CN117700545A - 靶向Artemin的抗体及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种靶向Artemin的抗体及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。具体而言，本发明提供了一种靶向Artemin的抗体或其抗原结合片段，其可例如包含选自SEQ ID NO:3、4、5的VHCDR1‑3和/或SEQ ID NO:6、7、8的VLCDR1‑3。本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及一种靶向Artemin的抗体、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
近年来，虽然免疫治疗(如抗体免疫治疗、CAR-T疗法)在部分肿瘤(如血液系统肿瘤)的临床试验中取得了令人瞩目的疗效，但对于大部分实体瘤，免疫治疗仍面临着巨大挑战，如临床反应性低、脱靶等毒副作用等问题。靶向检查点的抗体免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗的热点，但在肿瘤，尤其肝癌免疫治疗中的有效率仅为15-20％(Lancet 2017；389:2492-2502)。因此，发掘和鉴定新的治疗靶标、研发新的免疫治疗制品对于提升免疫治疗的疗效、降低临床毒副作用具有重要意义。
肿瘤是全球各个国家人群的主要死因，自2000年以来，肿瘤病例和死亡人数逐渐增加，其中，肝癌是我国发病率和致死率较高的恶性肿瘤，也是全球癌症死亡主要因素之一。由于缺乏早期诊断技术，多数确诊病例为晚期肝癌患者，导致患者可选择的治疗方案十分有限。我们前期发现晚期肝癌患者肿大的脾脏内存在一种巨核细胞-红细胞祖系起源的新型类红细胞(Tumor-inducible,erythroblast-like cells)，命名为Ter-细胞。这群细胞不表达免疫细胞标志，但却表达Ter-119、CD71和CD41等红系细胞标志。Ter细胞可分泌神经营养因子ARTN(artemin，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族成员，NCBI GeneID:9048)，通过与肝癌细胞表达的其受体GFRα3结合促进肝癌的生长和转移；阻断ARTN-GFRα3轴可有效地抑制肝癌的生长(Cell,2018；173(3):634-648)。Ter细胞的促肿瘤作用后续被多个研究机构证实，如阻断Ter细胞分泌的ARTN轴可提高放疗和抗PD-L1治疗敏感性(Science Translational Medicine,2021Feb24；13(582):eabb0130)；此外，有研究发现Ter细胞被认为是一种胰腺癌的预后标志物(Int J Cancer,2021Apr 1；148(7):1756-1767)。然而，本领域中仍然缺乏肿瘤(例如肝癌、胰腺癌等)治疗的有效药物，尤其是与ARTN相关的靶向药物。
发明内容
本申请的技术方案克服了现有技术的不足，提供了一种靶向ARTN蛋白的抗体或其抗原结合片段、及其制备方法和应用。本申请的抗体或其抗原结合片段为肿瘤免疫治疗提供了一种药效更好、靶向性更强的优质抗体生物药。
在本发明的第一方面，提供了一种靶向Artemin的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：
所述重链可变区包含重链互补决定区(VHCDR)1结构域、VHCDR2结构域和VHCDR3结构域，
所述重链可变区的VHCDR1结构域具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，
所述重链可变区的VHCDR2结构域具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
所述重链可变区的VHCDR3结构域具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，
所述轻链可变区包含轻链互补决定区(VLCDR)1结构域、VLCDR2结构域和VLCDR3结构域，
所述轻链可变区的VLCDR1结构域具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，
所述轻链可变区的VLCDR2结构域具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，
所述轻链可变区的VLCDR3结构域具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本发明的一些方面中，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些方面中，提供了一种表达载体或宿主细胞，所述表达载体或宿主细胞包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
在本发明的一些方面中，提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括：
(a)在允许本文所述核酸分子表达的条件下，培养包含本文所述核酸分子的宿主细胞，
(b)分离本文所述的抗体或其抗原结合片段，
