KR20230139570A - 친화도가 성숙된 cd47에 특이적인 인간화 항체 - Google Patents

친화도가 성숙된 cd47에 특이적인 인간화 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체, 상기 친화도가 성숙된 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 CD47에 결합하는 항체(3A5 항체)를 이용하여 인간화된 항체(Hu3A5V10 항체)를 제조하였으며, 상기 인간화된 항-CD47 항체는 CD47 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 인간화된 항-CD47 항체의 친화도가 성숙된 3종의 인간화된 항-CD47 항체를 제조하였으며, 이들 항체가 항원과의 결합력 및 친화도가 증가한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체는 CD47의 과발현에 의한 면역 반응이 억제되는 질환 또는 종양의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용할 수 있다.

Description

친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체{Affinity matured humanized antibody specific for CD47}
본 발명은 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체, 상기 친화도가 성숙된 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
CD47은 인테그린 결합 단백질(IAP)이라고도 하며, 세포 표면에서 광범위하게 발현되는 막관통 당단백질로서, 면역글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속하며, 인테그린, SIRPα(신호조절 단백질α), SIRPγ와 트롬보스폰딘(thrombospondin)과 같은 다양한 리간드와 상호 작용을 한다.
종양세포는 CD47의 과발현에 의한 면역 감시를 효과적으로 회피할 수 있으므로, CD47 및 CD47-SIRPα 신호 시스템은 종양 치료에서의 잠재적인 약물 표적으로서 가장 주목을 받고 있다. 이러한 CD47을 과발현하는 종양세포 또는 CD47 과발현과 관련된 질환 등의 치료 또는 진단을 위해 CD47에 특이적인 항체의 개발이 이루어지고 있으며, 국제공개특허 WO2018-075857호, 국제공개특허 WO2017-121771호 및 국제공개특허 WO2013-119714호에는 다양한 항-CD47 항체에 대해 개시되어 있다.
상기와 같이 치료를 위한 항체의 생산을 위해 주로 마우스를 이용하여 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 생산하고 있다. 하지만 마우스 유래 단일클론 항체와 같은 비인간 항체들은 인체 내에서 외래 항원으로 간주되기 때문에 면역반응을 유발하고 반감기가 짧기 때문에 치료효과가 제한적인 문제점이 있다.
상기 문제를 해결하기 위해 항체의 항원과 결합하는 CDR 부위만을 제외한 나머지 부분을 인간 항체로 치환한 인간화 항체가 개발되었다. 현재 사용되고 있는 마우스 항체의 인간화 항체로의 치환방법으로는 치환할 항체에 대한 가장 유사한 인간 항체 유전자를 선정하고, CDR 이식이라 불리는 방법으로 마우스 항체의 CDR 부위만을 인간 항체 CDR 위치로 치환하는 것이다. 이와 같은 인간화 항체는 유전자의 대부분을 인간화 하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 줄일 수 있는 장점이 있다.
그러나 단순히 CDR 부위만을 이식할 경우 인간화 항체의 친화도가 떨어지는 경우가 많으므로, CDR의 아미노산 잔기들과 중요하게 상호작용하는 FR(framework region) 아미노산 잔기들을 함께 인간화 항체 FR에 이식시켜 인간화 항체의 가변부위를 제작할 수 있다. 제작된 인간화 항체는 원하는 수준의 친화도와 물성을 얻기 위해 항체의 변이를 통한 최적화 과정을 거쳐 친화도 성숙된 인간화된 항체를 제조할 수 있다.
이에, 본 발명에서는 인체 내에서 면역반응을 줄이기 위해 CD47에 결합하는 항체(3A5)를 선별하고, 이를 이용하여 인간화된 항-CD47 항체(Hu3A5V10)를 제조하였다. 또한, Hu3A5V10 항체의 친화도가 성숙된 3종의 인간화된 항-CD47 항체를 제조하였으며, 이들 항체가 항원과의 결합력 및 친화도가 증가한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 항체를 발현하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (1) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
(3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체, 바람직하게는 scFv(Single-chain variable fragment) 또는 전장항체(full length antibody)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 항체는 CD47이 신호-조절-단백질(SIRPα)과 상호 작용하는 것을 방지하거나, CD47-발현 세포에 대한 대식세포 매개 식균 작용을 촉진할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 있어서, 상기 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서는 CD47에 결합하는 항체(3A5 항체)를 이용하여 인간화된 항체(Hu3A5V10 항체)를 제조하였으며, 상기 인간화된 항-CD47 항체는 CD47 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 인간화된 항-CD47 항체의 친화도가 성숙된 3종의 인간화된 항-CD47 항체를 제조하였으며, 이들 항체가 항원과의 결합력 및 친화도가 증가한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체는 CD47의 과발현에 의한 면역 반응이 억제되는 질환 또는 종양의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 선별한 3A5(mouse) 항체의 CD47 과발현 종양세포(MCF-7)에 대한 결합력을 유세포분석기(flow cytometer)로 확인한 데이터이다.
도 2는 본 발명의 인간화된 3A5 항체(Hu3A5V10 항체)의 CD47 과발현 종양세포(MCF-7)에 대한 결합력을 유세포분석기(flow cytometer)로 확인한 데이터이다.
