KR20230004220A - Cd47에 특이적인 인간화 항체 및 이를 포함하는 cd47 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Cd47에 특이적인 인간화 항체 및 이를 포함하는 cd47 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 CD47에 결합하는 항체(3A5)를 이용하여 인간화된 항체 16종을 제조하였으며, 상기 인간화된 항-CD47 항체는 CD47 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 인간화된 항-CD47 항체는 CD47-SIRPα 결합을 차단할 뿐만 아니라, CD47를 과발현하는 세포와 결합하여 대식세포에 의한 대식작용을 촉진하고, CD47을 발현하는 종양의 성장을 억제할 수 있으므로, CD47의 과발현에 의한 면역 반응이 억제되는 질환 또는 종양의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

Description

CD47에 특이적인 인간화 항체 및 이를 포함하는 CD47 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Humanized antibody specific for CD47 and a pharmaceutical composition for preventing or treating CD47-related diseases comprising the same}
본 발명은 CD47에 특이적인 인간화 항체 및 이를 포함하는 CD47 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CD47에 특이적인 인간화 항체, 상기 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
CD47은 인테그린 결합 단백질(IAP)이라고도 불리우며, 세포 표면에서 광범위하게 발현되는 막관통 당단백질로서, 면역글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속하며, 인테그린, SIRPα(신호조절 단백질α), SIRPγ와 트롬보스폰딘(thrombospondin)과 같은 다양한 리간드와 상호 작용을 한다.
SIRPα는 주로 대식세포, 과립세포, 골수계 수지상 세포(DCs), 비만세포, 및 조혈 줄기세포(HSCs)를 포함한 그들의 전구체를 포함한 골수 세포에서 발현된다. SIRPα는 대식세포에 의한 숙주 세포의 식균작용을 억제하며, 숙주 표적 세포 상에서 발현되는 CD47에 의한 대식세포 상의 SIRPα의 결찰(ligation)은 SHP-1에 의해 매개되는 억제 신호를 생성하여 식균작용을 음성적으로 조절한다.
선천적인 면역 시스템에서, CD47은 골수성 세포에서 발현되는 SIRPα와의 결합을 통하여 기능을 발휘하며, 생리적 조건에서 CD47의 광범위한 발현의 작용은 건강한 세포가 선척적인 면역 시스템에 의해 제거되는 것을 방지한다.
그러나 종양세포는 CD47의 과발현에 의한 면역 감시를 효과적으로 회피할 수 있으므로, 최근 몇 년 동안, CD47 및 CD47-SIRPα 신호 시스템은 종양 치료에서의 잠재적인 약물 표적으로서 가장 주목을 받고 있다. 기존 연구에 의하면, CD47의 발현은 대부분의 인간 암(예를들어, NHL, AML, 유방암, 결장암, 교모세포종(glioblastoma), 신경교종, 난소암, 방광암 및 전립선암)에서 상향조절되고, 상승된 CD47의 발현 수준은 침습성 질환과 낮은 생존율과 관련된다고 증명되었다.
항-CD47 항체의 종양에 대한 치료는 다양한 메커니즘과 관련이 있다. 먼저, 항-CD47 항체는 종양세포 상의 CD47과 대식세포 상의 SIRPα의 결합을 차단하여 종양세포가 탐식되게 한다. 또한, 항-CD47 항체는 NK 세포가 관여된 종양세포의 세포독성을 유도할 수 있으며, 사멸을 직접적으로 유도하여 종양세포를 제거할 수 있다. 마지막으로, 항-CD47 항체는 CD8+T 세포를 활성화시키고, 획득성 T세포의 면역반응을 일으켜 종양세포를 추가로 사멸시킬 수 있다.
이러한 CD47을 과발현하는 종양세포 또는 CD47 과발현과 관련된 질환 등의 치료 또는 진단을 위해 CD47에 특이적인 항체의 개발이 이루어지고 있으며, 국제공개특허 WO2018-075857호, 국제공개특허 WO2017-121771호 및 국제공개특허 WO2013-119714호에는 다양한 항-CD47 항체에 대해 개시되어 있다.
상기와 같이 치료를 위한 항체의 생산을 위해 주로 마우스를 이용하여 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 생산하고 있다. 하지만 마우스 유래 단일클론 항체와 같은 비인간 항체들은 인체 내에서 외래 항원으로 간주되기 때문에 면역반응을 유발하고 반감기가 짧기 때문에 치료효과가 제한적인 문제점이 있다.
상기 문제를 해결하기 위해 항체의 항원과 결합하는 CDR 부위만을 제외한 나머지 부분을 인간 항체로 치환한 인간화 항체가 개발되었다. 현재 사용되고 있는 마우스 항체의 인간화 항체로의 치환방법으로는 치환할 항체에 대한 가장 유사한 인간 항체 유전자를 선정하고, CDR 이식이라 불리는 방법으로 마우스 항체의 CDR 부위만을 인간 항체 CDR 위치로 치환하는 것이다. 이와 같은 인간화 항체는 유전자의 대부분을 인간화 하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 줄일 수 있는 장점이 있다.
이에, 본 발명에서는 인체 내에서 면역반응을 줄이기 위해 CD47에 결합하는 항체(3A5)를 선별하고, 이를 이용하여 인간화된 항-CD47 항체를 제조하였다. 본 발명에서 제조한 인간화된 항-CD47 항체는 CD47 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으며, CD47-SIRPα 결합을 효과적으로 차단할 뿐만 아니라, 백혈병 말초형 유래 T 세포(Jurkat cell)의 세포사멸(apoptosis)을 유도시키고 종양 성장을 효과적으로 억제시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 항체를 발현하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(4) 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(5) 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(6) 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(7) 서열번호 47의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(8) 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(9) 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(10) 서열번호 65의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(11) 서열번호 71의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 72의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(12) 서열번호 77의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 78의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(13) 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 84의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(14) 서열번호 89의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(15) 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 96의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
(16) 서열번호 101의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 102의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체, 바람직하게는 scFv(Single-chain variable fragment)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 조성물은 면역관문억제제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 면역관문억제제는 바람직하게 항-PD-1 항체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 있어서, 상기 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서는 CD47에 결합하는 항체(3A5 항체)를 이용하여 인간화된 항체 16종을 제조하였으며, 상기 인간화된 항-CD47 항체는 CD47 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 인간화된 항-CD47 항체는 CD47-SIRPα 결합을 차단할 뿐만 아니라, CD47를 과발현하는 세포와 결합하여 대식세포에 의한 대식작용을 촉진하고, CD47을 발현하는 종양의 성장을 억제할 수 있으므로, CD47의 과발현에 의한 면역 반응이 억제되는 질환 또는 종양의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 선별한 3A5(mouse) 항체의 CD47 과발현 종양세포(MCF-7)에 대한 결합력을 유세포분석기(flow cytometer)로 확인한 데이터이다.
도 2는 본 발명의 인간화된 3A5 항체 16종의 CD47 과발현 종양세포(MCF-7)에 대한 결합력을 유세포분석기(flow cytometer)로 확인한 데이터이다.
도 3은 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체의 CD47-SIRPα 결합 차단능을 확인한 데이터이다.
도 4는 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체가 백혈병 말초형 유래 T 세포(Jurkat Cell)의 표면 CD47과 결합함으로써 대식세포의 대식작용을 촉진함을 확인한 데이터이다.
도 5는 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체와 상업적 CD47 항체(clone#CC2C6)의 (A) 적혈구 및 혈소판 결합 여부, 및 (B) 적혈구 응집정도를 확인한 데이터이다.
도 6은 본 발명의 3A5(mouse) 항체를 인간 CD47이 발현되는 쥐 결장 선암종 세포(murine colon adenocarcinoma cell)가 이식된 마우스에 투여할 때, (A) 동물실험 방법 모식도 및 (B) 3A5 항체 투여에 따른 종양크기를 확인한 데이터이다. 마우스 PD-1 항체는 상업적 PD-1 항체(clone#RMP1-14)를 사용하였다.
도 7은 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체를 인간 CD47이 발현되는 쥐 결장 선암종 세포가 이식된 C57BL/6-hCD47/hSIRPα 녹인 마우스(C57BL/6-hCD47/hSIRPα knock-in mouse, hCD47 KI) 투여할 때, (A) 동물실험 방법 모식도 및 (B) Hu3A5(V10) 항체 투여에 따른 종양크기를 확인한 데이터이다.
도 8은 상기 도 7에서 Hu3A5(V10) 항체 투여 후, C57BL/6-hCD47/hSIRPα 녹인 마우스의 주요 장기를 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)으로 관찰한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
CD47에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체
본 발명은 일관점에서, (1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(4) 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(5) 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(6) 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(7) 서열번호 47의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(8) 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(9) 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(10) 서열번호 65의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(11) 서열번호 71의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 72의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(12) 서열번호 77의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 78의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(13) 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 84의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(14) 서열번호 89의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(15) 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 96의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
(16) 서열번호 101의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 102의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "인간화 항체"는 항원 결합에 핵심적인 부분인 CDR 부위를 제외한 나머지 부분을 인간에 의해 생산된 항체와 상응하는 아미노산 서열이 되도록 하여 보다 인간 항체와의 유사성이 증가된 항체를 의미한다. 항체(non-human antibody)를 인간화하는 가장 일반적인 방법으로는 동물항체의 CDR 부위를 인간 항체에 이식하는 CDR-그라프팅(CDR-grafting) 방법이 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 본 발명에서, 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 모노클로날 항체 또는 단일클론항체라고도 불리며, 단일 항체 형성세포가 생성하는 항체로, 1차 구조(아미노산 배열)가 균일한 특징이 있다. 오직 하나의 항원 결정기만을 인식하며, 일반적으로 암세포와 항체생산세포를 융합한 하이브리도마(hybridoma cell)을 배양하여 생산된다.
