效诱导需要在提供适当的辅助或二级信号的环境中的抗原呈递。
若干实验设计使用由病毒特异的或肿瘤相关肽所脉冲的树突状细胞以诱导肿瘤反应性T细胞和移植肿瘤细胞的排斥。可以用合成抗原肽或重组蛋白质来加载树突状细胞。树突状细胞也可以用下面的一种或多种加载：剥离自肿瘤细胞表面的天然肽；源自肿瘤的加载肽的热激蛋白；源自肿瘤的mRNA；或融合的肿瘤细胞(综述参见Shurin MR.Dendriticcells presenting tumor antigen.CancerImmunol Immunother 1996；43：158-164)。这些策略的一个优点在于可以向(独特的)单独的不同肿瘤抗原，以及肿瘤相关抗原诱导有力的免疫性。
对于Artemin和/或相关配体的抗原，可以使用牛痘、利斯塔氏菌属或病毒样颗粒来开发重组疫苗。其它方法中，可以使用遗传接种，例如通过肌内注射编码肿瘤抗原的裸露的DNA质粒构建体(参见例如Donnelly JJ，Ulmer JB，Liu MA.DNA vaccines.LifeSci1997；60：163-172)。也可使用GM-CSF以通过在注射位点的树突状细胞提高抗原呈递(参见例如Syrengelas AD，Chen TT，Levy R.DNAimmunization induces protectiveimmunity against B-celllymphoma.Nat Med 1996；2：1038-1041)。其它方法中，可以使用具有抗-独特型抗体的接种。
作为其他方法，可以使用被动抗体疗法或肿瘤特异的T细胞的过继转移。例如，由Artemin和/或相关配体的抗体的被动免疫可以保护对抗肿瘤细胞的攻击，并且在癌细胞攻击后不久给予可以是治疗性的(例如参见Riethmüller G等人，Monoclonal antibodytherapy for resected Dukes’C colorectal cancer：seven-yearoutcome of amulticenter randomized trial.J Clin Oncol1998；16：1788-1794；Riethmüller G等人，Randomized trial ofmonoclonal antibody for adjuvant therapy of resectedDukes’C colorectal carcinoma.German Cancer Aid 17-1A Study Group.Lancet 1994；343：1177-1183；Herlyn DM等人，Inhibition ofgrowth of colorectal carcinoma innude mice by monoclonalantibody.Cancer Res 1980；40：717-721)。
作为替代的方法，可以使用抗-独特型抗体治疗来诱导癌细胞进入长期休眠状态(参见例如Miller RA，Maloney DG，Warnke R，Levy R.TreaTMent of B-cell lymphomawith monoclonalanti-diotype antibody.N Engl J Med 1982；306：517-522)。此外，肿瘤细胞的抗体可以用作细胞因子或细胞毒性试剂(例如放射化学试剂或天然毒素)的运载体(参见例如Ghetie V，Vitetta E.Immunotoxins in the therapy of cancer：from benchto clinic.Pharmacol Ther 1994；63：209-234；Reisfeld RA，Gillies SD.Recombinantantibody fusion proteins for cancer immunotherapy.Curr Top Microbiol Immunol1996；213：27-53)。重组抗体-细胞因子或抗体-毒素融合蛋白可用于在围绕肿瘤细胞的基质中浓缩这些试剂。作为替代，可以改造双特异单克隆抗体以结合效应细胞以及癌细胞上的肿瘤抗原。也可以人源化单克隆抗体以降低患者对中和抗鼠抗体的刺激。作为另外的方法，T细胞的过继转移可以用于较长期建立的肿瘤负荷。已经从患者分离出的T细胞可以用IL-2体外扩充然后灌注到也接受了IL-2的患者中(参见例如Smith CA等人，Adoptiveimmunotherapy for Epstein-Barr virus-relatedlymphoma.Leuk Lymphoma 1996；23：213-220)。
可鉴于在此的本发明描述以及已知方法学来确定试剂抑制Artemin和/或相关配体的效力。例如，可通过观察试剂预防、降低 或抑制配体的表达或配体的一种或多种功能效果来确定它们的效力。作为特别的实例，可研究试剂对于细胞侵袭、细胞迁移、基因转录水平、以及应答Artemin和/或相关配体的基因中的一种或多种的影响。此种研究可在体外或体内进行。
下文在标题“实施例”下所描述的检测法可用于确定根据本发明的试剂的适合性。具体地，可以使用RT-PCR和Northern印迹来在mRNA水平检测表达，并且可以使用Western印迹和直接或间接免疫染色来检测蛋白质水平的表达。为了检测活性，可以使用基于细胞的检测法检测细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的。对于转移的抑制，可使用体内检测法，例如，描述于Fidler，I.J.(1973)Nat.New Biol.242，148 149；和PriceJ.E.Thebiology of cancer metastasis.Prog.Clin.Biol.Res.，354A：237-255，1990，或Kerbel R.S.What is the optimal rodent modelfor anti-tumor drug testing？CancerMetastasis Rev.，17：301-304，1998；Killion J.J.，Radinsky R.，FidlerI.J.Orthotopic models are necessary to predict therapy oftransplantabletumours in mice.Cancer Metastasis Rev.，17：279-284，1998；和Price J.E.Analyzingthe metastaticphenotype.J.Cell.Biochem.，56：16-22，1994。
给药途径/方案
本发明考虑通过能够向受使者身体内的靶位点递送期望的活性(例如抑制Artemin和/或相关配体)的任何手段对任何本发明试剂或组合物的给药。靶位点可为身体内可具有病症或者易于患有病症的任何位点，并且可包括一种或多种细胞、组织或特定肿瘤。例如，给药可以包括非经肠道给药途径、全身给药途径、口服和局部给药。给药可通过注射、皮下、眶内、眼部、脊柱内、脑池内、局部、灌注(使用例如，缓释装置或微泵如渗透泵或皮肤贴片)、植 入、气雾剂、吸入、划痕法、腹膜内、囊内、肌内、瘤内、鼻内、口服、含服、透皮、肺部、直肠或阴道递送的方式。应理解，所选择的给药途径可取决于受试者身体内的靶位点位置，以及所用试剂(例如肽、多肽、多核苷酸或抗体)或组合物的性质。
具体实施方式中，在多核苷酸的情形下，例如可通过使用缺陷性或者减毒性反转录或其它病毒载体的转染(参见例如美国专利No.4,980,286)，或者通过裸露DNA的直接注射，或者通过微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，DuPont)的使用；通过用脂或细胞表面受体或转染试剂的包覆；脂质体、微粒或微胶囊的包封；通过与已知进入核的肽的连接；或者通过与接受受体介导的内吞作用的配体的连接而给予(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可以用于靶向特异表达受体的细胞类型)等来给予它们。此外，可以形成核酸-配体复合体，其中配体包括病毒融合肽以分裂核内体，使得核酸分子避免溶酶体降解。
又另一实施方式，可以通过靶向特异受体，例如按1992年4月16日的WO 92/06180(Wu等人)；1992年12月23日的WO 92/22635(Wilson等人)；1992年11月26日的WO 92/20316(Findeis等人)；1993年7月22日的WO 93/14188(Clarke等人)；和1993年10月14日的WO 93/20221(Young)所述的方法体内靶向多核苷酸用于细胞特异的摄取和表达。或者，可以细胞内导入多核苷酸并且通过同源重组(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature 342：435-438)将其整合到宿主细胞DNA中用于表达。出于本发明的目的而可以导入多核苷酸的细胞包括任何想要的、可获得的细胞类型。适当的细胞类型将取决于待治疗的病症的性质。然而，作为实例，多核苷酸可以导入癌细胞。
如应理解，可根据如待治疗的病症的性质、受试者症状的严重性、待治疗的任何肿瘤的大小、待治疗的靶位点、所选择的给药模 式、以及受试者的年龄、性别和/或总体健康的变量，给予的试剂或组合物的剂量、给药周期、以及总体给药方案在受试者之间可有所不同。本发明所涉及领域普通技术人员考虑此种因素而将容易地理解或者能够确定适合的给药方案。应理解给药可包括单独的每日剂量或者许多不连续的分份剂量的给药也可能是合适的。本发明人也考虑了组合不同给药模式或途径的给药方案。例如，可以组合瘤内注射及全身给药。
应理解本发明方法可包括其他步骤，例如考虑到待治疗的状况，可有益于受试者的其它试剂或组合物的给药。例如，可以给予其它用于治疗增殖性病症的试剂(例如上述抗肿瘤试剂)。应理解此种其它试剂和组合物可与本发明的试剂和组合物同时给予，或者按顺序方式给予。例如，可以在本发明试剂或组合物给药之前或之后给予该其它试剂或组合物。应理解涉及在按顺序递送试剂或组合物时，尽管可能优选在给予一种试剂或组合物后立即顺序给予另一种，但这并不必须立即发生。在试剂或组合物递送之间可以有时间延迟。延迟期将取决于诸如待治疗的状况以及所递送的组合物或试剂的性质的因素。然而，作为实例，本发明人考虑几小时到几天或几个月的时间。
诊断方法和组合物