도 3은 본 발명의 친화도 성숙된 인간화 3A5 항체의 친화도를 측정하는 방법(SPR, surface plasmon resonance)을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 인간화된 3A5 항체(Hu3A5V10 항체)와 친화도 성숙된 인간화 3A5 항체(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)의 친화도 분석결과를 나타낸 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화된 항체
본 발명은 일관점에서, (1) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
(3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "인간화 항체" 또는 "인간화된 항체"는 항원 결합에 핵심적인 부분인 CDR 부위를 제외한 나머지 부분을 인간에 의해 생산된 항체와 상응하는 아미노산 서열이 되도록 하여 보다 인간 항체와의 유사성이 증가된 항체를 의미한다. 항체(non-human antibody)를 인간화하는 가장 일반적인 방법으로는 동물항체의 CDR 부위를 인간 항체에 이식하는 CDR-그라프팅(CDR-grafting) 방법이 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "친화도 성숙된(affinity matured) 인간화 항체"는 기준 항체(항원 결합 분자)의 친화도에 비해 더 높은 항원에 대한 친화도를 가지는 항체를 의미한다. 일반적으로, CDR-그라프팅 방법을 이용하여 인간화 항체를 제조한 경우, 인간화 항체의 친화도가 떨어지므로 CDR의 아미노산 잔기들과 중요하게 상호작용하는 FR(framework region) 영역의 아미노산 잔기를 인간화 항체 FR에 이식시켜 친화도가 성숙된 인간화 항체를 제조할 수 있다.
친화도는 항원과의 결합 친화도로 확인할 수 있으며, "결합 친화도"는 평형 해리 상수(KD, dissociation constant)로 표현될 수 있다. KD 값이 낮을수록 항체의 항원에 대한 친화도가 높으며, KD 값이 높을수록 친화도가 낮아지게 된다.
본 발명에서, 상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 본 발명에서, 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 모노클로날 항체 또는 단일클론항체라고도 불리며, 단일 항체 형성세포가 생성하는 항체로, 1차 구조(아미노산 배열)가 균일한 특징이 있다. 오직 하나의 항원 결정기만을 인식하며, 일반적으로 암세포와 항체생산세포를 융합한 하이브리도마(hybridoma cell)을 배양하여 생산된다.
본 발명에서, 용어 "CDR", 즉 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 부위 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비근접(non-contiguous) 항원 결합 부위를 의미하는 것이다.
본 발명의 용어 "항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태(전장항체)뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 펩타이드 태그(에피토프) 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 scFv, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다. 전장항체(full length antibody)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어지는 항체를 의미하며, 중쇄는 중쇄 가변부위(VH) 및 중쇄 불변부위(CH1, CH2, CH3)로, 경쇄는 경쇄 가변부위(VL) 및 경쇄 불변부위(CL1)로 구성된다. 본 발명의 항체는 바람직하게, scFv(Single-chain variable fragment) 또는 전장항체(full length antibody) 제조될 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 CD47 단백질 전체 또는 일부 펩타이드를 면역원(또는 항원)으로 이용하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 우선 면역원으로서 CD47, CD47 단백질을 포함하는 융합 단백질, 또는 CD47 단백질을 포함하는 캐리어(carrier)를 필요에 따라서 면역증강제인 아주반트(adjuvant)(예, Freund adjuvant)와 함께 인간을 제외한 포유동물의 피하, 근육, 정맥, 발볼록살 또는 복강 내에 1회 내지 그 이상 주사하는 것으로써 면역감작(immunization)을 시킨다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말 또는 소(인간 항체를 생산하는 형질 전환(transgenic) 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 조작된 형질 전환(transgenic) 동물을 포함한다.)이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭 또는 토끼이다. 첫 번째 면역으로부터 약 1 ~ 21일 마다 1 ~ 4회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1~10일 후에 면역 감작된 포유동물로부터 항체 생산하는 세포를 수득할 수 있다. 면역을 시키는 회수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 특징 등에 의하여 적당히 변경할 수 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조는 케이라 및 미르슈타인 등의 방법(Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) 및 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역 감작된 인간을 제외한 동물로부터 채취한 비장, 림프절, 골수 또는 편도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 생산하는 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 포유동물 유래의 골수종 세포(myeloma cells)를 세포 융합시키는 것에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 제조할 수 있다. 상기 포유동물은 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 닭, 토끼 또는 인간일 수 있고, 바람직하게는 마우스, 래트, 닭 또는 인간일 수 있다.
세포 융합은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스를 비롯한 융합 촉진제나 전기 펄스에 의한 방법이 이용되고, 일례를 들면, 융합 촉진제를 함유하는 융합 배지에 항체 생산 세포와 무한 증식 가능한 포유류 유래의 세포를 약 1:1 내지 1:10의 비율로 부유시켜, 이 상태로, 약 30 내지 40℃로 약 1 내지 5분간 배양한다. 융합 배지에는, 예를 들면, MEM 배지, RPMI1640 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 비롯한 통상의 일반적인 것을 이용하면 좋고, 소 혈청 등의 혈청류는 제외해 두는 것이 바람직하다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 방법은 우선, 상기한 바와 같이 획득한 융합 세포를 HAT 배지 등의 선택용 배지에 옮기고, 약 30 내지 40℃로 약 3일 내지 3주일 배양해서 하이브리도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등에서 하이브리도마를 배양한 후, 위에서 기술한 인간을 제외한 동물의 면역반응에 사용한 면역원과 배양 상청액과의 반응성이 증가된 부분을 RIA(radioactive substance-marked immuno antibody) 또는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)같은 면역분석방법을 통하여 찾는 방법을 통해 수행할 수 있다. 그리고 상기에서 찾은 단클론 항체를 생산하는 클론은 상기 면역원에 대하여 특이적인 결합력을 보여준다.