본 발명에서, 용어 "CDR", 즉 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 부위 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비근접(non-contiguous) 항원 결합 부위를 의미하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 펩타이드 태그(에피토프) 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 scFv, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 부위(hinge region)를 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 부위의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소한의 항체조각으로, 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 수득하거나, 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 CD47 단백질 전체 또는 일부 펩타이드를 면역원(또는 항원)으로 이용하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 우선 면역원으로서 CD47, CD47 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 CD47 단백질을 포함하는 캐리어(carrier)를 필요에 따라서 면역증강제인 아주반트(adjuvant)(예, Freund adjuvant)와 함께 인간을 제외한 포유동물의 피하, 근육, 정맥, 발볼록살 또는 복강 내에 1회 내지 그 이상 주사하는 것으로써 면역감작(immunization)을 시킨다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말 또는 소(인간 항체를 생산하는 형질 전환(transgenic) 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 조작된 형질 전환(transgenic) 동물을 포함한다.)이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭 또는 토끼이다. 첫 번째 면역으로부터 약 1 ~ 21일 마다 1 ~ 4회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1~10일 후에 면역 감작 된 포유동물로부터 항체 생산하는 세포를 수득할 수 있다. 면역을 시키는 회수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 특징 등에 의하여 적당히 변경할 수 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조는 케이라 및 미르슈타인 등의 방법(Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) 및 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역 감작된 인간을 제외한 동물로부터 채취한 비장, 림프절, 골수 또는 편도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 생산하는 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 포유동물 유래의 골수종 세포(myeloma cells)를 세포 융합시키는 것에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 제조할 수 있다. 상기 포유동물은 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 닭, 토끼 또는 인간일 수 있고, 바람직하게는 마우스, 래트, 닭 또는 인간일 수 있다.
세포 융합은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스를 비롯한 융합 촉진제나 전기 펄스에 의한 방법이 이용되고, 일례를 들면, 융합 촉진제를 함유하는 융합 배지에 항체 생산 세포와 무한 증식 가능한 포유류 유래의 세포를 약 1:1 내지 1:10의 비율로 부유시켜, 이 상태로, 약 30 내지 40℃로 약 1 내지 5분간 배양한다. 융합 배지에는, 예를 들면, MEM 배지, RPMI1640 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 비롯한 통상의 일반적인 것을 이용하면 좋고, 소 혈청 등의 혈청류는 제외해 두는 것이 바람직하다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 방법은 우선, 상기한 바와 같이 획득한 융합 세포를 HAT 배지 등의 선택용 배지에 옮기고, 약 30 내지 40℃로 약 3일 내지 3주일 배양해서 하이브리도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등에서 하이브리도마를 배양한 후, 위에서 기술한 인간을 제외한 동물의 면역반응에 사용한 면역원과 배양 상청액과의 반응성이 증가된 부분을 RIA(radioactive substance-marked immuno antibody) 또는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)같은 면역분석방법을 통하여 찾는 방법을 통해 수행할 수 있다. 그리고 상기에서 찾은 단클론 항체를 생산하는 클론은 상기 면역원에 대하여 특이적인 결합력을 보여준다.
본 발명의 단클론 항체는, 이와 같은 하이브리도마를 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양에는, 포유동물 유래의 세포를 배양하기 위한 통상의 방법이 이용되며, 배양물 등으로부터 단클론 항체를 채취하기 위해서는, 항체 일반을 정제하기 위한 이 분야에서의 통상의 방법이 이용된다. 각각의 방법으로서는, 예를들면, 염석(鹽析), 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있고, 이들은 필요에 따라서 조합해서 적용된다. 정제한 단클론 항체는, 그 후, 농축, 건조하여, 용도에 따라서 액상 또는 고상으로 한다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는, CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해, 항-CD47 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조 및 스크리닝 하여, CD47에 특이적으로 결합하는 항체(scFv)를 선별하였으며, 이를 3A5로 명명하였다.
상기 3A5 항체는 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYTFTSYW), 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(IDPSDSYT) 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARGGKRAMDY)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLVHSNGNTY), 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(KVS) 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(SQSTHVPFT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 3A5 항체는 서열번호 7의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 9의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 10의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서, 항-CD47 항체인 3A5를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody) 16종을 제조하였으며, 이를 Hu3A5(V1), Hu3A5(V2), Hu3A5(V3), Hu3A5(V4), Hu3A5(V5), Hu3A5(V6), Hu3A5(V7), Hu3A5(V8), Hu3A5(V9), Hu3A5(V10), Hu3A5(V11), Hu3A5(V12), Hu3A5(V13), Hu3A5(V14), Hu3A5(V15) 및 Hu3A5(V16)로 명명하였다.
상기 16종의 인간화된 항-CD47 항체의 중쇄 가변부위 CDR과 경쇄 가변부위 CDR은 3A5와 동일한 것으로 CDR 부분을 제외한 나머지 부분을 인간화하였다.
바람직하게 Hu3A5(V1) 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 13의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 14의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V2) 항체는 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 19의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 20의 염기서열로 코딩될 수 있다.
HU3A5(V3) 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 25의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 26의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V4) 항체는 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 31의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 32의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V5) 항체는 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 37의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 38의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V6) 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 43의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 44의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V7) 항체는 서열번호 47의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 49의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 50의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V8) 항체는 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 55의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 56의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V9) 항체는 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 61의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 62의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V10) 항체는 서열번호 65의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 67의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 68의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V11) 항체는 서열번호 71의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 72의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 73의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 74의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V12) 항체는 서열번호 77의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 78의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 79의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 80의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V13) 항체는 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 84의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 85의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 86의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V14) 항체는 서열번호 89의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 91의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 92의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V15) 항체는 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 96의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 97의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 98의 염기서열로 코딩될 수 있다.
Hu3A5(V16) 항체는 서열번호 101의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 102의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 103의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 104의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적인 항체는 바람직하게 scFv(single chain variable fragment)로, 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위가 링커로 연결될 수 있도록 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 상기 링커는 바람직하게 바람직하게 서열번호 107의 아미노산 서열로 표시되거나 또는 서열번호 108 내지 서열번호 123의 염기서열로 코딩될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
경쇄 가변부위-링커-중쇄 가변부위로 연결된 경우 Hu3A5(V1) 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열 표시되거나 서열번호 16의 염기서열로, Hu3A5(V2) 항체는 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 22의 염기서열로, 3A5(V3) 항체는 서열번호 27의 아미노산 서열 또는 서열번호 28의 염기서열로, Hu3A5(V4) 항체는 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 서열번호 34의 염기서열로, Hu3A5(V5) 항체는 서열번호 39의 아미노산 서열 또는 서열번호 40의 염기서열로, Hu3A5(V6) 항체는 서열번호 45의 아미노산 서열 또는 서열번호 46의 염기서열로, Hu3A5(V7) 항체는 서열번호 51의 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 염기서열로, 3A5(V8) 항체는 서열번호 57의 아미노산 서열 또는 서열번호 58의 염기서열로, Hu3A5(V9) 항체는 서열번호 63의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 염기서열로, Hu3A5(V10) 항체는 서열번호 69의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 염기서열로, Hu3A5(V11) 항체는 서열번호 75의 아미노산 서열 또는 서열번호 76의 염기서열로, Hu3A5(V12) 항체는 서열번호 81의 아미노산 서열 또는 서열번호 82의 염기서열로, Hu3A5(V13) 항체는 서열번호 87의 아미노산 서열 또는 서열번호 88의 염기서열로, Hu3A5(V14) 항체는 서열번호 93의 아미노산 서열 또는 서열번호 94의 염기서열로, Hu3A5(V15) 항체는 서열번호 99의 아미노산 서열 또는 서열번호 100의 염기서열로, Hu3A5(V16) 항체는 서열번호 105의 아미노산 서열 또는 서열번호 106의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 CD47이 신호-조절-단백질(SIRPα)과 상호 작용하는 것을 방지하거나, CD47-발현 세포에 대한 대식세포 매개 식균 작용을 촉진할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서, 본 발명에서 선별한 3A5 항체 및 이를 인간화시킨 16종의 Hu3A5 항체는 모두 CD47을 과발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2). 또한, 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체가 CD47과 SIRPα의 상호작용을 방지하는지 확인한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 CD47-SIRPα 결합을 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서, 인간화된 3A5 항체가 실제로 항체 치료제로 사용될 수 있는지 확인하기 위해, Hu3A5(V10) 항체를 백혈병 말초형 유래 T 세포(Jurkat cell)에 처리한 결과, Hu3A5(V10)에 의해 대식세포에 의한 저캣세포(Jurkat cell)의 대식작용(phagocytosis)이 효과적으로 유도되는 것을 확인하였다.
CD47은 적혈구 표면에도 다량 존재하여, 투여된 항-CD47 항체가 적혈구에 붙게 되면 대식세포가 적혈구를 잡아먹기 때문에 빈혈이나 적혈구가 엉겨 붙는 혈구 응집이 발생하게 된다. 상업적으로 판매되고 있는 또는 임상시험중인 일부 CD47 항체의 경우 적혈구 식균 작용으로 인한 부작용이 보고되고 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 있어서, 인간화된 3A5 항체가 적혈구 응집 반응을 유도하는지 확인하기 위해, 인간화된 Hu3A5(V10) 항체와 상업적 항-CD47 항체(clone#CC2C6)의 적혈구/혈소판 결합 여부 및 적혈구 응집 반응 여부를 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 상업적 항-CD47 항체(clone#CC2C6)는 적혈구와 반응하여 적혈구 응집 반응을 유도한 반면, 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체는 적혈구 및 혈소판과 결합하지 않으며(도 5A), 적혈구 응집 반응도 유도하지 않은 것으로 나타났다 (도 5B).
