CN113924316B - 抗cd25抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种结合CD25的抗体或其抗原结合片段及其在制备癌症治疗药物中的用途，该抗体或其抗原结合片段包含含有特定互补决定区序列的轻链可变区和重链可变区。该抗体或抗原结合片段具有以下一种或多中优势：增强的CD25蛋白结合能力、增强的CD25蛋白亲和力、增强的CD25表达细胞杀伤能力、减弱的PBMC的激活抑制性、增强的体内肿瘤生长抑制能力、增强的体内肿瘤杀伤能力、增强的减少Treg细胞数量的能力，或增强的增加效应T细胞数量的能力。

Description

抗CD25抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种结合CD25的抗体及其应用。
背景技术
调节性T细胞(Treg)在介导免疫稳态中起着至关重要的作用，可以促进外周耐受的建立和维持。但是，在癌症的背景下他们的角色更复杂。由于癌细胞表达自身和肿瘤相关的抗原，因此抑制效应细胞反应的Treg的存在可以促进肿瘤进展。因此，已建立的肿瘤中Treg的浸润是有效的主要障碍之一。使用抑制机制的Treg被认为对当前疗法的局限性甚至失败有重大贡献，特别是依赖诱导或增强抗肿瘤反应的免疫疗法(Onishi H et al,2012Anticanc.Res.32,997-1003)。Treg的肿瘤浸润也与几种预后较差的人类癌症有关(Shang B et al.,2015,Sci Rep.5:15179)。已经证明Treg细胞有助于小鼠模型中肿瘤的建立和进展以及它们的缺失导致肿瘤进展延迟。在人类中，高比例肿瘤Treg细胞浸润，更重要的是效应T细胞(Teff)与Treg细胞的比例较低，与多种人类癌症的不良预后相关(Shanget al.,2015)。
CD25是实现Treg消耗的潜在分子靶标之一。CD25也称为白细胞介素-2高亲和力受体α链(IL-2Rα)，CD25在Treg上高水平表达，但CD25在Teff上不存在或以低水平表达。
现有技术中存在结合CD25但不阻断IL2与CD25结合的抗体，如MA251(Rubin etal,1985,Hybridoma 4(2)91-102,Tanaka et al,1986,Microbiol.Immunol 30(4),373-388)，但其仍然存在CD25结合活性不够高、抑制PBMC激活、药代动力学表现一般等缺陷。
面对患者对于疾病治疗的药物需求，尤其是抗体药物的需求，临床上仍然亟待提供一种结合活性更高的抗CD25抗体。
发明内容
本发明全文中关于VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、LCDR(轻链互补决定区)、HCDR(重链互补决定区)、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的各个实施方式可以各自单独实施，也可以任意组合实施。
在本发明的一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段，包含3个重链互补决定区，其中HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。进一步地，所述抗体或其抗原结合片段还包含3个轻链互补决定区，其中LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在本发明的一方面，本发明提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4所示的重链可变区；优选还含有SEQ ID NO:3所示的轻链可变区。
在本发明的一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段，包含3个轻链互补决定区，其中LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或3个重链互补决定区，其中HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的一方面，前述任一方面所述抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的序列为SEQ ID NO:20。
根据本发明的一方面，前述任一方面所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的序列为SEQ ID NO:17。
具体地，本发明提供的抗体或其抗原结合片段优选包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链可变区，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链恒定区和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链恒定区。
具体地，本发明提供的抗体或其抗原结合片段优选包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链可变区，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链恒定区和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链恒定区。
根据本发明的一方面，本发明的抗体或其抗原结合片段结合CD25，优选结合人CD25。
根据本发明的一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段等。