본 발명의 단클론 항체는, 이와 같은 하이브리도마를 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양에는, 포유동물 유래의 세포를 배양하기 위한 통상의 방법이 이용되며, 배양물 등으로부터 단클론 항체를 채취하기 위해서는, 항체 일반을 정제하기 위한 이 분야에서의 통상의 방법이 이용된다. 각각의 방법으로서는, 예를들면, 염석(鹽析), 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있고, 이들은 필요에 따라서 조합해서 적용된다. 정제한 단클론 항체는, 그 후, 농축, 건조하여, 용도에 따라서 액상 또는 고상으로 한다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는, CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해, 항-CD47 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조 및 스크리닝 하여, CD47에 특이적으로 결합하는 항체(scFv)를 선별하였으며, 이를 3A5로 명명하였다.
상기 3A5 항체는 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYTFTSYW), 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(IDPSDSYT) 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARGGKRAMDY)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLVHSNGNTY), 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(KVS) 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(SQSTHVPFT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 3A5 항체는 서열번호 7의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 9의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 10의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서, 항-CD47 항체인 3A5를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody)인 Hu3A5V10 항체를 제조하였다. 상기 Hu3A5V10 항체의 중쇄 가변부위 CDR과 경쇄 가변부위 CDR은 3A5 항체와 동일한 것으로 CDR 부분을 제외한 나머지 부분을 인간화하였다.
바람직하게 Hu3A5V10 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 13의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 14의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서, 상기 Hu3A5V10 항체를 이용하여 친화도가 성숙된 인간화 항체 3종(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)을 제조하였다.
바람직하게 AHF16309 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 17의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 18의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16310 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 21의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 22의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16312 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 25의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 26의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적인 항체가 scFv(single chain variable fragment)로 제조될 경우, scFv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위가 링커로 연결될 수 있도록 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 상기 링커는 바람직하게 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열번호 27의 아미노산 서열은 서열번호 28의 염기서열로 코딩될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
경쇄 가변부위-링커-중쇄 가변부위로 연결된 경우 3A5 항체는 서열번호 29의 아미노산 서열 또는 서열번호 30의 염기서열로, Hu3A5V10 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열 또는 서열번호 32의 염기서열로 표시될 수 있다. 친화도가 성숙된 인간화 항체인 AHF16309 항체는 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 서열번호 34의 염기서열로, AHF16310 항체는 서열번호 35의 아미노산 서열 또는 서열번호 36의 염기서열로, AHF16312 항체는 서열번호 37의 아미노산 서열 또는 서열번호 38의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적인 항체가 전장항체(full length antibody)로 제조될 경우, 각 항체의 중쇄 가변부위C-말단 부분에 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변부위(CH1, CH2, CH3)가 추가될 수 있으며, 각 항체의 경쇄 가변부위 C-말단 부분에는 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변부위(CL1)가 추가될 수 있다. 상기 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변부위는 서열번호 41 또는 서열번호 42의 염기서열로 코딩될 수 있으며, 상기 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변부위는 서열번호 43의 염기서열로 코딩될 수 있다.
바람직하게, Hu3A5V10 전장 항체는 서열번호 44의 아미노산서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 46의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 47의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16309 전장 항체는 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 49의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 50의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 51의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16310 전장 항체는 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 54의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 55의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16312 전장 항체는 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 58의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 59의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 있어서, 본 발명에서 제조한 CD47에 특이적인 인간화 항체(Hu3A5V10 항체) 및 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)의 친화도, 즉, 항원과의 결합 친화도를 측정하였다. 각 항체를 전장 항체로 제조한 다음, 도 3에 나타난 방법으로 각 항체의 친화도를 측정한 결과, 도 4 및 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체의 친화도가 Hu3A5V10 항체에 비해 높은 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 CD47이 신호-조절-단백질(SIRPα)과 상호 작용하는 것을 방지하거나, CD47-발현 세포에 대한 대식세포 매개 식균 작용을 촉진할 수 있다.
본 발명의 친화도 성숙된 인간화 항체는 항원과의 친화도가 상승하였으므로, 종양세포에서 과발현된 CD47을 보다 효과적으로 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 친화도 성숙된 인간화 항체는 CD47-SIRPα 결합을 차단하여 암 또는 종양 세포의 면역회피를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 대식세포에 의한 CD47을 과발현하는 암 세포의 대식작용을 효과적으로 촉진할 수 있으므로, CD47을 과발현하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 항체 치료제로 활용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 임의의 길이로 분리된 핵산 분자(nucleic acid molecule), 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 (1) 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭과 같은 in-vitro 증폭; (2) 클로닝 및 재조합; (3) 절단(digestion) 및 겔 전기영동분리와 같은 정제; (4) 화학 합성과 같은 합성을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게 분리된 폴리뉴클레오타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본 발명에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하기 위한 핵산은 합성 올리고뉴클레오티드의 제한 단편 조작(restriction fragment operation) 또는 SOE PCR의 적용을 포함하지만 이에 제한하지 않고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5' 비-전사 서열, 및5' 또는 3' 비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5' 비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "형질전환체"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미하고, 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다.
상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 항체 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다.
본 발명에 따른 벡터는 항체의 생산을 위해 숙주세포, 바람직하게는 포유동물 세포에 형질전환 시킬 수 있다. 완벽한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 적합한 숙주 세포는 COS-1(예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들면, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들면, ATCC CRL-10), CHO(예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들면, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들 세포는 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection, 미국)으로부터 용이하게 이용 가능하다.
CD47 과발현에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는, CD47 과발현에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 CD47 과발현에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양일 수 있으며, 바람직하게, CD47을 과발현하는 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 치료제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 치료제는 CD47에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄에 공유결합된 상태로 존재하거나, 본 발명의 CD47에 특이적인 인간화 항체와 병용투여할 수 있다.