一个实施方式中，本发明涉及一种或多种本发明的试剂在诊断与细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性相关的病症的方法中的应用。优选地，该方法用于特征为受试者中异常细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的病症的诊断。这一异常细胞生长和/或增殖可发生于受试者的一种或多种细胞类型中并且可以包括转移性的或其它病症。这些病症可以包括，例如癌症(例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌)和子宫内膜异位。在此详细描述示例性的病症。
根据本发明，特异结合Artemin和/或相关配体的抗体可用于涉及改变的表达的状况或病症的诊断，或者用于监控待用这些配体中的一种或多种的抑制物治疗的患者的检测法。可以以与上述那些相同的方式来制备用于诊断目的的抗体。诊断检测法包括利用抗体或标记以检测人类体液或者细胞或组织提取物中的相应肽或多肽的方法。抗体可经修饰或不经修饰而使用，并且可通过将它们共价或非共价地与报告分子相连接而标记。可使用本领域已知的多种报告分子，在此描述它们中的一些。
多种方法包括ELISA、RIA和FACS是本领域已知的并且提供诊断改变的或异常的Artemin和/或相关配体的表达水平的基础。通过将取自正常哺乳动物受试者(优选人)的体液或细胞提取物与抗体在适于复合体形成的条件下结合而建立用于表达的正常或标准值。可通过多种方法，但优选通过光度测量手段来量化标准复合体形成的量。将受试者、对照以及疾病、活组织检查组织的样品中表达的量与标准值相比较。标准值与受试者值之间的偏差建立了用于诊断病症的参数。
本发明的另一实施方式中，用于Artemin或相关配体的多核苷酸可用于诊断目的。可使用的多核苷酸包括寡核苷酸、互补RNA和DNA分子、以及PNA。多核苷酸可用于检测和量化其中的表达可能与病症相关的活组织检查组织中的基因表达。诊断检测法可用于区别表达的存在、不存在以及改变，以及用于监控治疗干涉期间的水平调控。
一方面，可以使用能够检测用于Artemin或相关配体的多核苷酸序列(包括基因组序列和紧密相关的分子)的探针或引物(例如PCR引物)进行核酸杂交。探针或引物(是由高度特异区如5’调控区中的10个独特核苷酸，还是较少特异区如尤其是3’编码区所制成)的特异性，以及杂交或扩增的严谨性(最大、高、中或低)将决定该探针或引物是否只鉴定天然发生的序列、等位基因或相关序列。 探针和引物也可用于相关序列的检测，并且应优选含有至少50％来自任何天然序列的核苷酸。本发明的杂交探针可为DNA或RNA并且可源自本发明的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：35至171，或互补体、或SEQ ID NO：35至171的修饰序列，或源自包括启动子、增强子元件、以及天然发生的序列的内含子的基因组序列。
生产用于Artemin或相关配体的DNA的特异性杂交探针的手段包括将核酸序列或修饰序列克隆到载体中用于mRNA探针的生产。此种载体是本领域已知的，市售可得的，并且可用于通过添加适当的RNA聚合酶和适当的标记核苷酸来体外合成RNA探针。杂交探针可由多种报告基团标记，例如放射性核素如32P或35S，或者酶促标记如通过亲和素/生物素偶联体系偶联探针的碱性磷酸酶，等。
用于Artemin或相关配体的多核苷酸序列可用于与增加的或减少的表达相关的病症的诊断。多核苷酸序列可用于Southern或Northern分析；点印迹或其它基于膜的技术；PCR技术；或试纸条(dipstick)，针(pin)，ELISA检测法；或利用来自患者活组织检查的体液或组织的微阵列以检测改变的表达。此种定性或定量方法是本领域公知的。
特别方面，用于Artemin或相关配体的核苷酸序列可用于检测多种癌症(尤其是上面提及的那些)的活化或诱导的检测法。核苷酸序列可用标准方法标记，并在适于杂交复合体形成的条件下加入患者的体液或组织样品。适当的孵育期后，洗涤样品并将信号量化并与标准值相比较。如果在活组织检查或提取的样品中的信号量与可比较的对照样品的信号量有显著改变，那么核苷酸序列与样品中的核苷酸序列杂交，并且样品中改变的核苷酸序列水平的存在指示相关病症的存在。此检测也可用于评估在动物研究、临床试验中的特殊治疗性治疗方案的效力，或用于监控单个患者的治疗。
为了提供对于与Artemin和/或相关配体的表达相关的病症诊断的基础，建立了用于表达的正常或标准谱。这可通过将取自正常受 试者(动物或人)的体液或细胞提取物与用于Artemin或相关配体的序列或其修饰在适于杂交或扩增的条件下结合而实现。可通过将获自正常受试者的值与来自使用基本上纯化的多核苷酸的已知量的实验的那些值相比较而量化标准杂交。可将获自正常样品的标准值与获自有病症症状的患者的样品值相比较。使用标准和本发明之间的偏差建立病症的存在。
一旦诊断出病症并且开始治疗方案，可在常规基础上重复杂交检测以评估患者中的表达水平是否开始接近在正常患者中观察到的水平。获自连续检测的结果可用于显示在几天到几月的范围期间的治疗效力。对于癌症，来自个体的活组织检查组织中的转录本的相对高的量的存在可表示对于病症发展的倾向(predisposition)，或者可提供在实际临床症状出现前检测病症的手段。这一类型的更确定的诊断可允许健康专家更早地使用预防性措施或积极的治疗从而预防癌症的产生或进一步进展。
本发明寡核苷酸的其它诊断应用可涉及PCR的使用。此种寡聚物可为化学合成的、酶促产生的或者体外生产的。寡聚物将优选地由两条核苷酸序列组成，一条为有义方向(5’→3’)而另一条为反义方向(3’→5’)，在用于特异基因或状况鉴定的最适条件下使用。可在较不严谨的条件下使用相同的两种寡聚物，嵌套式寡聚物套或者甚至是寡聚物的简并集合用于紧密相关的DNA或RNA序列的检测和/或量化。
也可用于量化Artemin或相关配体的表达的方法包括放射标记或生物素化的核苷酸，对照核苷酸的共扩增，以及填入实验结果的标准曲线(Melby，P.C.等人，(1993)J.Immunol.Methods，159：235-244；Duplaa，C.等人，(1993)Anal.Biochem.229-236)。可通过进行ELISA形式的检测法加速多种样品的量化速度，在该检测中，目的寡聚物以多种稀释存在并且分光光度计或比色反应给出快速量化。
其他实施方式中，源自在此所述的任何多核苷酸序列的寡核苷酸或较长片段可用作微阵列中的靶标。该微阵列可以用于同时监控大量基因的表达水平(例如产生转录本图像)，并且鉴定遗传性变型、突变和多态性。这一信息可用于确定基因功能、理解病症的遗传基础、诊断病症以及显示和监控治疗剂的活性。一个实施方式中，根据本领域已知的方法例如PCT申请WO 95/11995(Chee等人)，Lockhart，D.J.等人，(1996；Nat.Biotech.14：1675-1680)和Schena，M.等人(1996；Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619)中描述的那些来制备并使用微阵列。
微阵列优选由大量固定到固体支撑物上的独特的、单链核酸序列(通常是合成的反义寡核苷酸或cDNA的片段)所构成。寡核苷酸优选长度约6至60个核苷酸，更优选长度约15至30个核苷酸，并且最优选长度约20-25个核苷酸。对于某些类型的微阵列，可优选使用长度为7至10个核苷酸的寡核苷酸。微阵列可含有涵盖已知的5’或3’序列的寡核苷酸，或者可含有涵盖全长序列的顺序寡核苷酸；或者选自沿序列长度的特殊区域的独特的寡核苷酸。
用于微阵列的多核苷酸可为对于目的基因特异性的寡核苷酸，该目的基因至少序列的一片段是已知的或者对于一种或多种未鉴定的cDNA特异的，该cDNA对于特殊细胞或组织类型或者对于正常的、发展的或疾病的状态是常见的。某些情势下，可能适合在微阵列上使用寡核苷酸对。除了优选地位于序列中心的一个核苷酸，该寡核苷酸对将是相同的。该对中的第二个寡核苷酸(有一个错配)用作对照。寡核苷酸对的数量可在1至1,000,000的范围。
为了产生用于已知序列的寡核苷酸用于微阵列，使用计算机算法检查目的基因，该算法开始于核苷酸序列的5’或更优选地3’端。该算法鉴定对于基因独特的限定长度的寡聚物，具有适于杂交的范围内的GC含量，以及缺乏可能干涉杂交的预测二级结构。一方面，使用光引导化学方法在底物的指定区域合成寡聚物。底物可为纸、 尼龙或任何其它类型的膜、过滤器、芯片、载玻片或任何其它适合的固体支撑物。
一方面，可使用化学偶联方法和ink jet应用装置，例如PCT申请WO 95/251116(Baldeschweiler等人)所述在底物表面合成寡核苷酸。另一方面，使用真空体系、热、UV、机械或化学结合方法，点或狭线印迹的网格阵列类似物(例如HYBRIDOT装置，LifeTechnologies)可用于将cDNA片段或寡核苷酸排列并连接至底物表面。又另一方面，阵列可手工或使用可获得的设备、材料和仪器(包括多通道移液器或机器人设备；Brinkmann，Westbury，NY)生产并可包括约8、24、96、384、1536或6144个寡核苷酸，或从2至1,000,000的任何其它倍数，这使其有效地用于市售可得的仪器。
为了使用微阵列构建样品分析，从生物样品提取多核苷酸。生物样品可获自任何体液(例如血液、尿、唾液、粘痰、胃液等)、培养的细胞、活组织检查或其它组织制剂。为了生产探针，使用从样品提取的多核苷酸来生产与微阵列上的寡核苷酸互补的核酸序列。如果微阵列由cDNA组成，那么反义RNA是合适的探针。因此，一方面，使用mRNA来生产cDNA，而该cDNA再在荧光核苷酸存在下，用于生产反义RNA探针的片段或寡核苷酸。这些荧光标记的探针与微阵列一起孵育以便探针序列与微阵列的cDNA寡核苷酸杂交。另一方面，用作探针的核酸序列可以包括使用杂交技术领域公知的限制性酶、PCR技术以及oligolabeling试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)生产的多核苷酸、片段和互补或反义序列。
调整孵育条件以便以精确的互补匹配或者多种程度的较少互补性来发生杂交。除去未杂交的探针后，使用扫描仪来确定荧光的水平和图样。检查经扫描的图像以确定互补性程度和微阵列上每种寡核苷酸序列的相对丰度。检测系统可用于同时测量所有的不同序列的杂交存在与否以及量。这一数据可用于样品间序列、突变、变体 或多态性的大规模相关性研究或功能分析(Heller，R.A.等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：2150-55)。