즉, 본 발명의 인간화된 항-CD47 항체는 CD47을 과발현하는 세포를 특이적으로 인식하였으며, CD47-SIRPα 결합을 차단하여 암 또는 종양 세포의 면역회피를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 대식세포에 의한 CD47을 과발현하는 암 세포의 대식작용을 효과적으로 촉진하는 것을 확인하였다. 나아가, 인간화된 항-CD47 항체는 적혈구 응집 반응을 유도하지 않으므로, 보다 안전하고 효과적으로 CD47을 과발현하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 항체 치료제로 활용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 임의의 길이로 분리된 핵산 분자(nucleic acid molecule), 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 (1) 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭과 같은 in-vitro 증폭; (2) 클로닝 및 재조합; (3) 절단(digestion) 및 겔 전기영동 분리와 같은 정제; (4) 화학 합성과 같은 합성을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게 분리된 폴리뉴클레오타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본 발명에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하기 위한 핵산은 합성 올리고뉴클레오티드의 제한 단편 조작(restriction fragment operation) 또는 SOE PCR의 적용을 포함하지만 이에 제한하지 않고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5' 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5' 비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "형질전환체"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미하고, 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다.
상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 항체 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다.
본 발명에 따른 벡터는 항체의 생산을 위해 숙주세포, 바람직하게는 포유동물 세포에 형질전환 시킬 수 있다. 완벽한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 적합한 숙주 세포는 COS-1(예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들면, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들면, ATCC CRL-10), CHO(예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들면, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들 세포는 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection, 미국)으로부터 용이하게 이용가능하다.
CD47 과발현에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서, CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 포함하는, CD47 과발현에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 CD47 과발현에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양일 수 있으며, 바람직하게, CD47을 과발현하는 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 치료제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 치료제는 CD47에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄에 공유결합된 상태로 존재하거나, 본 발명의 CD47에 특이적인 인간화 항체와 병용투여할 수 있다.
상기 치료제는 저분자 약물, 펩타이드성 약물, 독소(예를 들어, 세포독소) 등을 포함한다. 또한, 상기 치료제는 항암제일 수 있다. 항암제는 암 세포의 증식을 감소시키고, 세포독성 약제 및 세포 증식 억제제를 아우르는 비-펩타이드성(즉, 비-단백질계) 화합물을 포함한다. 항암제의 비제한적인 예는 알킬화제, 니트로소요소, 항대사물질, 항종양 항생물질, 식물(빈카) 알칼로이드 및 스테로이드 호르몬을 포함한다. 펩타이드성 화합물 또한 사용될 수 있다.
또한, 상기 조성물에 추가되는 치료제는 바람직하게 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor)일 수 있으며, 더 바람직하게는 항-PD-1 항체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 3A5 항체가 CD47이 발현되는 종양의 성장을 억제하는지 확인하기 위해, 도 6A의 모식도에 나타난 방법과 같이, CD47이 발현되는 쥐 결장 선암종 세포(murine colon adenocarcinoma cell, MC38-hCD47)를 마우스에 이식한 후, 대조군 항체(Rat IgG), 항-PD-1 항체, 항-CD47 항체(3A5 항체), 및 항-PD-1 항체(clone#RMP1-14) + 항-CD47 항체(3A5 항체)를 각각 투여하였다. 그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, 3A5 항체 단독 투여군에서 CD47을 과발현하는 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 3A5 항체 및 항-PD-1 항체 병용투여군의 종양 성장 억제 효능이 가장 우수한 것을 확인하였다. 이는 면역관문억제제인 항-PD-1 항체와 본 발명의 3A5 항체를 병용투여하는 경우, 종양 치료에 대한 시너지 효과를 보이는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 인간화된 3A5 항체의 종양 성장 억제 효능을 확인하기 위해, 마우스 CD47 및 SIRPα 유전자가 인간 CD47 및 인간 SIRPα 유전자로 대체된 C57BL/6-hCD47/hSIRPα 녹인 마우스에 인간 CD47이 발현되는 쥐 결장 선암종 세포를 이식한 다음, 대조군 항체(Rat IgG), 항-PD-1 항체(clone#RMP1-14), 항-CD47 항체(Hu3A5(V10) 항체), 및 항-PD-1 항체(clone#RMP1-14) + 항-CD47 항체(Hu3A5(V10) 항체)를 각각 투여하였다 (도 7A). 그 결과, Hu3A5(V10) 항체 단독 투여군에서 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 Hu3A5(V10) 항체 및 항-PD-1 항체 병용투여군의 종양 성장 억제 효능이 가장 우수한 것을 확인하였다.
또한, Hu3A5(V10) 항체 투여 후, C57BL/6-hCD47/hSIRPα 녹인 마우스의 주요 장기를 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)로 관찰한 결과, 염증으로 인한 주요 조직 손상은 관찰되지 않았다.
즉, 본 발명의 인간화된 Hu3A5 항체는 다른 조직의 손상 없이 CD47을 과발현하는 암 또는 종양을 표적으로 하여 종양의 성장을 억제할 수 있으므로, CD47을 과발현하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 항체 치료제로 적용할 수 있음을 확인하였다.
상기 약제 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 목표 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하는 데 필요한 치료제의 양을 의미하고, 또는 감지할 수 있는 정도의 치료 또는 예방효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 뜻한다. 어떤 항체에 대하여, 치료적 유효 투여량은 세포배양 분석법 또는 보통 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류와 같은 동물 모델로 최초로 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도범위와 투여루트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 정보는 인간의 투약을 위해 유용한 투여량 및 루트를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간환자를 위한 정밀한 유효량은 질환상태의 심각도, 환자의 일반적 건강 상태, 환자의 나이, 체중 및 성별, 식이요법, 투여시간, 투여빈도, 약제조성, 반응감도 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의사의 판단의 범위 내에 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 0.01 ~ 50mg/kg, 바람직하게는 0.1 ~ 20mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 15mg/kg이다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여되거나, 또는 다른 제제, 약제 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 투여되는 투여량은 치료될 상태의 성질, 악성 림프종 또는 백혈병의 등급, 및 항체가 질환 예방 차원에서 사용되는지 또는 현존하는 상태를 치료하기 위해 사용되는지에 따라 달라진다.
투여빈도는 항체분자의 반감기, 약 효과의 지속성에 따라 달라진다. 만약 항체분자가 짧은 반감기(예, 2 ~ 10시간)를 가지면, 하루당 1회 또는 그 이상의 투여량을 제공할 필요가 있다. 또는, 항체분자가 긴 반감기(예, 2 ~ 15일)를 가지면, 하루에 한번, 일주일에 한차례, 또는 매 1개월 또는 2개월당 한차례의 투여량을 제공할 필요가 있다.
또한, 약제 조성물은 항체의 투여를 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자신이 조성물을 투여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 유발해서는 안되고, 독성이 없어야만 한다. 적당한 담체로는 단백질, 폴리펩타이드, 리포오좀, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 아미노산 중합체, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자들과 같은, 서서히 물질대사되는 거대분자일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염들은, 예를 들면, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염과 같은 미네랄산염들, 또는 아세트산, 프로피온산. 말론산 및 벤조산 같은 유기산의 염들이 사용될 수 있다.
치료 조성물내의 약제학적으로 허용가능한 담체는 부가적으로, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질들이 이런한 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 담체는 환자에 의한 약제 조성물 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
투여를 위한 바람직한 형태는, 예로써 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의한 비경구적 투약에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주입 또는 주사용일 경우에는, 오일 또는 수용성 부형제내의 현탁제, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 이는 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 처방제들을 포함할 수 있다. 또는, 항체분자는 무수형태일 수 있고, 사용전에 적절한 멸균액으로 재구성될 수 있다.
일단 제제화된 경우, 본 발명의 조성물은 환자에게 직접 투여될 수 있다. 치료받을 환자들은 동물일 수 있다. 그러나, 조성물은 인간 환자 투여를 위해 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제 조성물은 제한은 없지만, 경구, 정맥, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous), 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 경로에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 물질로서 제조될 수 있다. 또한, 주입전에 액체 부형제내용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하주사, 복강내주사, 정맥내주사, 근육내주사에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 조직의 간질(interstitial) 공간으로 전달될 수도 있다. 또한, 조성물은 상처부위로 투여될 수 있다. 투여량 처리는 단일 복용 스케쥴 또는 다중 복용 스케쥴일 수 있다.
CD47를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 진단 또는 모니터링
본 발명은 또 다른 관점에서, CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 CD47를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 진단 또는 모니터링용 조성물에 관한 것이다.
상기 CD47에 특이적으로 결합하는 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적 표지는 검출가능 표지를 포함하는 2차 항체를 포함하는데, 여기서 2차 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 항체에 결합한다. 다른 간접적 표지는 바이오틴을 포함하는데, 여기서 바이오티닐화된 CD47에 특이적으로 결합하는 항체는 검출가능 표지를 포함하는 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하여 검출될 수 있다.
적절한 검출가능 표지는 분광분석적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 모든 조성물을 포함한다. 적절한 표지는, 비제한적으로, 자석 비드, 형광염료(예를 들어, 플루오레세인이소티오시안산염, 텍사스 레드, 로다민, 초록 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 등), 방사성 표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들어, 겨자무과산화효소, 알칼린 포스파타아제, 루시퍼라아제 및 효소-연결 면역흡착검사(ELISA)에 일반적으로 사용되는 것들) 및 콜로이드성 골드 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 표색계 표지를 포함한다.