根据本发明的一方面，本发明涉及一种核酸，其编码前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的一方面，本发明涉及一种载体，其包含前一方面所述的核酸，或其可表达前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述载体可以是病毒载体；优选地，所述病毒载体包含但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体等；优选地，所述载体可以是非病毒载体；优选地，所述载体可以是哺乳细胞表达载体；优选地，所述表达载体可以是细菌表达载体；优选地，所述表达载体可以是真菌表达载体。
根据本发明的一方面，本发明涉及一种细胞，其可表达前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段的细胞。优选地，所述细胞为细菌细胞；优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞等；优选地，所述细胞为真菌细胞；优选地，所述真菌细胞为酵母细胞；优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞等；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾细胞(293)、B细胞、T细胞、DC细胞或NK细胞等。
根据本发明的一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或细胞，优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂，优选地，所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂等。
在一些实施方式中，所述药物组合物还可以包含其他治疗剂。在一些实施方式中，其他治疗剂包括化疗剂、免疫治疗剂或激素治疗剂。所述抗体或其抗原结合片段与其他治疗剂的联合施用能够增强这些治疗剂的治疗效果。
在一些实施方式中，所述“增强治疗效果”是指增强其他治疗剂或疗法的治疗效果。本发明提供的所述抗体或抗原结合片段可以单独施用，也可以与其他治疗剂或疗法联合施用。在一些实施方式中，其他治疗剂或疗法包括化疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、放射治疗、手术治疗等。
根据本发明的一方面，提供一种试剂盒，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸。
根据本发明的一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或细胞在制备治疗或预防疾病的药物中的应用。
根据本发明的一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段或核酸在制备诊断或检测试剂盒中的应用。
根据本发明的一方面，本发明提供一种治疗或预防疾病的方法，包括将本发明的抗体或抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物给予有需要的受试者。
根据本发明的一方面，本发明提供一种诊断或检测的方法，包括将本发明的抗体或抗原结合片段、核酸或试剂盒给予有需要的受试者或样本。优选地，所述方法是诊断或检测疾病的方法。
根据本发明的一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物用于治疗或预防疾病的用途。
根据本发明的一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸或试剂盒用于检测或诊断的用途。优选地，所述用途是诊断或检测疾病的用途。
根据本发明的一方面，所述疾病是癌症。
根据本发明的一方面，所述癌症包括胃癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、宫颈癌、肉瘤、细胞瘤、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤等。
根据本发明的一方面，本发明涉及制备前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括使用上述载体转染细胞，并由转染的细胞表达所述抗体或其抗原结合片段；或者包括用上述细胞表达所述抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的一方面，本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有以下中的一种或多种优势：增强的CD25蛋白结合能力、增强的CD25蛋白亲和力、增强的CD25表达细胞杀伤能力、减弱的PBMC的激活抑制性、增强的体内肿瘤生长抑制能力、增强的体内肿瘤杀伤能力、增强的减少Treg细胞数量的能力，或增强的增加效应T细胞数量的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出实施例1中免疫方案的BoAn-hMab1小鼠七免后血清滴度(62500倍稀释)；
图2A-图2E示出实施例3中ELSIA检测CD25抗体与CD25的结合灵敏度；
图3A-图3B示出实施例3中候选抗体模拟杀伤活性检测结果；
图4示出实施例3中候选抗体细胞阻断活性检测结果；
图5示出实施例4中CD25Q2-BA9-IgG1对降低恒河猴Treg细胞含量的作用；
图6示出实施例4中候选抗体在食蟹猴体内的药物代谢情况；
图7A-图7B示出实施例5.1中候选抗体在B-hIL2Rα人源化小鼠MC38结肠癌动物模型中的药效结果，其中，图7A示出MC38肿瘤模型小鼠体重数据，图7B示出MC38肿瘤模型肿瘤体积数据。
图8A示出实施例5.2中CD3中的CD8+细胞(Teff)含量。
图8B示出实施例5.2中CD3中的CD25+Foxp3+细胞(Treg)含量。
图8C示出实施例5.2中CD4中的Foxp3+细胞(Treg)含量。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明全文所描述的不同实施方式中所涉及的技术特征均可以相互组合实施。
实施例1抗CD25单克隆抗体的产生