本发明的另一实施方式中，本发明的核酸序列可用于产生用于为天然发生的基因组序列作图的杂交探针。可将该序列定位到特定染色体上、染色体的具体区域，或者人工染色体构建体，例如人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、细菌P1构建体或单染色体cDNA文库(例如Price，C.M.(1993)Blood Rev.7：127-134；Trask，B.J.(1991)Trends Genet.7：149-154)。
荧光原位杂交(FISH，描述于例如Verma等人，(1988)HumanChromosomes：A Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，NewYork，NY)可与其它物理染色体作图技术和遗传图谱数据相关联。遗传图谱数据的实例可见于多种科学杂志或OnlineMendelianInheritance in Man(OMIM)站点。Artemin或相关配体的基因在物理染色体图谱上的位置和特定病症之间，或者和对特定病症的倾向之间的相关性可以帮助界定与该病症相关的DNA的区域。本发明的核苷酸序列可用于检测正常、携带者和受影响的个体之间基因序列的差异。
染色体制剂的原位杂交和物理作图技术、使用已建立的染色体标记的连锁分析可用于扩展遗传图谱。通常，另一哺乳动物种类(例如鼠)的染色体上的基因布局可揭示相关标记，即使具体的人染色体臂的数量是未知的。可以通过物理作图将新的序列分配到染色体臂，或其部分上。这为调查者使用定位克隆或其它基因发现技术寻找疾病基因提供了有价值的信息。一旦通过遗传连锁粗略地将病症定位到特定遗传区域，例如AT至11q22-23(例如Gatti，R.A.等人，(1988)Nature 336：577-580)，则定位到该区域的任何序列可显示为相关或调控基因用于进一步调查。本发明的核苷酸序列还可用于检测正常、携带者和受影响的个体之间由于易位、倒位等 所造成的染色体定位的差异。
另一实施方式中，本发明的抗体可用于基于免疫组织化学的应用。根据标准免疫组织化学技术，可以自目的组织获取薄层切片(例如约4-40μm)，或者可以整体使用组织。可以通过使用显微切片机实现切片，并且可以将切片固封到载玻片上。然后可以处理组织以使细胞膜破裂，例如使用去垢剂如Triton X-100。也可以使用其它的暴露步骤，以及阻断步骤以使非特异性结合最小化。对于直接免疫组织化学，使用目的标记抗体(例如FITC缀合的抗血清)结合组织切片中的抗原。对于间接免疫组织化学，使用未标记的一抗结合组织抗原，而使用标记的二级抗体与该一抗反应。
本发明的另一实施方式中，Artemin或相关配体，或其功能或免疫原性片段或修饰可以用于以多种药物筛选技术中的任一种来筛选化合物文库。此种筛选中使用的片段可在溶液中游离、附着到固体支撑物、负载到细胞表面上、或者在细胞内定位。可测量多肽或肽与被检测试剂之间的结合复合体的形成。其他实施方式中，可使用竞争性药物筛选检测法，该检测法中能够结合Artemin或相关配体的中和抗体特异地与用于结合多肽或肽的检测化合物相竞争。以这一相同方式，抗体可以用于检测任何与Artemin和/或相关配体共有一个或多个抗原决定簇的氨基酸序列的存在。
可用于提供高通量筛选对目的蛋白质具有适当的结合亲和性的化合物的药物筛选的其它技术如WO 84/03564所描述。这一方法中，用于Artemin或相关配体时，在固体支撑物(例如塑针或一些其它表面)上合成大量不同的小检测化合物。检测化合物与多肽或其修饰反应并洗涤。然后用本领域公知的方法检测结合的多肽或肽。也可以将纯化的多肽或肽直接涂覆到板上用于前述药物筛选技术。或者，可以使用非中和抗体来捕获多肽或其修饰，并将其固定化到固体支撑物上。
其它实施方式中，用于Artemin或相关配体的核苷酸序列可用 于任何仍待发展的分子生物学技术，只要该新技术依赖于目前已知的核苷酸序列的特性，包括但不限于如三联遗传密码和特异碱基对相互作用的特性。
用于治疗或诊断的试剂盒
本发明的试剂和组合物可用于适于控制或抑制Artemin和/或相关配体，或用于在此限定的病症的治疗的试剂盒。其它方面，该试剂和组合物可用于诊断试剂盒。试剂盒可以在适当容器中包括至少一种本发明的试剂。试剂可配制为适于直接向受试者给药，例如作为试剂或药学组合物。或者，试剂盒可包括在一个容器中的一种或多种试剂以及在另一容器中的药学稀释剂、运载体和/或赋形剂；每个容器中的内容物在给药前混合。作为特殊应用可能需要的，试剂盒也可包括在其他单独的容器中的其它试剂和组合物。任何适于存储和/或给予试剂或组合物的容器可用于本发明的试剂盒。本领域技术人员将理解适合的容器。作为实例，此种容器包括小瓶和注射器。容器可适当地灭菌和密封。此外，本发明的试剂盒也可以包括用于该试剂盒的组分的使用及给药的说明书。参考下面的实施例来进一步阐明本发明。
实施例
在此描述的实施例是出于说明本发明实施方式的目的。其它的实施方式、方法和分析类型在分子诊断领域普通技术人员技能的范围内并且不需在此详细说明。认为本领域范围内的其它实施方式是本发明的一部分。
实施例1：材料和方法
细胞培养
所有用于肺癌(A549)、胃癌(AGS)、结肠癌(Colo320DM和 DLD-1)、前列腺癌(DU145和PC 3)、胰腺癌(BxPC3)、子宫内膜癌(RL95-2和AN3)、乳腺癌(MCF-7、T47D、BT549和MDA-231)以及肝癌(HepG2)的癌细胞系都获自ATCC。所有细胞都在推荐条件下培养，除了MCF-7细胞系在补充了10％的热灭活胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mML-谷氨酸的RPMI1640培养基中，于37℃在5％CO2的保湿培养箱中培养。
质粒构建体
为了构建Artemin表达质粒，将含有来自IMAGE cDNA克隆5453642的人Artemin转录本变体4(NM_057090)编码序列的BamHI和BglII片段在BglII位点亚克隆到pCMV6-XL4。生成的质粒命名为pCMV6-XL4-ARTN。为了构建稳定转染的Artemin表达载体，将两种寡聚物5’-atcGCCGCCACCATGGaacttggacttggaggcctctccacgctgtcccactgcccctggc-3’(正向，大写字母为Kozak序列；SEQ ID NO：48)和5’-ctaggccaggggcagtgggacagcgtggagaggcctccaagtccaagttccatggcggcggcgat-3’(反向；SEQID NO：49)退火形成在其5’末端具有Kozak序列而在其3’末端具有AvrII突出的人Artemin的5’序列。这些退火的寡聚物与从pCMV6-XL4-ARTN释放的AvrII/AgeI片段(含有剩下的人Artemin编码序列)一起使用，用于克隆到pIRESneo3载体EcoRV和AgeI位点之间。生成的质粒命名为pIRESneo3-ARTN。
对于瞬时转染，将pIRESneo3-ARTN的EcoRV/EcoRI片段亚克隆到pCMV载体中获得pCMV-ARTN。为了显现siRNA的敲除效力，将Artemin cDNA插入EGFP表达载体质粒的3’UTR中。简言之，含有Artemin全长cDNA的EcoRI/KpnI片段从pCMV6-XL4-ARTN释放并且亚克隆到填平了插入物和载体的EcoRI位点后的pEGFP-C1载体的EcoRI/KpnI位点之间。在将两个填平的EcoRI末端连接后产生终止密码子，以便只有EGFP与位于3’-UTR中的Artemin序列一同表达。 出于简便，这一质粒命名为pEGFP-ARTN。
为了设计靶向Artemin的siRNA寡核苷酸，将DNA序列AA(N19)选为AACTGGCCTGTACTCACTCAT(SEQ ID NO：45)。这一序列对于所有四种Artemin转录本变体都是共同的。针对人基因组序列的BLAST检索显示只有Artemin基因将会被靶向。根据制造商说明书，将一对寡核苷酸5’-gatccgctggcctgtactcactcatttcaagagaatgagtgagtacaggccagttttttggaaa-3’(正向；SEQ ID NO：50)和5’-agcttttccaaaaaactggcctgtactcactcattctcttgaaatgagtgagtca ggccagcg-3’(反向；SEQ ID NO：51)克隆到pSilencer 2.1-U6潮霉素(hygro)载体(Ambion)。生成的质粒命名为pSilencer-ARTN。作为阴性对照，pSilencer-CK用作编码与人基因组序列没有明显序列相似性的siRNA(Ambion)。
使用来自Amersham Biosciences的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因融合系统在大肠杆菌中生产重组Artemin蛋白。将编码113个氨基酸的成熟的C末端肽的人Artemin cDNA片段克隆到pGEX-4T1载体(Amersham Biosciences)的5’BamHI和3’EcoRI识别位点之间以产生质粒pGEX-4T1-ARTN。这用于在大肠杆菌中表达GST融合蛋白。
将pGEX-4T1-ARTN的BamHI片段与N-末端His标记编码序列按读框亚克隆到pQE30载体(Qiagen)中。生成的构建体pQE30-ARTN编码MRGSHHHHHHGS(SEQ ID NO：33)的N末端肽，其后为包括113个氨基酸的成熟Artemin蛋白质。对于每个构建体，通过DNA测序验证插入物。
表达Artemin的稳定细胞系的建立
使用Saint-Mix转染试剂(Synvolux Therapeutics B.V.，Netherlands)用pIRESneo3-ARTN质粒稳定地转染细胞。作为对 照，用空载体pIRESneo3稳定地转染细胞。通过在培养基中加入G418(Bio-Rad Laboratories，CA)来选择细胞克隆。转染的细胞系生成阳性细胞克隆池。通过RT-PCR和Western印迹来确认在建立的稳定克隆中的Artemin的过表达。
通过基于质粒的siRNA建立Artemin耗尽的细胞系
为了检验Artemin特异性siRNA的效力，使用编码靶向Artemin转录本的siRNA的pSilencer-ARTN质粒或阴性对照siRNA质粒pSilencer-CK，以及pEGFP-C1载体(EGFP)或在EGFP编码序列的3’UTR内插入了Artemin cDNA的pEGFP-ARTN质粒一起进行检测。质粒瞬时共转染MCF-7细胞。转染24h后，用UV可见荧光显微镜显现EGFP的表达。