(c)任选地，对所得抗体或其抗原结合片段进行纯化和/或鉴定(例如鉴定其分子量大小、特异性)。
在本发明的一些方面中，提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用，例如所述肿瘤选自：实体瘤，例如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、甲状腺癌、结肠癌、食道癌和非小细胞肺癌；优选所述肿瘤选自：肝癌，胰腺癌；所述药物能够抑制癌细胞的增殖、转移和/或侵袭。
在本发明的一些方面中，提供了一种产品，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，或本文所述的核酸分子，或本文所述的表达载体或宿主细胞。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1显示了流式分选抗原(ARTN)特异性记忆性单B细胞。
图2显示了抗人ARTN抗体重链表达载体(pFUSEss-CHIg-hG1)结构示意图。
图3显示了抗人ARTN抗体轻链表达载体(pFUSE2ss-CLIg-hk)结构示意图。
图4显示了多种ARTN抗体特异性检测。
图5显示了ARTN抗体鉴定：
图5A：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度和分子量大小；
图5B：斑点杂交(Dot blot)显示纯化的抗体与人ARTN蛋白抗原的结合。
图6显示了ARTN抗体与人ARTN抗原的结合检测(ELISA方法)。
图7显示了ARTN抗体亲和力检测(SPR方法)。
图8显示了ARTN抗体阻断功能检测。
图9显示了ARTN抗体体外抑制HepG2细胞增殖活性；
其中，*，p<0.05，**，p<0.01。
图10显示了ARTN抗体抑制ARTN介导的促肝癌侵袭；
其中，***，p<0.001。
图11显示了ARTN抗体抑制ARTN介导的促胰腺癌侵袭；
其中，**，p<0.01，***，p<0.001。
图12显示了ARTN抗体体内抗肿瘤效应检测；
其中，**，p<0.01。
图13显示了ARTN-26重链和轻链序列。
具体实施方式
本发明的新型ARTN抗体通过特异性结合ARTN(Artemin)蛋白，抑制ARTN与其受体GFRα3的结合，从而抑制ARTN介导的促肿瘤生长或侵袭效应。与现有治疗手段相比，本发明提供了药效更好、靶向性更强的优质抗体生物药，为肿瘤治疗，尤其是肝癌和胰腺癌的免疫治疗提供了疗效优异的新方案。
本发明公开了一种靶向Artemin(ARTN)的抗体及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。具体地，本发明的ARTN抗体与人ARTN抗原具有强结合能力，具有良好的物种特异性。本发明的ARTN抗体能够有效结合人ARTN蛋白，在一些情况下，本发明的ARTN抗体与人ARTN蛋白之间的结合呈浓度依赖性。本发明的新型ARTN抗体可显著抑制ARTN与GFRα3的结合，在一些情况下，呈浓度依赖性抑制。本发明的新型ARTN抗体可显著抑制ARTN介导的促肝癌生长效应，并且可显著抑制ARTN介导的促肝癌、胰腺癌侵袭效应。
本发明中所述的“抗ARTN(Artemin)抗体或其抗原结合片段”，意在包括抗-ARTN(Artemin)抗体的scFv-Fc、scFv、(scFv)2、dsFv、Fab、F(ab’)2等功能性片段或其全长抗体形式，所述抗原结合片段具有与抗ARTN全长抗体相同的功能，能够抑制ARTN与其受体的结合，以发挥抗肿瘤活性。所述抗体不限于来自任何特定哺乳动物物种的免疫球蛋白，包括人、鼠、马和骆驼抗体(例如人抗体)，所述抗体包括天然来源的或分离自经抗原免疫的动物，以及工程改造抗体，例如从转化了导致抗体表达的核酸分子的宿主细胞中分离的抗体，从转人免疫球蛋白基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从抗体文库(例如噬菌体展示文库)中分离出的抗体。在一些实施方式中，通过单B细胞抗体制备技术获得本申请的抗体。
在一些实施方式中，所述靶向Artemin的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:1具有90％以上序列相同性的氨基酸序列，和/或其中轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有90％以上序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括抗-Artemin抗体的scFv-Fc、scFv、(scFv)2、dsFv、Fab、F(ab’)2等功能性片段或其全长形式。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合的Artemin是哺乳动物Artemin，所述哺乳动物Artemin优选人Artemin。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体的重链恒定区为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)和/或其轻链恒定区为κ或λ，优选人恒定区。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够抑制癌细胞的增殖、转移和/或侵袭。