1.1免疫方案
用CD25(义翘神州，目录号10165-H08H)与弗氏佐剂乳化后免疫博安生物全人抗体转基因小鼠BoAn-hMab1(按照中国专利CN103571872B记载的方法制备)。首免使用弗氏完全佐剂(Sigma，目录号：F5881-10ML)，二免至六免使用弗氏不完全佐剂(Sigma，目录号：F5506-10ML)，本次共免疫14只小鼠。选取血清滴度较高的7只小鼠加强免疫，3天后处死小鼠取出脾脏用于后续实验。小鼠血清滴度(62500倍稀释)见图1。
1.2噬菌体库的建立
取1.1中所述免疫小鼠的脾脏细胞，提取RNA后反转录获得cDNA，噬菌体库的建立步骤参照Carlos F.BarbasⅢ,Phage display：A laboratory manual中记载的方法进行，用PCR的方法从cDNA中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸PCR的方法获得scFv，scFv酶切后与质粒pCOMB3x连接，然后将连接产物电转染至大肠杆菌TG1感受态细胞中，TG1经培养后加入噬菌体侵染，培养物上清浓缩后即为本发明的噬菌体库。1.3噬菌体库筛选(两种方法)
(1)平板筛选：CD25蛋白(义翘神州，10165-H08H)以1μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天通过2％BSA封闭平板1h，加入噬菌体库(2×1012)孵育2h，洗涤4-10次后用洗脱缓冲液(向500ml超纯水中加入4.2ml浓盐酸(科密欧)，用甘氨酸粉末(Biotopped，BG0617-500)调节pH至2.2)或15μg/mL MA251洗脱与CD25特异性结合的噬菌体。
(2)磁珠筛选：CD25-Fc蛋白(义翘神州，10165-H02H)按照常规步骤进行生物素化，再与Thermo的磁珠(Invitrogen Dynabeads M-280Streptavidin，00355871)结合后与噬菌体库孵育，洗涤4-10次后用洗脱缓冲液(pH 2.2)或15μg/mL MA251洗脱与CD25特异性结合的噬菌体。
筛选的噬菌体克隆表达scFv，检测scFv与CD25的结合，并检测scFv对IL2/CD25结合的阻断，选择与CD25结合好并且不阻断的scFv进行后续构建。
ELISA检测scFv与CD25的结合：CBS缓冲液的制备：称取Na2CO3(国药，10019260)1.59g、NaHCO3 2.93g加蒸馏水至1L配制成CBS缓冲液。用pH 9.6CBS稀释CD25(10165-H08H，义翘神州)蛋白至0.2μg/mL，包被酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉于37℃封闭1h；洗板后加入80μL PBST(PBS+0.05％Tween20)，然后加入20μL ScFv周质，37℃孵育1h。洗板后加入anti-flag二抗(Proteintech，目录号：HRP-66008)，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100μL TMB(梅科万德，目录号1001)底物显色，10min后每孔加入50μL 2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450。
ELISA检测scFv阻断CD25/IL2的结合：用pH9.6 CBS稀释CD25(10165-H08H，义翘神州)蛋白至0.5μg/mL，包被酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉于37℃封闭1h。洗板后每孔加入scFv周质50μL。然后加入生物素标记的IL2蛋白(终浓度0.02μg/mL)，50μL/孔，37℃孵育1h；洗板后加入PBST稀释的STREP/HRP，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100μL TMB显色，10min后每孔加入50μL 2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450。
实施例2候选抗体分子的构建与生产
将磁珠筛选的克隆CD25Q2-BA3\BA9\BA125、CD25Q8-BT942、CD25Q11-BA402\BA406\BA410\BA415\BA422\BA428、CD25Q14-BA443\BA448\BA458和平板筛选的克隆CD25Q11-CA35\CA36\CT848、CD25Q14-CA705\CA707\CA721送Invitrogen生物技术有限公司测序。各克隆的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列如表1所示。
表1.克隆的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列
Figure BDA0002536478160000051
Figure BDA0002536478160000061
Figure BDA0002536478160000071
通过常规的分子生物学技术进行可变区基因扩增(2*Phanta Max Master Mix厂家：Vazyme货号：P515-AA批号：TE211GB)、信号肽与可变区重叠延伸、同源重组(ClonExpress II One Step Cloning Kit厂家：Vazyme货号：C112-01批号：TE211L8)等，最终把编码VH的核苷酸序列片段插入带有编码抗体重链恒定区氨基酸序列SEQ ID NO:17的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(Life Technology)，把编码VL的核苷酸序列片段插入带有编码抗体轻链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:20)的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(LifeTechnology)，将连接好的载体转染进入HEK293细胞在37℃\8％CO2\125rpm摇床中培养，瞬时表达6-7天后，上清通过Protein A亲和层析，纯化获得抗CD25抗体，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。