为了建立Artemin耗尽细胞系，将pSilencer-ARTN质粒或pSilencer-CK质粒稳定转染细胞。通过向培养基中加入潮霉素来选择细胞克隆。转染的细胞系生成阳性细胞克隆池。通过RT-PCR和Western印迹来确认在稳定克隆中的Artemin的表达。
总RNA的制备
根据制造商的说明书，用Trizol试剂(Invitrogen)以1ml/10cm2从培养的细胞分离总RNA。RNA重悬浮于焦碳酸二乙酯处理的不含核酸酶的水中。进一步用DNase I在37℃处理RNA样品30min。通过加入25mM EDTA并在65℃孵育15min来终止反应。然后通过在苯酚/氯仿(pH 5.2，苯酚∶氯仿∶异丙醇为25∶24∶1)中提取随后再次的氯仿提取以及乙醇沉淀来纯化RNA样品。通过A260/A280吸收值来评估RNA的量化和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的质量。将A260/A280比率大于1.6的RNA样品保存于-80℃用于进一步分析。
反转录-PCR
使用基因特异引物(表1，见下面)，用一步反转录(RT)-PCR试剂盒(Qiagen)来确定GDNF配体(Artemin和Persephin)、GFRα1-4和RET的存在。对于RT-PCR，使用下面的程序。开始，将1μg总RNA稀释为0.1μg/μl以使样品处理的变动最小。用DNase I对这一稀释液处理15min，然后通过加入EDTA至5M并加热至70℃持续15min来使Dnase失活。然后将DNase-处理的RNA与核心混合液(master cocktail)混合至终体积为50μl，该核心混合液以制造商建议的浓度含有RT-PCR缓冲液、有义和反义引物、dNTP、RNase抑制物、含反转录酶(Ommiscript和Sensicript)和HotStart TaqDNA聚合酶的酶混合物。
温度循环方法包括：50℃反转录反应60min，随后是95℃的变性和HotStart DNA聚合酶活化15min，以及95℃20sec，54-62℃30sec和72℃1min的PCR扩增30个循环。在循环最后进行72℃最终延伸5min。类似地，使用0.2μg总RNA作为内部对照通过RT-PCR扩增β-肌动蛋白。10微升每种RT-PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离。通过大小、限制性酶切以及DNA测序来鉴定RT-PCR产物。
mRNA表达检测
对于mRNA表达研究，通过用Artemin特异引物的PCR筛选来自多种人组织的由10ng第一链cDNA组成的cDNA组(表1，参见下面)。按制造商的推荐，人β-2-微球蛋白基因用作cDNA输入对照。也通过RT-PCR来确定Artemin在多种癌细胞系的表达。细胞系包括A549人肺癌细胞；AGS人胃癌细胞；Colo320DM和DLD-1结肠神经内分泌癌细胞；DU145和PC3人前列腺癌细胞；BxPC3胰腺癌；RL95-2子宫内膜癌细胞；HepG2人肝癌细胞；和T47D、BT459、MCF-7及MDA-231人乳腺癌细胞。
免疫印迹
用冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次并在裂解缓冲液(20mM Tris HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％ X-100，1％Nonidet P-40，1μg/ml蛋白酶抑制物混合液(GE Healthcare)和0.1mM PMSF)中4℃裂解。随后对裂解物超声处理并通过4℃以15,000×g离心15min使其澄清。向每种样品中加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)样品缓冲液(50mM TrisHCl，pH 6.8；2％SDS；2％β-巯基乙醇和溴酚蓝)并煮沸该样品5min。样品使用标准电印迹方法进行12.5％分离胶的不连续SDS-PAGE并转移到硝酸纤维素膜(HybondTM C-extra)上。用有0.1％ 20的5％脱脂乳的PBS(PBST)在室温封闭膜1h。然后于4℃用一抗在含有1％脱脂乳的PBST中免疫标记该印迹。
用适当的二级抗体室温孵育后，按照制造商所述，通过ECLplusTM化学发光检测免疫标记。剥离印迹并用抗β-肌动蛋白的单克隆抗体再次进行探针检测(reprobe)以保证细胞裂解物蛋白质的均等上样。通过在50℃于含有62.5mM Tris HCl，pH 6.7；2％SDS；和0.7％β-巯基乙醇的溶液中孵育30min来剥离印迹。然后经若干次换液用PBST室温洗涤印迹30min。通过将膜再次暴露于ECLplusTM来确定剥离的效率。此后，按上述重新封闭印迹并免疫标记。
细胞数量检测
在3ml含有10％或0.2％FBS的完全RPMI培养基中以每孔5×104个细胞的密度将细胞接种到6-孔板上，3个重复。在这些条件下培养细胞高达10天，其间每隔一天更换培养基直到收获。为了比较细胞增殖速率，每2天用血球计数器量化每孔中的总细胞数。使用台盼蓝来评估细胞存活力。
细胞增殖检测
使用MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四氮唑)检测法来测量细胞增殖。将细胞以5×103细胞/孔的浓度接种到100μl含有10％FBS的RPMI-1640培养物培养基的96孔平底组织培养微板中。在检测日，将10μl的MTT标记试剂以终浓度0.5mg/ml加入每孔并且细胞在孵育器中标记5h。孵育期最后，除去培养基并且用100μl溶解溶液(10％SDS水中0.01N HCl)使转化的染料溶解。然后密封板并在37℃过夜放置以完全溶解紫色甲臜(formazan)晶体。使用Spectra Max 250多板读取器在570nm的波长处测量转换的染料的吸收值，用650nm的读数进行背景扣除。每种处理进行至少3个重复。
按照制造商说明书，通过使用BrdU染色试剂盒(Zymed)的溴脱氧尿苷(BrdU)掺入来测量细胞周期动力学。简言之，将细胞接种到完全培养基的6-孔板的玻璃盖玻片上过夜孵育，而后在无血清培养基中血清饥饿18小时。然后将细胞以在无血清培养基中10μM的浓度用BrdU脉冲标记45min。固定、变性和封闭后，用生物素化抗BrdU小鼠单克隆抗体孵育细胞。然后用链亲和素过氧化酶孵育细胞，随后用二氨基联苯胺(DAB)生色团溶液孵育以在过氧化氢存在下生色。用苏木精对细胞核复染色。将具有深棕色核着色的细胞计数为BrdU标记的细胞。对于量化，通过显微照相来记录每个盖玻片的10个随机视野(放大40×)。计算BrdU阳性细胞核相对于细胞核总数的百分数。计数每个盖玻片的至少500个细胞。
细胞凋亡检测
将细胞接种到6孔板上并无血清培养24h。多种方法用于检测细胞凋亡。一组实验中，用亲核(karyophilic)Hoechst 33258通过细胞DNA染色模式的荧光显微分析来测量凋亡的细胞死亡(Del，B. G.，Z.Darzynkiewicz，C.Degraef，R.Mosselmans，D.Fokan和P.Galand.1999.Comparison of methods based on annexin-Vbinding，DNA content orTUNEL for evaluating cell death inHL-60 and adherent MCF-7 cells.CellProlif.32：25-37)。简言之，细胞用4％多聚甲醛固定，用0.6％ 20可渗透化处理和Hoechst 33258(1∶10,000；Molecular Probes，Eugene，OR)室温染色5min。PBS洗涤后，在UV可见荧光显微镜下以40×物镜检查核形态学。将具有凋亡的核特征如核浓缩和断裂的细胞记作凋亡的。
第二组实验中，根据制造商的说明书，使用膜联蛋白V-FLUOS染色试剂盒(RocheApplied Science)，用荧光素异硫氰酸酯缀合的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)来染色凋亡细胞。在荧光显微镜下分析样品的磷脂酰丝氨酸(PS)外化。膜联蛋白V和PI的组合染色用于测定早期以及晚期凋亡。当细胞为膜联蛋白V-阳性而PI阴性时，该细胞被认作早期凋亡，而当细胞为V-和PI-阳性时，该细胞被认作晚期凋亡。对于每种处理，检查200-300个细胞。
失巢凋亡(Anoikis)检测
根据Folkman和Moscona报导的方法(Folkman，J.and Moscona，A.(1978).Role ofcell shape in growth control.Nature 278，345-349)，用聚-HEMA膜包被常规细胞培养6孔板。简言之，将95％乙醇中10mg/ml聚HEMA溶液过夜混合。这在800×g离心以除去未溶解的颗粒。生成的溶液放入培养板中，并且在组织培养箱中干燥。重复一次。使用前，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤经包被的板两次。
对于悬浮培养，对常规塑料组织培养瓶上的接近汇合的细胞进行胰蛋白酶化以产生单细胞悬浮液。通过加入10％FBS使胰蛋白酶失活。然后计数经胰蛋白酶化的细胞并以每孔50,000细胞的密度接 种在2ml生长培养基中的用聚HEMA包被的6孔板中。每隔一天向细胞饲以1ml新鲜培养基。在指示的那天，通过移液收集细胞，用PBS洗涤，并用胰蛋白酶处理以移去细胞团块。使用台盼蓝排除方法在血细胞计数器上计数活细胞。
检测集落形成的软琼脂检测法
对于软琼脂集落形成检测，在首先覆盖有一层琼脂(0.5％)的6孔板中培养细胞。细胞在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中生长。中层包括在含有10％FBS的0.35％琼脂中的RPMI 1640培养基中的5×103细胞。加入培养基作为顶层以防止琼脂糖凝胶干燥。该板于37℃在保湿培养箱中孵育14天。这以后，细胞用0.5ml在蒸馏水中的0.005％结晶紫染色1h并在水中脱色2h。检查集落并照相。
软琼脂生长检测法