상기 치료제는 저분자 약물, 펩타이드성 약물, 독소(예를 들어, 세포독소) 등을 포함한다. 또한, 상기 치료제는 항암제일 수 있다. 항암제는 암 세포의 증식을 감소시키고, 세포독성 약제 및 세포 증식 억제제를 아우르는 비-펩타이드성(즉, 비-단백질계) 화합물을 포함한다. 항암제의 비제한적인 예는 알킬화제, 니트로소요소, 항대사물질, 항종양 항생물질, 식물(빈카) 알칼로이드 및 스테로이드 호르몬을 포함한다. 펩타이드성 화합물 또한 사용될 수 있다.
상기 약제 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 목표 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하는 데 필요한 치료제의 양을 의미하고, 또는 감지할 수 있는 정도의 치료 또는 예방효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 뜻한다. 어떤 항체에 대하여, 치료적 유효 투여량은 세포배양 분석법 또는 보통 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류와 같은 동물 모델로 최초로 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도범위와 투여루트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 정보는 인간의 투약을 위해 유용한 투여량 및 루트를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간환자를 위한 정밀한 유효량은 질환상태의 심각도, 환자의 일반적 건강 상태, 환자의 나이, 체중 및 성별, 식이요법, 투여시간, 투여빈도, 약제조성, 반응감도 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의사의 판단의 범위 내에 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 0.01 ~ 50mg/kg, 바람직하게는 0.1 ~ 20mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 15mg/kg이다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여되거나, 또는 다른 제제, 약제 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 투여되는 투여량은 치료될 상태의 성질, 악성 림프종 또는 백혈병의 등급, 및 항체가 질환 예방 차원에서 사용되는지 또는 현존하는 상태를 치료하기 위해 사용되는지에 따라 달라진다.
투여빈도는 항체분자의 반감기, 약 효과의 지속성에 따라 달라진다. 만약 항체분자가 짧은 반감기(예, 2 ~ 10시간)를 가지면, 하루당 1회 또는 그 이상의 투여량을 제공할 필요가 있다. 또는, 항체분자가 긴 반감기(예, 2 ~ 15일)를 가지면, 하루에 한번, 일주일에 한차례, 또는 매 1개월 또는 2개월당 한차례의 투여량을 제공할 필요가 있다.
또한, 약제 조성물은 항체의 투여를 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자신이 조성물을 투여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 유발해서는 안되고, 독성이 없어야만 한다. 적당한 담체로는 단백질, 폴리펩타이드, 리포오좀, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 아미노산 중합체, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자들과 같은, 서서히 물질대사되는 거대분자일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염들은, 예를 들면, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염과 같은 미네랄산염들, 또는 아세트산, 프로피온산. 말론산 및 벤조산 같은 유기산의 염들이 사용될 수 있다.
치료 조성물내의 약제학적으로 허용가능한 담체는 부가적으로, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질들이 이런한 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 담체는 환자에 의한 약제 조성물 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
투여를 위한 바람직한 형태는, 예로써 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의한 비경구적 투약에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주입 또는 주사용일 경우에는, 오일 또는 수용성 부형제내의 현탁제, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 이는 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 처방제들을 포함할 수 있다. 또는, 항체분자는 무수형태일 수 있고, 사용전에 적절한 멸균액으로 재구성될 수 있다.
일단 제제화된 경우, 본 발명의 조성물은 환자에게 직접 투여될 수 있다. 치료받을 환자들은 동물일 수 있다. 그러나, 조성물은 인간 환자 투여를 위해 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제 조성물은 제한은 없지만, 경구, 정맥, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous), 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 경로에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 물질로서 제조될 수 있다. 또한, 주입전에 액체 부형제내용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하주사, 복강내주사, 정맥내주사, 근육내주사에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 조직의 간질(interstitial) 공간으로 전달될 수도 있다. 또한, 조성물은 상처부위로 투여될 수 있다. 투여량 처리는 단일 복용 스케쥴 또는 다중 복용 스케쥴일 수 있다.
CD47를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 진단 또는 모니터링
본 발명은 또 다른 관점에서, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 CD47를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 진단 또는 모니터링용 조성물에 관한 것이다.
상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 항체 또는 이의 단편은 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적 표지는 검출가능 표지를 포함하는 2차 항체를 포함하는데, 여기서 2차 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 항체에 결합한다. 다른 간접적 표지는 바이오틴을 포함하는데, 여기서 바이오티닐화된 CD47에 특이적으로 결합하는 항체는 검출가능 표지를 포함하는 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하여 검출될 수 있다.
적절한 검출가능 표지는 분광분석적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 모든 조성물을 포함한다. 적절한 표지는, 비제한적으로, 자석 비드, 형광염료(예를 들어, 플루오레세인이소티오시안산염, 텍사스 레드, 로다민, 초록 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 등), 방사성 표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들어, 겨자무과산화효소, 알칼린 포스파타아제, 루시퍼라아제 및 효소-연결 면역흡착검사(ELISA)에 일반적으로 사용되는 것들) 및 콜로이드성 골드 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 표색계 표지를 포함한다.
또한, 진단 또는 모니터링을 위해 상기 항체는 형광 단백질로 표지될 수 있으며, 조영제 또는 방사선 동위원소를 포함할 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 진단 키트에 이용하는 경우, 상기 항체는 지지체에 고정되어 있으며, 상기 지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 또는 멤브레인 일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
CD47에 특이적으로 결합하는 항체 제조 및 선별
CD47 펩타이드 특이적인 항체를 선별하기위해, CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하여 항체를 선별하였다.
먼저, CD47 단백질(Acrobiosystems, cat# CD7-HA2E9)을 면역하여 비장세포를 적출하고 마우스 골수증세포와 세포 융합을 통하여 하이브리도마 세포를 제작하였다.