또한, 진단 또는 모니터링을 위해 상기 항체는 형광 단백질로 표지될 수 있으며, 조영제 또는 방사선 동위원소를 포함할 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 진단 키트에 이용하는 경우, 상기 항체는 지지체에 고정되어 있으며, 상기 지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 또는 멤브레인 일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
CD47에 특이적으로 결합하는 항체 제조 및 선별
CD47 펩타이드 특이적인 항체를 선별하기위해, CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하여 항체를 선별하였다.
먼저, CD47 단백질(Acrobiosystems, cat#CD7-HA2E9)을 면역하여 비장세포를 적출하고 마우스 골수증세포와 세포 융합을 통하여 하이브리도마 세포를 제작하였다.
세포 융합에 이용하는 마우스 골수종 세포는 HGPRT(Hypoxanthine Guanidine-Phosphoribosyl-Transferase)를 가지고 있지 않기 때문에 HAT 배지에서는 생존할 수 없으나, 하이브리도마는 비장세포와 융합함으로써 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 이를 이용하면 하이브리도마만을 증식시킬 수 있으므로, 통상 하이브리도마를 확립시킬때까지 HAT 배지에서 증식시켰다.
증식된 하이브리도마 중에서 CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하기 위해 한계희석법을 사용하였다. 우선 96웰당 1개 세포 이하가 되도록 한 다음, 1개의 세포로부터 증식된 클론에서 얻어진 항체가 CD47과 결합하는지를 ELISA로 확인하고 CD47과 결합하는 클론을 선별하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 이와 같은 방법으로 CD47에 결합하는 항체를 수득하였다.
상기 항체는 3A5로 명명하였으며, 이들의 염기서열과 아미노산 서열을 분석하였다. 서열분석 결과에 따른 각 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 1에 나타내었으며, 표 1에서 밑줄 친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미한다.
3A5 항체의 서열정보
3A5 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYTFTSYW 서열번호 1
중쇄가변부위 CDR2 IDPSDSYT 서열번호 2
중쇄가변부위 CDR3 ARGGKRAMDY 서열번호 3
경쇄가변부위 CDR1 QSLVHSNGNTY 서열번호 4
경쇄가변부위 CDR2 KVS 서열번호 5
경쇄가변부위 CDR3 SQSTHVPFT 서열번호 6
중쇄가변부위
아미노산서열		 EVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYW MHWMNQRPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTSVTVSS 서열번호 7
경쇄가변부위
아미노산서열		 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWYLQKPGQSPKLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC SQSTHVPFT FGSGTKLEIK 서열번호 8
중쇄가변부위
염기서열		 GAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGATGAACCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGGTAAGAGAGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 서열번호 9
경쇄가변부위
염기서열		 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 서열번호 10
선별한 항체의 CD47에 대한 특이성 확인 - ELISA와 유세포분석(flow cytometer)
2-1: ELISA 분석
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, CD47 펩타이드를 코딩하기 위해, CD47 단백질(Acrobiosystems, cat#CD7-HA2E9)을 100 ng/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 분주한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 3% BSA가 포함된 1 X PBST를 처리한 후, 상온에서 30분 동안 블로킹시켰다.
3A5 항체를 생산하는 각 클론의 하이브리도마 세포 배양액 3 ㎕를 각 웰에 처리한 다음, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-HRP, 1:10,000)를 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척한 다음, 발색을 위해 TMB를 처리하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로 1N H2SO4의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 종료시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA 실험 조건
ELISA reader Infinite F50
Measurement Filter 450 nm
Measurement Mode Single Point Photo
Antigen Coating 100 ng/well
2 nd Antibody (Anti-mIgG -HRP) 1:10,000 dilution
Substrate TMB
ELISA 실험 결과
항체 종류 OD450 측정값
3A5 2.010
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 선별한 3A5 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
2-2: 유세포분석(flow cytometer)기를 이용한 분석
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 유세포분석(flow cytometer)을 수행하였다.
먼저, CD47을 과발현하는 유방암세포주 MCF-7(1 x 107개)과 3A5 항체(1 ㎍)를 30분간 반응시킨 다음, 2차 항체로 표면(surface)을 염색한 후, 유세포분석기로 측정하였다.
양성 대조군(positive control)으로 CD47 항체(Biolegend PE anti-human CD47, cat# 323108, 5㎕)를, 2차 항체로는 PE-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체(PE-conjugated goat anti-mouse IgG; Biolegend Inc., cat# 405307, 미국, 5㎕)를 사용하였다.
유세포분석 결과
항체 종류 Count Median Mean
3A5 11285 13866 14951
positive 11535 10972 11930
2 nd Ab alone 11285 73.9 80
none 11077 24.5 25.0
그 결과, 도 1 및 표 4에 나타난 바와 같이 3A5 항체는 CD47을 과발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
3A5 항체 기반 인간화 항체 제조
상기 실시예 1에서 선별한 3A5 항체를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody)를 제조하였다.
구체적으로, 인간 항체의 생식계열 염기서열(germline sequence)를 프레임(frame)으로하여 CD47과 결합하는 마우스 항체의 CDR를 인간 항체의 CDR를 교체하는 CDR-그라프팅(CDR grafting) 방법으로 마우스 3A5 항체를 인간화한 항체 16종을 제작하였다. 인간화한 항체는 각각 Hu3A5(V1), Hu3A5(V2), Hu3A5(V3), Hu3A5(V4), Hu3A5(V5), Hu3A5(V6), Hu3A5(V7), Hu3A5(V8), Hu3A5(V9), Hu3A5(V10), Hu3A5(V11), Hu3A5(V12), Hu3A5(V13), Hu3A5(V14), Hu3A5(V15) 및 Hu3A5(V16)로 명명하였으며, 아미노산 서열을 분석하였다.
서열분석 결과에 따른 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 5 내지 표 20에 나타내었다. 밑줄 친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미하며, 16종의 인간화한 3A5 항체의 CDR은 모두 상기 마우스 3A5 항체(표 1)의 CDR과 동일하다.
표 5 내지 표 20에서 scFv는 경쇄 가변부위-링커-중쇄 가변부위 구조로 이루어진 항체를 의미하며, scFv 아미노산서열 및 scFv 염기서열에서 밑줄 친 부분은 링커 부분을 의미한다.
Hu3A5(V1) 항체의 서열정보
Hu3A5(V1) 서열정보 서열번호
중쇄가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 11
경쇄가변부위
아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 12
중쇄가변부위
염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCTAGCGTGAAAGTTTCCTGTAAAGCGTCTGGCTACACGTTCACAAGCTATTGGATGCACTGGATGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCTTGGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCGTCCGACAGCTACACCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGTCGTGTCACCCTCACTGTGGACACCTCGACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTACGGTCTGAAGATACAGCCGTGTACTACTGTGCTCGTGGTGGCAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACTGTATCGTCC 서열번호 13
경쇄가변부위
염기서열		 GATGTGGTGATGACCCAGTCTCCTCTTTCCCTGCCCGTAACCCTCGGACAGCCAGCATCTATCTCATGCCGATCCTCCCAGAGCCTTGTCCACTCAAATGGCAACACGTACCTGCATTGGTTCCAGCAGAGGCCTGGGCAGAGCCCGCGCCTGCTGATCTACAAGGTGAGTAACCGCTTTTCTGGGGTGCCCGACCGCTTCAGTGGGTCGGGCTCCGGGACCGACTTTACTCTGAAGATTTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTTCTGCTCTCAATCTACTCACGTTCCCTTCACCTTCGGCGGCGGTACCAAGCTGGAGATCAAG 서열번호 14
scFv 아미노산서열 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPFTFGGGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWMRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTSYNQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGKRAMDYWGQGTTVTVSS 서열번호 15
scFv 염기서열 GATGTGGTGATGACCCAGTCTCCTCTTTCCCTGCCCGTAACCCTCGGACAGCCAGCATCTATCTCATGCCGATCCTCCCAGAGCCTTGTCCACTCAAATGGCAACACGTACCTGCATTGGTTCCAGCAGAGGCCTGGGCAGAGCCCGCGCCTGCTGATCTACAAGGTGAGTAACCGCTTTTCTGGGGTGCCCGACCGCTTCAGTGGGTCGGGCTCCGGGACCGACTTTACTCTGAAGATTTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTTCTGCTCTCAATCTACTCACGTTCCCTTCACCTTCGGCGGCGGTACCAAGCTGGAGATCAAG GGCGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGCGGGTCCGGGGGAGGCGGCTCG GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCTAGCGTGAAAGTTTCCTGTAAAGCGTCTGGCTACACGTTCACAAGCTATTGGATGCACTGGATGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCTTGGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCGTCCGACAGCTACACCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGTCGTGTCACCCTCACTGTGGACACCTCGACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTACGGTCTGAAGATACAGCCGTGTACTACTGTGCTCGTGGTGGCAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACTGTATCGTCC 서열번호 16
Hu3A5(V2) 항체의 서열정보
Hu3A5(V2) 서열정보 서열번호
중쇄가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 17
경쇄가변부위
아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 18
중쇄가변부위
염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTGAAAGTATCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACGTTCACCAGCTATTGGATGCACTGGATGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGTTTGGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCGTCCGACAGCTACACCTCCTACAACCAGAAATTTCAGGGCCGCGTCACTCTTACCGTGGATACCAGCACTTCGACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCAGCGAGGACACCGCGGTGTACTACTGCGCCCGTGGCGGCAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACTACCGTCACAGTGTCCAGC 서열번호 19
경쇄가변부위