为了进行软琼脂集落形成检测，将50μl在含有血清的0.5％琼脂糖培养基铺到96孔平底微板的每个孔中作为基底琼脂层。接下来，将在100μl的含血清培养基中0.35％琼脂糖的混合物中的5×103个细胞铺板到基底层上。随后，加入100μl培养基以防止琼脂糖凝胶干燥。对于抗体处理，将所指示浓度的抗体加入到琼脂顶层和培养基中以保证细胞对抗体的完全接触。于37℃在保湿培养箱中孵育该板。每隔3天更换包括抗体的上层培养基。10天后，将20μl的5mg/ml MTT(Sigma Chemical Company，St Louis，MO，USA)加入每孔并于37℃孵育4小时，随后加入100μl酸化裂解缓冲液(10％SDS中的0.01％HCl)。于42℃孵育该板以保证均匀混合。简短摇动该板然后使用SynergyTM 2 Multi-Mode Microplate Reader(BioTek instruments，Inc.，Vermont，USA)在595nm(检验波长)和690nm(参考波长)下读数。
伤口愈合检测
对于体外伤口愈合检测，细胞在常规细胞培养盘上以单层生长直到汇合。用灭菌枪头在汇合层中制造4-mm刮伤。用PBS洗涤3次而除去移位的细胞并且在新鲜培养基中洗剩下的细胞。每天替换培养基。定期为伤口边缘照相。
细胞迁移和侵袭
使用含有聚碳酸酯膜(组织培养物处理的，直径6.5mm，厚度10μm，孔8μm，Costar，Cambridge，MA)的改良的博伊登室，按前述(Doerr，M.E.和J.I.Jones.1996.The rolesof integrins and extracellular matrix proteins intheinsulin-like growth factor I-stimulated chemotaxis of humanbreast cancercells.J.Biol.Chem.271：2443-2447)稍加改变来分析细胞迁移。根据制造商的说明书，除了将MatrigelTM层聚合到膜上，使用相同的方法来进行细胞侵袭检测。这在向上面的孔中加入细胞前进行。
为了保证单细胞悬浮以进行迁移/侵袭检测法，临近汇合的细胞在检测前一天胰蛋白酶化，通过18G针(needle)若干次并在检测前孵育至少12小时。下一天，用PBS中5mMEDTA，pH 7.4收获细胞，洗涤两次然后悬浮于无血清RPMI/BSA中。将100μl体积的细胞(1.0×105)上样到 室。用含10％FBS的600μl的RPMI填充下室。将负载的室放入37℃有5％CO2的湿润的培养箱中。24h后，取出室然后用4％多聚甲醛固定细胞。通过用棉签擦去上表面的细胞(和MatrigelTM)。迁移到膜的下表面的那些细胞用结晶紫染色并显微鉴定。
通过计数穿过圆过滤器中心的一排上的六个网格中的所有细胞获得细胞计数。这使用Lovins Microslide视野取景器(Gurley，Troy，NY)在总放大100×的显微镜下进行。从每个膜的代表性视野 获得照片。所有呈现的数据是三个重复分析的平均值±标准差(SD)。
MatrigelTM内的3D培养
对于3D MatrigelTM培养，单层生长细胞通过胰蛋白酶化收获，在完全培养基中悬浮并通过巴斯德移液器若干次而分离成单细胞悬浮液。这以后，将50μl含有5,000个细胞的完全培养基加入150μl用具有20％FBS的完全培养基以1∶1稀释的生长因子减少的MatrigelTM(Becton Dickinson，Bedford，MA)。轻混它，置于用Matrigel预涂覆的Nunc 4-孔载片上，并于37℃孵育直到Matrigel固化。然后用完全培养基覆盖细胞并于37℃在5％CO2中生长达24天，其间每2天更换培养基。用光学显微镜在随机选择的视野中计数细胞器的形成。
实时PCR和反转录-PCR
对于实时PCR，使用SuperScriptTM III First-StrandSynthesis SuperMix forqRT-PCR(Invitrogen，CA)按照制造商的说明书将总RNA转换成cDNA。对于这一分析使用ABI实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)。围绕基因组以及三种持家基因分布的多个基因标记用于使用 GreenERTM qPCR SuperMixfor ABI (Invitrogen，CA)的实时PCR分析。引物的序列信息列于表2，进一步参见下面。对于反应，来自检测基因和内源对照基因的5ng总cDNA都加入到20μl含有 GreenERTM qPCRSuperMix for ABI以及200nM每种引物的反应混合物中。对于每种标记，使用两步扩增程序在384孔板中进行三个重复反应，该两步扩增程序为95℃初始变性10min，随后为95℃持续20s和60℃持续30s的40个循环。在扩增最后进行熔解曲线分析步骤，其由95℃变性1min和55℃重退火1min所组成。
使用未处理的cDNA的连续的5-倍稀释液，从每个实验板产生标准曲线。计算每个反应的Ct-值的几何平均值。根据等式E＝10(-1/斜率)(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM(1996).Realtime quantitative PCR.Genome Res 6：986-94.)计算扩增效率并且所有基因标记的范围为90-104％。在由熔解曲线分析所确认的任何反应中都没有观察到非特异性扩增或引物二聚物。为了补偿标记之间的潜在差异，根据样品对对照的效率(E)值和Ct差异(Δ)计算相对表达，效率(E)值标准化为一组持家基因，β-肌动蛋白、HPRT和GAPDH(例如，相对表达＝2-(Ct，样品-Ct，HKG)-(Ct，对照-Ct，HKG))，Ct差异(Δ)(ΔCt样品-对照)(例如，相对表达＝2-ddCt)。
重组人Artemin蛋白质在细菌中的生产
于37℃在1升含有100μg/ml羧苄青霉素的LB中生长转化有质粒pQE30-ARTN的大肠杆菌Rosetta-gamiTM B(DE3)pLysS感受态细胞直到A600达到0.5。然后通过加入异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)至终浓度0.2mM来诱导蛋白表达，并对培养物孵育额外的5至6h。收获细胞并在50ml的20mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA和0.1mg/ml溶菌酶中重悬浮细胞团。通过超声破裂细胞然后于4℃以10,000g离心30分钟以分离包涵体。用2％TritonX-100，20mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA洗涤包涵体2次，然后用20mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤以除去去垢剂和EDTA。
随后，将包涵体溶解在50ml溶解缓冲液(6M盐酸胍，10mMTris-HCl和100mMNaH2PO4，pH 8.0)中并于4℃过夜摇动。于4℃以10,000g离心30分钟后，将上清液与4ml的Ni-NTA(Qiagen)50％浆混合并于4℃摇动1小时。然后将裂解物-树脂混合物上样到空柱中，随后用20ml的25mM咪唑，10mM Tri-HCl，100mMNaH2PO4，500mM NaCl，8M尿素(pH 8)来洗涤。用1ml含有250mM咪唑，10mM Tri-HCl，100mM NaH2PO4，150mM NaCl，8M尿素(pH 8)的洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。收集级分并通过SDS-PAGE分析以及通过考马斯亮蓝染色而显现。通过Bradford’s检测法估算纯化蛋白质的产量。
兔多克隆抗体的生产
按Bean(Eric S.Bean(2001)Polyclonal Antibodies.In：Basic Methods inantibody Production and Characterizationantibodies.Howard，G.and Bethel D.(编)，CRC Press，5：31-50，2000)所述，使用将免疫原皮下和肌内注射到兔中产生抗人Artemin的多克隆抗血清。使用标准方法学从抗血清亲和纯化抗体。
针对Artemin的鸡多克隆抗体的生产
免疫：在第0天用重组人Artemin(～0.5mg/鸡)和完全Freund’s佐剂免疫鸡，而在第9，29和39天再次加强(～0.17mg/鸡)。在免疫前后收集鸡蛋。由蛋黄的IgY提取：收集鸡蛋并分离蛋黄以及混合。在4℃进行纯化。稀释蛋黄并离心。从澄清的上清液沉淀IgY。离心分离沉淀物并溶解在PBS中。对免疫前后的鸡IgY样品过滤灭菌以得到纯度等于或大于90％的～5mg/ml的终浓度并于4℃保存。
下面进一步详细描述结果。
表1、在PCR和RT-PCR中用于检测基因特异性转录体的引物序列。
基因 引物 引物序列(5’-3’) SEQ ID NO：
Artemin 正向： CTTTGCAGACTGGACCCTTACC 52
反向： AGCTCCCATGAGTGAGTACAGG 53
Persephin 正向： ATGGCCGTAGGGAAGTTCCTG 54
反向： TCAGCCACCACAGCCGCAGGC 55
GFRα1 正向： TTGCAGGACTCCTGCAAGACG 56
反向： GACCACAGCTTGGAGGAGCAG 57
GFRα2 正向： CAGCTGCTCCTATGAGGACAAG 58
反向： CTGGGATGATATTTGTCGTGAGC 59
GFRα3 正向： CTGCTCACTTTCTTCGAGAAGG 60
反向： CAGGGTTTTCATTCTGGTGTGC 61
GFRα4 正向： ATGGTGCCATTCAGGCCTTTGC 62
反向： ATGGTCTCTGACCTGCTCTAGG 63
RET 正向： CGTGAAGAGGAGCCAGGGTC 64
反向： TAACCATCATCTTCTCCAGGTCT 65
β-2-微球蛋白 正向： TCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTG 66
反向： AACATGTCTCGATCCCACTTAACTATC 67
β-肌动蛋白 正向： ATGATATCGCCGCGCTCG 68
反向： CGCTCGGTGAGGATCTTCA 69
表3：相对于MCF7-Vec细胞，功能基因在MCF7-ARTN中的表达
*三个实验的平均值表示每种基因的倍数变化(p值＜0.05)。正值表示基因上调而负值表示基因下调。
实施例2：结果
Artemin对于人乳腺癌细胞是致癌性的
Artemin在人组织和癌细胞系中的表达