在一些实施方式中，本发明的产品包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，或本文所述的核酸分子，或本文所述的表达载体或宿主细胞，所述产品为用于如下应用的产品：用于肿瘤治疗的药物或用于药物研发的材料，例如所述肿瘤选自：实体瘤，例如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、甲状腺癌、结肠癌、食道癌和非小细胞肺癌；优选所述肿瘤选自：肝癌，胰腺癌。
在一些实施方式中，所述产品包括：单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体-药物偶联物(ADC)或嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方式中，所述产品包含有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。所述“有效量”是指向对象给予产品，以能够对疾病、病症或病况的任何症状、方面或特征产生任何可检测的、积极影响的量。所述“有效量”为至少包含0.0001ng，优选至少包含0.001ng，优选至少包含0.01ng，优选至少包含0.1ng，优选至少包含1ng的本发明所述抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述产品包含有效量的本发明所述抗体或其抗原结合片段的浓度至少为5nM，优选浓度至少为10nM，优选浓度至少为15nM，优选浓度至少为20nM，优选浓度至少为25nM，优选浓度至少为30nM，优选浓度至少为35nM，优选浓度至少为40nM，优选浓度至少为45nM，优选浓度至少为50nM，优选浓度至少为55nM，优选浓度至少为60nM，优选浓度至少为65nM，优选浓度至少为70nM，优选浓度至少为75nM，优选浓度至少为80nM，优选浓度至少为85nM，优选浓度至少为90nM，优选浓度至少为95nM，优选浓度至少为100nM。
在本发明的一些方面中，提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括：抗原免疫、单B细胞分选、单细胞测序、载体构建、抗体筛选、CHO-S表达和纯化、亲和力检测、抗体阻断效应和抗体抗肿瘤功能检测等。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.人ARTN蛋白免疫小鼠，流式分选ARTN特异性单记忆性B细胞及单细胞测
序
1.1实验材料
BALB/c小鼠购于江苏集萃药康生物技术有限公司，弗氏佐剂购于西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司(货号：F5506(不完全弗氏佐剂)/F5881(完全弗氏佐剂))，抗原ARTN蛋白购自南京铭研生物技术有限公司，小鼠记忆性B细胞分离试剂盒(货号：130-095-838)、QuadroMACS起始试剂盒(货号：130-042-303)购自美天旎(Miltenyi)公司，PBS购自Hyclone公司，0.4％台盼蓝购自生工生物工程有限公司。FITC购自赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司(货号：46410)。
1.2实验方法
选取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将50μg抗原和完全弗氏佐剂等体积混合，进行首次皮下注射免疫；分别于第21天和42天采用抗原50μg和不完全弗氏佐剂等体积混合，进行第2和第3次免疫；待第70天采用仅蛋白抗原50μg，进行第4次免疫。3天后，将小鼠颈椎脱臼处死，取新鲜脾脏和淋巴结，放于70μm筛网之上，研磨至无大块组织，70μm筛网过滤，重悬混匀细胞并离心。PBS重悬，以380μl/108个细胞的比例加入分选缓冲液。每108个细胞加入100μL的记忆B细胞生物素-抗体混合物(Memory B Cell Biotin-Antibody Cocktail)，10μL抗IgG1-APC，50μl分选缓冲液，4℃中孵育5分钟。加入300μl缓冲液及200μl抗生物素微珠(Anti-Biotin MicroBeads)，4℃孵育10分钟，300g、10min离心弃上清。加入500μl缓冲液过柱子，收集得到阴性细胞。将收集获得的细胞300g、10min离心，弃上清，再加入400μl缓冲液，100μl抗-APC微珠(Anti-APC MicroBeads)，4℃孵育15分钟，加入10倍体积的分选缓冲液，混匀后300g、10min离心弃上清。加入500μl缓冲液重悬混匀后过分离柱进行清洗和分离，收集获得IgG1+细胞，300g、10min离心弃上清。用抗体孵育液(PBS+2％FBS)重悬调整细胞密度至107个/ml，取少量细胞作为对照组。根据2μg/ml浓度加入FITC标记的ARTN抗体，4℃孵育20分钟，PBS洗涤两次，1500rpm、5min离心弃上清。PBS调整细胞密度为105-106个/ml进行流式分选。
1.3实验结果
如图1所示，通过流式分选，获得ARTN特异性的IgG1+ARTN+记忆性B细胞(图1中P5)。委托上海晶能生物科技有限公司进行单B细胞10x Genomics BCR基因测序，选择频率≥2的抗体序列进行克隆和表达。