염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGAGTCCACTTTCGCTGCCTGTCACACTAGGACAGCCGGCGTCCATCTCGTGCCGATCGTCCCAAAGCCTCGTCCACTCAAATGGCAACACGTACCTGCATTGGTTCCAGCAGCGCCCCGGGCAGAGCCCACGTCTCCTGATCTACAAGGTGAGTAACCGCTTCTCTGGCGTTCCCGACAGGTTTTCAGGATCTGGGTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCTCGGGTGGAGGCTGAAGATGTGGGCGTTTATTACTGTTCGCAGAGCACTCACGTCCCCTTCACCTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAGATCAAG 서열번호 20
scFv 아미노산서열 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPFTFGGGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWMRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTSYNQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGKRAMDYWGQGTTVTVSS 서열번호 21
scFv 염기서열 GACGTGGTGATGACCCAGAGTCCACTTTCGCTGCCTGTCACACTAGGACAGCCGGCGTCCATCTCGTGCCGATCGTCCCAAAGCCTCGTCCACTCAAATGGCAACACGTACCTGCATTGGTTCCAGCAGCGCCCCGGGCAGAGCCCACGTCTCCTGATCTACAAGGTGAGTAACCGCTTCTCTGGCGTTCCCGACAGGTTTTCAGGATCTGGGTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCTCGGGTGGAGGCTGAAGATGTGGGCGTTTATTACTGTTCGCAGAGCACTCACGTCCCCTTCACCTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAGATCAAG GGCGGGGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGCTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTGAAAGTATCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACGTTCACCAGCTATTGGATGCACTGGATGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGTTTGGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCGTCCGACAGCTACACCTCCTACAACCAGAAATTTCAGGGCCGCGTCACTCTTACCGTGGATACCAGCACTTCGACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCAGCGAGGACACCGCGGTGTACTACTGCGCCCGTGGCGGCAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACTACCGTCACAGTGTCCAGC 서열번호 22
Hu3A5(V3) 항체의 서열정보
Hu3A5(V3) 서열정보 서열번호
중쇄가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 23
경쇄가변부위
아미노산서열		 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS QSLVHSNGNTY LHWYQQKPGQPPKLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 24
중쇄가변부위
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경쇄가변부위
염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGGGCAGAGGTAAAGAAGCCGGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCGTGTAAGGCTTCTGGCTACACGTTCACATCCTACTGGATGCATTGGATGCGCCAGGCTCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCGAGCGATTCTTACACCAGCTACAACCAGAAATTTCAGGGACGAGTGACTCTTACGGTGGACACCTCGACCTCCACTGCCTACATGGAGCTGAGCTCTCTGCGCTCGGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGTGGTGGCAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCACAGTCACCGTGTCGTCC 서열번호 26
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Hu3A5(V4) 항체의 서열정보
Hu3A5(V4) 서열정보 서열번호
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중쇄가변부위
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Hu3A5(V5) 항체의 서열정보
Hu3A5(V5) 서열정보 서열번호
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Hu3A5(V6) 항체의 서열정보
Hu3A5(V6) 서열정보 서열번호
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염기서열		 CAGGTGCAGCTAGTGCAGTCTGGGGCGGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAAGTTTCGTGTAAGGCATCCGGCTACACGTTCACCAGCTATTGGATGCATTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCGTGATTGACCCGTCCGACAGTTACACCAGTTACAACCAGAAGTTCCAGGGCCGGGTGACCATGACTGTGGACACCTCGACCTCCACTGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCGGAGGACACCGCGGTGTACTACTGCGCCCGTGGTGGGAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACTGTCAGCTCC 서열번호 43
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염기서열		 GATGTGGTGATGACCCAGTCCCCTTTGTCCCTTCCCGTCACCTTGGGTCAGCCAGCTTCTATCTCTTGCCGAAGCTCTCAGTCTCTGGTCCACTCTAATGGCAACACATACCTGCACTGGTTCCAGCAGAGACCAGGTCAGTCGCCGCGCCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACCGTTTCTCCGGAGTCCCCGACAGGTTTTCAGGCTCCGGGTCAGGGACCGACTTTACACTCAAAATCTCGCGCGTGGAGGCTGAAGATGTTGGCGTGTATTACTGTTCTCAAAGCACTCACGTACCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 서열번호 44
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Hu3A5(V7) 항체의 서열정보
Hu3A5(V7) 서열정보 서열번호
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아미노산서열		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWVRQAPGQGLEWMGV IDPSDSYT SYNQKFQGRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 47
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염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGAGCCCAGATTCTCTGGCGGTATCTCTTGGCGAGCGGGCTACTATCAACTGCAAATCTTCCCAGAGCCTAGTCCACAGCAATGGGAACACGTACCTGCATTGGTACCAGCAGAAGCCTGGTCAGCCGCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGTTAGCAACCGCTTCTCCGGTGTCCCCGACAGGTTTTCAGGCTCCGGCTCCGGGACCGACTTCACCCTGACCATCTCGTCTTTGCAGGCTGAAGATGTGGCGGTCTACTTCTGTTCACAGAGCACACACGTTCCCTTCACCTTCGGCGGGGGCACTAAGCTGGAGATCAAG 서열번호 50
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Hu3A5(V8) 항체의 서열정보
Hu3A5(V8) 서열정보 서열번호
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Hu3A5(V9) 항체의 서열정보
Hu3A5(V9) 서열정보 서열번호
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아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 60
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염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTTCCGAGCTGAAGAAGCCCGGGGCTTCCGTGAAGGTGTCGTGTAAAGCTTCTGGCTACACGTTCACAAGCTATTGGATGCACTGGATGCGCCAGGCCCCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGTAATTGACCCGTCCGACAGCTACACTAGCTACAACCAGGGCTTCACCGGCCGCTTCGTCCTTTCTGTTGATACCTCCGTGTCCACTGCCTACTTGCAAATTTCTTCTCTGAAAGCGGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGTGGTGGCAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTGAGCAGC 서열번호 61
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scFv 염기서열 GATGTGGTGATGACCCAGTCTCCCCTGAGTCTACCTGTCACTCTTGGACAGCCAGCAAGCATCTCCTGCCGATCCTCACAGTCCTTGGTACACTCGAATGGCAACACGTACCTGCACTGGTTCCAGCAGAGACCGGGACAGAGCCCACGCCTGCTCATCTACAAGGTTAGTAACCGCTTTTCTGGCGTCCCCGACAGGTTTTCAGGTTCCGGCAGTGGAACCGACTTTACTCTGAAGATCTCCCGGGTGGAGGCGGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGTTCGCAGTCCACCCATGTCCCCTTCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG GGCGGAGGCGGCTCGGGTGGGGGGGGCTCCGGCGGGGGTGGGTCG GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTTCCGAGCTGAAGAAGCCCGGGGCTTCCGTGAAGGTGTCGTGTAAAGCTTCTGGCTACACGTTCACAAGCTATTGGATGCACTGGATGCGCCAGGCCCCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGTAATTGACCCGTCCGACAGCTACACTAGCTACAACCAGGGCTTCACCGGCCGCTTCGTCCTTTCTGTTGATACCTCCGTGTCCACTGCCTACTTGCAAATTTCTTCTCTGAAAGCGGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGTGGTGGCAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTGAGCAGC 서열번호 64
Hu3A5(V10) 항체의 서열정보
Hu3A5(V10) 서열정보 서열번호
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아미노산서열		 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 65
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아미노산서열		 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 66
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염기서열		 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTTCGGAGCTGAAGAAGCCAGGTGCATCCGTGAAGGTATCATGCAAAGCTTCCGGCTACACGTTCACCAGCTATTGGATGCATTGGATGCGCCAGGCCCCTGGGCAGGGGCTTGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCAAGTGACAGCTACACCAGCTACAACCAGGGCTTCACCGGCCGGTTCGTCCTCTCCGTTGATACCAGCGTATCCACGGCCTACCTGCAAATTTCCAGCCTGAAAGCGGAGGACACAGCTGTTTACTACTGTGCTCGTGGCGGGAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTGTCCTCT 서열번호 67
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염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCGCTGCCGGTGACTCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCTTGCCGATCTTCCCAGTCCTTGGTCCACTCTAATGGCAACACGTACTTGCACTGGTTCCAGCAGCGTCCCGGGCAGAGCCCTCGCCTGCTGATCTACAAGGTGTCGAACCGCTTCTCGGGCGTCCCCGACAGGTTTTCAGGCTCCGGTAGTGGCACCGACTTTACTCTCAAGATCAGCCGCGTGGAGGCGGAAGATGTGGGCGTGTACTACTGTTCTCAGTCCACTCACGTCCCCTTCACCTTTGGCGGTGGGACCAAGCTAGAGATCAAG 서열번호 68
scFv 아미노산서열 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPFTFGGGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWMRQAPGQGLEWIGVIDPSDSYTSYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGKRAMDYWGQGTTVTVSS 서열번호 69