通过RT-PCR来分析Artemin和Persephin在哺乳动物MCF-7癌细胞中的表达。如图1A所示，在MCF-7细胞中观察到特异的Artemin和Persephin条带。使用市售可得的来自多种人组织的cDNA组来测定Artemin在正常组织中的表达谱。用对人Artemin特异的引物进行PCR对mRNA表达的筛选揭示了Artemin基因在许多非神经组织中表达(图1B)。在小脑中观察到最高表达其次是正常结肠。也在前列腺、子宫、胃、肾、气管、胎脑、脂肪和软骨中检测到表达。在心脏、骨骼肌、小肠、脾脏、胸腺、皮肤、肝、胎肝、肺、脑、脊髓、胎盘、肾上腺、受刺激的PBL、胰腺、唾腺、甲状腺、脐带、卵巢或PBL中没有观察到Artemin的表达。
也通过RT-PCR检查Artemin在多种人癌细胞系中的表达。如图1C所示，Artemin在列出的所有癌细胞系中都表达。在DLD-1结肠、PC3前列腺和RL95-2子宫内膜癌细胞系中检测到较高表达。在BxPC3胰脏癌细胞系以及在四种乳腺癌细胞系中观察到中度表达，其中两种(T47D和MCF-7)是雌激素受体阳性的，两种(BT549和MDA-231)是雌激素受体阴性的。在A549肺、AGS胃、Colo320DM结肠、DU145前列腺和HepG2肝癌细胞系中观察到有限的表达。
也通过RT-PCR在MCF-7、T47D和BT549乳腺癌细胞中测定GFRα同工型和RET的表达(图1D)。容易地检测到GFRα1和3，以及RET在MCF-7细胞中的表达，而GFRα2以极低水平表达并需要更多的循环来检测到其表达。如图1D所观察，三个细胞系都没有可检测水平的GFRα4表达。这些受体在T47D和BT549细胞中的表达模式与在MCF-7中的非常相似，只是T47D展现低得多的水平的GFRα1表达，而BT549展现高得多的GFRα2表达。
Artemin强制表达对乳腺癌细胞数量的影响
建立细胞模型体系来测定Artemin表达对乳腺癌细胞的功能影响。MCF-7细胞稳定转染Artemin表达质粒pIRESneo3-ARTN(命名为MCF7-ARTN)或空载体pIRESneo3(命名为MCF7-Vec)。在mRNA水平(图2A)以及蛋白质水平(图2B，中间组)验证了相比于对照MCF7-Vec细胞，Artemin在MCF7-ARTN细胞中的强制表达。Artemin的强制表达也在条件培养基中产生了增加的Artemin蛋白质(图2B，上组)。
我们首先确定Artemin的强制表达是否影响单层培养物中的总乳腺癌细胞数量。如图2C所观察，在8天的期间，在血清充分条件下，Artemin在MCF-7细胞中的强制表达没有显著增加细胞数。然而，在血清减少的(0.2％)培养基中，MCF7-ARTN细胞数的增加明显快于MCF7-Vec细胞(图2D)。8天后，MCF7-ARTN细胞的总数比MCF7-Vec细胞多23％(p＜0.05)。通过BrdU掺入来评估Artemin的强制表达对乳腺癌细胞进入S期的影响。如图2E所观察，Artemin在MCF-7细胞中的强制表达没有改变BrdU掺入。
Artemin的强制表达增加细胞存活
使用两种不同方法，在无血清条件下，检查Artemin的强制表达对MCF-7细胞存活的影响。用Hoechst 33258染料(图2F)的细胞凋亡估测表明对于MCF7-Vec细胞，在MCF7-ARTN中细胞凋亡显著降低(p＜0.05)。磷脂酰丝氨酸外化是细胞凋亡的独特标记。因此细胞用荧光异硫氰酸酯缀 合的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色。如图2G所观察，相比于对照MCF7-Vec细胞，MCF7-ARTN细胞对缺乏血清所诱导的细胞凋亡有抗性。在凋亡细胞中，28％的MCF7-ARTN细胞为早期凋亡(膜联蛋白V阳性的和PI阴性细胞)，相比之下，46％的MCF7-Vec细胞为早期凋亡，表明Artemin保护细胞免于早期凋亡。
Artemin的强制表达上调BCL2
进行实时PCR(表3，参见上面)来评估ARTN对参与细胞增殖和存活的关键基因的相对表达水平的影响。Artemin的强制表达只最低限度地改变大多数细胞周期相关标记的表达，包括细胞周期蛋白D1和E1、ATM、CDC25A以及CDK2和4，但显著减少细胞周期蛋白依赖的激酶抑制物-2A(CDKN2A)的表达。编码p16(INK4a)的CDKN2A被认为是肿瘤抑制基因，其通过由细胞周期蛋白依赖的激酶CDK4和CDK6来抑制Rb蛋白的磷酸化而诱导G1细胞周期的停滞(Stott等人，1998)。
相比于对照MCF7-Vec细胞，BCL2在MCF7-ARTN细胞中的表达增加了8.4倍(表3，参见上面)。BCL2是充分描述的存活基因(Zinkel等人，2006)。由Artemin所显著增加的另一基因为端粒酶-反转录酶(TERT)。TERT除了对永生化的作用外也抑制细胞凋亡(Zhang等人，2003)。值得注意的是γ-突触核蛋白(SNCG，也称作乳腺癌特异基因1)被Artemin上调了1.67倍。观察到SNCG保护肿瘤细胞免于凋亡；并且刺激细胞运动性和转移(Wu等人，2003)。
Artemin的强制表达促进无贴壁依赖性生长
在悬浮培养中以及通过软琼脂中的集落形成来检查Artemin的强制表达对无贴壁依赖性生长的影响。如图3A所观察，在悬浮培养中MCF7-ARTN细胞比对照MCF7-Vec细胞生长更快。10天后，MCF7-ARTN细胞的总数比MCF7-Vec细胞的总数多42％(p＜0.01)。相比于MCF7-Vec细胞，当将MCF7-ARTN细胞接种在软琼脂上时，形成的集落数显著增加了两倍(图3B)。
也在3D Matrigel中培养MCF7-ARTN细胞和MCF7-Vec对照细胞。与在软琼脂中的集落形成一致，相比于MCF7-Vec细胞，观察到MCF7-ARTN细胞集落数的增加(数据未示出)。此外，在Matrigel中由MCF7-ARTN细胞形成的集落尺寸更大并且集落中的细胞比MCF7-Vec细胞形成的那些展现为更加能动和侵袭性的特征(图3C)。MCF7-Vec细胞产生局限的集落，而更大数量的MCF7-ARTN细胞从集落的主体中扩展，表明Artemin促进局部侵袭行为。
Artemin的强制表达增强细胞迁移和侵袭
使用荧光显微镜(图3D)来显现丝状肌动蛋白。这揭示了MCF7-Vec细胞以上皮表型所典型的、具有显著的细胞间接触的团块来生长，，而MCF7-ARTN细胞分散并展示很少的细胞间接触。因此通过首先使用标准Transwell室而随后通过伤口愈合检测来评估Artemin对细胞运动性的影响。经过24h期间，我们发现迁移通过Transwell小室的MCF7-ARTN细胞是对照MCF7-Vec细胞的2倍(图3E)。
进一步使用包被有Matrigel的Transwell室来评估MCF7-ARTN细胞的侵袭能力。在48h周期中，MCF7-ARTN细胞的侵袭比对照MCF7-Vec细胞增强2倍(图3E)。进行伤口愈合检测作为监控细胞迁移的替代方法。如图3F所观察，在72h内，单层培养的MCF7-ARTN细胞显示了完全的伤口愈合，但MCF7-Vec细胞并没有。Artemin的强制表达因此增强MCF-7细胞的运动性和侵袭能力。与这一观察一致，实时PCR证明Artemin的强制表达显著增加参与侵袭和转移的多种基因的表达，包括MMP1(基质金属蛋白酶1；7.6倍)，PLAU(3.8倍)和SERPINE1(3.1倍)(表3，参见上面)。
Artemin强制表达促进体内MCF-7肿瘤异种移植生长
上述体外研究的证据清楚地表明Artemin的致癌作用。我们要确定Artemin是否可以增强体内致肿瘤性。对于此，使用异种移植模型，其中 MCF-7细胞注射到免疫缺陷裸鼠的乳房脂肪垫中。MCF7-ARTN和MCF7-Vec细胞都形成明显的和可测量的肿瘤。然而，对于MCF7-ARTN细胞，观察到比MCF7-Vec对照细胞更大的肿瘤体积(图4A)。第二周实现肿瘤体积的统计学上显著的增强(p＝0.023)。六周半后，由MCF7-ARTN细胞形成的肿瘤是由MCF7-Vec细胞形成的肿瘤的尺寸的2倍还多。
如由MCF-7雌激素依赖性生长所反映，MCF-7是相当充分分化的肿瘤细胞系。苏木精-曙红组织学证明由MCF7-Vec细胞形成的肿瘤是充分分化的(左组，图4B)，而由MCF7-ARTN细胞形成的那些展示出较差的分化特征(右组，图4B)。MCF7-Vec对照细胞显示规则形状和均一的核，以及清楚的细胞质边界。相反，MCF7-ARTN细胞形成小的纺锤形多形细胞，该细胞具有不规则的深染色核，以及不清楚的细胞质边界和稀少的染色质。
为了量化肿瘤内的增殖和凋亡，对肿瘤切片进行BrdU掺入和TUNEL标记。MCF7-ARTN肿瘤展现比MCF7-Vec肿瘤更高的BrdU标记的核的百分数(图4C)。由TUNEL标记所测量的细胞凋亡水平也证明Artemin增强肿瘤细胞存活。相比于MCF7-Vec肿瘤，在MCF7-ARTN肿瘤中有显著更少的TUNEL-阳性细胞(图4D)。
Artemin的强制表达增强T47D和BT549细胞中无贴壁依赖性生长、细胞迁移和侵袭
我们也稳定地强制Artemin在雌激素受体阳性T47D和雌激素受体阴性BT549细胞中的表达(图5A)。如图5B-D所观察，分别相比于对照T47D-Vec和BT549-Vec细胞，具有Artemin的强制表达的T47D-ARTN和BT549-ARTN细胞在软琼脂中都展现出显著增加的集落形成，以及在Transwell检测中都展现出显著增加的迁移和侵袭。对BT549细胞的影响比对T47D细胞更明显。在软琼脂中，T47D-ARTN细胞形成比T47D-Vec对照细胞多35％的集落，而BT549-ARTN细胞形成比BT-549-Vec对照细胞多64％的集落(图5B)。相比于T47D-Vec细胞，T47D-ARTN细胞展现分别为37和74％更多的迁移和侵袭(图5C)。然而，相比于BT549-Vec对照细胞， BT549-ARTN细胞展现出分别为272和169％更多的迁移和侵袭(图5D)。此外，具有Artemin强制表达的BT549细胞比对照细胞展现出更多的间充质形态(图5E)。
通过siRNA消除内源Artemin显著增加凋亡性细胞死亡
接下来通过基于质粒载体的siRNA来消除内源Artemin并检查MCF-7细胞的行为。为了测定siRNA的敲除效率，Artemin cDNA插入EGFP表达载体pEGFP(pEGFP-ARTN)的3’UTR内。通过使用荧光显微镜来检查EGFP蛋白质的表达水平来测定靶向Aartemin转录本的siRNA的效率。如图6A所观察，相比于siRNA阴性对照(CK-RNAi)，Artemin特异的siRNA(ARTN-RNAi)构建体有效地降低瞬时转染了pEGFP-ARTN的细胞中的EGFP的荧光。相比于CK-RNAi，ARTN-RNAi没有降低pEGFP转染细胞的EGFP表达。