对照抗体生产：MA251抗体是现有技术中不阻断IL2与CD25结合的抗人CD25抗体，对人CD25有较高亲和力，且具有良好的不阻断IL2与CD25结合的表现。MA251抗体是研究IL2与CD25结合的经典抗体。将编码MA251抗体可变区的核苷酸序列经全基因合成后插入载体pCDNA3.4并通过HEK293细胞表达，生产的抗体命名为CD25-MA251-IgG1(重链可变区序列为SEQ ID NO:18，轻链可变区序列为SEQ ID NO:19，轻链恒定区序列为SEQ ID NO:20，重链恒定区序列为SEQ ID NO:17)。
实施例3候选抗体的表征
3.1 ELISA检测候选抗体与CD25蛋白的结合活性
用CBS稀释CD25蛋白(10165-H08H，义翘神州)至不同浓度(0.08μg/mL、0.02μg/mL、0.005μg/mL、0.00125μg/mL、0.0003125μg/mL、0.000078125μg/mL)，包被酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入用PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释至1μg/mL的候选抗体各100μL，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP(KPL，目录号：5450-0009)，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450，计算得到EC50。结果见图2A-2E和表2-表6。
如表2所示，候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1与CD25抗原结合EC50值为3.328，显著低于对照组CD25-MA251-IgG1的EC50值10.63，说明候选抗体的抗原结合能力显著优于对照组CD25-MA251-IgG1。
如表6所示，候选抗体CD25Q8-BT942-IgG1与CD25抗原结合EC50值为2.26，显著低于对照组CD25-MA251-IgG1的EC50值24.5，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组CD25-MA251-IgG1。
预示候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1、CD25Q8-BT942-IgG1相较对照组CD25-MA251-IgG1对表达CD25的Treg细胞有更强的靶向性和结合性，有更好杀伤效果，减少Treg细胞对Teff细胞的抑制，有更好的药学效果。
表2.ELISA检测候选抗体与CD25蛋白的结合活性数据(对应图2A)
抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL) 抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
CD25Q2-BA3-IgG1 7.375 CD25Q5-BA303-IgG1 1.202
CD25Q2-BA9-IgG1 3.328 CD25Q11-BA402-IgG1 0.6743
CD25Q3-BA125-IgG1 1.608 CD25-MA251-IgG1 10.63
表3.ELISA检测候选抗体与CD25蛋白的结合活性数据(对应图2B)
抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL) 抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
CD25Q11-BA406-IgG1 0.6515 CD25Q11-BA415-IgG1 0.9405
CD25Q11-BA410-IgG1 16.82 CD25Q14-CA705-IgG1 4.773
CD25Q11-CA36-IgG1 2.41 CD25-MA251-IgG1 14.06
表4.ELISA检测候选抗体与CD25蛋白的结合活性数据(对应图2C)
抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL) 抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
CD25Q11-BA422-IgG1 1.304 CD25Q14-BA448-IgG1 2.684
CD25Q11-BA428-IgG1 0.5974 CD25Q14-BA458-IgG1 1.003
CD25Q14-BA443-IgG1 1.06 CD25-MA251-IgG1 16.98
表5.ELISA检测候选抗体与CD25蛋白的结合活性数据(对应图2D)
抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL) 抗体名称 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
CD25Q14-CA707-IgG1 6.415 CD25-MA251-IgG1 12.09
CD25Q14-CA721-IgG1 3.252 / /
表6.ELISA检测候选抗体与CD25蛋白的结合活性数据(对应图2E)
Figure BDA0002536478160000081
Figure BDA0002536478160000091
3.2候选抗体的模拟杀伤活性检测