实施例2.ARTN抗体VH、VL序列载体构建与初步筛选
2.1实验材料
抗体的重、轻链表达质粒购于InvivoGen公司(如图2和图3所示)，由苏州金唯智生物技术有限公司合成实施例1中所得的抗体重、轻链基因，胶回收试剂盒购于Takara公司，同源重组酶购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，jetPEI质粒转染试剂购自Polyplus，硝酸纤维素膜购于GE公司，ARTN蛋白购于南京铭研生物技术有限公司，一抗是质粒转染的293t细胞上清，二抗购于Abcam公司(货号：ab6759)，显色液购于赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)公司。
2.2实验方法
抗体重、轻链ScFv基因由苏州金唯智生物技术有限公司合成，再以基因合成的质粒为模板进行亚克隆，获得的PCR片段利用胶回收试剂盒进行纯化，通过同源重组的方式将PCR片段连接到VH(pFUSEss-CHIg-hG1，图2)和VL(pFUSE2ss-CLIg-hk，图3)表达载体，后续利用DH5α感受态细胞进行转化。在平板上挑取单克隆菌落，摇菌扩大培养并测序，将测序结果正确的菌液扩增，通过大规模质粒提取，获得正确配对的抗体的重、轻链表达质粒。将293t细胞以3X105/孔密度铺于12孔板中，18-24小时后转染质粒，轻、重链质粒各0.75μg/孔，转染72h后收上清。利用斑点杂交(Dot blot)方法初步筛选与ARTN结合的抗体：将0.1μgARTN蛋白经PBS稀释后点在硝酸纤维素膜上，待干后，用5％BSA室温封闭1h，将封闭好的硝酸纤维素膜分别加293t转染上清、阳性对照抗体(抗-his)和阴性对照抗体(IgG)，室温孵育3-4h，TBST洗膜4次，每次15分钟。将洗涤好的硝酸纤维素膜，分别加对应二抗(HRP-人、HRP-小鼠、HRP-兔)室温孵育1h，TBST洗膜4次，每次15分钟，显色液显色。
2.3实验结果
如图4所示，通过斑点杂交结果发现表达的ARTN抗体中，#8和#26抗体与人ARTN抗原具有较强的结合能力，并且强于阳性对照组(抗-his组)；但不与小鼠的ARTN结合。这说明所制备的抗体具有较好的特异性，与小鼠的ARTN不存在交叉反应性。
实施例3.ARTN抗体的表达与纯化
3.1实验材料
expiCHO-S细胞系、转染试剂购买于赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司(货号：A29129)，蛋白G柱购买于GE公司。
3.2实验方法
获得天然配对的抗体的轻、重链表达质粒，通过CHO-S细胞表达系统进行表达。具体方法：分别配置反应混合物A：2ml OptiPro-SFM+质粒(轻链和重链表达质粒各50μg)和混合物B：1.84ml OptiPro-SFM+160μl ExpiFectamineTM CHO试剂，震荡混匀，室温静置5分钟后将B混合物加入到A混合物，震荡混匀，室温静置10-20分钟，缓慢加入50ml CHO-S细胞体系。转染18-22h，向体系内补加300μl ExpiCHOTM增强剂(Enhancer)，12ml ExpiCHOTM辅料(Feed)，37℃培养，7天后，收取细胞培养上清。利用AKTA蛋白纯化系统进行抗体的纯化，具体方法：将细胞培养上清离心或过滤除去细胞碎片。用1×PBS冲洗蛋白G柱10CV至基线平稳，将含有抗体的细胞上清上样至AKTA，PBS再次平衡柱子洗去未结合的杂质；用0.1M甘氨酸，pH 2.8将柱上的抗体洗脱，并收集到含有中和液(1M Tris，pH 9.0)的管中使pH达到中性，洗脱后的抗体溶液用超滤管离心置换到PBS中。
3.3实验结果
如图5所示，纯化好的抗体经10％聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其纯度和分子量大小，在完全还原的条件下，ARTN抗体呈现分子量为50kDa和25kDa的两条带，其分别为抗体的重链和轻链条带(图5A)。这些结果表明，我们所构建的ARTN抗体结构正确，其分子量大小与理论值一致。斑点杂交(图5B)结果显示纯化的抗体与阳性对照抗体都与人ARTN蛋白抗原有特异性结合，其中ARTN抗体#26特异性结合最强。
实施例4.ARTN抗体亲和力测定
4.1实验材料
抗原包被96孔板购于赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司(货号：442404)，ARTN蛋白购于南京铭研生物技术有限公司，一抗是质粒转染CHOS的上清纯化后的抗体，二抗购于Abcam公司(货号：ab6759)，TMB显色液和终止液购于Abcam公司，S系列CM5传感芯片购自Cytiva公司(货号：22054643-AE)。
4.2实验方法
ELISA方法检测抗体结合力：PBS稀释ARTN蛋白包被96孔板，100ng/孔，4℃过夜，PBST洗板四次，3％BSA室温封闭1h，PBST洗板四次，分别加入100μl样品(1μg/ml)(待测样品、标准品和对照样品)，最终抗体样品量如图6所示，室温孵育1h后PBST洗板四次，加入100μl二抗，室温孵育1h后PBST洗板四次，加100μl TMB显色液，待变色后加入100μl终止液，单波450nm检测OD值。SPR方法检测抗体亲和力：在Biacore T200(Cytiva)仪器上放置芯片，使用缓冲液HBSEP(10mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％ Tween-20)，实验温度为25℃。采用氨基偶联的方法将抗原蛋白ARTN共价连接到实验通道，倍比稀释抗体作为分析物以30μl/分钟的速率流过对照通道和实验通道，结合时间120秒，解离时间400秒，重生缓冲液为Glycine 2.0。实验结果采用Biacore T200评估软件3.1(Cytiva)软件进行亲和力(KD)分析，使用1:1结合的作用模式。