分别通过Artemin特异的siRNA质粒(pSilencer-ARTN)或阴性对照质粒(pSilencer-CK)的转染来建立两个稳定的MCF-7细胞系，MCF7-siRNA和MCF7-CK。通过RT-PCR和Western印迹两者来测定这些细胞系中的Artemin表达水平。如图6B所观察，相比于MCF7-CK对照细胞，MCF7-siRNA细胞中的内源Artemin的表达在mRNA水平和蛋白质水平都降低。
通过siRNA的内源Artemin消除不影响充满血清条件下的MCF-7细胞数，而显著减少(20％)血清降低(0.2％)条件下的细胞数(图6C和D)。如所期待，通过siRNA的内源Artemin的消除显著增加由缺乏血清所诱导的凋亡性细胞死亡。根据Hoechst 33258可视化后的核形态，在血清缺乏24h后，相对于20％的MCF7-siRNA细胞，只有13％的MCF7-CK细胞被鉴定为凋亡(图6E)。对膜联蛋白-V标记也观察到类似的倍数改变。如图6F所见，作为Artemin消除的结果，具有MCF7-CK构建体的细胞对比具MCF7-siRNA构建体的的细胞的凋亡细胞百分数显出2倍的增加。在凋亡细胞中，MCF7-siRNA细胞的早期和晚期凋亡的比率约1比3.55(29％对 71％)；而MCF7-CK细胞为1比2.45(22％对78％)。这次表明内源Artemin的消除优先增加早期凋亡细胞。
通过siRNA的内源Artemin消除显著抑制MCF-7细胞中无贴壁依赖性生长
也发现siRNA介导的Artemin在MCF-7细胞中的消除抑制这些细胞的无贴壁依赖性生长。如图7A所观察，由MCF7-siRNA细胞在软琼脂上形成的集落数相比于MCF7-CK对照细胞显著降低(低24％)。当在3D Matrigel中生长时，相比于MCF7-CK细胞，也在MCF7-siRNA细胞观察到集落数的减少(数据未示出)。此外，在Matrigel中由MCF7-siRNA细胞形成的集落形态与由MCF7-CK细胞形成的不同(图7B)。Artemin消除的MCF7-siRNA细胞形成具有皱缩外表的较小集落，而MCF7-CK对照细胞形成更大的、更多的集落。
通过siRNA的内源Artemin消除损害细胞迁移和侵袭
评估内源Artemin消除是否将损害MCF-7细胞的运动性/侵袭。如图7C所观察，相比于MCF7-CK对照细胞，在Artemin消除的MCF7-siRNA细胞中，迁移通过Transwell室的非包被(迁移)或Matrigel-包被的(侵袭)多孔过滤器的细胞数显著降低。Artemin消除的MCF7-siRNA细胞也在伤口诱导的迁移中显示出显著降低。如图7D所示，在单层MCF7-siRNA中产生的伤口没有在MCF7-CK细胞中闭合得快。
重组人Artemin蛋白质在细菌中的生产
使用pQE30-ARTN质粒在细菌中以His-融合体(His-Artemin)表达成熟的Artemin蛋白序列。通过加入IPTG成功地诱导His-Artemin融合体的生产(图8A)。通过由山羊抗Artemin多克隆抗体(R&D Systems)的Western印迹分析来确认蛋白质的鉴定(图8B)。使用Ni-NTA(Qiagen)来纯化诱导的His-Artemin蛋白。重组Artemin蛋白具有序列：mrgshhhhhhgs AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG(SEQ ID NO：34；小写字母显示标签序列)。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白并通过考马斯亮蓝染色来显现。这显示了如期待的13.5kDa条带(图8C)。
抗Artemin的兔多克隆抗体降低MCF-7细胞的存活力以及抑制细胞侵袭
产生抗Artemin的兔多克隆抗体。如图9A所示，抗血清不仅能识别MCF7-Vec细胞中的内源Artemin，而且识别MCF7-ARTN细胞中的Artemin的强制表达。与从强制表达的观察相一致，用对Artemin的兔抗血清对MCF-7细胞的处理当在血清充满培养基中生长时，没有影响单层中的MCF-7细胞数(图9B)，但在无血清培养基中生长时，显著降低细胞数(图9C)。这些结果也与由通过siRNA的内源Artemin消除所获得的那些一致。此外，Artemin的抗血清也能够以剂量依赖方式抑制MCF-7细胞侵袭(图9D)。在200μg/ml和400μg/ml抗体浓度，分别观察到51.3％和74.6％的降低。抗体浓度进一步增加没有提供更多抑制。
抗Artemin的鸡多克隆抗体的生产
使用重组人Artemin我们也生产了鸡多克隆抗体。如图10所示，抗Artemin的鸡抗体不仅能够特异识别BT549-Vec细胞中的内源Artemin，而且能识别BT549-ARTN细胞中的强制性Artemin表达。
抗Artemin的鸡多克隆抗体降低MCF-7细胞的细胞存活力和无贴壁依赖性生长并且抑制侵袭
抗Artemin的鸡抗体显著降低在含有低血清(0.2％)的培养基中生长的MCF-7细胞的存活力。免疫前对照没有什么影响，而抗Artemin的鸡多克隆抗体以剂量依赖方式降低细胞存活力(图11A)。在200μg/ml，相比于IgY免疫前对照，细胞的存活力降至67.7％。在400μg/ml，细胞的存活 力降至IgY处理的对照的57.5％。在800μg/ml，细胞的存活力进一步降至IgY处理的对照的48.3％。
抗Artemin的鸡多克隆抗体显著抑制MCF-7细胞在软琼脂中的无贴壁依赖性生长(图11B)。观察到剂量依赖方式的抗体抑制。在200μg/ml，相比于IgY免疫前对照，软琼脂生长降至83.9％。在400μg/ml，软琼脂生长降至IgY处理的对照的66.0％。然而，对于400至600μg/ml的浓度，没有观察到进一步降低。
抗Artemin的鸡多克隆抗体也以剂量依赖方式损害MCF-7细胞的侵袭(图11C)。相比于IgY免疫前对照，用600μg/ml抗-Artemin抗体实现显著抑制。
在它莫西芬(Tamoxifen)抗性MCF-7细胞中的Artemin表达上调
假设Artemin表达水平可能决定化疗药物的敏感性。渐进地暴露于渐增的它莫西芬浓度后，MCF-7细胞获得在它莫西芬高浓度下生长的能力，并变成它莫西芬抗性。如图12所示，相比于它莫西芬敏感的亲代MCF-7细胞，在它莫西芬抗性MCF-7细胞中的Artemin表达显著增加。
Artemin的强制表达显著消除化疗诱导的死亡
已知MCF-7细胞是ER-阳性的，并且如上面所公开，Artemin能够保护这些细胞免于凋亡。进一步通过MTT检测分析Artemin表达对它莫西芬的作用的影响。如图13A所示，它莫西芬以剂量依赖方式造成在具有Artemin的强制表达的MCF7-ARTN细胞和MCF7-Vec对照细胞中的细胞死亡。然而，MCF7-ARTN细胞在除了0.1μM以外的所有它莫西芬检测浓度下都显示出显著更高的存活率。
这一结果可解释为较低浓度(0.1-1μM)的它莫西芬已证实能诱导细胞周期停滞，而药学浓度(5μM之上)显示出诱导细胞凋亡(Otto A，Paddenberg R，Schubert S，Mannhertz H 1996 Cell-cycle arrest，micronucleus formation，and cell death ingrowth inhibition of MCF-7 breast cancer cells by tamoxifen and cisplatin.JCancer Res ClinOncol 22：603-612。Perry R，Kang Y，Greaves B 1995 Effectsoftamoxifen on growth and apoptosis of estrogen-dependent and-independenthuman breast cancer cells.Ann Surg Oncol 2：238-245)。也观察到Artemin对阿霉素和紫杉醇诱导的细胞死亡的类似保护作用(图13B和13C)。这些结果显示Artemin的强制性过表达能够消除化疗诱导的细胞死亡。
在它莫西芬存在下Artemin的强制性过表达显著增加无贴壁依赖性生长
进一步以软琼脂检测法评估Artemin抗化学治疗剂的保护作用。与上述观察一致(参见例如图3B)，不存在它莫西芬时，Artemin的强制表达导致集落形成增加2倍以上(图14A)。1μM和5μM浓度的它莫西芬降低在软琼脂中形成的集落数(图14A)。然而，Artemin的强制表达消除这一影响(图14B)。在Matrigel中，Artemin的强制表达也减少它莫西芬对集落形成的影响(图14C)。
通过抗Artemin的鸡多克隆抗体和抗雌激素试剂对MCF-7细胞的无贴壁依赖性生长的协同抑制
如图15A和15B所示，抗雌激素试剂、它莫西芬和氟维司群(Faslodex)(ICI 182，780)都有效地抑制软琼脂中MCF-7细胞的无贴壁依赖性生长。相比于对照，它莫西芬(图15A)和氟维司群(图15B)分别降低生长至40.4和55.8％。在相同实验条件下，相比于免疫前对照，抗Artemin的鸡多克隆抗体降低生长至72.3％。此外，它莫西芬(图15A)或氟维司群(图15B)与抗Artemin抗体的组合显著降低软琼脂集落形成。抗Artemin抗体与它莫西芬(图15A)或氟维司群(图15B)一起几乎完全抑制MCF-7的无贴壁依赖性生长，相比于对照，其集落形成分别降至7.1和10.0％。
实施例3：结果
Artemin对子宫内膜癌细胞是致癌性的
自分泌ARTN的强制性生产诱导人子宫内膜癌细胞的细胞生长
用Artemin表达质粒pIRESneo3-ARTN(命名为RL95-2-ARTN)或空pIRESneo3载体作为对照(RL95-2-CK)稳定转染人子宫内膜癌RL95-2细胞。相比于对照RL95-2-CK细胞，通过RT-PCR在mRNA水平检测Artemin在RL95-2-ARTN细胞中的增加的表达，而用Western印迹分析在蛋白质水平检测(图16)。
如总细胞检测所示，ARTN在RL95-2细胞中的强制表达显著增加细胞生长(图17A)。增加的细胞生长可归因于增加的细胞周期进程和/或凋亡的减少的净结果。在此证明了在FBS存在或不存在下，相比于RL95-2-CK细胞，ARTN在RL95-2细胞中的强制表达显著增加有丝分裂发生(图17B)并且随后减少作为缺乏血清结果的凋亡细胞死亡(图17C)。