用FBS(Gibco，目录号：10091-148)和RPMI-1640(Gibco，目录号：11875-093)按照1:99混合以配制1％FBS RPMI-1640，收集SU-DHL-1靶细胞，用1％FBS RPMI-1640稀释至1.2×106细胞/mL，取适当候选抗体用1％FBS RPMI-1640稀释至25μg/mL，以此浓度为起始浓度；依次4倍梯度稀释共8个点，备后续使用；收集效应细胞Jurkat(G7011，Promega)，用1％FBS RPMI-1640稀释至2.4×106细胞/mL，在白色96孔板中加入靶细胞25μL/孔；在铺有靶细胞的孔中加入梯度稀释的抗体25μL/孔；加入效应细胞Jurkat 25μL/孔，将96孔板放入细胞培养箱培养5h；取出96孔板，放置室温，使其温度平衡到室温；加入Bio-Gl显色液(G7940，Promega)75μL/孔，反应15min，Tecan酶标仪读取Luminescense得值。结果见图3A-图3B及表7-表8。
表7.候选抗体模拟杀伤活性检测结果(对应图3A)
抗体名称 EC<sub>50</sub>(μg/mL) 抗体名称 EC<sub>50</sub>(μg/mL)
CD25Q2-BA3-IgG1 0.3310 CD25Q14-CA705-IgG1 0.4094
CD25Q2-BA9-IgG1 0.2356 CD25Q11-BA422-IgG1 0.8362
CD25Q3-BA125-IgG1 0.2512 CD25Q11-BA428-IgG1 0.2170
CD25Q11-BA402-IgG1 0.4429 CD25-MA251-IgG1 0.3606
CD25Q11-BA410-IgG1 0.2149 / /
表8.候选抗体模拟杀伤活性检测结果(对应图3B)
抗体名称 EC<sub>50</sub>(μg/mL) 抗体名称 EC<sub>50</sub>(μg/mL)
CD25Q14-BA443-IgG1 0.3604 CD25Q11-BA35-IgG1 0.5040
CD25Q14-BA448-IgG1 0.2756 CD25Q11-CA36-IgG1 0.8569
CD25Q14-BA458-IgG1 0.2656 CD25Q11-BA415-IgG1 0.2332
CD25Q14-CA707-IgG1 0.2476 CD25-MA251-IgG1 0.2546
CD25Q14-CA721-IgG1 0.2879 / /
如表7所示，候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1模拟杀伤活性检测EC50值为0.2356，低于对照组CD25-MA251-IgG1的EC50值0.3606，说明候选抗体对SU-DHL-1的杀伤能力优于对照组CD25-MA251-IgG1。
以上结果说明候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1对表达CD25的细胞有良好杀伤效果，预示候选抗体能够减少表达CD25的Treg细胞及其对Teff细胞的抑制，从而具有更好的药学效果。3.3BiaCore检测抗体亲和力
抗体结合动力学使用基于表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SRP)技术的BIAcore8K仪器测量。通过GE anti Human IgG Fc氨基偶联试剂盒(GE，cat#BR-1008-39)，将anti-human IgG抗体氨基偶联到CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将CD25蛋白(义翘神州，10165-H08H)用HBS-EP+1×(GE，BR-1008-26)缓冲液2倍连续稀释，50nM起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。待测抗体：2μg/mL，进样时间70s，流速5μL/min，稳定5s；CD25蛋白：结合60s，流速30μL/min，解离450s；再生：用3M MgCl2 buffer再生30s，Startup 3次。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合常数(ka)和解离常数(kd)，平衡解离常数(KD)以比率kd/ka计算。各抗体亲和力数据见表9。
表9.BiaCore检测候选抗体结合动力学数据
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
CD25Q2-BA3-IgG1 4.56E+05 1.36E-03 2.98E-09
CD25Q2-BA9-IgG1 6.96E+05 5.86E-04 8.43E-10
CD25Q11-CA36-IgG1 6.02E+04 9.66E-05 1.61E-09
CD25Q3-BA125-IgG1 6.99E+05 3.01E-04 4.31E-10
CD25Q11-BA402-IgG1 3.50E+05 2.12E-04 6.07E-10
CD25Q11-BA410-IgG1 1.40E+06 6.74E-03 4.81E-09
CD25Q11-BA415-IgG1 3.23E+05 1.99E-04 6.14E-10
CD25Q11-BA428-IgG1 5.55E+05 2.10E-04 3.79E-10
CD25Q14-BA443-IgG1 1.36E+05 2.01E-04 1.48E-09
CD25Q14-BA448-IgG1 5.87E+05 5.31E-04 9.04E-10
CD25Q14-BA458-IgG1 3.62E+05 2.16E-04 5.96E-10
CD25Q14-CA705-IgG1 3.81E+05 7.52E-04 1.97E-09
CD25Q14-CA707-IgG1 3.31E+05 9.44E-04 2.85E-09
CD25Q14-CA721-IgG1 6.80E+05 3.65E-04 5.36E-10
CD25Q11-CT848-IgG1 7.05E+05 2.18E-03 3.09E-09
CD25Q8-BT942-IgG1 8.96E+04 3.39E-04 3.79E-09