세포 융합에 이용하는 마우스 골수종 세포는 HGPRT(Hypoxanthine Guanidine-Phosphoribosyl-Transferase)를 가지고 있지 않기 때문에 HAT 배지에서는 생존할 수 없으나, 하이브리도마는 비장세포와 융합함으로써 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 이를 이용하면 하이브리도마만을 증식시킬 수 있으므로, 통상 하이브리도마를 확립시킬때까지 HAT 배지에서 증식시켰다.
증식된 하이브리도마 중에서 CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하기 위해 한계희석법을 사용하였다. 우선 96웰당 1개 세포 이하가 되도록 한 다음, 1개의 세포로부터 증식된 클론에서 얻어진 항체가 CD47과 결합하는지를 ELISA로 확인하고 CD47과 결합하는 클론을 선별하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 이와 같은 방법으로 CD47에 결합하는 항체를 수득하였다.
상기 항체는 3A5로 명명하였으며, 이들의 염기서열과 아미노산 서열을 분석하였다. 서열분석 결과에 따른 각 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 1에 나타내었으며, 표 1에서 밑줄 친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미한다.
3A5 항체의 서열정보
3A5 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYTFTSYW 서열번호 1
중쇄가변부위 CDR2 IDPSDSYT 서열번호 2
중쇄가변부위 CDR3 ARGGKRAMDY 서열번호 3
경쇄가변부위 CDR1 QSLVHSNGNTY 서열번호 4
경쇄가변부위 CDR2 KVS 서열번호 5
경쇄가변부위 CDR3 SQSTHVPFT 서열번호 6
중쇄가변부위
아미노산서열		 EVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYW MHWMNQRPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTSVTVSS 서열번호 7
경쇄가변부위
아미노산서열		 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWYLQKPGQSPKLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC SQSTHVPFT FGSGTKLEIK 서열번호 8
중쇄가변부위
염기서열		 GAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGATGAACCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGGTAAGAGAGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 서열번호 9
경쇄가변부위
염기서열		 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 서열번호 10
선별한 항체의 CD47에 대한 특이성 확인 - ELISA 및 유세포분석(flow cytometer)
2-1: ELISA 분석
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, CD47 펩타이드를 코딩하기 위해, CD47 단백질(Acrobiosystems, cat#CD7-HA2E9)을 100 ng/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 분주한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 3% BSA가 포함된 1 X PBST를 처리한 후, 상온에서 30분 동안 블로킹시켰다.
3A5 항체(scFv)를 생산하는 각 클론의 하이브리도마 세포 배양액 3 ㎕를 각 웰에 처리한 다음, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-HRP, 1:10,000)를 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척한 다음, 발색을 위해 TMB를 처리하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로 1N H2SO4의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 종료시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA 실험 조건
ELISA reader Infinite F50
Measurement Filter 450 nm
Measurement Mode Single Point Photo
Antigen Coating 100 ng/well
2 nd Antibody (Anti-mIgG -HRP) 1:10,000 dilution
Substrate TMB
ELISA 실험 결과
항체 종류 OD450 측정값
3A5 2.010
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 선별한 3A5 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
2-2: 유세포분석(flow cytometer)기를 이용한 분석
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 유세포분석(flow cytometer)을 수행하였다.
먼저, CD47을 과발현하는 유방암세포주 MCF-7(1 x 107개)과 3A5 항체(1 ㎍)를 30분간 반응시킨다음, 2차 항체로 표면(surface)을 염색한 후, 유세포분석기로 측정하였다.
양성 대조군(positive control)으로 CD47 항체(Biolegend PE anti-human CD47, cat# 323108, 5 ㎕)를, 2차 항체로는 PE-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체(PE-conjugated goat anti-mouse IgG; Biolegend Inc., cat# 405307, 미국, 5 ㎕)를 사용하였다.
유세포분석 결과
항체 종류 Count Median Mean
3A5 11285 13866 14951
positive 11535 10972 11930
2 nd Ab alone 11285 73.9 80
none 11077 24.5 25.0
그 결과, 도 1 및 표 4에 나타난 바와 같이 3A5 항체는 CD47을 과발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
3A5 항체 기반 인간화 항체 제조
상기 실시예 1에서 선별한 3A5 항체를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody)를 제조하였다.
구체적으로, 인간 항체의 생식계열 염기서열(germline sequence)를 프레임(frame)으로하여 CD47과 결합하는 마우스 항체의 CDR를 인간 항체의 CDR를 교체하는 CDR-그라프팅(CDR grafting) 방법으로 마우스 3A5 항체를 인간화한 항체를 제조하였다. 이를 Hu3A5V10 항체로 명명하였으며, 아미노산 서열을 분석하였다.
서열분석 결과에 따른 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 5에 나타내었다. 밑줄 친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미하며, Hu3A5V10 항체의 CDR은 모두 상기 마우스 3A5 항체(표 1)의 CDR과 동일하다.
Hu3A5V10 항체의 서열정보
Hu3A5V10 서열정보 서열번호
중쇄가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 11
경쇄가변부위
아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 12
중쇄가변부위
염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTTCGGAGCTGAAGAAGCCAGGTGCATCCGTGAAGGTATCATGCAAAGCTTCCGGCTACACGTTCACCAGCTATTGGATGCATTGGATGCGCCAGGCCCCTGGGCAGGGGCTTGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCAAGTGACAGCTACACCAGCTACAACCAGGGCTTCACCGGCCGGTTCGTCCTCTCCGTTGATACCAGCGTATCCACGGCCTACCTGCAAATTTCCAGCCTGAAAGCGGAGGACACAGCTGTTTACTACTGTGCTCGTGGCGGGAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTGTCCTCT 서열번호 13
경쇄가변부위
염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCGCTGCCGGTGACTCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCTTGCCGATCTTCCCAGTCCTTGGTCCACTCTAATGGCAACACGTACTTGCACTGGTTCCAGCAGCGTCCCGGGCAGAGCCCTCGCCTGCTGATCTACAAGGTGTCGAACCGCTTCTCGGGCGTCCCCGACAGGTTTTCAGGCTCCGGTAGTGGCACCGACTTTACTCTCAAGATCAGCCGCGTGGAGGCGGAAGATGTGGGCGTGTACTACTGTTCTCAGTCCACTCACGTCCCCTTCACCTTTGGCGGTGGGACCAAGCTAGAGATCAAG 서열번호 14
인간화된 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성 확인 - ELISA와 유세포분석(flow cytometer)
4-1: ELISA 분석
본 발명에서는 상기 실시예 3에서 확립한 Hu3A5V10 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 ELISA 분석을 수행하였다.