scFv 염기서열 GACGTGGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCGCTGCCGGTGACTCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCTTGCCGATCTTCCCAGTCCTTGGTCCACTCTAATGGCAACACGTACTTGCACTGGTTCCAGCAGCGTCCCGGGCAGAGCCCTCGCCTGCTGATCTACAAGGTGTCGAACCGCTTCTCGGGCGTCCCCGACAGGTTTTCAGGCTCCGGTAGTGGCACCGACTTTACTCTCAAGATCAGCCGCGTGGAGGCGGAAGATGTGGGCGTGTACTACTGTTCTCAGTCCACTCACGTCCCCTTCACCTTTGGCGGTGGGACCAAGCTAGAGATCAAG GGCGGAGGCGGGTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGAGGGGGCGGCTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTTCGGAGCTGAAGAAGCCAGGTGCATCCGTGAAGGTATCATGCAAAGCTTCCGGCTACACGTTCACCAGCTATTGGATGCATTGGATGCGCCAGGCCCCTGGGCAGGGGCTTGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCAAGTGACAGCTACACCAGCTACAACCAGGGCTTCACCGGCCGGTTCGTCCTCTCCGTTGATACCAGCGTATCCACGGCCTACCTGCAAATTTCCAGCCTGAAAGCGGAGGACACAGCTGTTTACTACTGTGCTCGTGGCGGGAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTGTCCTCT 서열번호 70
Hu3A5(V11) 항체의 서열정보
Hu3A5(V11) 서열정보 서열번호
중쇄가변부위
아미노산서열		 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 71
경쇄가변부위
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중쇄가변부위
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Hu3A5(V12) 항체의 서열정보
Hu3A5(V12) 서열정보 서열번호
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Hu3A5(V13) 항체의 서열정보
Hu3A5(V13) 서열정보 서열번호
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Hu3A5(V14) 항체의 서열정보
Hu3A5(V14) 서열정보 서열번호
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Hu3A5(V15) 항체의 서열정보
Hu3A5(V15) 서열정보 서열번호
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scFv 아미노산서열 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLVHSNGNTYLHWYQQKPGQPPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCSQSTHVPFTFGGGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGVIDPSDSYTSYNQGFTGRFVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGKRAMDYWGQGTTVTVSS 서열번호 99
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Hu3A5(V16) 항체의 서열정보
Hu3A5(V16) 서열정보 서열번호
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염기서열		 GACGTGGTGATGACCCAGTCGCCCGATTCTTTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCGACCATCAACTGCAAATCCAGCCAGTCCCTAGTGCACTCAAATGGCAACACGTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGTCAGCCGCCTAAGCTGCTCATCTACAAGGTTTCGAACCGCTTCTCCGGTGTGCCAGACAGGTTTTCTGGTTCCGGCTCCGGAACCGACTTCACACTGACCATCTCTTCCCTGCAGGCGGAGGATGTAGCCGTGTACTACTGTTCTCAGTCCACCCATGTGCCCTTTACTTTCGGTGGGGGCACTAAACTGGAGATCAAG 서열번호 104
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scFv 염기서열 GACGTGGTGATGACCCAGTCGCCCGATTCTTTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCGACCATCAACTGCAAATCCAGCCAGTCCCTAGTGCACTCAAATGGCAACACGTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGTCAGCCGCCTAAGCTGCTCATCTACAAGGTTTCGAACCGCTTCTCCGGTGTGCCAGACAGGTTTTCTGGTTCCGGCTCCGGAACCGACTTCACACTGACCATCTCTTCCCTGCAGGCGGAGGATGTAGCCGTGTACTACTGTTCTCAGTCCACCCATGTGCCCTTTACTTTCGGTGGGGGCACTAAACTGGAGATCAAG GGCGGAGGCGGGAGCGGCGGCGGCGGAAGTGGCGGAGGTGGCAGC CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGGTCCGAGCTCAAGAAGCCCGGCGCCTCAGTGAAGGTATCGTGCAAGGCTTCCGGTTACACGTTTACCTCTTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGACAGGGGTTGGAATGGATGGGCGTCATTGACCCGTCCGACAGTTACACCAGCTACAACCAGGGCTTCACTGGCCGTTTCGTCTTCTCCGTGGACACTTCGGTCTCCACCGCTTACCTTCAAATTTCTAGCCTGAAAGCGGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCACGGGGGGGGAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACGACCGTCACCGTGAGCTCT 서열번호 106
인간화된 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성 확인 - ELISA와 유세포분석(flow cytometer)
4-1: ELISA 분석
본 발명에서는 상기 실시예 3에서 확립한 인간화된 항체 16종을 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, CD47 펩타이드를 코딩하기 위해, CD47 단백질(Acrobiosystems, cat#CD7-HA2E9)을 100 ng/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 분주한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 3% BSA가 포함된 1 X PBST를 처리한 후, 상온에서 30분 동안 블로킹시켰다.
정제된 0.8 ㎍의 인간화된 항체를 각 웰에 처리한 다음, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-HRP, 1:5,000)를 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척한 다음, 발색을 위해 TMB를 처리하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로 1N H2SO4의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 종료시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA 실험 조건
ELISA reader Infinite F50
Measurement Filter 450 nm
Measurement Mode Single Point Photo
Antigen Coating 100 ng/well
2 nd Antibody (Anti-mIgG -HRP) 1:5,000 dilution
Substrate TMB
ELISA 실험 결과
항체 종류 OD450 측정값
Hu3A5(V1) 2.5827
Hu3A5(V2) 2.6904
Hu3A5(V3) 2.5426
Hu3A5(V4) 2.7364
Hu3A5(V5) 2.5703
Hu3A5(V6) 2.624
Hu3A5(V7) 2.674
Hu3A5(V8) 2.4529
Hu3A5(V9) 2.647
Hu3A5(V10) 2.8076
Hu3A5(V11) 2.8133
Hu3A5(V12) 2.8549
Hu3A5(V13) 0.0966
Hu3A5(V14) 0.1467
Hu3A5(V15) 0.1114
Hu3A5(V16) 0.106
음성대조군 0.0431
그 결과, 표 22에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 선별한 Hu3A5(V1), Hu3A5(V2), Hu3A5(V3), Hu3A5(V4), Hu3A5(V5), Hu3A5(V1), Hu3A5(V6), Hu3A5(V7), Hu3A5(V8), Hu3A5(V9), Hu3A5(V10), Hu3A5(V11), Hu3A5(V12), Hu3A5(V13), Hu3A5(V14), Hu3A5(V15), 및 Hu3A5(V16) 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
4-2: 유세포분석(flow cytometer)를 이용한 분석
본 발명에서는 상기 실시예 3에서 확립한 16종의 인간화된 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 유세포분석(flow cytometer)을 수행하였다.
먼저, CD47을 과발현하는 유방암세포주 MCF-7(1 x 107개)과 인간화된 16종의 3A5 항체(1 ㎍) 각각을 30분간 반응시킨 다음, 2차 항체로 표면(surface)을 염색한 후, 유세포분석기로 측정하였다.
양성 대조군(positive control)으로 CD47 항체(Biolegend PE anti-human CD47, cat# 323108, 5㎕)를, 2차 항체로는 PE-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체(PE-conjugated goat anti-mouse IgG; Biolegend Inc., cat# 405307, 미국, 5㎕)를 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 16종의 인간화된 3A5 항체는 모두 CD47을 과발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
인간화된 3A5 항체의 CD47-SIRPα 결합 차단능 확인
암 세포에서 발현되는 CD47과 대식세포 상의 SIRPα 결합은 식균작용을 음성적으로 조절하여 암 세포의 면역회피를 유도한다. 본 발명에서는 인간화된 Hu3A5(V10) 항체가 CD47-SIRPα의 상호작용을 차단하는지 확인하고자 하였다.
CD47를 발현하는 MCF-7 세포에 10-1,100,101,102,103,104,105,106및 107ng/㎖ 농도의 Hu3A5(V10) 항체를 각각 처리하여 MCF-7 세포에 Hu3A5(V10) 항체가 결합하도록 하였다. 그 다음, 상기 Hu3A5(V10) 항체가 부착된 MCF-7 세포와 PE가 붙은 SIRPα 단백질(Acrobiosystems, cat#SIA-HP252)를 반응시킨 후, SIRPα가 세포 표면의 CD47과 결합하는 정도를 유세포분석기로 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간화된 3A5(V10) 항체는 CD47-SIRPα 결합을 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다.
인간화된 3A5 항체에 의한 대식세포의 대식작용을 향상시키는 효과 확인
정상인의 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC)를 Ficoll-Paque로 분리하여 AIM-V 미디어가 들어 있는 24웰 플레이트에 넣고 단핵구(monocyte)가 바닥에 붙기를 기다린 다음, 단핵구가 대식세포(macrophage)로 분화되도록 AIM-V 배지에서 7일간 배양하였다.
말초혈액단핵세포(PBMC)를 CFSE를 붙인 저캣세포와 공동배양(co-culture)한 다음, Hu3A5(V10) 항체와 함께 상기 대식세포가 분화된 공동배양 플레이트에 첨가한 후, 대식세포가 저캣세포를 소화하는 대식작용을 CFSE+CD14+세포로 분석하였다. Hu3A5(V10) 항체는 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/㎖ 농도가 되도록 각각 첨가하였으며, 대조군으로는 10 ㎍/㎖ 농도의 인간 lgG(hlgG)를 이용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체는 CD47를 과발현하는 암세포와 결합하여 대식세포의 암세포 대식작용을 촉진하는 것을 확인하였다.
인간화된 3A5 항체의 적혈구 응집 여부 확인
본 발명에서는 인간화된 3A5 항체가 적혈구 응집반응을 유도하는지 확인하기 위해, Hu3A5(V10) 항체와 상업적 항-CD47 항체(clone#CC2C6)의 적혈구/혈소판 결합 여부 및 적혈구 응집반응 여부를 확인하였다.
건강한 자원자로부터 채혈한 혈액을 1 mmol/ℓ EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)가 포함된 PBS로 세번 세척하였으며, 세척된 혈액을 1:400 비율로 1 mmol/ℓ EDTA가 포함된 PBS에 희석하여 사람의 RBC(red blood cell)를 준비하였다. 세척된 RBC를 96-웰 플레이트(96-well round culture plate)에 100 ㎕/well씩 분주하였으며, 항-CD47 항체(anti-human CD47 mAb, CC2C6 clone)와 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체를 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25㎍/㎖ 농도로 각각 처리하였다. 항체를 첨가한 96-웰 플레이트를 37℃ 배양기에서 2시간 동안 배양하여 적혈구 응집반응(RBC hemagglutination)을 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 상업적 항-CD47 항체(clone#CC2C6)는 적혈구와 반응하여 적혈구 응집반응을 유도한 반면, 본 발명의 인간화된 Hu3A5(V10) 항체는 적혈구 및 혈소판과 결합하지 않으며(도 5A), 적혈구 응집반응도 유도하지 않은 것으로 나타났다 (도 5B).