4.3实验结果
如图6、7所示，ELISA结果显示ARTN#26抗体可与人ARTN蛋白之间存在较好的结合，并呈浓度依赖性结合(图6)。SPR检测也显示ARTN#26抗体具有较高的亲和力，KD＝2.7X10-9M(图7)。
实施例5.抗体阻断效应检测
5.1实验材料
生物素化标记试剂盒购买于Genemore公司(货号：G-MM-IGT)；ELISA用耗材购买于赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司；IgG抗体、TMB显色液、ELISA终止液购买于Abcam公司；PBS、Tween均购买于生工生物工程有限公司；BSA购买于上海博光生物科技有限公司。
5.2实验方法
ARTN蛋白进行生物素化标记，ARTN结合蛋白GFRα3包板，4℃过夜，PBST洗板4次，加入封闭液室温封闭1小时；PBST洗板4次；加入对照抗体IgG及生物素标记ARTN蛋白或不同浓度梯度待检测抗体抗-ARTN及生物素标记ARTN蛋白，37℃孵育1h；PBST洗板4次；加入稀释后的辣根过氧化物酶，37℃孵育1h。PBST洗板4次，加入TMB显色液；变色后加入终止液；单波450nm检测OD值。
5.3实验结果
如图8所示，通过阻断效应检测，发现ARTN#26抗体可显著抑制ARTN与GFRα3的结合，并且呈浓度依赖性的抑制，IC50＝59.95nM。
实施例6.抗人ARTN#26抗体体外抑制HepG2细胞增殖
6.1实验材料
ARTN蛋白购自R&D公司，CCK8试剂购自达科为生物技术股份有限公司。
6.2实验方法
HepG2细胞(人肝癌细胞，购自中国科学院细胞库，货号：TCHu72)以6X103/孔密度铺于96孔板中，18-24小时后，分别加入ARTN(50ng/ml)，ARTN#26(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)、IgG(50μg/ml)和空白孔做阴性对照，各设3个复孔。培养72h后，每孔加入10μl CCK8工作液，常规培养1-4h，利用酶标仪测定450nm波长处各孔光吸收值，同时用空白对照调零，测取吸光值。
6.3实验结果
如图9所示，我们发现ARTN可促进肝癌细胞HepG2细胞的增殖，ARTN#26抗体可显著抑制ARTN介导的促肝癌生长效应。
实施例7.ARTN抗体抑制ARTN介导的促肿瘤侵袭
7.1实验材料
Matrigel(货号：354234)、Transwell小室(货号：3422)购自康宁(Corning)公司，快速瑞氏-姬姆萨染液购自南京建成科技有限公司。
7.2实验方法
冰上用无血清培养基稀释Matrigel胶(1：5-1：10)，取100μl稀释的Matrigel胶加入24孔Transwell小室(8μm)上室，培养箱孵育1-5小时后用无血清培养基清洗凝胶，使之充分水化；取对数生长期的各组细胞，胰蛋白酶常规消化，无血清培养基重悬，HepG2细胞调整密度为6X105个细胞/ml，Patu8988细胞(人胰腺癌细胞，购自上海逐一生物科技有限公司)调整密度为5X105个细胞/ml；设置3个复孔，取细胞悬液200μl加入铺好Matrigel胶的Transwell小室上室，同时在下室加入600μl含10％ FBS的完全培养基，常规培养24h；取出Transwell小室，吸除上室培养液，用棉签擦掉小室内膜面细胞，姬姆萨染液室温染色3分钟、终止染色8分钟，PBS清洗3次，室温下自然风干；在显微镜下随机挑选5-10个视野，200X拍照并计算穿膜细胞数。
7.3实验结果
如图10、11所示，结果显示，ARTN可促进肝癌细胞、胰腺癌细胞的侵袭，ARTN#26抗体可抑制ARTN介导的促肝癌、胰腺癌侵袭效应。
实施例8.ARTN抗体体内抗肿瘤效应检测
8.1实验材料
BALB/c裸鼠购买自江苏集萃药康生物技术有限公司。
8.2实验方法
BALB/c裸鼠(6-8周，雄鼠)皮下注射0.2mL研磨的SMMC-LTNM(裸鼠人肝癌组织模型)肿瘤组织，构建肝癌模型。接种7天后，尾静脉给药(包括PBS、ARTN、ARTN+ARTN#26抗体组，ARTN：2μg/只，抗体：10μg/只)，间隔2天给药一次，共给药5次，观察肿瘤的生长情况。用游标卡尺在第5、10、15天测量肿瘤大小(给药当天记为第0天)，接种第22天小鼠颈椎脱臼死亡，对ARTN抗体进行疗效评估。
8.3实验结果
如图12所示，在裸鼠肝癌模型上，可以看出ARTN能够促进肝癌的生长，ARTN抗体#26可显著的抑制ARTN介导的促肝癌生长效应。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
附录：
本发明的技术方案中所涉及序列的序列号、序列名称和具体序列如下：
Claims (10)
1.一种靶向Artemin的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中：