ELISA 실험 결과
항체 종류 OD450 측정값
Hu3A5V10 2.8076
음성대조군 0.0431
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, Hu3A5V10 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
4-2: 유세포분석(flow cytometer)를 이용한 분석
본 발명에서는 상기 실시예 3에서 확립한 Hu3A5V10 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 유세포분석(flow cytometer)을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 Hu3A5V10 항체는 CD47을 과발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
3A5 항체 기반 친화도 성숙된 인간화 항체 제조
상기 실시예 3에서 제조한 Hu3A5V10 항체의 항원에 대한 친화도를 높이기 위해, 친화도 성숙된 인간화 항체를 제조하였다. 친화도 성숙된 인간화 항체는 진스크립트(GenScript)에 의뢰하여 제조하였으며, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 합성하여 FESEB 벡터(Gencript)에 클로닝하고 박테리아(TG1 competent E. coli)으로 형질전환 시킨 후, IPTG로 유도하여 Fab를 생산하는 시스템(Fab FASEBA sample)을 구축하였다. 또한, PML(precise mutagenesis library) 라이브러리를 제작하여 친화도 성숙된 항체를 최종적으로 선별하였다.
보다 구체적으로, E. coli에 대한 최적 코돈을 사용하여 항체 CDR 영역의 67개 잔기를 다른 19개의 원하는 아미노산으로 돌연변이시켰다. 프로그래밍 가능한 마이크로어레이에서 DNA 올리고뉴클레오티드 라이브러리 합성을 수행하였으며, 라이브러리 품질은 NGS를 통해 90%의 최소 적용 범위를 보장하였다. E. coli에서의 발현을 위해 각 PML 라이브러리에서 48개의 클론을 무작위로 선택한 다음, 48개의 PML 라이브러리 클론을 접종하고 96-딥 웰 플레이트에서 발현을 유도하였다. 그 다음, 배지에서 분비된 항체의 발현, 및 인간 CD47 단백질에 대한 결합친화도를 ELISA를 이용하여 평가하였다.
최종적으로 친화도가 성숙된 인간화 항체 3종을 선별하였으며, 각각 AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체로 명명하고, 아미노산 서열을 분석하였다.
서열분석 결과에 따른 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 7 내지 표 9에 나타내었다.
AHF16309 항체의 서열정보
AHF16309 서열정보 서열번호
중쇄 가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRMMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 15
경쇄 가변부위
아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LNWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 16
중쇄 가변부위
염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTTAAGGTGTCTTGTAAAGCTTCTGGCTACACCTTCACATCTTATTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTGGAATGGATCGGCGTGATCGATCCTAACGACAGCTACACCTCCTACAACCAGGGATTTACCGGCAGATTCGTGCTGAGCGTGGACACCAGCGTCAGCACAGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCTGAAGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGGAAAGCGGATGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGC 서열번호 17
경쇄 가변부위
염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGCCAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGTCTCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTCAACTGGTTCCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCCCCTAGACTGCTGATCTATAAGGTGTCCAACCGGTTTCCAGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGCAGCGGATCTGGCACCGACTTCACACTGAAAATCTCTAGAGTTGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGCAGCCAGTCCACCCACGTGCCCTTCACCTTCGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG 서열번호 18
AHF16310 항체의 서열정보
AHF16310 서열정보 서열번호
중쇄 가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRMMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 19
경쇄 가변부위
아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 20
중쇄 가변부위
염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTTAAGGTGTCTTGTAAAGCTTCTGGCTACACCTTCACATCTTATTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTGGAATGGATCGGCGTGATCGATCCTAACGACAGCTACACCTCCTACAACCAGGGATTTACCGGCAGATTCGTGCTGAGCGTGGACACCAGCGTCAGCACAGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCTGAAGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGGAAAGCGGATGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGC 서열번호 21
경쇄 가변부위
염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGTCTCCACTGAGCCTGCCTGTGACCCTCGGCCAACCTGCCAGCATCTCTTGTAGAAGCAGCCAGTCCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTTCCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTATAAGGTGTCCAACCGGTTTACAGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGAAAATCAGCAGAGTCGAGGCCGAGGACGTTGGAGTGTACTACTGCAGCCAGTCTACACACGTGCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG 서열번호 22
AHF16312 항체의 서열정보
AHF16312 서열정보 서열번호
중쇄 가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRIMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 23
경쇄 가변부위
아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 24
중쇄
염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCTTGTAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCGTGATCGACCCCAACGACAGCTATACATCTTACAACCAGGGATTTACCGGCAGATTCGTGCTGAGCGTCGACACCAGCGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCTGAAGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGGCAAGCGGATCATGGATTACTGGGGACAAGGCACCACAGTTACAGTGTCCAGC 서열번호 25
경쇄 가변부위
염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGTCTCCACTGAGCCTGCCTGTGACCCTCGGCCAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGTCCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTATAAGGTGTCCAACCGGTTCACCGGCGTTCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGAAAATCTCTAGAGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGTCCACCCACGTGCCCTTCACATTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG 서열번호 26
친화도 측정
본 발명에서는 실시예 3의 Hu3A5V10 항체 및 실시예 5의 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)의 친화도를 측정하기 위해, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변부위 및 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변부위를 각 항체의 아미노산 서열에 추가하여 IgG4 Fc에 연결하여 전장항체(full length anti body)를 제조하였다. 그 다음, 제조된 전장 항체를 사용하여 SPR(surface plasmon resonance) 방법으로 친화도를 측정하였다 (도 3).