3A5 항체에 의한 CD47 과발현 종양의 성장 억제 효능 확인
본 발명에서는 3A5 항체가 CD47이 발현되는 종양의 성장을 억제하는지 확인하기 위해, 도 6A의 모식도에 나타난 방법과 같이 동물 실험을 수행하였다.
먼저, C57BL/6 (6주령, female) 마우스에 2.5 × 106개의 인간 CD47이 발현되는 쥐 결장 선암종 세포(murine colon adenocarcinoma cell, MC38-hCD47, Biocytogen)를 피하주사로 이식하였다. 암세포 이식 10일째, 각 생쥐의 암조직 크기를 측정하여 균일하게 하기와 같이 4의 그룹으로 나누었다 (n=5 per group).
1) Rat IgG 투여군(대조군)
2) 항-PD-1 항체 투여군
3) 항-CD47 항체(3A5 항체) 투여군
4) 항-PD-1 항체 및 항-CD47 항체(3A5 항체) 병용투여군
각 실험군에 맞게 200 μg 농도의 항체를 그룹별로 각각 복강 투여하였으며, 5일 간격으로 총 3회 투여하였다. 항체 투여와 함께 암조직의 크기를 주기적으로 측정하여 암조직의 성장을 측정하였다.
그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, 3A5 항체 단독 투여군에서 CD47을 과발현하는 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 3A5 항체 및 항-PD-1 항체 병용투여군의 종양 성장 억제 효능이 가장 우수한 것을 확인하였다. 이는 면역관문억제제인 항-PD-1 항체와 본 발명의 3A5 항체를 병용투여하는 경우, 종양 치료에 대한 시너지 효과를 보이는 것을 의미한다.
인간화된 3A5 항체에 의한 CD47 과발현 종양의 성장 억제 효능 확인
인간화된 3A5 항체의 종양 성장 억제 효능을 확인하기 위해, 마우스 CD47 및 SIRPα 유전자가 인간 CD47 및 인간 SIRPα 유전자로 대체된 C57BL/6-hCD47/hSIRPα 녹인 마우스(C57BL/6-hCD47/hSIRPα knock-in mouse, hCD47 KI)를 준비하였다.
25 마리의 C57BL/6-hCD47/hSIRPα (hCD47 KI, female, 6 주령)에 2.5 × 106개의 인간 CD47이 발현되는 쥐 결장 선암종 세포(murine colon adenocarcinoma cell, MC38-hCD47, Biocytogen)을 피하로 이식하였다. 암세포 이식 10일째 각 생쥐의 암조직 크기를 측정한 후, 25마리의 생쥐 중 20마리를 선정하여 균일하게 하기와 같이 4의 그룹으로 나누었다 (n=5 per group).
1) Rat IgG 투여군(대조군)
2) 항-PD-1 항체 투여군
3) 항-CD47 항체(3A5 항체) 투여군
4) 항-PD-1 항체 및 항-CD47 항체(3A5 항체) 병용투여군
각 실험군에 맞게 200 μg 농도의 항체를 그룹별로 각각 복강 투여하였으며, 5일 간격으로 총 4회 투여하였다. 항체 투여와 함께 암조직의 크기를 주기적으로 측정하여 암조직의 성장을 측정하였다.
상기 실시예 10과 같이 인간 CD47이 발현되는 쥐 결장 선암종 세포를 마우스에 이식한 다음, 대조군 항체(Rat IgG), 항-PD-1 항체, 항-CD47 항체(Hu3A5(V10) 항체), 및 항-PD-1 항체 + 항-CD47 항체(Hu3A5(V10) 항체)를 각각 투여하였다 (도 7A).
그 결과, Hu3A5(V10) 항체 단독 투여군에서 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 Hu3A5(V10) 항체 및 항-PD-1 항체 병용투여군의 종양 성장 억제 효능이 가장 우수한 것을 확인하였다.
또한, 마지막 항체 투여 후, 실험을 종결한 암세포 이식 32일째 C57BL/6-hCD47/hSIRPα 녹인 마우스의 주요 장기(간, 폐, 신장)를 분리하여 10% 포르말린 용액에 담궈 하루 동안 조직을 고정하였다. 고정된 각 조직은 파라핀 왁스에 임베딩(embedding)하였으며, 5 μm 두께로 절편을 만들어 유리슬라이드(glass slide)에 부착하였다. 각 슬라이드는 H&E 염색 키트(Hematoxylin and Eosin stain kit; VECTOR laboratories, CAT #: H-3502)을 이용하여 H&E(hematoxylin and eosin) 염색하였다. 염색이 완료된 각 조직은 슬라이드 스캐너(Vectra Polaris Imaging system, PerkinElmer)를 이용하여 이미지를 획득하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 항체 투여에도 염증으로 인한 주요 조직 손상은 관찰되지 않았다.
<110> InnoBation Bio Co., Ltd. <120> Humanized antibody specific for CD47 and a pharmaceutical composition for preventing or treating CD47-related diseases comprising the same <130> PDPC214315k01 <150> KR 10-2021-0085561 <151> 2021-06-30 <160> 123 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5 VH_CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5 VH_CDR2 <400> 2 Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5 VH_CDR3 <400> 3 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5 VL_CDR1 <400> 4 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5 VL_CDR2 <400> 5 Lys Val Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A5 VL_CDR3 <400> 6 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr 1 5 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tcttctttgc aggccgagga cgtggcggtt tatttctgtt ctcaatccac ccacgtcccc 300 ttcaccttcg gcggcgggac caagctggag atcaaa 336 <210> 26 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V3) VL nucleotide sequence <400> 26 gaggtgcagc tggtgcagtc cggggcagag gtaaagaagc cgggcgcttc cgtgaaggtg 60 tcgtgtaagg cttctggcta cacgttcaca tcctactgga tgcattggat gcgccaggct 120 cccggacagg gcctggagtg gatcggtgtg attgacccga gcgattctta caccagctac 180 aaccagaaat ttcagggacg agtgactctt acggtggaca cctcgacctc cactgcctac 240 atggagctga gctctctgcg ctcggaagac accgccgtgt actactgcgc ccgtggtggc 300 aagcgcgcca tggattattg gggccagggt accacagtca ccgtgtcgtc c 351 <210> 27 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V3) scFv amino acid sequence <400> 27 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 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actgtggaca cctcgacctc caccgcctac 240 atggagctga gctccctgcg cagcgaagac acagcggtgt actactgtgc ccgtgggggc 300 aagcgcgcca tggattattg gggccagggt actaccgtga ccgtttcgag c 351 <210> 33 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V4) scFv amino acid sequence <400> 33 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 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atcaagggcg ggggaggctc cggtgggggc 360 ggtagcggcg gcggaggctc ccaggtgcag ctagtgcagt ctggggcgga ggtgaagaag 420 cctggcgctt ccgtgaaagt ttcgtgtaag gcatccggct acacgttcac cagctattgg 480 atgcattggg tccgccaggc ccccggccag ggtctggagt ggatgggcgt gattgacccg 540 tccgacagtt acaccagtta caaccagaag ttccagggcc gggtgaccat gactgtggac 600 acctcgacct ccactgccta catggagctg agcagcctgc gctcggagga caccgcggtg 660 tactactgcg cccgtggtgg gaagcgcgcc atggattatt ggggccaggg caccaccgtg 720 actgtcagct cc 732 <210> 47 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V7) VH amino acid sequence <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 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sequence <400> 90 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 91 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V14) VH nucleotide sequence <400> 91 caggtccagc tggtgcagtc tgggtccgag ctgaagaagc ctggcgcgtc cgtgaaggtg 60 tcgtgtaaag cttccggcta caccttcacc agctattgga tgaactgggt gcgccaggcc 120 cccgggcagg ggctggagtg gatgggcgtg attgacccgt ccgattctta cacaagctac 180 aaccagggct tcaccggccg gttcgtgttc tccgtggaca cctccgttag cactgcctac 240 ctgcagattt cgtcgctcaa agcagaagac acggccgtgt actactgtgc tcgcggcggc 300 aagcgcgcca tggattattg gggccagggt acgaccgtca ccgtgtcctc t 351 <210> 92 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V14) VL nucleotide sequence <400> 92 gatgtggtga tgacccagag ccccctgtcc cttccagtca ccctgggaca gccagcttcc 60 atctcatgcc gaagttctca gagtctagtc cattctaatg gcaacactta cctccactgg 120 ttccagcaga gacctgggca gtccccgcgc ctgcttatct acaaggtcag caaccgcttt 180 tcaggcgtac ccgacaggtt ttcaggatcg ggcagcggga ccgacttcac attgaagatc 240 tctcgtgtgg aggcggagga cgtgggcgtg tactactgca gccaatcgac tcacgttccc 300 ttcaccttcg gcggaggcac caagctggag atcaag 336 <210> 93 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V14) scFv amino acid sequence <400> 93 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe Thr 180 185 190 Gly Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 94 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V14) scFv nucleotide sequence <400> 94 gatgtggtga tgacccagag ccccctgtcc cttccagtca ccctgggaca gccagcttcc 60 atctcatgcc gaagttctca gagtctagtc cattctaatg gcaacactta cctccactgg 120 ttccagcaga gacctgggca gtccccgcgc ctgcttatct acaaggtcag caaccgcttt 180 tcaggcgtac ccgacaggtt ttcaggatcg ggcagcggga ccgacttcac attgaagatc 240 tctcgtgtgg aggcggagga cgtgggcgtg tactactgca gccaatcgac tcacgttccc 300 ttcaccttcg gcggaggcac caagctggag atcaagggcg gcggcggttc tgggggcgga 360 ggttccggtg gtggtggttc ccaggtccag ctggtgcagt ctgggtccga gctgaagaag 420 cctggcgcgt ccgtgaaggt gtcgtgtaaa gcttccggct acaccttcac cagctattgg 480 atgaactggg tgcgccaggc ccccgggcag gggctggagt ggatgggcgt gattgacccg 540 tccgattctt acacaagcta caaccagggc ttcaccggcc ggttcgtgtt ctccgtggac 600 acctccgtta gcactgccta cctgcagatt tcgtcgctca aagcagaaga cacggccgtg 660 tactactgtg ctcgcggcgg caagcgcgcc atggattatt ggggccaggg tacgaccgtc 720 accgtgtcct ct 732 <210> 95 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V15) VH amino acid sequence <400> 95 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 96 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V15) VL amino acid sequence <400> 96 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 97 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V15) VH nucleotide sequence <400> 97 caggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ctggggcttc cgtaaaggtc 60 tcatgcaagg cttcgggcta cacgttcaca agctattgga tgaactgggt gcgccaggcc 120 cctggtcagg ggctggagtg gatgggcgtc attgacccga gtgacagcta caccagctac 180 aaccagggct tcaccggccg gttcgtcttt tccgtggaca cctccgtttc cactgcctac 240 ctccaaattt cttctcttaa agccgaggac actgcagtgt actactgtgc gcgtggtggc 300 aagcgcgcca tggattactg gggccagggt actaccgtca ccgtgtcgtc c 351 <210> 98 