CD25-MA251-IgG1 1.76E+05 9.12E-04 5.19E-09
如表9所示，候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1的平衡解离常数KD值为8.43E-10低于对照组CD25-MA251-IgG1的KD值5.19E-09，说明候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1的CD25蛋白亲和力优于对照组CD25-MA251-IgG1。
如表9所示，候选抗体CD25Q8-BT942-IgG1的平衡解离常数KD值为3.79E-09低于对照组CD25-MA251-IgG1的KD值5.19E-09，说明候选抗体CD25Q8-BT942-IgG1的CD25蛋白亲和力优于对照组CD25-MA251-IgG1。
以上结果预示候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1、CD25Q8-BT942-IgG1相较对照组CD25-MA251-IgG1对表达CD25的Treg细胞有更强的靶向性和结合性，有更好杀伤效果，减少Treg细胞对Teff细胞的抑制，有更好的药学效果。
3.4候选抗体的细胞阻断活性
冻存的PBMC(外周血单核细胞，厂家：ALLCELLS货号：PB003F-C)复苏后与10μg/mL的CD25抗体在96-U底板共培养30min，对照组不加抗体，标记为NoAb，然后加入IL2(0.1U/mL、1U/mL、10U/mL)培养10min(工作培养基：1640+10％FBS，含2mM L-谷氨酰胺以及10000U/mL Pen-Strep)，制备细胞悬液：最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全离解沉淀；每孔加入200μL Foxp3固定/破膜工作溶液。于2-8℃或室温避光孵育30-60分钟；在室温下400-600g离心样品5分钟，弃上清；每孔加入200μL 1X破膜液，室温下400-600g离心样品5分钟，弃上清，洗涤2遍；(预先将BD PhosflowTM Perm Buffer Ⅲ放入-20℃预冷)PBS洗涤1次，离心弃上清；涡旋同时缓慢加入冰冷的PhosflowTM Perm Buffer Ⅲ，冰上孵育30分钟；PBS洗涤细胞2次，250g离心10分钟弃上清；PBS重悬细胞至107个/mL，分装100μL/孔，继续荧光标记抗体染色并流式检测；划门区分活细胞，进一步区分CD3阳性T细胞。磷酸化信号转导子与转录激活子5(PSTAT5)百分比越高，说明阻断率越低。结果见图4及表10。
如表10所示，候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1的％PSTAT5值为26.09，显著高于对照组CD25-MA251-IgG1的％PSTAT5值18.52，说明候选抗体在不阻断IL2与PBMC结合的表现上显著优于对照组CD25-MA251-IgG1。说明候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1相较对照组CD25-MA251-IgG1能更少的抑制PBMC的激活，预示候选抗体CD25Q2-BA9-IgG1能更好的发挥PBMC免疫效果，有更好的药学效果/抑瘤效果。
如表10所示，候选抗体CD25Q8-BT942-IgG1的％PSTAT5值为16.46，CD25-MA251-IgG1的％PSTAT5值18.52，说明候选抗体在不阻断IL2与PBMC结合的表现上与对照组CD25-MA251-IgG1基本相当。预示候选抗体CD25Q8-BT942-IgG1能良好的发挥PBMC免疫效果，有良好的药学效果/抑瘤效果。
表10.候选抗体细胞阻断活性数据(对应图4)
抗体名称 ％PSTAT5 抗体名称 ％PSTAT5
CD25Q2-BA9 26.09 CD25Q11-CT848-IgG1 15.76
CD25Q11-Q36 23.08 CD25Q8-BA747-IgG1 8.1
NoAb 22.38 CD25Q11-BT957-IgG1 6.72
CD25Q-MA251 18.52 CD25Q14-BT819-IgG1 5.3
CD25Q11-BA422-IgG1 18.09 CD25Q11-CT847-IgG1 4.41
CD25Q11-BA410 16.84 CD25Q11-BT956-IgG1 3.78
CD25Q8-BT942-IgG1 16.46 CD25Q2-CT805-IgG1 1.68
实施例4候选抗体的体内活性
4.1 CD25Q2-BA9-IgG1在健康恒河猴体内的PD活性
将CD25Q2-BA9-IgG1抗体以10mg/kg的给药剂量静脉给药3只恒河猴，采用流式细胞仪(CytomicsTM FC500)按照流式细胞术检测给药前后不同时间点Treg细胞(CD3+CD4+CD25+FoxP3+)的含量，检测时间点为：给药前给药结束(±1分钟)，给药结束后0.5小时(±1分钟)、3小时(±2分钟)、6小时(±5分钟)、24小时(±10分钟)、48小时(±20分钟，2天)、96小时(±30分钟，4天)、168小时(±1小时，7天)、336小时(±1小时，14天)，实验结果见图5。
由图5可见，CD25Q2-BA9-IgG1给药后，可以显著降低恒河猴体内Treg细胞含量，能够有效调节免疫微环境。
4.2候选抗体在食蟹猴体内的PK活性
每组两只食蟹猴，静脉注射不同CD25抗体后，并于给药前(0h)及给药后1min，30min，3h，6h，1d，2d，4d，7d，10d，14d经静脉取出全血样品，置血样收集管中，冰盒内让其自然凝固，于血样取出后8h内置离心机中，1000～3000g离心10min，分离血清，置样本保存管中，第14天再次静脉注射不同CD25抗体，并于给药前(0h)及给药后1min(14d+1m)，30min(14d+30m)，3h(14d+3h)，6h(14d+6h)，1d(15d)，2d(16d)，4d(18d)和7d(21d)经静脉取出全血样品，置血样收集管中，冰盒内让其自然凝固，于血样取出后8h内置离心机中，1000～3000g离心10min，分离血清，置样本保存管中，用ELISA的方法检测抗体在食蟹猴体内的代谢情况，结果见图6和表11。