所述重链可变区包含重链互补决定区(VHCDR)1结构域、VHCDR2结构域和VHCDR3结构域，
所述VHCDR1结构域具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，
所述VHCDR2结构域具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
所述VHCDR3结构域具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，
所述轻链可变区包含轻链互补决定区(VLCDR)1结构域、VLCDR2结构域和VLCDR3结构域，
所述VLCDR1结构域具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，
所述VLCDR2结构域具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，
所述VLCDR3结构域具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，
其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有90％以上序列相同性的氨基酸序列，和/或
其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有90％以上序列相同性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2中所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：scFv-Fc、scFv、(scFv)2、dsFv、Fab、F(ab’)2功能性片段或其全长形式。
4.如权利要求1或2中所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Artemin是哺乳动物Artemin，所述哺乳动物Artemin优选人Artemin；和/或
所述抗体或其抗原结合片段包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)和/或其轻链恒定区为κ或λ，优选人恒定区；和/或
所述抗体或其抗原结合片段能够抑制癌细胞的增殖、转移和/或侵袭。
5.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.一种表达载体或宿主细胞，所述表达载体或宿主细胞包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种制备如权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)在允许如权利要求5所述核酸分子表达的条件下，培养包含所述核酸分子的宿主细胞，
(b)分离如权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
(c)任选地，对所得抗体或其抗原结合片段进行纯化和/或鉴定(例如鉴定其分子量大小、特异性)。
8.如权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用，
例如所述肿瘤选自：实体瘤，例如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、甲状腺癌、结肠癌、食道癌和非小细胞肺癌；优选所述肿瘤选自：肝癌，胰腺癌；
所述药物能够抑制癌细胞的增殖、转移和/或侵袭。
9.一种产品，其包含如权利要求1～4所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求5所述的核酸分子，或权利要求6所述的表达载体或宿主细胞；
所述产品是用于如下应用的产品：用于肿瘤治疗的药物或用于药物研发的材料；
例如所述肿瘤选自：实体瘤，例如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、甲状腺癌、结肠癌、食道癌和非小细胞肺癌；优选所述肿瘤选自：肝癌，胰腺癌。
10.如权利要求9所述的产品，所述产品包括：单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体-药物偶联物(ADC)或嵌合抗原受体(CAR)。
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| CN102711772A (zh) * | 2009-10-16 | 2012-10-03 | 奥克兰联合服务有限公司 | Artemin拮抗剂的抗肿瘤用途 |
| CN107827983A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-03-23 | 中国药科大学 | 一种靶向artn的单链抗体、制备方法及应用 |
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2023
- 2023-10-26 CN CN202311399957.3A patent/CN117700545A/zh active Pending
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