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V15) VL nucleotide sequence <400> 98 gatgtggtga tgacccagtc ccccgattct ctagccgtgt ccctgggcga gcgcgctaca 60 atcaactgca aaagctccca gtccttggtg cacagcaatg gcaacacgta cctgcattgg 120 taccagcaga agcccggaca gccaccgaag ctgctcatct acaaggtgag caaccgcttc 180 agtggggtcc ccgacaggtt ttcaggctcc ggttcgggga ccgactttac tctgaccatc 240 tcctctctgc aggcggaaga cgtggcggta tatttctgtt ctcagtccac ccacgttccc 300 ttcaccttcg gcggagggac caagcttgag atcaaa 336 <210> 99 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V15) scFv amino acid sequence <400> 99 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe Thr 180 185 190 Gly Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 100 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V15) scFv nucleotide sequence <400> 100 gatgtggtga tgacccagtc ccccgattct ctagccgtgt ccctgggcga gcgcgctaca 60 atcaactgca aaagctccca gtccttggtg cacagcaatg gcaacacgta cctgcattgg 120 taccagcaga agcccggaca gccaccgaag ctgctcatct acaaggtgag caaccgcttc 180 agtggggtcc ccgacaggtt ttcaggctcc ggttcgggga ccgactttac tctgaccatc 240 tcctctctgc aggcggaaga cgtggcggta tatttctgtt ctcagtccac ccacgttccc 300 ttcaccttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggcg gcggcggttc tggaggtggt 360 gggtctggcg gcggaggctc ccaggtgcag ctggtgcaga gcggcagcga gctgaagaag 420 cctggggctt ccgtaaaggt ctcatgcaag gcttcgggct acacgttcac aagctattgg 480 atgaactggg tgcgccaggc ccctggtcag gggctggagt ggatgggcgt cattgacccg 540 agtgacagct acaccagcta caaccagggc ttcaccggcc ggttcgtctt ttccgtggac 600 acctccgttt ccactgccta cctccaaatt tcttctctta aagccgagga cactgcagtg 660 tactactgtg cgcgtggtgg caagcgcgcc atggattact ggggccaggg tactaccgtc 720 accgtgtcgt cc 732 <210> 101 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V16) VH amino acid sequence <400> 101 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 102 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V16) VL amino acid sequence <400> 102 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 103 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V16) VH nucleotide sequence <400> 103 caggtgcagc tggtgcagag cgggtccgag ctcaagaagc ccggcgcctc agtgaaggta 60 tcgtgcaagg cttccggtta cacgtttacc tcttattgga tgaactgggt ccgccaggcc 120 cccggacagg ggttggaatg gatgggcgtc attgacccgt ccgacagtta caccagctac 180 aaccagggct tcactggccg tttcgtcttc tccgtggaca cttcggtctc caccgcttac 240 cttcaaattt ctagcctgaa agcggaggac accgccgtgt attactgtgc acgggggggg 300 aagcgcgcca tggattattg gggccagggc acgaccgtca ccgtgagctc t 351 <210> 104 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V16) VL nucleotide sequence <400> 104 gacgtggtga tgacccagtc gcccgattct ttggccgtgt ccctgggcga gcgcgcgacc 60 atcaactgca aatccagcca gtccctagtg cactcaaatg gcaacacgta cctgcactgg 120 taccagcaga agcctggtca gccgcctaag ctgctcatct acaaggtttc gaaccgcttc 180 tccggtgtgc cagacaggtt ttctggttcc ggctccggaa ccgacttcac actgaccatc 240 tcttccctgc aggcggagga tgtagccgtg tactactgtt ctcagtccac ccatgtgccc 300 tttactttcg gtgggggcac taaactggag atcaag 336 <210> 105 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V16) scFv amino acid sequence <400> 105 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Gly Phe Thr 180 185 190 Gly Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 106 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu3A5(V16) scFv nucleotide sequence <400> 106 gacgtggtga tgacccagtc gcccgattct ttggccgtgt ccctgggcga gcgcgcgacc 60 atcaactgca aatccagcca gtccctagtg cactcaaatg gcaacacgta cctgcactgg 120 taccagcaga agcctggtca gccgcctaag ctgctcatct acaaggtttc gaaccgcttc 180 tccggtgtgc cagacaggtt ttctggttcc ggctccggaa ccgacttcac actgaccatc 240 tcttccctgc aggcggagga tgtagccgtg tactactgtt ctcagtccac ccatgtgccc 300 tttactttcg gtgggggcac taaactggag atcaagggcg gaggcgggag cggcggcggc 360 ggaagtggcg gaggtggcag ccaggtgcag ctggtgcaga gcgggtccga gctcaagaag 420 cccggcgcct cagtgaaggt atcgtgcaag gcttccggtt acacgtttac ctcttattgg 480 atgaactggg tccgccaggc ccccggacag gggttggaat ggatgggcgt cattgacccg 540 tccgacagtt acaccagcta caaccagggc ttcactggcc gtttcgtctt ctccgtggac 600 acttcggtct ccaccgctta ccttcaaatt tctagcctga aagcggagga caccgccgtg 660 tattactgtg cacggggggg gaagcgcgcc atggattatt ggggccaggg cacgaccgtc 720 accgtgagct ct 732 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker amino acid sequence <400> 107 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 108 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 108 ggcggcggag gctccggtgg aggcgggtcc gggggaggcg gctcg 45 <210> 109 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 109 ggcgggggag gctccggcgg aggcggctcc ggtggtggtg gctcc 45 <210> 110 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 110 ggcggaggcg gctccggtgg ggggggctcg ggcggcggtg gctcc 45 <210> 111 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 111 ggtggcggag gttccggggg gggcggctct ggtggcggcg gctcc 45 <210> 112 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 112 ggcgggggcg ggtctggagg tggcggctcc ggtggtgggg gctcc 45 <210> 113 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 113 ggcgggggag gctccggtgg gggcggtagc ggcggcggag gctcc 45 <210> 114 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 114 ggcggtggtg gttccggcgg aggaggctcc ggagggggtg ggtct 45 <210> 115 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 115 ggcgggggtg ggtctggggg tggcggttcc ggaggtggag gctcc 45 <210> 116 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 116 ggcggaggcg gctcgggtgg ggggggctcc ggcgggggtg ggtcg 45 <210> 117 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 117 ggcggaggcg ggtctggtgg cggaggttct ggagggggcg gctcc 45 <210> 118 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 118 ggcggcggag gctccggagg gggaggctcg ggtggtggcg gctcc 45 <210> 119 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 119 ggcgggggcg gctccggtgg tggaggtagt gggggagggg gctcc 45 <210> 120 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 120 ggaggtggtg ggtctggcgg tggcggttcg ggcggaggcg gctcc 45 <210> 121 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 121 ggcggcggcg gttctggggg cggaggttcc ggtggtggtg gttcc 45 <210> 122 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 122 ggcggcggcg gttctggagg tggtgggtct ggcggcggag gctcc 45 <210> 123 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker nucleotide sequence <400> 123 ggcggaggcg ggagcggcgg cggcggaagt ggcggaggtg gcagc 45

Claims (10)

  1. (1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (4) 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (5) 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (6) 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (7) 서열번호 47의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (8) 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (9) 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (10) 서열번호 65의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (11) 서열번호 71의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 72의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (12) 서열번호 77의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 78의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (13) 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 84의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (14) 서열번호 89의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (15) 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 96의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
    (16) 서열번호 101의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 102의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된, CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터로 형질전환된 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포.
  5. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 CD47에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편은 CD47이 신호-조절-단백질 α(SIRPα)와 상호 작용하는 것을 방지하거나, CD47 과발현 세포에 대한 대식세포 매개 식균 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 면역관문억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 항-PD-1 항체인 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양인 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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