结果显示：CD25Q2-BA9-IgG1与CD25Q8-BT942-IgG1的生物利用度高于对照抗体CD25-MA251-IgG1，有良好的药代动力学表现。
表11.候选抗体在食蟹猴体内代谢
Figure BDA0002536478160000111
Figure BDA0002536478160000121
实施例5候选抗体的体内肿瘤模型药效
5.1候选抗体在B-hIL2Rα人源化小鼠MC38结肠癌动物模型中的药效测试
根据体重将B-hIL2Rα人源化小鼠(百奥赛图)分为5组，其中G1阴性对照组10只，G2-G4治疗组每组8只。分组当天开始给药(10mg/kg，I.P.，BIW)(10mg/kg，腹腔注射，每周两次)，第二天将PBS重悬的MC38细胞以5×105个/0.1mL浓度，0.1mL/只，接种于B-hIL2Rα人源化小鼠的右侧皮下。每周测量两次肿瘤体积及动物体重，并记录测量值，肿瘤体积(mm3)＝0.5×长径×短径2。结果见图7A、7B及表12、表13。
如图7A所示，小鼠体重稳定增长，说明CD25Q2-BA9-IgG1、CD25Q8-BT942-IgG1、CD25Q11-CT848-IgG1(10mg/kg，I.P.，BIW)对小鼠没有毒副作用。
如图7B所示，与对照组相比CD25Q2-BA9-IgG1、CD25Q8-BT942-IgG1、CD25Q11-CT848-IgG1均可显著抑制小鼠MC38肿瘤的生长，其中CD25Q8-BT942-IgG1显示出了更好的抑瘤效果。
表12.MC38肿瘤模型小鼠体重数据(对应图7A)
Figure BDA0002536478160000122
表13.MC38肿瘤体积数据(对应图7B)
Figure BDA0002536478160000123
Figure BDA0002536478160000131
5.2FACS检测给药后免疫细胞对MC38肿瘤的浸润效果
5.1试验小鼠在第5次给药后(分组后第16天)，阴性对照组取4只小鼠，治疗组每组取3只小鼠，杀死小鼠并将肿瘤剪碎，加入消化酶，37℃，孵育消化40min，过滤，洗涤，重悬为单细胞悬液。96孔圆底板每孔加入25μL封闭与死活染液和25μL的细胞悬液，混匀，4℃，避光孵育15min；每孔加入50μL表面染料，混匀，4℃，避光孵育30min；每孔加入150μL FACS液洗2次，4℃，500g，离心5min，弃上清；每孔加入200μL固定液重悬细胞，混匀后，室温固定30min；固定结束后4℃，1400g，离心5min，弃上清；每孔加入200μL穿膜液，4℃，1400g，离心5min，弃上清；每孔加入100μL胞内染液，室温，避光孵育30min；每孔加150μL穿膜液洗涤2次，1400g，离心5min，弃上清；250μL PBS重悬细胞，上机检测CD3中的CD8+细胞(Teff)含量、CD3中的CD25+Foxp3+细胞(Treg)含量及CD4中的Foxp3+细胞(Treg)含量。结果见图8A-图8C。
如图8A-图8C所示，与对照组Human IgG1 Kappa Isotype相比，CD25Q2-BA9-IgG1、CD25Q8-BT942-IgG1、CD25Q11-CT848-IgG1均可降低小鼠MC38肿瘤内的Treg细胞比例，增加Teff细胞的浸润，从而提高肿瘤杀伤能力。
序列表
<110> 山东博安生物技术有限公司
<120> 抗CD25抗体及其应用
<150> 201910495614.4
<151> 2019-06-10
<150> 201910495626.7
<151> 2019-06-10
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 VL
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 VH
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Glu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 VL
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 VH
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Val Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Gly Asp Tyr Ser Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 LCDR1
<400> 5
Gln Ser Leu Arg Ser Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 LCDR2
<400> 6
Lys Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 LCDR3
<400> 7
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp Thr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 HCDR1
<400> 8
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 HCDR2
<400> 9
Ile Asp His Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BA9 HCDR3
<400> 10
Ala Arg Gly Glu Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 LCDR1