인간 CD47에 대한 항체의 결합 친화도는 Biacore 8K를 사용하여 인간 CD47 단백질에 대한 친화도를 측정하였으며, 측정 조건은 하기 표 10과 같다.
실험조건
Capture
Ligand antibodies
Capture time(s) 30
Flow rate(μl/min) 10
Association & Dissociation
Association contact time(s) 120
Dissociation contact time(s) 360
Flow rate(μl/min) 30
Sample concentrations(nM) 100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.5625
Surface regeneration
Regeneration buffer 10 mM Glycine-HCl pH 1.5
Contact time(s) 30
Flow rate(μl/min) 30
항체의 항원에 대한 친화도
Ligand Analyte Chi²
(RU²)		 ka
(1/Ms)		 kd
(1/s)		 KD
(M)		 Rmax
(RU)
U822EGG010-
Hu3A5V10		 Human CD47 8.53E-01 1.00E+06 4.67E-04 4.65E-10 48
AHF16309 Human CD47 2.53E+00 2.78E+06 8.65E-04 3.12E-10 40
AHF16310 Human CD47 1.86E+00 2.21E+06 4.58E-04 2.08E-10 37.3
AHF16312 Human CD47 1.48E+00 1.85E+06 3.07E-04 1.66E-10 35.5
도 4 및 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체의 해리 상수(KD, dissociation constant)가 Hu3A5V10 항체에 비해 낮은 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 친화도 성숙된 인간화 항체의 항원(CD47)에 대한 결합력 및 친화도가 Hu3A5V10 항체에 비해 증가한 것을 확인하였다.
<110> InnoBation Bio Co., Ltd. <120> Affinity matured humanized antibody specific for CD47 <130> PDPC222268 <160> 59 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VH_CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VH_CDR2 <400> 2 Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VH_CDR3 <400> 3 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VL_CDR1 <400> 4 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VL_CDR2 <400> 5 Lys Val Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VL_CDR3 <400> 6 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VH <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VL <400> 8 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VH <400> 9 gaggtccagc tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactggat gaaccagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagtg attgatcctt ctgatagtta tactagctac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggggt 300 aagagagcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351 <210> 10 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5_VL <400> 10 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcca 300 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5V10_VH <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Leu Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5V10_VL <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5V10_VH <400> 13 gaggtgcagc tggtgcagag cggttcggag ctgaagaagc caggtgcatc cgtgaaggta 60 tcatgcaaag cttccggcta cacgttcacc agctattgga tgcattggat gcgccaggcc 120 cctgggcagg ggcttgagtg gatcggtgtg attgacccaa gtgacagcta caccagctac 180 aaccagggct tcaccggccg gttcgtcctc tccgttgata ccagcgtatc cacggcctac 240 ctgcaaattt ccagcctgaa agcggaggac acagctgttt actactgtgc tcgtggcggg 300 aagcgcgcca tggattattg gggccagggc accaccgtca ccgtgtcctc t 351 <210> 14 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5V10_VL <400> 14 gacgtggtga tgacccagag ccccctgtcg ctgccggtga ctcttggaca gccggcctcc 60 atctcttgcc gatcttccca gtccttggtc cactctaatg gcaacacgta cttgcactgg 120 ttccagcagc gtcccgggca gagccctcgc ctgctgatct acaaggtgtc gaaccgcttc 180 tcgggcgtcc ccgacaggtt ttcaggctcc ggtagtggca ccgactttac tctcaagatc 240 agccgcgtgg aggcggaaga tgtgggcgtg tactactgtt ctcagtccac tcacgtcccc 300 ttcacctttg gcggtgggac caagctagag atcaag 336 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16309_VH <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Asn Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Leu Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Met Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16309_VL <400> 16 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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 53 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16310 Full Length Antibody Light Chain <400> 53 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 54 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16310 Full Length Antibody Heavy Chain <400> 54 gaggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ccggcgccag cgttaaggtg 60 tcttgtaaag cttctggcta caccttcaca tcttattgga tgcactggat gagacaggcc 120 cctggacaag gcctggaatg gatcggcgtg atcgatccta acgacagcta cacctcctac 180 aaccagggat ttaccggcag attcgtgctg agcgtggaca ccagcgtcag cacagcctac 240 ctgcagatca gcagcctgaa ggctgaagat acagccgtgt actactgcgc cagaggcgga 300 aagcggatga tggactactg gggccagggc accaccgtga ccgtgtccag cgccagcacc 360 aagggccctt ccgtgtttcc cctggcccct tgctcccggt ccacatctga gagcaccgcc 420 gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc ccagagcccg tgaccgtgag ctggaacagc 480 ggcgccctga caagcggcgt gcacacattt cccgccgtgc tgcagagctc cggcctgtac 540 tccctgtcta gcgtggtgac agtgccttcc tctagcctgg gcaccaagac atatacctgt 600 aacgtggacc acaagccaag caataccaag gtggataagc gggtggagtc taagtacggc 660 cctccttgcc ctccatgtcc tgctccagag tttctgggcg gcccttccgt gttcctgttt 720 ccacccaaac caaaggacac actgatgatc tctagaacac cagaggtgac ctgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggagga tcccgaggtg cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcacaatg ccaagaccaa gccaagagag gagcagttta actctacata cagggtggtg 900 agcgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctcaacggca aggagtataa gtgcaaggtg 960 tccaataagg gcctgccctc ctctatcgag aagacaatct ctaaggctaa gggccagcca 1020 agagagcctc aggtgtacac cctgcctcca agccaggagg agatgacaaa gaaccaggtg 1080 tccctgacat gtctggtgaa gggcttctat ccctccgaca tcgccgtgga gtgggagtct 1140 aatggccagc ctgagaacaa ttacaagacc acaccccctg tgctggactc tgatggcagc 1200 ttctttctgt attccaggct gaccgtggat aagtctcggt ggcaggaggg caacgtgttc 1260 agctgctctg tgatgcacga agccctgcat aatcactata ctcagaaaag tctgtcactg 1320 tcactgggaa agtgataa 1338 <210> 55 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16310 Full Length Antibody Light Chain <400> 55 gacgtggtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga ccctcggcca acctgccagc 60 atctcttgta gaagcagcca gtccctggtg cacagcaacg gcaataccta cctgcactgg 120 ttccagcagc ggcctggcca gagccccaga ctgctgatct ataaggtgtc caaccggttt 180 acaggcgtgc ctgatagatt cagcggatct ggcagcggca cagacttcac cctgaaaatc 240 agcagagtcg aggccgagga cgttggagtg tactactgca gccagtctac acacgtgccc 300 ttcaccttcg gcggaggcac caagctggaa atcaagagga cagtggccgc cccaagcgtg 360 ttcatctttc ccccttccga cgagcagctg aagtctggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctaccctcg ggaggccaag gtccagtgga aggtggataa cgccctgcag 480 tctggcaata gccaggagtc cgtgaccgag caggactcta aggatagcac atattccctg 540 tctagcaccc tgacactgag caaggccgat tacgagaagc acaaggtgta tgcctgtgaa 600 gtcacccatc aggggctgtc atcacccgtc actaagtcat tcaatcgcgg agaatgc 657 <210> 56 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16312 full length antibody heavy chain <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Asn Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Leu Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 57 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16312 Full Length Antibody Light Chain <400> 57 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 58 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16312 full length antibody heavy chain <400> 58 gaggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ctggagcttc tgtgaaggtg 60 tcttgtaaag ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactggat gagacaggcc 120 cctggccagg gcctggaatg gatcggcgtg atcgacccca acgacagcta tacatcttac 180 aaccagggat ttaccggcag attcgtgctg agcgtcgaca ccagcgtgtc caccgcctac 240 ctgcagatca gcagcctgaa ggctgaagat accgccgtgt actactgcgc cagaggcggc 300 aagcggatca tggattactg gggacaaggc accacagtta cagtgtccag cgccagcacc 360 aagggccctt ccgtgtttcc cctggcccct tgctcccggt ccacatctga gagcaccgcc 420 gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc ccagagcccg tgaccgtgag ctggaacagc 480 ggcgccctga caagcggcgt gcacacattt cccgccgtgc tgcagagctc cggcctgtac 540 tccctgtcta gcgtggtgac agtgccttcc tctagcctgg gcaccaagac atatacctgt 600 aacgtggacc acaagccaag caataccaag gtggataagc gggtggagtc taagtacggc 660 cctccttgcc ctccatgtcc tgctccagag tttctgggcg gcccttccgt gttcctgttt 720 ccacccaaac caaaggacac actgatgatc tctagaacac cagaggtgac ctgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggagga tcccgaggtg cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcacaatg ccaagaccaa gccaagagag gagcagttta actctacata cagggtggtg 900 agcgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctcaacggca aggagtataa gtgcaaggtg 960 tccaataagg gcctgccctc ctctatcgag aagacaatct ctaaggctaa gggccagcca 1020 agagagcctc aggtgtacac cctgcctcca agccaggagg agatgacaaa gaaccaggtg 1080 tccctgacat gtctggtgaa gggcttctat ccctccgaca tcgccgtgga gtgggagtct 1140 aatggccagc ctgagaacaa ttacaagacc acaccccctg tgctggactc tgatggcagc 1200 ttctttctgt attccaggct gaccgtggat aagtctcggt ggcaggaggg caacgtgttc 1260 agctgctctg tgatgcacga agccctgcat aatcactata ctcagaaaag tctgtcactg 1320 tcactgggaa ag 1332 <210> 59 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHF16312 Full Length Antibody Light Chain <400> 59 gacgtggtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga ccctcggcca acctgccagc 60 atcagctgta gaagcagcca gtccctggtg cacagcaacg gcaataccta cctgaactgg 120 ttccagcagc ggcctggcca gagccccaga ctgctgatct ataaggtgtc caaccggttc 180 accggcgttc ctgatagatt cagcggatct ggcagcggca ccgacttcac actgaaaatc 240 tctagagtcg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagtccac ccacgtgccc 300 ttcacatttg gcggaggaac aaagctggaa atcaagagga cagtggccgc cccaagcgtg 360 ttcatctttc ccccttccga cgagcagctg aagtctggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctaccctcg ggaggccaag gtccagtgga aggtggataa cgccctgcag 480 tctggcaata gccaggagtc cgtgaccgag caggactcta aggatagcac atattccctg 540 tctagcaccc tgacactgag caaggccgat tacgagaagc acaaggtgta tgcctgtgaa 600 gtcacccatc aggggctgtc atcacccgtc actaagtcat tcaatcgcgg agaatgc 657

Claims (7)

  1. (1) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
    (3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터로 형질전환된 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포.
  5. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양인 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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