参与细胞周期进程和细胞存活的转录调控基因直接与参与或促进细胞致癌行为的信号途径的激活相关联(Evan和Littlewood，1998；Nagasawa等人，1985)。为了用RL95-2细胞验证Artemin强制性生产的功能结果，利用实时PCR来评估参与细胞周期进程和细胞存活的多种基因标记的转录水平。Artemin在RL95-2细胞的强制表达导致细胞周期进程所需基因DDND1、CDK2、CDC25A、BRCA1、CHEK2和RB1；以及抗凋亡基因Bcl-2和BCL2L1；以及TERT的mRNA表达的上调(图17D和17E)。Artemin的强制表达也导致BAD、BAX和CASP7表达的下调(图17E)。因此，Artemin的强制性生产增强细胞周期进程和降低细胞凋亡。其随后激活增殖和细胞存活所需的基因，并导致子宫内膜癌细胞的增加的细胞生长。
ARTN在子宫内膜癌细胞中的强制表达增强无贴壁依赖性生长和侵袭潜力
接下来在软琼脂检测中评估强制表达Artemin是否影响RL95-2细胞形 成集落的能力。结果显示RL95-2-ARTN细胞在软琼脂中比RL95-2-CK细胞形成更多的集落(图18A)。RL95-2-ARTN细胞也形成比RL95-2-CK细胞形成的更大的集落。此外，相比于RL95-2-CK细胞，RL95-2-ARTN细胞证明了在悬浮培养中增加的生长(图18B)并展现出显著的转化灶(foci)形成(图18E)。这表明Artemin表达促进RL95-2细胞的无贴壁依赖性生长。
为了检查Artemin强制表达对形态结构的影响，进行2D和3DMatrigel培养。RL95-2-ARTN细胞在2D(图18D)和3D(图18C)Matrigel培养中形成具有分支形态的集落。RL95-2-ARTN细胞在2D Matrigel培养中展现间充质分支形态(图18D)。
ARTN在子宫内膜癌细胞中强制性表达促进间充质表型以及增加的细胞迁移和侵袭
为了密切地检查Artemin在RL95-2细胞中的形态影响，在从单细胞状态开始的每日基础上监控集落形成。Artemin在RL95-2细胞中的强制表达诱导EMT转变。细胞获得了显著的纺锤细胞形态(图19A)，表明侵袭能力。如图19B所示，相比于RL95-2-CK细胞，观察到两倍以上的RL95-2-ARTN细胞数具有迁移和侵袭特征。
实时PCR证明相比于RL95-2-CK细胞，发现若干参与侵袭和转移的基因，包括例如MMP1、MMP9、PLAUR、SERPINB5和SERPINE1在RL95-2-ARTN细胞中增加(图19C)。间充质表型的特异标记Vimentin在RL95-2-ARTN细胞中比在RL95-2-CK细胞中上调7倍(图19D)。
在子宫内膜癌细胞中通过siRNA的ARTN的消除降低致癌表型和诱导细胞凋亡
使用基于质粒的siRNA来消除ARTN表达。用pSilencer-ARTN质粒(RL95-2-siARTN)或阴性对照pSilencer-CK质粒(RL95-2-siCK)稳定转染RL95-2细胞。通过RT-PCR在mRNA水平确认Artemin的表达消除而通过Western印迹分析在蛋白质水平确认(图16)。
如总细胞数检测所示，RL95-siARTN细胞的生长显著慢于RL95-2-siCK细胞(图20A)。BrdU掺入和细胞凋亡检测证明RL95-2-siARTN细胞展现细胞周期进入的减少(图20B)以及细胞凋亡的增加(图20C)。Artemin的消除也损害非贴壁依赖的细胞生长(图20D)、细胞迁移和侵袭(图20E)。
Artemin的强制表达增强在子宫内膜癌AN3细胞中的无贴壁依赖性细胞生长、细胞迁移和侵袭，而Artemin的消除则损害它们
为了将在RL95-2细胞中的观察扩展到其它子宫内膜癌细胞，用Artemin表达质粒pIRESneo3-ARTN(AN3-ARTN)或空pIRESneo3载体作对照(AN3-CK)稳定转染AN3细胞。通过RT-PCR在mRNA水平确认Artemin在AN3-ARTN细胞中的强制表达，而通过Western印迹分析在蛋白质水平确认(图16)。与RL95-2细胞相似，Artemin在AN3细胞中的强制表达增加了无贴壁依赖性生长(图21A)并且也促进细胞迁移和侵袭(图21C)。
为了在AN3细胞中消除内源Artemin的表达，用pSilencer-ARTN质粒(AN3-siARTN)或用阴性对照pSilencer-CK质粒(AN3-siCK)稳定转染细胞。通过RT-PCR在mRNA水平确认在AN3-siARTN细胞中Artemin的消除表达而通过Western印迹分析在蛋白质水平确认(图16)。与强制表达相反，Artemin在AN3-细胞中的消除减少了无贴壁依赖性生长(图21B)以及细胞迁移和侵袭(图21D)。
抗Artemin的鸡多克隆抗体降低子宫内膜癌细胞的细胞存活力和无贴壁依赖性生长以及抑制侵袭
在含有低血清(0.2％)的培养基中生长的RL95-2细胞的细胞存活力没有受到免疫前对照IgY的显著影响。然而，其被抗Artemin的鸡多克隆抗体以剂量依赖方式显著降低。在200μg/ml，抗-Artemin抗体和免疫前对照IgY都将细胞存活力降低至几乎相同的程度(图22A)。然而，当浓度增加至400、600和800μg/ml，对照IgY对细胞存活力的作用为没有影 响，而抗-Artemin抗体显示了显著的抑制作用。
RL95-2和AN3细胞在软琼脂上的无贴壁依赖性生长受到抗Artemin的鸡多克隆抗体的显著抑制(图22B)。相比于PBS对照，400μg/ml的免疫前对照IgY没有显著影响集落形成，但是相同浓度的抗-Artemin抗体显著降低集落形成。相比于对照IgY，RL95-2和AN3细胞的存活力分别降低了37.1和46.1％。
如Transwell侵袭检测所揭示，RL95-2和AN3细胞的侵袭也受到抗Artemin的鸡多克隆抗体的显著抑制(图22C)。相比于对照IgY，抗-Artemin抗体使RL95-2和AN3细胞的侵袭分别降低了47.7和26.3％。
在此参考某些优选的实施方式描述了本发明以帮助读者不需要过度的实验而实践本发明。然而，本领域普通技术人员将容易地理解可改变或修改许多组分和参数到某一程度而不悖离本发明的范围。此外，提供名称、标题等以提高读者对这一文本的理解，而这不应被理解为限制本发明的范围。
所有上面和下面引用的专利申请、专利和公开出版物的全部公开在此通过整体引用作为参考。
贯穿这一说明书和所附任何权利要求，除非上下文中另有需要，措词“包括”、“包括有”等理解为包括的含义，而非排除的含义，也就是说，为“包括但不限于”的含义。
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Claims (17)

1.试剂在制备用于治疗有需要的受试者的乳腺癌或子宫内膜癌的药物中的用途，在所述乳腺癌或子宫内膜癌中表达Artemin，其中所述试剂抑制Artemin对细胞增殖、细胞存活或致癌性的生物活性。
2.权利要求1的用途，其中受到抑制的Artemin的生物活性是促进增加的或异常的肿瘤细胞增殖、促进增加的或异常的肿瘤细胞存活、或者促进增加的致癌性。
3.权利要求1的用途，其中所述试剂是
a)针对于用于Artemin的核苷酸序列的反义核苷酸分子，或
b)针对于用于Artemin的核苷酸序列的干涉RNA分子，或
c)结合Artemin的氨基酸序列的抗体分子，或
d)表达a)至c)中任一种的载体，或
e)包括a)至d)中任一种的宿主细胞。
4.权利要求3的用途，其中所述试剂是
a)结合包括SEQ ID NO:35-42中任一种的核酸序列的多核苷酸的反义核苷酸分子，或
b)使得包括SEQ ID NO:35-42中任一种的核酸序列的多核苷酸沉默的小干涉RNA分子，或
c)结合选自SEQ ID NO:1-3或5-32或34的氨基酸序列的抗体分子，或
d)表达a)至c)中任一种的载体，或
e)包括a)至d)中任一种的宿主细胞。
5.权利要求4的用途，其中所述试剂是包括SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:53的核酸序列的反义核苷酸分子。
6.权利要求4的用途，其中所述试剂是结合选自SEQ ID NO:1-3或5-32或34的氨基酸序列的单克隆抗体。
7.权利要求4的用途，其中所述试剂是包括SEQ ID NO:46、47、50和51中任一种的核酸序列的小干涉RNA分子。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述药物还包括一种或多种抗肿瘤试剂。
9.如权利要求8所述的用途，其中该一种或多种抗肿瘤试剂选自下组：烷基化试剂,抗代谢物或S-期试剂,有丝分裂毒,抗生素型试剂,激素类试剂,卡培他滨,曲妥珠单抗,和任意两种或多种抗肿瘤试剂的组合。
10.如权利要求9所述的用途，其中烷基化试剂选自苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺和塞替派。
11.如权利要求9所述的用途，其中抗代谢物或S-期试剂选自甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、5-氟尿嘧啶、羟基脲、安吖啶、吉西他滨、达卡巴嗪和硫鸟嘌呤。
12.如权利要求9所述的用途，其中有丝分裂毒选自依托泊苷、长春碱、去乙酰长春酰胺、长春瑞滨、紫杉醇和多西紫杉醇。
13.如权利要求9所述的用途，其中抗生素型试剂选自阿霉素、博来霉素、放线菌素D、道诺霉素和丝裂霉素。
14.如权利要求9所述的用途，其中激素类试剂选自氨鲁米特、阿那曲唑、雌莫司汀、戈舍瑞林、六甲基三聚氰胺、来曲唑，和它莫西芬。
15.如权利要求9-14中任一项所述的用途，其中所述药物还包含抗肿瘤试剂阿霉素、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺(FAC)的组合或者抗肿瘤试剂环磷酰胺、甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(CMF)的组合。
16.使得SEQ ID NO:35-42中任一种的核酸序列沉默的小干涉RNA分子、或表达所述小干涉RNA分子的载体、或包括所述载体的宿主细胞在制备治疗受试者癌症的药物中的用途，其中该癌症选自乳腺癌或子宫内膜癌。
17.结合选自SEQ ID NO:1-3、5-32或34的氨基酸序列的抗体分子、或表达所述抗体分子的载体、或包括所述载体的宿主细胞在制备治疗受试者癌症的药物中的用途，其中该癌症选自乳腺癌或子宫内膜癌。
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