<400> 11
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 LCDR2
<400> 12
Trp Ala Ser
1
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 LCDR3
<400> 13
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 HCDR1
<400> 14
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Asp Ala
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 HCDR2
<400> 15
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Val Ala
1 5
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> BT942 HCDR3
<400> 16
Ala Arg Glu Arg Gly Asp Tyr Ser Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 17
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 重链恒定区
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MA251 VH
<400> 18
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MA251 VL
<400> 19
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Asp Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 轻链恒定区
<400> 20
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (13)

1.一种结合CD25的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含3个重链互补决定区和3个轻链互补决定区，其中，HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示。
2.根据权利要求1所述的结合CD25的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4所示的重链可变区和/或SEQ ID NO:3所示的轻链可变区。
3.一种结合CD25的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含3个重链互补决定区和3个轻链互补决定区，其中，HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:8 所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:10 所示；LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，LCDR3 氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。
4.根据权利要求3所述的结合CD25的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2所示的重链可变区和/或SEQ ID NO:1所示的轻链可变区。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，所述Fv片段为scFv或dsFv片段。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合人CD25。
8.一种核酸，所述核酸编码权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种细胞，所述细胞表达权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求8所述的核酸，或权利要求9所述的细胞。
11.一种试剂盒，其包含权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求8所述的核酸。
12.权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求8所述的核酸用于制备治疗、预防、检测或诊断疾病的药物的用途，所述疾病是癌症。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于癌症选自胃癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、宫颈癌、肉瘤、细胞瘤、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
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CN101189265B (zh) * 2005-06-01 2012-07-04 米克罗麦特股份公司 抗il2抗体
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EP3630825B1 (en) * 2017-05-25 2024-02-14 Institute For Basic Science Anti-human interleukin-2 antibodies and uses thereof

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